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杂种枫香组织培养再生研究

王泽伟 张炎 齐帅征 朱军杰 袁玮 张亚东 刘学增 张金凤

王泽伟, 张炎, 齐帅征, 朱军杰, 袁玮, 张亚东, 刘学增, 张金凤. 杂种枫香组织培养再生研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
引用本文: 王泽伟, 张炎, 齐帅征, 朱军杰, 袁玮, 张亚东, 刘学增, 张金凤. 杂种枫香组织培养再生研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
Wang Zewei, Zhang Yan, Qi Shuaizheng, Zhu Junjie, Yuan Wei, Zhang Yadong, Liu Xuezeng, Zhang Jinfeng. Tissue culture regeneration of hybrid Liquidambar styraciflua × L. formosana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
Citation: Wang Zewei, Zhang Yan, Qi Shuaizheng, Zhu Junjie, Yuan Wei, Zhang Yadong, Liu Xuezeng, Zhang Jinfeng. Tissue culture regeneration of hybrid Liquidambar styraciflua × L. formosana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443

杂种枫香组织培养再生研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
基金项目: 

国家重点研发计划项目 2017YFD0600404

“948”国家林业局引进项目 2014-4-59

北京市园林绿化局项目 CEG-2016-01

北京林业大学青年教师长中期科研项目 2015ZCQ-SW-02

教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目 IRT13047

国家自然科学基金项目 31370658

详细信息
    作者简介:

    王泽伟。主要研究方向:枫香组织培养。Email:linxuewzw@163.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    张金凤,教授, 博士生导师,主要研究方向:林木遗传改良。Email: zjf@bjfu.edu.cn  地址:同上

  • 中图分类号: S722.3+7

Tissue culture regeneration of hybrid Liquidambar styraciflua × L. formosana

  • 摘要: 目的枫香具有适应性强、生长速度快、观赏价值高等特点,既可以作为用材树种又可以作为优良的园林绿化树种。北美枫香能够与中国枫香杂交并可产生有杂种优势的后代,但是杂种枫香的快速繁殖技术和遗传转化体系还有待完善。方法本研究以北美枫香为母本,中国枫香为父本进行杂交,选用子一代杂种枫香的子叶、子叶节以及下胚轴为外植体材料建立高效的组培再生体系,并对3种外植体的分化能力进行比较。结果(1) 子叶和子叶节外植体最佳芽诱导培养基为0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基,而下胚轴外植体最佳芽诱导培养基为0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基。(2)3种外植体在0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.8 mg/L GA不加琼脂的WPM芽伸长液体培养基中获得最高的平均不定芽诱导数。(3)不定芽在2.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA的WPM培养基中生根,生根率达到100%。(4)不定芽生根培养2个月后长为完整植株,移栽成活率在90%以上。结论(1) 杂种枫香3种外植体的分化能力依次为:子叶节>子叶>下胚轴,其中子叶节的分化能力显著高于子叶和下胚轴。(2)TDZ能够有效促进不定芽的诱导,GA对不定芽的伸长具有显著的影响。(3)杂种枫香外植体在固体培养基中获得了最高的不定芽诱导率,在液体培养基中获得了最高不定芽平均数量,而且液体培养中未出现玻璃化。本研究为杂种枫香新品种的快速繁育以及遗传转化体系的建立奠定了良好的基础。
  • 图  1  不同质量浓度组合的TDZ和NAA培养基中的不定芽诱导率

    Figure  1.  Adventitious bud induction rate in TDZ and NAA medium with different concentrations

    图  2  不同质量浓度组合的TDZ和NAA培养基中的平均

    Figure  2.  Average adventitious bud induction number in TDZ and NAA medium with different concentrations

    图  5  杂种枫香子叶、子叶节、下胚轴外植体不定芽诱导

    A.子叶外植体在0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM芽诱导培养基中培养1个月后;B.子叶节外植体在0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM芽诱导培养基中培养1个月后;C.下胚轴外植体在0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM芽诱导培养基中培养1个月后;D.子叶外植体在0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA的WPM芽伸长培养基培养1个月后;E.子叶节外植体在0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA的WPM芽伸长培养基培养1个月后;F.下胚轴外植体在0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA的WPM芽伸长培养基培养1个月后;G.子叶外植体在0.8 mg/L GA+0 g琼脂的WPM芽伸长培养基培养1个月后;H.子叶节外植体在0.8 mg/L GA+0 g琼脂的WPM芽伸长培养基培养1个月后;I.下胚轴外植体在0.8 mg/L GA+0 g琼脂的WPM芽伸长培养基培养1个月后。

    Figure  5.  Adventitious bud induction of cotyledon, cotyledon node, hypocotyl explants of hybrid sweetgum

    A, cotyledon explants were cultured in 0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA WPM bud induction medium for one month; B, cotyledon node explants were cultured in 0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA WPM bud induction medium for one month; C, hypocotyl explants were cultured in 0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA WPM bud induction medium for one month; D, cotyledon explants were cultured in 0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA WPM shoot elongation medium for one month; E, cotyledon node explants were cultured in 0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA WPM shoot elongation medium for one month; F, hypocotyl explants were cultured in 0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA WPM shoot elongation medium for one month; G, cotyledon explants were cultured in 0.8 mg/L GA+0 g agar WPM bud elongation medium for one month; H, cotyledon node explants were cultured in 0.8 mg/L GA+0 g agar WPM bud elongation medium for one month; I, hypocotyl explants were cultured in 0.8 mg/L GA+0 g agar WPM bud elongation medium for one month.

    图  3  不同质量浓度组合的GA和琼脂培养基中的不定芽诱导率

    Figure  3.  Adventitious bud induction rates in GA and agar medium with different concentrations

    图  4  不同质量浓度组合的GA和琼脂培养基中的平均不定芽诱导数

    Figure  4.  Average adventitious bud induction number in GA and agar medium with different concentrations

    图  6  杂种枫香各阶段生长情况

    A.不定芽在2.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA的WPM培养基中生长2个月后;B.移栽1个月后;C.移栽3个月后;D.移栽6个月后。

    Figure  6.  Morphology condition of hybrid sweetgum at different stages

    A, adventitious buds grown in 2.0 mg/L IBA + 0.1 mg/L NAA WPM medium for two months; B, one month after transplanting; C, three months after transplanting; D, six months after transplanting.

    表  1  不同质量浓度组合的TDZ和NAA对不定芽诱导的效果

    Table  1.   Effects of different concentrations TDZ and NAA on adventitious bud induction

    编号
    No.
    培养基组成
    Composition of medium(WPM)
    子叶
    Cotyledon
    子叶节
    Cotyledon node
    下胚轴
    Hypocotyl
    平均不定芽诱导数
    Average adventitious bud induction number
    不定芽诱导率
    Adventitious bud induction rate/%
    平均不定芽诱导数
    Average adventitious bud induction number
    不定芽诱导率
    Adventitious bud induction rate/%
    平均不定芽诱导数
    Average adventitious bud induction number
    不定芽诱导率
    Adventitious bud induction rate/%
    1 0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 5.40±0.26a 93.33±4.41a 6.0±0.38a 100 4.35±0.22ab 75±4.04a
    2 0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 4.50±0.18ab 65±5.77bc 5.20±0.28ab 98.33±1.67 4.50±0.21a 83.33±3.84a
    3 0.05 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 2.65±0.16ab 60±3.46bc 1.84±0.13c 100 1.97±0.37b 56.67±2.37abc
    4 0.2 mg/L TDZ+0 mg/L NAA 2.45±0.46b 61.67±6.01bc 3.30±0.12abc 90±5.77 2.65±0.17ab 63.33±6.84ab
    5 0.1 mg/L TDZ+0 mg/L NAA 2.78±0.29b 73.33±4.37ab 2.85±0.17bc 93.33±3.33 2.22±0.17b 45±1.73bc
    6 0.05 mg/L TDZ+0 mg/L NAA 2.47±0.42b 48.33±6.67c 2.04±0.22c 93.33±6.67 1.90±0.24b 35±2.89c
    注:平均不定芽诱导数、不定芽诱导率的数据为平均数±标准差。同一列中不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。Notes: data of the average induction number of adventitious shoots, the induction percentage of adventitious buds are mean ±SD. Different letters in a same column mean significant difference at P < 0.05 level. The same below.
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    表  2  不同质量浓度组合的GA和琼脂对不定芽伸长的效果

    Table  2.   Effects of different concentrations of GA and agar on adventitious bud elongation

    编号
    No.
    培养基组成
    Composition of medium (WPM)
    子叶
    Cotyledon
    子叶节
    Cotyledon node
    下胚轴
    Hypocotyl
    平均不定芽诱导数
    Average adventitious bud induction number
    不定芽诱导率
    Adventitious bud induction rate/%
    平均不定芽诱导数
    Average adventitious bud induction number
    不定芽诱导率
    Adventitious bud induction rate/%
    平均不定芽诱导数
    Average adventitious bud induction number
    不定芽诱导率
    Adventitious bud induction rate/%
    1 0.4 mg/L GA+4 g/L倍力凝+2 g/L琼脂0.4 mg/L GA+4 g/L polygel+2 g/L agar 5.78±0.38b 90±5.77a 6.00±0.61b 100 5.30±0.48b 71.67±2.31b
    2 0.4 mg/L GA+0 g/L琼脂0.4 mg/L GA+0 g/L agar 7.70±0.42a 62.67±4.04b 8.18±0.42ab 95±2.89 6.21±0.45ab 63.33±7.26c
    3 0.8 mg/L GA+4 g/L倍力凝+ 2 g/L琼脂0.8 mg/L GA+4 g/L polygel+ 2 g/L agar 6.24±0.66b 93.33±1.67a 7.08±0.23ab 100 5.85±0.22b 83.33±1.67a
    4 0.8 mg/L GA+0 g/L琼脂0.8 mg/L GA+0 g/L agar 8.29±0.78a 50±2.89b 9.13±0.67a 100 7.34±0.61a 73.33±1.67b
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    , 严晓素, 赵兵, 高荣孚, 于京民2, 王建中, 尹伟伦, 王玉兵, 王晓楠, 李凯, 谢磊, 张志翔, 刘玉军, 冯仲科, 王民中, 杨伟光, 张兴杰, 林善枝, 丁霞, 刘玉军, 陈卫平, 孙建华, 沈应柏, 李凤兰, 刘艳, 李镇宇, 陶凤杰, 王玉春, 张庆, 呼晓姝, 蒋平, 赵新丽, 汪植, 马建海, 付瑞海.  诱导大孢子染色体加倍选育白杨杂种三倍体 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 22-25.
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    , 王晓楠, 刘玉军, 尹伟伦, 谢磊, 冯仲科, 严晓素, 高荣孚, 李凯, 郭晓萍, 冯晓峰, 温秀凤3, 于京民2, 吴坚, 赵兵, 王瑛, 王冬梅, 王玉兵, 邹坤, 骈瑞琪, 王华芳, 王建中, 李凤兰, 王民中, 丁霞, 陶凤杰, 张兴杰, 孙建华, 张庆, 刘玉军, 陈卫平, 杨伟光, 王玉春, 李镇宇, 刘艳, 林善枝, 呼晓姝, 沈应柏, 赵新丽, 付瑞海, 马建海, 蒋平, 汪植.  毛白杨叶片离体再生培养的基因型效应 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 38-43.
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-12-14
  • 修回日期:  2018-03-20
  • 刊出日期:  2018-08-01

杂种枫香组织培养再生研究

doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
    基金项目:

    国家重点研发计划项目 2017YFD0600404

    “948”国家林业局引进项目 2014-4-59

    北京市园林绿化局项目 CEG-2016-01

    北京林业大学青年教师长中期科研项目 2015ZCQ-SW-02

    教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目 IRT13047

    国家自然科学基金项目 31370658

    作者简介:

    王泽伟。主要研究方向:枫香组织培养。Email:linxuewzw@163.com  地址:100083  北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 张金凤,教授, 博士生导师,主要研究方向:林木遗传改良。Email: zjf@bjfu.edu.cn  地址:同上
  • 中图分类号: S722.3+7

摘要: 目的枫香具有适应性强、生长速度快、观赏价值高等特点,既可以作为用材树种又可以作为优良的园林绿化树种。北美枫香能够与中国枫香杂交并可产生有杂种优势的后代,但是杂种枫香的快速繁殖技术和遗传转化体系还有待完善。方法本研究以北美枫香为母本,中国枫香为父本进行杂交,选用子一代杂种枫香的子叶、子叶节以及下胚轴为外植体材料建立高效的组培再生体系,并对3种外植体的分化能力进行比较。结果(1) 子叶和子叶节外植体最佳芽诱导培养基为0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基,而下胚轴外植体最佳芽诱导培养基为0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基。(2)3种外植体在0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.8 mg/L GA不加琼脂的WPM芽伸长液体培养基中获得最高的平均不定芽诱导数。(3)不定芽在2.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA的WPM培养基中生根,生根率达到100%。(4)不定芽生根培养2个月后长为完整植株,移栽成活率在90%以上。结论(1) 杂种枫香3种外植体的分化能力依次为:子叶节>子叶>下胚轴,其中子叶节的分化能力显著高于子叶和下胚轴。(2)TDZ能够有效促进不定芽的诱导,GA对不定芽的伸长具有显著的影响。(3)杂种枫香外植体在固体培养基中获得了最高的不定芽诱导率,在液体培养基中获得了最高不定芽平均数量,而且液体培养中未出现玻璃化。本研究为杂种枫香新品种的快速繁育以及遗传转化体系的建立奠定了良好的基础。

English Abstract

王泽伟, 张炎, 齐帅征, 朱军杰, 袁玮, 张亚东, 刘学增, 张金凤. 杂种枫香组织培养再生研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
引用本文: 王泽伟, 张炎, 齐帅征, 朱军杰, 袁玮, 张亚东, 刘学增, 张金凤. 杂种枫香组织培养再生研究[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
Wang Zewei, Zhang Yan, Qi Shuaizheng, Zhu Junjie, Yuan Wei, Zhang Yadong, Liu Xuezeng, Zhang Jinfeng. Tissue culture regeneration of hybrid Liquidambar styraciflua × L. formosana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
Citation: Wang Zewei, Zhang Yan, Qi Shuaizheng, Zhu Junjie, Yuan Wei, Zhang Yadong, Liu Xuezeng, Zhang Jinfeng. Tissue culture regeneration of hybrid Liquidambar styraciflua × L. formosana[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(8): 42-49. doi: 10.13332/j.1000-1522.20170443
  • 北美枫香(Liquidambar styraciflua)是隶属金缕梅科(Hamamelidaceae)的高大落叶乔木,其生长速度快,在天然野生状态下也表现出很强的适应性,秋季叶色变红,广泛分布于美国东南部,是园林绿化的优良树种[1-3]。中国枫香(Liquidambar fomorsana)树干圆满通直,枝叶繁茂,适应性很强,能耐干旱瘠薄,生长较为迅速其材质优良、药用价值高,而且对SO2、氯化物有较强的抗性,主要分布于我国秦岭及淮河以南各省[4]。国外通过杂交试验研究表明,北美枫香可以与中国枫香进行杂交,并能够产生有杂种上优势的后代[5-7]。国外优良的枫香杂种由于受到多种因素限制未能成功引进我国,且国内杂种枫香相关研究工作还鲜有报道。因此,急需在我国开展枫香的杂交试验以期获得具有我国自主知识产权的枫香品种。目前,枫香有关组培研究报道中的外植体包括幼嫩的芽尖[8]、下胚轴[9-10]、侧芽[11]以及成熟的叶片和叶柄[12]等。虽然外植体种类繁多,但是没有系统性对不同外植体分化能力进行比较,并且从未使用子叶和子叶节作为外植体进行组织培养研究。

    不同的激素种类和质量浓度对植株不定芽诱导有显著影响,当外植体体内细胞分裂素与生长素积累到一定比例时,才能诱导不定芽的形成[13]。TDZ是一种植物细胞分裂素,在不定芽器官的发生中能够起到关键的作用[14-15]。低质量浓度的TDZ(0.002 2~0.088 mg/L)常用于木本树种的微繁殖,水平略高的TDZ(0.1~1 mg/L)在芽生长中更为有效,但是高质量浓度的TDZ会导致愈伤组织形成和不定芽生长的停止[1]。NAA是一种广谱型植物生长调节剂,可促进细胞分裂与扩大[16]。Radhika等人[13]发现TDZ与NAA组合能够高效地诱导不定芽产生,而且能降低基因型的影响。赤霉素(GA)作为一种重要的植物激素,能够参与控制多种多样的植物发育和生理调控过程[17],Reeves等人[18]认为赤霉素能显著促进李属(Prunus)植株茎的伸长。

    因此本研究中选用杂种枫香的子叶、子叶节和下胚轴3种外植体作为研究材料,建立了高效的杂种枫香组培再生体系,并对它们的分化能力进行比较,筛选出最优外植体类型和最优培养基配方,为杂种枫香新品种的高效繁殖和遗传转化体系的建立奠定基础。

    • 选取上海辰山植物园4株北美枫香和5株中国枫香、河南郑州绿博园2株北美枫香以及信阳鸡公山选优的7棵中国枫香为亲本,以北美枫香为母本,以中国枫香为父本。每年3月份,采集中国枫香花枝进行室内水培,收集并混合花粉,4 ℃冰箱保存;4月份分别在上海辰山植物园、郑州绿博园进行杂交试验,去除北美枫香雄花序,使用中国枫香花粉进行控制授粉;9月中旬,获得杂种枫香种子,种子在4 ℃冰箱保存。

    • 挑选出洁净无杂质、成熟度高、种质饱满、结构完整的杂种枫香种子,进行表面消毒,消毒方法为:在超净工作台中,使用75%的酒精浸泡1 min,浸泡完后用无菌水清洗1次,然后再用2%的次氯酸钠浸泡10 min,浸泡完后用无菌水清洗3次。将消毒完的种子接种到加MS培养基[19]中(30 g/L的蔗糖、4 g/L的倍力凝、2 g/L的琼脂,pH为5.8,121 ℃,1.1 kg/cm2高压下灭菌15 min),在组培室中进行萌发培养,组培室温度控制在(25±2)℃,日光灯光照强度1 200 lx左右,光照时间为16 h/d。

    • 以消毒处理后18~20 d无菌生长的400株杂种枫香幼苗为材料,分别获得子叶(横向剪切2刀伤口)、子叶节以及下胚轴(切为每段长0.5 cm)外植体,这些外植体在添加不同浓度的的TDZ(0.2、0.1、0.05 mg/L)和NAA(0.1、0 mg/L)的WPM[20]不定芽诱导培养基中生长。采用完全随机区组设计,培养基共6个质量浓度组合,将子叶、子叶节和下胚轴分别接种于6个不同质量浓度组合的培养基中,每个质量浓度组合接种30个外植体,均重复3次。1个月后,将外植体放到BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的WPM芽伸长培养基(30 g/L的蔗糖、4 g/L的倍力凝、2 g/L的琼脂,pH为5.8,121 ℃,1.1 kg/cm2高压下灭菌15 min)中培养;2个月后,统计再生率和不定芽诱导数(不定芽入选长度≥1 cm),并筛选出最优芽诱导培养基。

    • 3种外植体在最优的芽诱导培养基中生长1个月后,放到0.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+(0.4、0.8 mg/L)GA+(0、0;4 g/L、2 g/L)倍力凝/琼脂的WPM培养基中继续生长。采用完全随机区组设计,共4个浓度组合,将子叶、子叶节和下胚轴分别接种于4个不同质量浓度组合的培养基中,每个质量浓度组合接种30个外植体,均重复3次。2个月后,统计再生率和不定芽诱导数(不定芽入选长度≥1 cm)。

    • 1个月后,将高度大于2 cm的不定芽从不定芽团块中分离,并接种到2.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA的1/2 WPM生根培养基中进行生根培养。2个月后,将高度大于5 cm的杂种枫香小苗开口炼苗2 d,然后从培养瓶中取出,并清洗掉根部的培养基,移栽到装有草炭、珍珠岩和蛭石(体积比为1 :2 :1)混合营养土的无纺育苗袋中,每个袋子放1棵杂种枫香小苗,温室光照条件为自然光照,温度控制在(25±5) ℃,1个月后统计存活率。

    • 不定芽诱导率=诱导产生不定芽的外植体数/接种的总外植体数×100%

      平均不定芽诱导数=诱导产生的不定芽总数/产生不定芽的外植体数

      存活率=成活的小苗数量/总移栽的小苗数量×100%

      试验数据通过SPSS 19.0 for Windows和Excel2015进行分析。

    • 下胚轴外植体在接种4 d后出现膨胀并变为暗红,平均10 d后出现芽点,并且均未产生愈伤组织。子叶外植体切口处在接种6 d后开始膨胀,外植体的颜色从绿色变成暗红色,在第10天观察到外植体切口处变红且出现芽点,部分产生愈伤组织。子叶节在接种后第6天基部开始膨大、变红,在第10天出现芽点,并且从外植体顶端开始长出真叶。

      6种不同质量浓度组合的TDZ和NAA用于杂种枫香3种不同外植体不定芽的诱导。在子叶外植体中最高的再生率为93.33%,最高的平均不定芽诱导数为5.40,是在0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基中获得的。在子叶节外植体中,最佳的芽诱导培养为0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基,不定芽再生率达到100%,平均不定芽诱导数为6.0;同时在0.05 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基下子叶节外植体也出现了100%的高分化率,但平均不定芽诱导数仅为1.84。在下胚轴外植体中最高的再生率为83.33%,最高的平均不定芽诱导数为4.50,在0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA的WPM培养基中获得(表 1图 125)。

      表 1  不同质量浓度组合的TDZ和NAA对不定芽诱导的效果

      Table 1.  Effects of different concentrations TDZ and NAA on adventitious bud induction

      编号
      No.
      培养基组成
      Composition of medium(WPM)
      子叶
      Cotyledon
      子叶节
      Cotyledon node
      下胚轴
      Hypocotyl
      平均不定芽诱导数
      Average adventitious bud induction number
      不定芽诱导率
      Adventitious bud induction rate/%
      平均不定芽诱导数
      Average adventitious bud induction number
      不定芽诱导率
      Adventitious bud induction rate/%
      平均不定芽诱导数
      Average adventitious bud induction number
      不定芽诱导率
      Adventitious bud induction rate/%
      1 0.2 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 5.40±0.26a 93.33±4.41a 6.0±0.38a 100 4.35±0.22ab 75±4.04a
      2 0.1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 4.50±0.18ab 65±5.77bc 5.20±0.28ab 98.33±1.67 4.50±0.21a 83.33±3.84a
      3 0.05 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 2.65±0.16ab 60±3.46bc 1.84±0.13c 100 1.97±0.37b 56.67±2.37abc
      4 0.2 mg/L TDZ+0 mg/L NAA 2.45±0.46b 61.67±6.01bc 3.30±0.12abc 90±5.77 2.65±0.17ab 63.33±6.84ab
      5 0.1 mg/L TDZ+0 mg/L NAA 2.78±0.29b 73.33±4.37ab 2.85±0.17bc 93.33±3.33 2.22±0.17b 45±1.73bc
      6 0.05 mg/L TDZ+0 mg/L NAA 2.47±0.42b 48.33±6.67c 2.04±0.22c 93.33±6.67 1.90±0.24b 35±2.89c
      注:平均不定芽诱导数、不定芽诱导率的数据为平均数±标准差。同一列中不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。Notes: data of the average induction number of adventitious shoots, the induction percentage of adventitious buds are mean ±SD. Different letters in a same column mean significant difference at P < 0.05 level. The same below.

      图  1  不同质量浓度组合的TDZ和NAA培养基中的不定芽诱导率

      Figure 1.  Adventitious bud induction rate in TDZ and NAA medium with different concentrations

      图  2  不同质量浓度组合的TDZ和NAA培养基中的平均

      Figure 2.  Average adventitious bud induction number in TDZ and NAA medium with different concentrations

      图  5  杂种枫香子叶、子叶节、下胚轴外植体不定芽诱导

      Figure 5.  Adventitious bud induction of cotyledon, cotyledon node, hypocotyl explants of hybrid sweetgum

    • 4种不同质量浓度组合的GA和琼脂用于枫香子叶、子叶节、下胚轴外植体不定芽的伸长。子叶外植体在0.8 mg/L GA+0 g琼脂的WPM芽伸长培养基中获得最高的平均不定芽诱导数为8.29,而最高的再生率(93.33%)是在0.8 mg/L GA+4 g/L倍力凝+2 g/L琼脂的WPM芽伸长培养基中获得。子叶节外植体的最高平均不定芽诱导数为9.13,是在0.8 mg/L GA+0 g琼脂的WPM芽伸长培养基中获得,除0.4 mg/LGA+0 g琼脂的WPM芽伸长培养基外,其他3种质量浓度组合均获得100%的不定芽诱导率。下胚轴外植体在0.8 mg/LGA+0 g琼脂的WPM芽伸长培养基中获得最高的平均不定芽诱导数为7.34,而最高的再生率(83.33%)是在0.8 mg/LGA+4 g/L倍力凝+2 g/L琼脂的WPM芽伸长培养基中获得(表 2图 3~5)。

      表 2  不同质量浓度组合的GA和琼脂对不定芽伸长的效果

      Table 2.  Effects of different concentrations of GA and agar on adventitious bud elongation

      编号
      No.
      培养基组成
      Composition of medium (WPM)
      子叶
      Cotyledon
      子叶节
      Cotyledon node
      下胚轴
      Hypocotyl
      平均不定芽诱导数
      Average adventitious bud induction number
      不定芽诱导率
      Adventitious bud induction rate/%
      平均不定芽诱导数
      Average adventitious bud induction number
      不定芽诱导率
      Adventitious bud induction rate/%
      平均不定芽诱导数
      Average adventitious bud induction number
      不定芽诱导率
      Adventitious bud induction rate/%
      1 0.4 mg/L GA+4 g/L倍力凝+2 g/L琼脂0.4 mg/L GA+4 g/L polygel+2 g/L agar 5.78±0.38b 90±5.77a 6.00±0.61b 100 5.30±0.48b 71.67±2.31b
      2 0.4 mg/L GA+0 g/L琼脂0.4 mg/L GA+0 g/L agar 7.70±0.42a 62.67±4.04b 8.18±0.42ab 95±2.89 6.21±0.45ab 63.33±7.26c
      3 0.8 mg/L GA+4 g/L倍力凝+ 2 g/L琼脂0.8 mg/L GA+4 g/L polygel+ 2 g/L agar 6.24±0.66b 93.33±1.67a 7.08±0.23ab 100 5.85±0.22b 83.33±1.67a
      4 0.8 mg/L GA+0 g/L琼脂0.8 mg/L GA+0 g/L agar 8.29±0.78a 50±2.89b 9.13±0.67a 100 7.34±0.61a 73.33±1.67b

      图  3  不同质量浓度组合的GA和琼脂培养基中的不定芽诱导率

      Figure 3.  Adventitious bud induction rates in GA and agar medium with different concentrations

      图  4  不同质量浓度组合的GA和琼脂培养基中的平均不定芽诱导数

      Figure 4.  Average adventitious bud induction number in GA and agar medium with different concentrations

    • 从枫香子叶、子叶节和下胚轴不定芽团块剪取不定芽(约2~3 cm长),微扦插到2.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA的WPM培养基中生根,生根率达到100%。生根2个月后,枫香小苗移栽到温室,成活率在90%以上(图 6)。

      图  6  杂种枫香各阶段生长情况

      Figure 6.  Morphology condition of hybrid sweetgum at different stages

    • 在本研究中,杂种枫香子叶、子叶节和下胚轴3种外植体都展现出极强的不定芽诱导能力,其中子叶节表现出最强的诱导能力。Qi等[21]在使用海甘蓝(Crambe abyssinica)进行遗传转化研究中,子叶节也表现出极强的诱导能力,不定芽再生率均达到90%以上。子叶节位于胚轴和子叶交界处[22],其具有比其他外植体更高的再生率,Yang等人[23]认为主要原因是该区域有更多可再生的腋生分生组织细胞。本研究利用子叶节外植体获得了最高的不定芽再生,提高了杂种枫香快速繁殖效率。

    • TDZ对外植体不定芽的诱导起到了关键作用,通常TDZ需要与低浓度的生长素或者其他细胞分裂素组合使用可以有效的促进不定芽的诱导[24]。本研究中使用TDZ与NAA组合有效的提高外植体不定芽诱导能力,NAA对外植体不定芽的诱导具有一定的影响,不添加NAA,会降低外植体不定芽诱导率和平均不定芽诱导数,这与Patial等[25]在TDZ对红花(Carthamus tinctorius)外植体不定芽再生研究中结论一致。在Kim等人[1]研究TDZ对北美枫香不定芽再生的影响认为,TDZ对不定芽的伸长有抑制作用。因此本研究中,在不定芽伸长培养基中不添加TDZ,通过添加GA,促进不定芽伸长。研究表明,GA对不定芽的伸长具有显著影响,子叶、子叶节、下胚轴外植体的平均不定芽诱导数明显增加,分别提高了45.4%、63.0%、70.3%,班德宇等人[26]也发现通过添加GA能够显著提高甘蔗(Saccharum officinarum)愈伤再生苗的茎径。

    • 液体培养基对于不定芽的增殖有重要的影响。Izabela等[27]、Prasad等[28]、Maxwell等[29]认为主要是因为液体培养基相对于固体培养基,液体培养基中不存在营养梯度,能够让外植体得到充足的营养,但是不利之处是外植体浸泡在液体培养基中,缺乏空气不利于生长,还有易出现玻璃化。因此在本研究中,杂种枫香的3种外植体最高芽诱导率是在固体培养基中获得。此外,Maxwell等[29]认为液体培养中植物组织于环境间有限的气体交换,造成了金丝桃(Echinacea purpurea)外植体的低诱导率。但是杂种枫香外植体在液体培养基中获得了最高不定芽平均数量,而且本研究液体培养中未出现玻璃化,这可能是物种特性,Kim等人[1]研究北美枫香不定芽诱导试验中也得到了同样的结论。因此,还需要更加深入的研究。

      本文首次报道了以杂种枫香子叶、子叶节和下胚轴为外植体进行的器官离体再生研究,对外植体类型、激素浓度、琼脂含量进行试验,最终建立了高效的杂种枫香组培再生体系。此外,本试验的研究方法可在今后被用于杂种枫香的快速繁殖、多倍体研究和遗传转化。本研究为杂种枫香新品种的快速繁殖和遗传改良奠定了良好的基础。

参考文献 (30)

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