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高产优质毛白杨良种组培繁育体系构建

宋跃朋 陈盼飞 卜琛皞 轩安然 张德强

宋跃朋, 陈盼飞, 卜琛皞, 轩安然, 张德强. 高产优质毛白杨良种组培繁育体系构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
引用本文: 宋跃朋, 陈盼飞, 卜琛皞, 轩安然, 张德强. 高产优质毛白杨良种组培繁育体系构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
Song Yuepeng, Chen Panfei, Bu Chenhao, Xuan Anran, Zhang Deqiang. Construction of tissue culture breeding system of high yield and quality species in Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
Citation: Song Yuepeng, Chen Panfei, Bu Chenhao, Xuan Anran, Zhang Deqiang. Construction of tissue culture breeding system of high yield and quality species in Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428

高产优质毛白杨良种组培繁育体系构建

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
基金项目: 国家林业和草原局科技成果推广计划项目([2016]28),国家自然科学基金项目(31400553、31770707)
详细信息
    作者简介:

    宋跃朋,副教授。主要研究方向:林木分子设计育种。Email:YuepengSong@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    张德强,教授,博士生导师。主要研究方向:林木分子设计育种。Email:DeqiangZhang@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S722.8;S792.117

Construction of tissue culture breeding system of high yield and quality species in Populus tomentosa

  • 摘要: 目的毛白杨是我国北方人工林营造、景观绿化及木材加工等产业应用的主要树种。近年来,由于林业产业升级,原有的毛白杨多圃配套繁育体系不能满足高质量毛白杨良种的快速繁育需求,因此亟需构建高效的毛白杨良种繁育技术体系以保障毛白杨良种在木材生产以及城市绿化中的广泛应用。方法以高产优质毛白杨良种‘毅杨1号’‘毅杨2号’和‘毅杨3号’为研究对象,以其茎段和叶片为试验材料,利用组织培养技术构建毛白杨良种组培繁育体系。本研究系统地分析了‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’和‘毅杨3号’外植体的消毒方法及植物激素对其不定芽、生根及叶片增殖诱导过程中的作用。结果(1)75%乙醇处理30 s联合2%次氯酸钠处理5 min是3个毛白杨良种外植体的最佳消毒方法。(2)不定芽诱导中0.3 mg/L 6-BA和0.1 mg/L的NAA适用于‘毅杨 1 号’和‘毅杨2号’ ‘毅杨3号’则在0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的条件下增殖系数达到最大。(3)生根诱导中‘毅杨 1 号’和‘毅杨3号’的IBA最适质量浓度为0.5 mg/L,‘毅杨2号’则为0.3 mg/L。(4)叶片增殖结果显示,‘毅杨 1 号’和‘毅杨3号’的植物激素最适质量浓度为1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA,‘毅杨2号’为0.7 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA。结论本研究构建了‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’ ‘毅杨3号’的快速繁育体系,可用于毛白杨良种的快速繁殖以及遗传转化研究,并将为毛白杨良种推广应用以及进一步利用基因工程技术在分子水平对现有良种开展精准改良奠定了基础。
  • 图  1  高产优质毛白杨良种茎段最适增殖培养基上的生长状况

    Figure  1.  Optimum growth conditions of stem segments of high yield and quality elite of P. tomentosa and their performance

    图  2  高产优质毛白杨树良种茎段在最适生根培养基上的生根状况

    Figure  2.  Optimum growth conditions of rooting medium for high yield and quality elite of P. tomentosa and their performance

    图  3  高产优质毛白杨树良种叶片最适分化培养基上的生长状况

    Figure  3.  Optimum condition of leaf differentiation medium for high yield and quality elite of P. tomentosa and their performance

    表  1  外植体消毒处理

    Table  1.   Sterilization treatment of explants

    编号
    No.
    75%乙醇处理时间
    Treating time of 75% ethanol/s
    2%次氯酸钠处理时间
    Treating time of 2% sodium hypochlorite/min
    1 30 3
    2 30 5
    3 30 7
    4 60 3
    5 60 5
    6 60 7
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    表  2  不定芽诱导培养基中激素水平

    Table  2.   Hormone levels in adventitious bud induction medium mg·L− 1

    编号 No.6-BANAA
    1 0.1 0.1
    2 0.3 0.1
    3 0.5 0.1
    4 0.7 0.1
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    表  3  消毒处理时间对毛白杨良种外植体的影响

    Table  3.   Effects of sterilization time treatment on explants of poplar

    编号
    No.
    75%乙醇处理时间
    Treating time of 75%
    ethyl alcohol/s
    2%次氯酸钠处理时间
    Treating time of 2% sodium
    hypochlorite/min
    污染死亡率 Pollution mortality rate/%
    ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
    130351.7ab 43.3bc 34.5bc
    230520.7c 23.4c 18.8d
    330746.7bc 49.1abc32.6bc
    460358.3a 53.2ab 38.8b
    560550.4abc48.8abc22.6bc
    660753.3ab 60.1a 47.5a
    注:同一列中不同字母表示差异显著(P < 0. 05)。下同。Notes: different letters indicate significant difference at P < 0. 05 level. The same below.
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    表  4  激素质量浓度对毛白杨良种不定芽诱导的影响

    Table  4.   Effects of mass concentrations of hormones on adventitious bud induction

    编号
    No.
    6-BA/(mg·L− 1)NAA/(mg·L− 1)增殖系数 Multiplication coefficient/%
    ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
    10.10.162.0bc55.6bc31.5c
    20.30.183.3a 77.4a 40.2bc
    30.50.179.1b 60.2b 80.6a
    40.70.154.1c 44.8c 52.9b
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    表  5  激素质量浓度对毛白杨良种生根的影响

    Table  5.   Effects of hormone mass concentration on rooting condition of high yield and quality elite of P. tomentosa

    编号
    No.
    IBA/(mg·L− 1)生根率 Rooting percentage/%
    ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
    1 0.1 21.67 ± 3.33b 23.33 ± 4.41d 31.67 ± 3.56c
    2 0.3 36.67 ± 3.31b 98.33 ± 5.01a 91.67 ± 4.24a
    3 0.5 85.12 ± 5.77a 86.67 ± 4.41b 97.02 ± 1.51a
    4 0.7 68.33 ± 6.01a 55.00 ± 5.77c 66.67 ± 4.43b
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    表  6  激素质量浓度对毛白杨良种叶片增殖的影响

    Table  6.   Effects of hormone mass concentration on leaf proliferation of P. tomentosa

    编号
    No.
    6-BA/(mg·L− 1)NAA/(mg·L− 1)出芽率 Budding rate/%
    ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
    1 0.3 0.1 20.10 ± 3.11d 18.65 ± 2.22d 26.15 ± 3.89d
    2 0.5 0.1 55.45 ± 3.44c 60.23 ± 4.52bc 30.56 ± 6.41c
    3 0.7 0.1 72.3 ± 4.21b 92.10 ± 4.65a 70.39 ± 5.21b
    4 1.0 0.1 95.8 ± 1.02a 65.45 ± 3.78b 90.77 ± 6.12a
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    , 高荣孚, 郭晓萍, 吴坚, 冯仲科, 尹伟伦, 王晓楠, 王华芳, 骈瑞琪, 严晓素, 于京民2, 李凯, 王玉兵, 谢磊, 王民中, 陈卫平, 孙建华, 李镇宇, 呼晓姝, 丁霞, 刘玉军, 张兴杰, 刘艳, 杨伟光, 林善枝, 王玉春, 沈应柏, 陶凤杰, 张庆, 李凤兰, 蒋平, 付瑞海, 马建海, 赵新丽, 汪植.  截叶胡枝子组织培养的研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 31-37.
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    , 王晓楠, 刘玉军, 尹伟伦, 谢磊, 冯仲科, 严晓素, 高荣孚, 李凯, 郭晓萍, 冯晓峰, 温秀凤3, 于京民2, 吴坚, 赵兵, 王瑛, 王冬梅, 王玉兵, 邹坤, 骈瑞琪, 王华芳, 王建中, 李凤兰, 王民中, 丁霞, 陶凤杰, 张兴杰, 孙建华, 张庆, 刘玉军, 陈卫平, 杨伟光, 王玉春, 李镇宇, 刘艳, 林善枝, 呼晓姝, 沈应柏, 赵新丽, 付瑞海, 马建海, 蒋平, 汪植.  毛白杨叶片离体再生培养的基因型效应 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 38-43.
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    ZHAOGuang-jie, 刘金福, 李吉跃, 刘常富, 邹大林, 常德龙, 郑凌凌, 鲁绍伟, 温俊宝, 徐文铎, 李雪萍, 白陈祥, 吴斌, 李增元, 李吉跃, 洪伟, 吴庆利, 韩烈保, 何兴元, 翟洪波, 赵广杰, 温俊宝, 何正权, 何友均, 王玉杰, 宋湛谦, 张树文, 余新晓, 何承忠, 韩士杰, 朱天辉, 张路平, 张建国, LUOWen-sheng, 刘凤芹, 李俊清, 骆有庆, 陈发菊, 骆有庆, 何静, 黄文豪, 匡秋明, 张养贞, 陈尔学, 张志毅, 姜伟, 郭忠玲, ]陈玮, FurunoTakeshi, 林秦文, ]魏晓霞, 童书振, 梁小红, 安新民, 庞勇, 张振明, 梁宏伟, 李颖, 许志春, 张军, 胡伟华, 崔国发, 张璧光, 郑兴波, 许志春, RENQian, 赵桂玲, 曾会明, PaulWolfgang, 刘君, 宋国正, 雷渊才, 曹川健, 侯伟, 李福海, 杨凯, 郑杰, 李凤兰, 赵广亮, 姚永刚, 董建生, 张全来, 张有慧, 李考学, 田桂芳, 李永波, 赫万成, 李长明, 张世玺.  毛白杨ISSR反应体系的建立及优化 . 北京林业大学学报, 2006, 28(3): 61-65.
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-12-20
  • 修回日期:  2019-05-08
  • 网络出版日期:  2019-07-01
  • 刊出日期:  2019-07-01

高产优质毛白杨良种组培繁育体系构建

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
    基金项目:  国家林业和草原局科技成果推广计划项目([2016]28),国家自然科学基金项目(31400553、31770707)
    作者简介:

    宋跃朋,副教授。主要研究方向:林木分子设计育种。Email:YuepengSong@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 张德强,教授,博士生导师。主要研究方向:林木分子设计育种。Email:DeqiangZhang@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S722.8;S792.117

摘要: 目的毛白杨是我国北方人工林营造、景观绿化及木材加工等产业应用的主要树种。近年来,由于林业产业升级,原有的毛白杨多圃配套繁育体系不能满足高质量毛白杨良种的快速繁育需求,因此亟需构建高效的毛白杨良种繁育技术体系以保障毛白杨良种在木材生产以及城市绿化中的广泛应用。方法以高产优质毛白杨良种‘毅杨1号’‘毅杨2号’和‘毅杨3号’为研究对象,以其茎段和叶片为试验材料,利用组织培养技术构建毛白杨良种组培繁育体系。本研究系统地分析了‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’和‘毅杨3号’外植体的消毒方法及植物激素对其不定芽、生根及叶片增殖诱导过程中的作用。结果(1)75%乙醇处理30 s联合2%次氯酸钠处理5 min是3个毛白杨良种外植体的最佳消毒方法。(2)不定芽诱导中0.3 mg/L 6-BA和0.1 mg/L的NAA适用于‘毅杨 1 号’和‘毅杨2号’ ‘毅杨3号’则在0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的条件下增殖系数达到最大。(3)生根诱导中‘毅杨 1 号’和‘毅杨3号’的IBA最适质量浓度为0.5 mg/L,‘毅杨2号’则为0.3 mg/L。(4)叶片增殖结果显示,‘毅杨 1 号’和‘毅杨3号’的植物激素最适质量浓度为1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA,‘毅杨2号’为0.7 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA。结论本研究构建了‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’ ‘毅杨3号’的快速繁育体系,可用于毛白杨良种的快速繁殖以及遗传转化研究,并将为毛白杨良种推广应用以及进一步利用基因工程技术在分子水平对现有良种开展精准改良奠定了基础。

English Abstract

宋跃朋, 陈盼飞, 卜琛皞, 轩安然, 张德强. 高产优质毛白杨良种组培繁育体系构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
引用本文: 宋跃朋, 陈盼飞, 卜琛皞, 轩安然, 张德强. 高产优质毛白杨良种组培繁育体系构建[J]. 北京林业大学学报, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
Song Yuepeng, Chen Panfei, Bu Chenhao, Xuan Anran, Zhang Deqiang. Construction of tissue culture breeding system of high yield and quality species in Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
Citation: Song Yuepeng, Chen Panfei, Bu Chenhao, Xuan Anran, Zhang Deqiang. Construction of tissue culture breeding system of high yield and quality species in Populus tomentosa[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2019, 41(7): 121-127. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180428
  • 毛白杨(Populus tomentosa)是我国特有的白杨派乡土树种,不仅生长迅速、材质优良而且具有树形挺拔美观,适应性强等优点。在我国黄河流域及华北平原地区用材林、农田林网和城乡绿化中发挥了重要作用[1]。自毛白杨良种选育被列入国家科技攻关课题以来,共选育出毛白杨良种12个,为支撑我国生态文明建设以及林业产业发展提供了坚实的良种材料。然而,毛白杨难以通过硬枝扦插进行高质量的规模化繁育,是其良种推广过程中面临的主要技术难题[2]。目前,毛白杨良种推广及新品种繁育主要采用多圃配套系列育苗技术[3],即通过采穗圃、砧木圃、繁殖圃、根繁圃四圃配套育苗,来解决毛白杨无性繁殖材料大规模扩繁的技术难题。但是,该繁殖策略依赖于成熟高效的嫁接技术,环节多且比较复杂[4-5]。随着我国农村经济的迅速发展,农村劳动力转移以及采穗圃占用土地成本逐年提升,导致熟练嫁接工人数量锐减以及采穗圃的大规模弃用[6],从而使毛白杨良种快速繁育过程中显现劳动力匮乏的瓶颈效应,并且导致育苗质量参差不齐,出现位置效应、年龄效应等老态现象[7-8]

    在当前的社会经济条件下,占地面积较大、技术环节复杂、劳动力成本逐年攀升的嫁接育苗技术显然远不能满足生态与绿化工程对高品质种苗培育的需求。植物组织培养技术依据植物细胞全能性,在无菌条件下,将离体器官、组织或原生质体作为外植体培养在人工培养基上,在合适的培养条件下,可以诱导产生愈伤组织、分化形成不定芽、不定根,进而培育成完整植株[9-10]。与传统繁殖方法相比,组织培养繁育技术可以突破外界环境及传统繁殖难生根、年龄效应等限制因素,不仅能够保持品种的优良特性,缩短育种周期,还可以降低生产成本、提高成苗率,以满足林业生产中大批量、高标准的种苗生产要求[11-12]。尽管组织培养用于大规模造林育苗仍然具有较高的生产成本,但是利用组织培养技术生产的幼化种苗配套形成组培−硬枝扦插扩繁体系,不仅可以保持苗木繁育质量,还极大地提高了毛白杨良种扩繁系数,从而显著地削减育苗成本[6]。因此,建立毛白杨良种组织培养快繁体系将成为未来良种繁育及推广应用工作的核心步骤。

    因此,本研究选用高产优质毛白杨良种‘毅杨1号’‘毅杨2号’和‘毅杨3号’为研究材料,建立了高效的毛白杨良种组培扩繁体系,并针对不同类型的培养基优化了激素配比,筛选出了分别适用于3个毛白杨良种快速增殖的培养基配方,为高产优质毛白杨良种的高效繁育以及示范化应用提供理论指导与技术支持。

    • ‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’和‘毅杨3号’是由母本毛新杨(P. tomentosa × P. bolleana)、父本‘截叶毛白杨’(P. tomentosa ‘Truncata’)杂交选育获得的良种。本研究以山东冠县国家毛白杨种质资源库中采集的‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’ 和 ‘毅杨3号’一年生长势良好的枝条为试验材料,置于北京林业大学温室内水培,每3天换一次水,实验前选取生长良好的叶片及茎段作为外植体材料。

    • 取外植体新鲜茎段,使用自来水冲洗3遍,冲洗完毕后除去叶片及部分叶柄,茎段按1腋芽/段,1.5 cm长剪开,使用75%酒精和2%次氯酸钠溶液进行不同时间的浸泡消毒灭菌(表1)。消毒完毕用无菌水冲洗3 ~ 5遍,无菌滤纸吸干茎段表面多余水分,剪去外植体暴露于消毒液的剪口面。最后,将消毒后的茎段接种在含0.3 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA的MS培养基中,附加3%蔗糖、5 g琼脂,pH为5.8 ~ 6.2。培养15 d后统计各处理外植体污染率,选择外植体最适消毒处理时间。

      表 1  外植体消毒处理

      Table 1.  Sterilization treatment of explants

      编号
      No.
      75%乙醇处理时间
      Treating time of 75% ethanol/s
      2%次氯酸钠处理时间
      Treating time of 2% sodium hypochlorite/min
      1 30 3
      2 30 5
      3 30 7
      4 60 3
      5 60 5
      6 60 7
    • 试验中全部均使用MS培养基,加入蔗糖30 g/L,琼脂4.5 g/L,调节pH至5.8 ~ 6.2之间,再通过设计不同质量浓度激素配成不同的不定芽诱导培养基、生根培养基以及叶片再生培养基。

    • 剪取带1个腋芽的茎段,接入添加6-BA及NAA的MS培养基中。6-BA质量浓度为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 4个梯度,NAA加入质量浓度为0.1 mg/L,共4个处理(表2),每个处理接种10瓶,每瓶茎段数为3。经30 d培养后统计不定芽增殖情况。

      表 2  不定芽诱导培养基中激素水平

      Table 2.  Hormone levels in adventitious bud induction medium mg·L− 1

      编号 No.6-BANAA
      1 0.1 0.1
      2 0.3 0.1
      3 0.5 0.1
      4 0.7 0.1
    • 剪取带腋芽的茎段,接种于含不同质量浓度IBA的MS培养基,IBA质量浓度设置为0.1、0.3、0.5、0.7 mg/L 4个梯度,4个处理组每组接种10瓶,每瓶3个茎段。在30 d培养时间内统计不同处理组的生根天数及生根率。

    • 取无菌苗叶片,保留部分叶柄,将叶片剪为小叶片或沿垂直于叶片中脉方向剪至过中脉,每个叶片剪2 ~ 3个口,将叶片接入培养基中,使远轴面接触培养基,叶片正面朝上。叶片再生培养基为MS培养基中加入6-BA及IBA,按6-BA加入的质量浓度分为4个处理组,分别为0.1、0.5、0.7、1.0 mg/L,每个处理组的NAA加入量均为0.1 mg/L,每个处理接种10培养皿。30 d培养后观察记录各处理组中的叶片增殖情况。

    • 接种30 d后观察与统计不定芽个数、生根率及叶片不定芽个数,使用Origin软件对结果进行统计分析。主要指标包括污染死亡率、增殖系数、生根率、叶片出芽率。污染死亡率:污染及死亡的外植体数与外植体总数的比值;增殖系数:一个培养周期后长出的有效芽数与外植体接种数的比值;生根率:诱导生根的外植体数与接种外植体数的比值;叶片出芽率:不定芽再生的叶片数与接种叶片数的比值。实验数据通过R3.4.2软件进行One-way ANOVA分析,利用Fisher’s Least Significant Difference(LSD)进行多重比较。根据分析结果,筛选出不定芽诱导、生根诱导以及叶片再生快速繁育体系中培养基适合的植物激素质量浓度。

    • 组织培养中的外植体消毒要杀死材料表面微生物且不伤及材料,在不同的处理时间后接入培养基中培养15 d后记录材料生长情况。通过对表3的统计数据分析发现,在6个试验处理组中,‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’及‘毅杨3号’的最佳消毒方式组合均为75%乙醇处理30 s和2%次氯酸钠处理5 min,且污染死亡率均显著低于其他处理组,分别为20.7%、23.4%和18.8%。结果表明,75%乙醇处理时间的增加对外植体存在明显的伤害作用。

      表 3  消毒处理时间对毛白杨良种外植体的影响

      Table 3.  Effects of sterilization time treatment on explants of poplar

      编号
      No.
      75%乙醇处理时间
      Treating time of 75%
      ethyl alcohol/s
      2%次氯酸钠处理时间
      Treating time of 2% sodium
      hypochlorite/min
      污染死亡率 Pollution mortality rate/%
      ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
      130351.7ab 43.3bc 34.5bc
      230520.7c 23.4c 18.8d
      330746.7bc 49.1abc32.6bc
      460358.3a 53.2ab 38.8b
      560550.4abc48.8abc22.6bc
      660753.3ab 60.1a 47.5a
      注:同一列中不同字母表示差异显著(P < 0. 05)。下同。Notes: different letters indicate significant difference at P < 0. 05 level. The same below.
    • 选择使用合适的培养基是组织培养中成功的关键环节。通过4个6-BA质量浓度水平的处理组中增殖系数的计算及对比分析结果(表4图1)显示,‘毅杨 1 号’及‘毅杨2号’的激素最适质量浓度为0.3 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA,增殖系数分别达到83.3%和77.4%,而‘毅杨3号’的最适6-BA质量浓度为0.5 mg/L,增殖系数为80.6%。3个毛白杨良种的在6-BA质量浓度为最适质量浓度的培养条件下增殖系数均显著大于其他质量浓度的处理组。

      图  1  高产优质毛白杨良种茎段最适增殖培养基上的生长状况

      Figure 1.  Optimum growth conditions of stem segments of high yield and quality elite of P. tomentosa and their performance

      表 4  激素质量浓度对毛白杨良种不定芽诱导的影响

      Table 4.  Effects of mass concentrations of hormones on adventitious bud induction

      编号
      No.
      6-BA/(mg·L− 1)NAA/(mg·L− 1)增殖系数 Multiplication coefficient/%
      ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
      10.10.162.0bc55.6bc31.5c
      20.30.183.3a 77.4a 40.2bc
      30.50.179.1b 60.2b 80.6a
      40.70.154.1c 44.8c 52.9b
    • 实验中使用不同IBA质量浓度配制的培养基对毅杨外植体进行生根诱导(图2),结果如表5表5中数据显示,较低质量浓度的IBA有利于毅杨的生根诱导,‘毅杨 1 号’和3号的IBA最适质量浓度为0.5 mg/L,而‘毅杨2号’在IBA质量浓度为0.3 mg/L的条件下生根率更高,同时作者发现在试验中最适质量浓度的培养条件下,‘毅杨2号’和3号的生根情况要优于‘毅杨 1 号’。

      图  2  高产优质毛白杨树良种茎段在最适生根培养基上的生根状况

      Figure 2.  Optimum growth conditions of rooting medium for high yield and quality elite of P. tomentosa and their performance

      表 5  激素质量浓度对毛白杨良种生根的影响

      Table 5.  Effects of hormone mass concentration on rooting condition of high yield and quality elite of P. tomentosa

      编号
      No.
      IBA/(mg·L− 1)生根率 Rooting percentage/%
      ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
      1 0.1 21.67 ± 3.33b 23.33 ± 4.41d 31.67 ± 3.56c
      2 0.3 36.67 ± 3.31b 98.33 ± 5.01a 91.67 ± 4.24a
      3 0.5 85.12 ± 5.77a 86.67 ± 4.41b 97.02 ± 1.51a
      4 0.7 68.33 ± 6.01a 55.00 ± 5.77c 66.67 ± 4.43b
    • 实验以6-BA质量浓度为变量对叶片增殖培养基进行筛选(图3),在30 d培养后统计结果如表6所示。实验结果显示,较高质量浓度的6-BA有利于毅杨的叶片不定芽增殖,在最适的激素质量浓度培养条件下出芽率均可超过90%,但过高的质量浓度也会造成增殖率下降。‘毅杨 1 号’和‘毅杨3号’的最佳植物激素质量浓度组合为1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA,‘毅杨2号’为0.7 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA。

      图  3  高产优质毛白杨树良种叶片最适分化培养基上的生长状况

      Figure 3.  Optimum condition of leaf differentiation medium for high yield and quality elite of P. tomentosa and their performance

      表 6  激素质量浓度对毛白杨良种叶片增殖的影响

      Table 6.  Effects of hormone mass concentration on leaf proliferation of P. tomentosa

      编号
      No.
      6-BA/(mg·L− 1)NAA/(mg·L− 1)出芽率 Budding rate/%
      ‘毅杨1号’ ‘Yiyang 1’‘毅杨2号’ ‘Yiyang 2’‘毅杨3号’ ‘Yiyang 3’
      1 0.3 0.1 20.10 ± 3.11d 18.65 ± 2.22d 26.15 ± 3.89d
      2 0.5 0.1 55.45 ± 3.44c 60.23 ± 4.52bc 30.56 ± 6.41c
      3 0.7 0.1 72.3 ± 4.21b 92.10 ± 4.65a 70.39 ± 5.21b
      4 1.0 0.1 95.8 ± 1.02a 65.45 ± 3.78b 90.77 ± 6.12a
    • 在毛白杨组培快繁研究与应用中,多种组织与器官可用作外植体来进行无性系扩繁,如茎尖、茎段、腋芽、叶片等。在实验及生产前应挑选再生能力强、操作相对简便的材料,一般认为通过茎段发育途径形成的植株遗传稳定性好,变异率相较于通过愈伤组织分化的要小[13]。本研究采用带腋芽的茎段,在培养基中均长势良好,而在以叶片为外植体的实验中多使用幼叶。幼叶的芽分化率高而老叶不易分化出芽。此外,接种时外植体的大小也是影响组织培养效果的因素之一,过小的外植体生存能力较弱,在组培工作中不易存活和诱导,且更易发生褐化[14],而外植体过大时容易造成污染,因此实验中应采用中等长度和大小的茎段和叶片作为外植体材料。

    • 在本研究中,毛白杨良种的外植体消毒适宜使用5%乙醇30 s联合2%次氯酸钠5 min的消毒方法,结果显示乙醇和次氯酸钠的处理时间对外植体的污染和死亡率都有较大影响,而乙醇消毒处理的时间增加对外植体有更大的伤害。在进一步的研究中可以设置更小的时间梯度组合以获得更精确的处理时间组合,在有效降低污染率的同时减少消毒剂对外植体的伤害,达到更好的处理效果。在组织培养工作中,消毒方法的选择应根据具体的实验材料,对药剂的敏感程度及消毒效果来选择和设定消毒剂及处理时间。同样,同种材料不同部位的茎段也存在着一定差异。通常而言,消毒剂的种类及消毒时间被视为外植体褐化的重要原因,但仅以对消毒方法的控制不足以使褐化率显著下降,同时规范化培养条件、外植体的选择可有效减少材料的褐变,另外可加入抗坏血酸、PVP及抗氧化剂等减少外植体的褐化现象[15]

    • 外源生长调节剂是组培实验中诱导植物形态建成的主要因素[16-17],而细胞分裂素是植物不定芽分化和增殖不可缺少的调节物质,6-BA是实验中广泛应用且有效的细胞分裂素,常与低质量浓度NAA组合诱导不定芽产生[18]。实验结果显示,0.3 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA为‘毅杨 1 号’和‘毅杨2号’不定芽诱导培养基中加入的植物激素最佳质量浓度,‘毅杨3号’则在0.3 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的条件下增殖系数最高,且均显著高于其他质量浓度水平,可在进一步的实验中缩小质量浓度梯度范围,获得更高效的培养基配方。增殖率在一定质量浓度范围内的6-BA条件下呈上升趋势,较低质量浓度的6-BA促进茎段不定芽的增殖,而达到最佳的质量浓度后再增加6-BA的质量浓度则表现为抑制不定芽的诱导,同时外植体玻璃化的趋势加重。通常认为高质量浓度的6-BA有利于外植体芽的分化,且在细胞分裂素与生长素比值较大的条件下诱导芽的分化,但在实际操作中质量浓度不宜过高,否则抑制外植体的整体生长[19]

      相反,在细胞分裂素较高的条件下根的分化和生长则受到抑制,因外植体内源植物激素的存在,在诱导生根的实验中应排除细胞分裂素的使用,使用生长素以便诱导生根。IBA及NAA在组培的生根诱导实验中广泛使用,一般认为较低的生长素质量浓度有利于外植体生根,NAA除了促进生根外还能促进发芽,而IBA多用于诱导生根,作用较强且发根数量较大。实验结果显示,生根诱导中‘毅杨 1 号’与‘毅杨3号’的IBA最适质量浓度为0.5 mg/L,‘毅杨2号’则为0.3 mg/L;随着IBA质量浓度的变化,外植体的生根率也有显著变化,高质量浓度的IBA不利于毅杨良种的生根。

      现有的研究提及在叶片分化培养中,多种激素的混合使用相较于单一激素的使用有更好的效果[20-22]。在实验中较高质量浓度的6-BA配合0.1 mg/L的NAA对叶片增殖的促进效果较好,在‘毅杨2号’中6-BA的质量浓度提升到1.0 mg/L后叶片的出芽率开始下降,说明过高的6-BA质量浓度同样不利于叶片的分化,而在‘毅杨 1 号’与‘毅杨3号’的实验中,叶片的出芽率随6-BA质量浓度的提升而逐步增大,因此可继续增加6-BA的使用量来确定其最适的质量浓度范围。

      本文首次报道了高产优质毛白杨良种‘毅杨 1 号’ ‘毅杨2号’与‘毅杨3号’的高效组织培养体系,对外植体消毒时间、外源植物生长调节剂质量浓度进行优化,最终建立了高效的毛白杨良种组培再生体系。本试验的研究方法可用于毛白杨良种的快速繁殖以及遗传转化研究,并将为毛白杨良种推广应用以及进一步利用基因工程技术在分子水平对现有良种开展精准改良奠定了基础。

参考文献 (22)

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