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红花玉兰（Magnolia wufengensis）是近年来新发现的木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Magnolia）品种[1]，目前发现仅在湖北省五峰县中西部海拔1 400 ~ 2 000 m的高山地带有分布，属于濒危的珍稀物种。红花玉兰花部形态变异丰富，花色类型有从内外深红到内白外粉等各个系列，花被片数目9 ~ 46瓣不等，花型有菊花型、月季型、牡丹型等，是珍贵的园林绿化素材。自2004年首次发现该新物种以来，先后收集保存了大量不同优良性状的红花玉兰种质资源[2-4]。近年来，红花玉兰课题组攻克了红花玉兰的嫁接繁殖和扦插繁殖等繁育技术难题。同时通过对红花玉兰抗寒性机理的不断研究，实现了红花玉兰在华北、华中、西南和华南等地的推广和繁育[5-6]。不断培育红花玉兰优良新品种并完成新品种的鉴定、分类、驯化和繁育，对红花玉兰优良性状及其资源的保护具有十分重要的意义。随着红花玉兰新品种的逐渐推广，尚未完备的品种鉴定体系以及复杂不清的遗传背景严重制约了红花玉兰品种的种权保护，所以急需建立红花玉兰品种的快速鉴定体系。红花玉兰品种鉴定研究的开展既有利于实现品种系统化、信息化的办理，同时也能更好地实现对育种者和种植者权力的保护，为侵权事务的快速处置提供参考尺度。
近年来，SSR和SRAP分子标记技术在植物遗传多样性研究中得到了广泛的应用，成为分析亲缘关系和构建遗传图谱可靠而高效的方法，如芍药（Paeonia lactiflora）[7]、葡萄（Vitis vinifera）[8]、月季（Rosa chinensis）[9]、焕镛木（Woonyoungia septentrionalis）[10]等。SSR和SRAP标记具有高度多态性，尤其适用于栽培品种的遗传多样性鉴定[11]。与其他标记系统相比，SRAP技术简单，可靠，并且不需要事先了解基因组序列；SSR标记具有共显性，高重复性，相对高水平的多态性和丰富的基因组分布等许多优点。本研究采用SSR和SRAP分子标记对现有的35个红花玉兰新品种进行了遗传多样性研究和品种鉴定，实现了对红花玉兰新品种的简便、快速、准确地鉴定，同时也为红花玉兰的保护和新品种的选育提供了重要的参考。
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35个红花玉兰品种的母株从湖北省五峰县不同地区实生群体中筛选获得，并且每个品种的母株均起源于天然林，具体地理分布见图1。将筛选后的母株通过人工嫁接方法培育成性状稳定的新品种，最后将其保存于五峰红花玉兰种质资源圃。实验材料采自于五峰红花玉兰种质资源圃，每个品种随机采集5棵植株的叶片，经液氮快速冷冻后保存于− 80 ℃超低温冰箱中。具体采样信息见表1。
图 1 红花玉兰品种的地理位置
Figure 1. Geographic distribution of the analyzed M. wufengensis samples from Wufeng
表 1 35个红花玉兰品种采样信息表
Table 1. Details of sampling of the M. wufengensis investigated in this study
序号 No. 品种代号 Cultivar code 品种名 Cultivar 来源 Origin 经度 Longitude 纬度 Latitude 海拔 Altitude/m 1 HHYL1 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 2 HHYL2 娇月 Jiaoyue 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 3 HHYL3 娇逸 Jiaoyi 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 4 HHYL4 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 5 HHYL5 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 6 HHYL6 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 7 HHYL7 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 8 HHYL8 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 9 HHYL9 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 10 HHYL10 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 11 HHYL11 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 12 HHYL12 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 13 HHYL13 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 14 HHYL14 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 15 HHYL15 ~ 五峰牛庄 Niuzhuang, Wufeng 110°21′55″E 30°13′58″N 1 800 16 HHYL16 ~ 五峰独树坪 Dushuping, Wufeng 110°24′11″E 30°09′53″N 1 400 17 LZP1 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 18 LZP2 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 19 LZP4 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 20 LZP18 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 21 16B ~ 五峰独树坪 Dushuping, Wufeng 110°24′11″E 30°09′53″N 1 620 22 WT ~ 五峰湾潭 Wantan, Wufengan 110°25′50″E 30°02′53″N 1 400 23 JH1 娇红一号 Jiaohong1 五峰罗筐岩 Luokuangyan, Wufeng 110°24′09″E 30°05′35″N 1 470 24 JH2 娇红二号 Jiaohong2 五峰高峰 Gaofeng, Wufeng 110°44′53″E 30°15′27″N 1 800 25 JY 娇玉 Jiaoyu 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 26 JL 娇莲 Jiaolian 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″ E 30°06′12″N 1 690 27 JD 娇丹 Jiaodan 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 28 CYH ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 29 JZX ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 30 LKY2 娇婉 Jiaowan 五峰罗筐岩 Luokuangyan, Wufeng 110°24′09″E 30°09′35″N 1 470 31 DBH 娇韵 Jiaoyun 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 32 SLX 娇荷 Jiaohe 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 33 HH1 ~ 五峰后荒 Houhuang, Wufeng 110°38′58″E 30°17′43″N 1 800 34 DSP 娇阳 Jiaoyang 五峰独树坪 Dushuping, Wufeng 110°24′11″E 30°09′53″N 1 620 35 YTYT ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 注：~代表新品种申请中。Note: ~ represents new cultivar in application. -
使用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit（TakaRa，9768）分别提取样品基因组DNA。利用NanoDrop 2000分光光度计检测所提样品的DNA浓度，同时用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA纯度。用0.1%TE缓冲液稀释样品DNA约至10.0 ng/μL，置于− 20 ℃冰箱中保存备用。
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参考相关文献（表2），选择已发表的8种木兰科植物的67对SSR引物作为初始筛选引物，对35个红花玉兰品种进行筛选。SRAP正反向引物各12条选自文献[12]，标记采用原始名称。PCR选用10 μL体系：DNA 1 μL（10 ng/μL），l.2 × Taq PCR Master Mix 5 μL，正反向引物各0.5 μL，去离子水3 μL。SSR标记PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃至49.5 ℃每循环递减0.7 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共15个循环；94 ℃变性30 s，49.5 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共20个循环；最后72 ℃延伸20 min。SRAP标记PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，共5个循环；94 ℃变性30 s，49.5 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（150 V，1.5 h），银染检测，并使用DL500 DNA Marker（Takara，3590A）估算条带的大小。
表 2 实验所用SSR引物信息
Table 2. Information of SSR primers used in the experiment
引物
Primer正向引物（5′—3′）
Forward sequence (5′−3′)反向引物（5′—3′）
Reverse sequence (5′−3′)重复单元
Repeat motif参考文献
ReferenceMC3 CCGCAGCAAACCCTACGC GCACACGCCAACAATGGAAAG (CT)16 [16] MC8 GAGTTCCGTGAGTCCCA CATAATAGAAGTCATAAATCCC (TC)15 [16] MC11 TCAACAGCACAAACCGAC AGAACAACAGAACCAGGG (CT)4(CT)3(CT)(CT)2 [16] MC35 TACATCTAAAGTCCCCACAT CTCATTTCCAGCCCATAC (CT)3(CT)4(CT)3 [16] MMA51 CGATGCAGCCTAAAAAGAGC CGATCATCTCTCCCGTCACT (GA)10 [17] SGA5 GAGATGAGTCACCGCCTGTT ATTCAGTTGCACGGCTCTCT (AG)15 [17] SGA15 CTGACGTAACCCGACCTGAT CCTGACTTGATCCCACCACT (GA)14 [17] Ksep11 GACGGGGTCCCTCCACTA TCACACCAACCAATCAGC (CT)10 [18] Ksep13 TAGATGTTGGACAGTTTGC CATTGATTTTGATTTGGTG (GA)11(G)2(GA)8 [18] L78 GAGTAAGAAATGAAGACGCTCG AGTAACAAGCCAATCAGGAGG (AG)13 [19] M10D6 CGACGACGAAACTACTAACA TTAAGTTGAGGTGGAATGAC (CT)11 [20] M17D3 AAAATTACCATAGAAGAACA TTAACAGAAACAAGCACTTA (CT)19 [20] LT078 ACTGGGCCGTTTATACTTTT TGACCTTTCCCTTATTCTCA (AACA)5 [4] LT083 ATTACGCAGCTTCCCTTAC GGAGTTCTGGTATGGTTGAG (ACAACC)4 [4] LT092 GGGGTTTTGCTTAATGTGA CATTCCCTACCTCCTTCTCT (GGAGCC)4 [4] LT115 CTCTCATTCCGACCTTCATA ACTTTTCCTGCAACTACTGC (TCA)9 [4] LT149 GTGAAGACCAAGGAAAATGA GGAAAAGAGAGGAGGAATGT (CTT)6 [4] LT164 AGCTGCCAAGACCTACAAC CCTCTTCAGGTTCCACATTA (CTT)7 [4] -
电泳检测中，明亮清晰且能够再次重复的条带标记为“1”，而在对应位置没有条带或者条带看起来模糊不清的标记为“0”。所有数据都编辑成（0，1）矩阵进行分析。采用POPGENE32[13]统计平均有效等位基因的数量，平均期望杂合度以及Shannon’s指数。在基因距离和相似指数的基础上，使用NTSYS-pc version 2.1[14]进行UPGMA和孟德尔遗传相关性分析。使用R语言对引物的带型分布进行X2检测，量化每对引物的带型分布情况[15]。
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从67对SSR初始引物中共筛选出18对能扩增出清晰明亮且多态性丰富条带的引物，可用于红花玉兰SSR分子标记分析（表2）。
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用筛选出的18对引物对35个红花玉兰品种进行SSR标记分析，共扩增出128个DNA条带，引物扩增条带数在2 ~ 15条之间，平均每对引物扩增7.1条。基于SSR标记的红花玉兰品种遗传多样性分析结果显示，MC3引物扩增的多态性条带数目最多，为15条。而M10D6和MC35引物扩增的多态性条带数最少，仅为2条。如表3所示，Shannon’s指数平均为0.304 2，范围是0.086 4至0.433 7；平均期望杂合度为0.248 8，范围是0.059 2至0.282 3；不同引物的多态性位点百分比变化范围很大，最大值为1.000 0，最小值仅为0.142 9，均值是0.730 2。
表 3 基于SSR标记的红花玉兰品种遗传多样性分析
Table 3. Genetic diversity of M. wufengensis cultivars analyzed by SSR
引物
Primer样本量
Number of samples期望杂合度
Expected heterozygosity信息指数
Shannon index多态性位点百分比
Percentage of polymorphic lociKesp11 35 0.171 4 0.278 3 0.657 1 Kesp13 35 0.279 5 0.433 7 0.914 3 L78 35 0.123 7 0.194 5 0.428 6 LT078 35 0.261 4 0.417 7 1.000 0 LT083 35 1.229 5 0.273 9 0.714 3 LT092 35 0.272 5 0.425 8 0.942 9 LT115 35 0.188 5 0.325 2 0.942 9 LT149 35 0.162 1 0.290 3 0.914 3 LT164 35 0.225 9 0.367 8 0.971 4 M10D6 35 0.059 2 0.086 4 0.142 9 M17D3 35 0.180 0 0.264 6 0.457 1 MC3 35 0.147 2 0.255 5 0.800 0 MC8 35 0.238 9 0.377 7 0.857 1 MC11 35 0.139 1 0.245 5 0.771 4 MC35 35 0.082 8 0.120 9 0.200 0 MMA51 35 0.282 3 0.431 6 0.857 1 SGA5 35 0.240 5 0.366 9 0.714 3 SGA15 35 0.193 6 0.319 1 0.857 1 均值 Mean 35 0.248 8 0.304 2 0.730 2 -
将18对SSR引物扩增出的128个DNA条带建立（0, 1）矩阵，利用NTSYS-pc2.10软件中Similarity程序的Dice系数计算出35个红花玉兰品种的遗传相似系数。研究结果显示不同品种红花玉兰的遗传相似系数区间为0.285 7 ~ 0.795 2，平均相似系数为0.497 0，变幅为0.509 5。其中，HHYL9和HHYL14遗传相似系数最大（0.795 2），表明这两个品种之间的亲缘关系最近。HHYL2和HHYL7的遗传相似系数最小（0.285 7），表明两者之间存在较远的亲缘关系。用UPGMA对35个红花玉兰品种间的遗传相似系数进行聚类分析。如图2所示，当遗传相似系数为0.45时，35个红花玉兰品种聚类成两大类群。第一类群包含HHYL2、HHYL15、16B和YTYT 4个品种；其余31个品种聚类于第二类群中。当遗传相似系数为0.51时，第二类群又可以进一步地细分成5个亚类群。另外，聚类结果显示地理位置分布较近的红花玉兰品种几乎聚为一类，这表明红花玉兰的遗传多样性具有一定的地理区域特性，来自于不同分布区域的红花玉兰品种亲缘关系存在明显的差异。
图 2 35个红花玉兰品种的聚类分析树状图
Figure 2. Cluster analysis tree diagram of 35 M. wufengensis cultivars
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18对SSR引物多态性位点共形成191个带型数，平均每对引物10.6个带型。以X2表示各引物带型的分布情况，其值越小，则带型分布越均匀，结果如表4所示。引物M17D3的带型接近均匀分布，而引物LT149的带型表现为严重的偏分布。18对引物的平均分辨能力（D）为0.72，不同引物的分辨能力差异较大。引物MMA51的分辨能力最强，D为0.96，引物极限分辨能力（DL）为0.94，有效带型数为16，无法区分的样品对数为22。无法区分的品种为：HHYL1、HHYL11；HHYL2、WT；HHYL5、HHYL14、LZP2、JD；HHYL、HHYL15、LZP1、JL、DBH；HHYL7、HHYL8、JH2；JZX、SLX。引物LT149的D值最小，仅为0.27，DL为0.26，有效带型数为1.4。
表 4 SSR引物对鉴别能力
Table 4. Discriminating power of SSR primer pairs
引物对
Primer pair带型数
Number of banding patternX2 D DL 有效带型数
Number of effective banding patternX Kesp11 9 28.00 0.823 5 0.800 0 5.000 0 105 Kesp13 12 28.43 0.873 9 0.849 0 6.621 6 75 L78 7 56.00 0.647 1 0.628 6 2.692 3 210 LT078 19 44.80 0.905 9 0.880 0 8.333 3 56 LT083 6 55.69 0.584 9 0.568 2 2.315 7 247 LT092 16 54.14 0.865 5 0.840 8 6.282 1 80 LT115 5 79.71 0.354 6 0.344 5 1.525 5 384 LT149 5 94.57 0.267 2 0.259 6 1.350 6 436 LT164 13 58.97 0.816 8 0.793 5 4.841 9 109 M10D6 4 41.23 0.468 9 0.455 5 1.836 6 316 M17D3 5 8.29 0.774 8 0.752 7 4.042 9 134 MC11 4 28.89 0.559 7 0.543 7 2.191 4 262 MC3 20 22.71 0.944 5 0.917 6 12.128 7 33 MC35 3 16.69 0.522 7 0.507 8 2.031 5 284 MC8 15 41.71 0.879 0 0.853 9 6.843 6 72 MMA51 23 16.91 0.963 0 0.935 5 15.506 3 22 SGA15 8 18.26 0.833 6 0.809 8 5.257 5 99 SGA5 17 42.23 0.895 8 0.870 2 7.704 4 62 均值 Mean 10.61 40.96 0.721 1 0.700 6 5.361 4 166 注：D. 引物分辨能力；DL. 引物极限分辨能力；X. 单对无法区分的样品对数；X2，各引物带型的分布情况。表8同此。Notes: D, discriminating power of primer; DL, promer limitation of discriminating power; X, number of sample pairs can’t be distinguished by a single primer pair; X2 indicates the distribution of each primer belt type. The same as Tab.8. -
由于所有的单对SSR引物都无法将35个红花玉兰品种完全区分，因此需要考虑将多对引物进行组合。SSR引物对组合优化结果（表5）显示，3对引物组合就能将所有的红花玉兰品种完全区分。在本研究中，选用的18对SSR引物经引物对组合优化分析后，共生成能够完全区分所有35个红花玉兰品种的引物对组合11种，分辨能力（D值）为1，多态性条带数为30 ~ 35。
表 5 SSR引物对组合优化分析
Table 5. Majorization of SSR primer pair combination
序号
No.引物组合
Prime pair combination多态性条带数
Number of polymorphic bandsD DL 无法区分的样品对数
Indistinguishable cultivar pairs1 LT078 + MC3 + MMA51 35 1 0.971 4 0 2 LT078 + MC3 + MC8 34 1 0.971 4 0 3 LT164 + MC3 + MMA51 33 1 0.971 4 0 4 MC3 + SGA15 + SGA5 33 1 0.971 4 0 5 LT092 + MC3 + MMA51 32 1 0.971 4 0 6 LT092 + MC3 + MC8 31 1 0.971 4 0 7 LT092 + MC3 + SGA5 31 1 0.971 4 0 8 Kesp11 + LT092 + MC3 30 1 0.971 4 0 9 LT078 + MC8 + SGA15 30 1 0.971 4 0 10 MC3 + MC8 + MMA51 30 1 0.971 4 0 11 MC3 + MMA51 + SGA5 30 1 0.971 4 0 -
首先，以JH1、JH2、JD、LZP1基因组DNA为模板，对144个SRAP引物对组合（em1-em12 × me1-me12）（表6）进行扩增初筛，随后再用35个品种对初筛引物组合进行再次筛选，最后挑选条带清晰可辨、多态性高的11对引物用于SRAP标记分析。
表 6 实验所用SRAP引物信息
Table 6. Information of SRAP primers used in the experiment
引物 Primer 正向引物（5 ′—3′） Forward sequence (5′−3′) 引物 Primer 反向引物（5′—3′） Reverse sequence (5′−3′) me1 TGAGTCCAAACCGGATA em1 GACTGCGTACGAATTAAT me2 TGAGTCCAAACCGGAGC em2 GACTGCGTACGAATTTGC me3 TGAGTCCAAACCGGAAT em3 GACTGCGTACGAATTGAC me4 TGAGTCCAAACCGGACC em4 GACTGCGTACGAATTTGA me5 TGAGTCCAAACCGGAAG em5 GACTGCGTACGAATTAAC me6 TGAGTCCAAACCGGGAT em6 GACTGCGTACGAATTGCA me7 TGAGTCCAAACCGGTGC em7 GACTGCGTACGAATTTAG me8 GTACATAGAACCGGAGT em8 GACTGCGTACGAATTATT me9 AGCGAGCAAGCCGGTGG em9 GACTGCGTACGAATTATG me10 TGGGGACAACCCGGCTT em10 GACTGCGTACGAATTCTG me11 TTCAGGGTGGCCGGATG em11 AGGCGGTTGTCAATTGAC me12 GACCAGTAAACCGGATG em12 TGTGGTCCGCAAATTTAG -
以35个红花玉兰品种的基因组DNA为模板，用筛选出的11对SRAP引物共扩增出条带数156条，单对引物扩增7 ~ 18条，平均每对引物扩增14.2条。引物对me1-em1、me4-em5和me11-em7扩增的条带数最多，均为18条；而me9-em9扩增的条带数最少，仅有9条。基于11对SRAP引物分析结果显示，平均Shannon’s指数为0.375 9，变异区间在0.287 2 ~ 0.455 3；平均期望杂合度为0.240 4，范围在0.180 2 ~ 0.311 6之间；各引物间的多态性位点百分比平均数为0.815 6，变异范围是0.657 1 ~ 1.000 0（表7）。
表 7 基于SRAP标记的红花玉兰品种遗传多样性分析
Table 7. Genetic diversity of M. wufengensis cultivars analyzed by SRAP
引物
Primer样本量
Number of samples期望杂合度
Expected heterozygosity信息指数
Shannon index多态性位点百分比
Percentage of polymorphic locime1-em1 35 0.223 5 0.366 9 0.885 7 me3-em1 35 0.284 2 0.448 2 1.000 0 me4-em5 35 0.274 2 0.424 4 0.885 7 me5-em1 35 0.207 8 0.319 3 0.657 1 me5-em5 35 0.265 5 0.411 2 0.828 6 me5-em6 35 0.311 6 0.456 2 0.800 0 me8-em5 35 0.198 0 0.308 1 0.685 7 me9-em7 35 0.219 5 0.353 7 0.857 1 me9-em9 35 0.296 4 0.455 3 0.885 7 me10-em10 35 0.180 2 0.287 2 0.685 7 me11-em7 35 0.183 1 0.304 4 0.800 0 均值 Mean 35 0.240 4 0.375 9 0.815 6 -
将11对SRAP引物扩增出的156条谱带建立（0,1）矩阵，利用NTSYS-pc2.10软件中Similarity程序的Dice系数计算35个红花玉兰品种间的遗传相似系数。结果显示不同品种红花玉兰的遗传相似系数区间为0.188 2 ~ 0.844 8，平均相似系数为0.482 2，变幅为0.656 6。其中，LZP2和LZP4遗传相似系数最大（0.844 8），表明这两个品种之间的亲缘关系最近；HHYL5和JY遗传相似系数最小（0.188 2），表明HHYL5和JY之间存在较远的亲缘关系。用UPGMA对35个红花玉兰品种间的遗传相似系数进行聚类分析。如图3所示，当遗传相似系数为0.40时，35个红花玉兰品种聚类成两大类群。第一类群只包含2个品种：HHYL9、JL；其余的33个品种聚类于第二大类群。在相似系数约为0.49时，第二大类群又可以进一步地细分成6个亚类群。从聚类图的总体结果来看，在地理位置上相同的品种依然是几乎归聚为一类。再次表明红花玉兰的遗传多样性具有地理区域特性，不同区域之间存在差异。
图 3 35个红花玉兰品种的聚类分析树状图
Figure 3. Cluster analysis tree diagram of 35 M. wufengensis cultivars
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11对引物多态性位点共形成250个带型数，平均每对引物22.7个带型。同上分析，结果如表8所示，引物me1-em1的带型接近均匀分布，而引物me9-em9的带型稍微偏分布。11对引物的平均分辨能力（D）为0.93，不同引物之间的分辨能力差异较大。其中引物me1-em1的分辨能力最强，D为0.98，DL为0.96，有效带型数为23，无法区分的样品对数为9，无法区分的品种为：HHYL7、JH1、JH2、YTYT；HHYL12、16B；LZP18、WT；JY、CYH。引物me9-em9的D值最小，仅为0.82，DL为0.8，有效带型数为4.92。
表 8 SRAP引物对鉴别能力
Table 8. Discriminating power of SRAP primer pairs
引物对
Primer pair带型数
Number of banding patternX2 D DL 有效带型数
Number of effective banding patternX me1-em1 29 8.91 0.984 9 0.956 7 23.113 2 9 me10-em10 17 51.94 0.879 0 0.853 9 6.843 6 72 me11-em7 26 26.66 0.959 7 0.932 2 14.759 0 24 me3-em1 23 15.60 0.964 7 0.937 1 15.909 1 21 me4-em5 28 9.00 0.983 2 0.955 1 22.272 7 10 me5-em1 22 72.49 0.885 7 0.860 4 7.163 7 68 me5-em5 19 31.77 0.926 1 0.899 6 9.959 3 44 me5-em6 25 25.71 0.958 0 0.930 6 14.411 8 25 me8-em5 24 65.80 0.905 9 0.880 0 8.333 3 56 me9-em7 25 14.29 0.971 4 0.943 7 17.753 6 17 me9-em9 12 50.37 0.820 2 0.796 7 4.919 7 107 均值 Mean 22.72 33.87 0.930 8 0.904 2 13.221 7 41 -
由于所有的单对SRAP引物都无法将35个红花玉兰品种完全区分，因此需要考虑多个引物对组合。SRAP引物对组合优化结果显示（表9），2对引物组合就能完全区分所有红花玉兰品种，共有11对引物组合，D都为1，均能完全区分所有35个红花玉兰品种，多态性条带数为26 ~ 36。
表 9 SRAP标记引物对组合优化
Table 9. Majorization of SRAP primer pair combination
序号
No.引物组合
Primer pair combination多态性条带数
Number of polymorphic bandD DL 无法区分的样品对数
Indistinguishable cultivar pair1 me1-em1 + me10-em10 30 1 0.971 4 0 2 me1-em1 + me3-em1 30 1 0.971 4 0 3 me1-em1 + me9-em7 33 1 0.971 4 0 4 me1-em1 + me9-em9 35 1 0.971 4 0 5 me10-em10 + me11-em7 30 1 0.971 4 0 6 me10-em10 + me5-em6 27 1 0.971 4 0 7 me10-em10 + me9-em7 27 1 0.971 4 0 8 me11-em7 + me4-em5 36 1 0.971 4 0 9 me3-em1 + me8-em5 26 1 0.971 4 0 10 me4-em5 + me8-em5 32 1 0.971 4 0 11 me4-em5 + me9-em7 33 1 0.971 4 0 -
基于Mantel检验SSR和SRAP遗传相似系数矩阵来分析两种标记之间的相关性。如图4所示，SSR和SRAP标记的遗传相似系数矩阵之间的Mantel test相关性不显著（r = 0.141 3，P = 0.035）（图4A）；SRAP标记和综合数据（注：综合数据即SSR和SRAP两种标记统计的整体数据）矩阵之间的Mantel test有较大的相关性（r = 0.869 5，P = 0.002）（图4B）；SSR标记和综合数据处于中等水平即显著性不大，（r = 0.605 9，P = 0.002）（图4C）。由此可以说明SRAP标记相比较来说更适用于分析亲缘关系较近的红花玉兰品种间的遗传差异。
图 4 基于Mantel检验的SSR、SRAP数据和综合数据的相关性
Figure 4. Correlation of SSR, SRAP data and comprehensive data based on Mantel test
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分子标记技术的运用为研究物种的遗传多样性、系统分类和品种鉴定提供了有力的手段。利用多种分子标记技术分析不同植物种群或品种间的遗传差异和亲缘关系已有不少报道，如Solmaz等人利用SSR和SRAP分析土耳其西瓜（Citrullus lanatus）遗传多样性[21]，Yuan等人基于SSR和SRAP分析了73个禾本植物的遗传多样性[22]；Archak等人[23]基于ISSR与RAPD分子标记分析了不同腰果（Anacardium occidentalie）种群遗传多样性。本研究中选择共显性标记SSR和显性标记SRAP两种分子标记对红花玉兰栽培品种的遗传多样性和遗传分化程度进行评估，筛选出能将现有红花玉兰新品种完全区分开的SSR和SRAP引物对组合，实现了对红花玉兰新品种的简便、快速、准确地鉴定。随着红花玉兰遗传基础研究的不断深入，以及转录组数据的不断公布，为红花玉兰新品种的选育、分子鉴定和品种数据库的建立提供了更加有利的条件。两种分子标记的方法均呈现较高的多态性，这一结果与通过ISSR和AFLP标记分析野生红花玉兰物种遗传多样性以及通过SSR和SRAP标记鉴定5个红花玉兰栽培品种的遗传多样性结果相一致[2-4]。红花玉兰各品种间的遗传相似系数平均值为0.4，表明其遗传差异较大。对各栽培种进行聚类分析显示，有些来自相同区域的红花玉兰品种聚在不同的分支上，推测可能是相同区域的红花玉兰母株有较大的遗传差异。毛秀红等人采用SSR分子标记对49份刺槐（Robinia pseudoacacia）无性系进行遗传多样性分析发现来自相同区域的刺槐之间遗传差异较大[24]。因分子标记针对基因组序列不同区域进行扩增，它们分别扩增基因组不同部位的重复序列，故两种标记聚类结果存在一些差异。此外，两种标记之间呈现不显著相关，推测也可能是由于不同分子标记方法之间的遗传相似系数和相关性的大小取决于不同分子标记所揭示品种的基因组多态性的高低[25]。基于SSR和SRAP标记对73个禾本植物遗传多样性进行分析，发现野生材料中的地理起源和分子标记之间呈现不显著相关[22]。在腰果的ISSR与RAPD分子标记的研究中也呈现无显著线性关系[23]。这些结果将为红花玉兰新品种的选育、分子鉴定和品种数据库的建立提供重要参考。
红花玉兰作为一种地方性树种，其种内期望杂合度（He）较高，SSR为0.25，SRAP为0.25，这表明红花玉兰种内存在相对较高的遗传变异水平。与同属厚朴（Magnolia officinalis）的遗传多样性（多态性位点百分比（P）：49.8%；He：0.194；有效等位基因数（Ne）：1.33）和中国特有的其他9种濒临灭绝植物种群的遗传多样性（P：12.30% ~ 87.01%；He：0.03 ~ 0.32；Ne：1.032 ~ 1.401）水平相比，均体现红花玉兰群体内具有更高的遗传多样性[26-27]，同时也明显高于其近源种武当木兰（Magnolia sprengeri）的种群遗传多样性（He = 0.128；香农指数I = 0.198）[28]。据报道，种群内不同授粉系统（自花传粉，混合交配和异交）的平均He分别为0.12、0.18和0.25[29]。红花玉兰具有较高的种内期望杂合度意味着其授粉系统可能是异交授粉类型。在红花玉兰亲缘关系较近的物种中，如厚朴和长蕊木兰（Alcimandra cathcartii），以及重要经济物种罗汉果（Siraitia grosvenorii）中，同样表现出栽培种内的遗传多样性水平要低于野生型的遗传多样性水平[30-33]。本研究开发了针对35个现有红花玉兰新品种的SSR和SRAP分子标记鉴定技术，筛出了18对SSR引物和11对SRAP引物组合，经筛选优化后的SSR和SRAP引物组合均能将现有红花玉兰新品种完全区分开，在分子水平上实现了对红花玉兰新品种的简便、快速、准确地鉴定。该方法不仅完成了对现有红花玉兰品种的分子鉴定，或许也能满足不断选育的红花玉兰新品种的分子鉴定要求，同时该研究为红花玉兰的保护和新品种的选育提供了重要的参考。
Genetic relationship analysis and molecular identification of Magnolia wufengensis cultivars based on SSR and SRAP markers
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摘要:
目的为了解析红花玉兰各品种间的遗传多样性和遗传差异等问题，本研究采用SSR和SRAP分子标记方法对红花玉兰不同品种的遗传多样性水平和遗传分化程度进行评估，以建立其分子标记体系。 方法以35个红花玉兰品种为实验材料，分别进行SSR和SRAP标记扩增，计算出SSR和SRAP分子标记的各遗传参数。利用NTSYS-pc2.1软件计算各品种间的遗传相似系数并用非加权法（UPGMA）进行聚类分析。通过R语言分析筛选出能够完全区分红花玉兰品种的引物对组合。 结果经筛选共获得18对具有多态性且条带清晰的SSR引物，分别以35个红花玉兰品种基因组DNA为模板，共扩增出DNA条带128条，每对引物扩增条带在2 ~ 15之间，平均每对引物扩增7.1条，平均带型数为10.6，平均有效带型数为5.4，平均分辨能力（D）为0.72；不同引物的多态性位点百分比变化范围很大，在0.142 9 ~ 1.000 0之间，均值为0.730 2；Shannon’s指数平均为0.304 2，范围是0.086 4 ~ 0.433 7；平均期望杂合度为0.248 8，范围是0.059 2 ~ 0.282 3。利用筛选获得的11对SRAP引物对35个红花玉兰品种进行鉴定，共扩增156条DNA条带，引物扩增条带数在7 ~ 18之间，平均每对引物扩增14.2条，平均带型数为22.7，平均有效带型数为13.2，平均分辨能力（D）为0.93；11对引物的多态性位点百分比平均数为0.815 6，变异范围是0.657 1 ~ 1.000 0；平均Shannon’s指数为0.375 9，变异区间在0.287 2 ~ 0.455 3；平均期望杂合度为0.240 4，范围在0.180 2 ~ 0.311 6之间。 结论红花玉兰具有较高的遗传多样性，经筛选和优化后的SSR和SRAP引物组合均能将现有红花玉兰品种完全区分开，实现了对红花玉兰品种的简便、快速、准确地鉴定，并为红花玉兰的保护和繁育，以及新品种的选育提供了重要的参考。 Abstract:ObjectiveGenetic diversity and genetic variation of Magnolia wufengensis cultivars were examined by simple sequence repeats (SSR) and sequence-related amplified polymorphism (SRAP) molecular markers for establishing its molecular marker system. MethodThirty-five simples of M.wufengensis cultivars were applied to PCR amplification for SSR and SRAP markers. The genetic similarity coefficient of each cultivar was calculated by NTSYS-pc2.1 and cluster analysis was carried out using UPGMA.The locus data of combination of primer pairs that can discriminate all cultivars were screened by R language. ResultA total of 18 pairs of SSR primers with polymorphism and clear bands were obtained. With the genome DNA of 35 M. wufengensis cultivars as the PCR template, a total of 128 polymorphic bands were generated. The number of polymorphic bands at each polymorphic primer ranged from 2 to 15, with mean band number of 7.1, mean pattern number of 10.6, mean effective pattern number of 5.4 and mean D of 0.72.The mean value of the percentage of polymorphic loci was 0.730 2, ranging from 0.142 9 ~ 1.000 0. The mean Shannon's index was 0.304 2, ranging from 0.086 4 to 0.433 7. The mean expected heterozygosity among cultivars was 0.248 8, ranging from 0.059 2 to 0.282 3.Eleven pairs of effective SRAP primers were acquired through screening. A total of 156 polymorphic bands were produced with the genome DNA of 35 M.wufengensis cultivars as the template. The number of polymorphic bands at each polymorphic primer ranged from 7 to 18, with mean band number of 14.2, mean pattern number of 22.7, mean effective pattern number of 13.2 and mean D of 0.93. The mean value of the percentage of polymorphic loci was 0.815 6, ranging from 0.657 1 ~ 1.000 0. The mean Shannon’s index was 0.375 9, ranging from 0.287 2 to 0.455 3. The mean expected heterozygosity among cultivars was 0.240 4, ranging from 0.180 2 to 0.311 6. ConclusionM. wufengensis has relatively high genetic diversity. The analysis of molecular variation of both SSR and SRAP marker systems indicates that most genetic diversity is within M. wufengensis cultivars. The locus data of combination of primer pairs can discriminate all cultivars for identifying M. wufengensis cultivars efficiently and accurately.These results provide important references for the protection and breeding of M. wufengensis. -
图 1 红花玉兰品种的地理位置
Figure 1. Geographic distribution of the analyzed M. wufengensis samples from Wufeng
图 2 35个红花玉兰品种的聚类分析树状图
Figure 2. Cluster analysis tree diagram of 35 M. wufengensis cultivars
图 3 35个红花玉兰品种的聚类分析树状图
Figure 3. Cluster analysis tree diagram of 35 M. wufengensis cultivars
图 4 基于Mantel检验的SSR、SRAP数据和综合数据的相关性
Figure 4. Correlation of SSR, SRAP data and comprehensive data based on Mantel test
表 1 35个红花玉兰品种采样信息表
Table 1. Details of sampling of the M. wufengensis investigated in this study
序号 No. 品种代号 Cultivar code 品种名 Cultivar 来源 Origin 经度 Longitude 纬度 Latitude 海拔 Altitude/m 1 HHYL1 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 2 HHYL2 娇月 Jiaoyue 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 3 HHYL3 娇逸 Jiaoyi 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 4 HHYL4 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 5 HHYL5 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 6 HHYL6 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 7 HHYL7 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 8 HHYL8 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 9 HHYL9 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 10 HHYL10 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 11 HHYL11 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 12 HHYL12 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 13 HHYL13 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 14 HHYL14 ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 15 HHYL15 ~ 五峰牛庄 Niuzhuang, Wufeng 110°21′55″E 30°13′58″N 1 800 16 HHYL16 ~ 五峰独树坪 Dushuping, Wufeng 110°24′11″E 30°09′53″N 1 400 17 LZP1 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 18 LZP2 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 19 LZP4 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 20 LZP18 ~ 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 21 16B ~ 五峰独树坪 Dushuping, Wufeng 110°24′11″E 30°09′53″N 1 620 22 WT ~ 五峰湾潭 Wantan, Wufengan 110°25′50″E 30°02′53″N 1 400 23 JH1 娇红一号 Jiaohong1 五峰罗筐岩 Luokuangyan, Wufeng 110°24′09″E 30°05′35″N 1 470 24 JH2 娇红二号 Jiaohong2 五峰高峰 Gaofeng, Wufeng 110°44′53″E 30°15′27″N 1 800 25 JY 娇玉 Jiaoyu 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 26 JL 娇莲 Jiaolian 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″ E 30°06′12″N 1 690 27 JD 娇丹 Jiaodan 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 28 CYH ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 29 JZX ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 30 LKY2 娇婉 Jiaowan 五峰罗筐岩 Luokuangyan, Wufeng 110°24′09″E 30°09′35″N 1 470 31 DBH 娇韵 Jiaoyun 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 32 SLX 娇荷 Jiaohe 五峰栗子坪 Liziping, Wufeng 110°21′12″E 30°06′12″N 1 690 33 HH1 ~ 五峰后荒 Houhuang, Wufeng 110°38′58″E 30°17′43″N 1 800 34 DSP 娇阳 Jiaoyang 五峰独树坪 Dushuping, Wufeng 110°24′11″E 30°09′53″N 1 620 35 YTYT ~ 五峰黄粱坪 Huangliangping, Wufeng 110°37′47″E 30°07′20″N 1 400 注：~代表新品种申请中。Note: ~ represents new cultivar in application. 
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表 2 实验所用SSR引物信息
Table 2. Information of SSR primers used in the experiment
引物
Primer正向引物（5′—3′）
Forward sequence (5′−3′)反向引物（5′—3′）
Reverse sequence (5′−3′)重复单元
Repeat motif参考文献
ReferenceMC3 CCGCAGCAAACCCTACGC GCACACGCCAACAATGGAAAG (CT)16 [16] MC8 GAGTTCCGTGAGTCCCA CATAATAGAAGTCATAAATCCC (TC)15 [16] MC11 TCAACAGCACAAACCGAC AGAACAACAGAACCAGGG (CT)4(CT)3(CT)(CT)2 [16] MC35 TACATCTAAAGTCCCCACAT CTCATTTCCAGCCCATAC (CT)3(CT)4(CT)3 [16] MMA51 CGATGCAGCCTAAAAAGAGC CGATCATCTCTCCCGTCACT (GA)10 [17] SGA5 GAGATGAGTCACCGCCTGTT ATTCAGTTGCACGGCTCTCT (AG)15 [17] SGA15 CTGACGTAACCCGACCTGAT CCTGACTTGATCCCACCACT (GA)14 [17] Ksep11 GACGGGGTCCCTCCACTA TCACACCAACCAATCAGC (CT)10 [18] Ksep13 TAGATGTTGGACAGTTTGC CATTGATTTTGATTTGGTG (GA)11(G)2(GA)8 [18] L78 GAGTAAGAAATGAAGACGCTCG AGTAACAAGCCAATCAGGAGG (AG)13 [19] M10D6 CGACGACGAAACTACTAACA TTAAGTTGAGGTGGAATGAC (CT)11 [20] M17D3 AAAATTACCATAGAAGAACA TTAACAGAAACAAGCACTTA (CT)19 [20] LT078 ACTGGGCCGTTTATACTTTT TGACCTTTCCCTTATTCTCA (AACA)5 [4] LT083 ATTACGCAGCTTCCCTTAC GGAGTTCTGGTATGGTTGAG (ACAACC)4 [4] LT092 GGGGTTTTGCTTAATGTGA CATTCCCTACCTCCTTCTCT (GGAGCC)4 [4] LT115 CTCTCATTCCGACCTTCATA ACTTTTCCTGCAACTACTGC (TCA)9 [4] LT149 GTGAAGACCAAGGAAAATGA GGAAAAGAGAGGAGGAATGT (CTT)6 [4] LT164 AGCTGCCAAGACCTACAAC CCTCTTCAGGTTCCACATTA (CTT)7 [4]
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表 3 基于SSR标记的红花玉兰品种遗传多样性分析
Table 3. Genetic diversity of M. wufengensis cultivars analyzed by SSR
引物
Primer样本量
Number of samples期望杂合度
Expected heterozygosity信息指数
Shannon index多态性位点百分比
Percentage of polymorphic lociKesp11 35 0.171 4 0.278 3 0.657 1 Kesp13 35 0.279 5 0.433 7 0.914 3 L78 35 0.123 7 0.194 5 0.428 6 LT078 35 0.261 4 0.417 7 1.000 0 LT083 35 1.229 5 0.273 9 0.714 3 LT092 35 0.272 5 0.425 8 0.942 9 LT115 35 0.188 5 0.325 2 0.942 9 LT149 35 0.162 1 0.290 3 0.914 3 LT164 35 0.225 9 0.367 8 0.971 4 M10D6 35 0.059 2 0.086 4 0.142 9 M17D3 35 0.180 0 0.264 6 0.457 1 MC3 35 0.147 2 0.255 5 0.800 0 MC8 35 0.238 9 0.377 7 0.857 1 MC11 35 0.139 1 0.245 5 0.771 4 MC35 35 0.082 8 0.120 9 0.200 0 MMA51 35 0.282 3 0.431 6 0.857 1 SGA5 35 0.240 5 0.366 9 0.714 3 SGA15 35 0.193 6 0.319 1 0.857 1 均值 Mean 35 0.248 8 0.304 2 0.730 2
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表 4 SSR引物对鉴别能力
Table 4. Discriminating power of SSR primer pairs
引物对
Primer pair带型数
Number of banding patternX2 D DL 有效带型数
Number of effective banding patternX Kesp11 9 28.00 0.823 5 0.800 0 5.000 0 105 Kesp13 12 28.43 0.873 9 0.849 0 6.621 6 75 L78 7 56.00 0.647 1 0.628 6 2.692 3 210 LT078 19 44.80 0.905 9 0.880 0 8.333 3 56 LT083 6 55.69 0.584 9 0.568 2 2.315 7 247 LT092 16 54.14 0.865 5 0.840 8 6.282 1 80 LT115 5 79.71 0.354 6 0.344 5 1.525 5 384 LT149 5 94.57 0.267 2 0.259 6 1.350 6 436 LT164 13 58.97 0.816 8 0.793 5 4.841 9 109 M10D6 4 41.23 0.468 9 0.455 5 1.836 6 316 M17D3 5 8.29 0.774 8 0.752 7 4.042 9 134 MC11 4 28.89 0.559 7 0.543 7 2.191 4 262 MC3 20 22.71 0.944 5 0.917 6 12.128 7 33 MC35 3 16.69 0.522 7 0.507 8 2.031 5 284 MC8 15 41.71 0.879 0 0.853 9 6.843 6 72 MMA51 23 16.91 0.963 0 0.935 5 15.506 3 22 SGA15 8 18.26 0.833 6 0.809 8 5.257 5 99 SGA5 17 42.23 0.895 8 0.870 2 7.704 4 62 均值 Mean 10.61 40.96 0.721 1 0.700 6 5.361 4 166 注：D. 引物分辨能力；DL. 引物极限分辨能力；X. 单对无法区分的样品对数；X2，各引物带型的分布情况。表8同此。Notes: D, discriminating power of primer; DL, promer limitation of discriminating power; X, number of sample pairs can’t be distinguished by a single primer pair; X2 indicates the distribution of each primer belt type. The same as Tab.8.
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表 5 SSR引物对组合优化分析
Table 5. Majorization of SSR primer pair combination
序号
No.引物组合
Prime pair combination多态性条带数
Number of polymorphic bandsD DL 无法区分的样品对数
Indistinguishable cultivar pairs1 LT078 + MC3 + MMA51 35 1 0.971 4 0 2 LT078 + MC3 + MC8 34 1 0.971 4 0 3 LT164 + MC3 + MMA51 33 1 0.971 4 0 4 MC3 + SGA15 + SGA5 33 1 0.971 4 0 5 LT092 + MC3 + MMA51 32 1 0.971 4 0 6 LT092 + MC3 + MC8 31 1 0.971 4 0 7 LT092 + MC3 + SGA5 31 1 0.971 4 0 8 Kesp11 + LT092 + MC3 30 1 0.971 4 0 9 LT078 + MC8 + SGA15 30 1 0.971 4 0 10 MC3 + MC8 + MMA51 30 1 0.971 4 0 11 MC3 + MMA51 + SGA5 30 1 0.971 4 0
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表 6 实验所用SRAP引物信息
Table 6. Information of SRAP primers used in the experiment
引物 Primer 正向引物（5 ′—3′） Forward sequence (5′−3′) 引物 Primer 反向引物（5′—3′） Reverse sequence (5′−3′) me1 TGAGTCCAAACCGGATA em1 GACTGCGTACGAATTAAT me2 TGAGTCCAAACCGGAGC em2 GACTGCGTACGAATTTGC me3 TGAGTCCAAACCGGAAT em3 GACTGCGTACGAATTGAC me4 TGAGTCCAAACCGGACC em4 GACTGCGTACGAATTTGA me5 TGAGTCCAAACCGGAAG em5 GACTGCGTACGAATTAAC me6 TGAGTCCAAACCGGGAT em6 GACTGCGTACGAATTGCA me7 TGAGTCCAAACCGGTGC em7 GACTGCGTACGAATTTAG me8 GTACATAGAACCGGAGT em8 GACTGCGTACGAATTATT me9 AGCGAGCAAGCCGGTGG em9 GACTGCGTACGAATTATG me10 TGGGGACAACCCGGCTT em10 GACTGCGTACGAATTCTG me11 TTCAGGGTGGCCGGATG em11 AGGCGGTTGTCAATTGAC me12 GACCAGTAAACCGGATG em12 TGTGGTCCGCAAATTTAG
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表 7 基于SRAP标记的红花玉兰品种遗传多样性分析
Table 7. Genetic diversity of M. wufengensis cultivars analyzed by SRAP
引物
Primer样本量
Number of samples期望杂合度
Expected heterozygosity信息指数
Shannon index多态性位点百分比
Percentage of polymorphic locime1-em1 35 0.223 5 0.366 9 0.885 7 me3-em1 35 0.284 2 0.448 2 1.000 0 me4-em5 35 0.274 2 0.424 4 0.885 7 me5-em1 35 0.207 8 0.319 3 0.657 1 me5-em5 35 0.265 5 0.411 2 0.828 6 me5-em6 35 0.311 6 0.456 2 0.800 0 me8-em5 35 0.198 0 0.308 1 0.685 7 me9-em7 35 0.219 5 0.353 7 0.857 1 me9-em9 35 0.296 4 0.455 3 0.885 7 me10-em10 35 0.180 2 0.287 2 0.685 7 me11-em7 35 0.183 1 0.304 4 0.800 0 均值 Mean 35 0.240 4 0.375 9 0.815 6
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表 8 SRAP引物对鉴别能力
Table 8. Discriminating power of SRAP primer pairs
引物对
Primer pair带型数
Number of banding patternX2 D DL 有效带型数
Number of effective banding patternX me1-em1 29 8.91 0.984 9 0.956 7 23.113 2 9 me10-em10 17 51.94 0.879 0 0.853 9 6.843 6 72 me11-em7 26 26.66 0.959 7 0.932 2 14.759 0 24 me3-em1 23 15.60 0.964 7 0.937 1 15.909 1 21 me4-em5 28 9.00 0.983 2 0.955 1 22.272 7 10 me5-em1 22 72.49 0.885 7 0.860 4 7.163 7 68 me5-em5 19 31.77 0.926 1 0.899 6 9.959 3 44 me5-em6 25 25.71 0.958 0 0.930 6 14.411 8 25 me8-em5 24 65.80 0.905 9 0.880 0 8.333 3 56 me9-em7 25 14.29 0.971 4 0.943 7 17.753 6 17 me9-em9 12 50.37 0.820 2 0.796 7 4.919 7 107 均值 Mean 22.72 33.87 0.930 8 0.904 2 13.221 7 41
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表 9 SRAP标记引物对组合优化
Table 9. Majorization of SRAP primer pair combination
序号
No.引物组合
Primer pair combination多态性条带数
Number of polymorphic bandD DL 无法区分的样品对数
Indistinguishable cultivar pair1 me1-em1 + me10-em10 30 1 0.971 4 0 2 me1-em1 + me3-em1 30 1 0.971 4 0 3 me1-em1 + me9-em7 33 1 0.971 4 0 4 me1-em1 + me9-em9 35 1 0.971 4 0 5 me10-em10 + me11-em7 30 1 0.971 4 0 6 me10-em10 + me5-em6 27 1 0.971 4 0 7 me10-em10 + me9-em7 27 1 0.971 4 0 8 me11-em7 + me4-em5 36 1 0.971 4 0 9 me3-em1 + me8-em5 26 1 0.971 4 0 10 me4-em5 + me8-em5 32 1 0.971 4 0 11 me4-em5 + me9-em7 33 1 0.971 4 0
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