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AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

吴晓娟 鲁俊倩 常英英 钟姗辰 苏晓华 张冰玉

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AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

    作者简介: 吴晓娟。主要研究方向:林木遗传育种。Email:yy992@foxmail.com 地址:100091 北京市海淀区青龙桥街道中国林业科学研究院林业研究所.
    通讯作者: 张冰玉,博士,研究员。主要研究方向:林木遗传育种。Email:byzhang@caf.ac.cn 地址:同上

Genetic transformation of Populus alba × P. glandulosa ‘84K’ with AtDME1 and its chemical-inducible expression analysis

图(5)表(2)
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-25
  • 录用日期:  2019-03-22
  • 网络出版日期:  2020-05-30
  • 刊出日期:  2020-06-01

AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

    通讯作者: 张冰玉, byzhang@caf.ac.cn
    作者简介: 吴晓娟。主要研究方向:林木遗传育种。Email:yy992@foxmail.com 地址:100091 北京市海淀区青龙桥街道中国林业科学研究院林业研究所
  • 林木遗传育种国家重点实验室,国家林业与草原局林木培育重点实验室,中国林业科学研究院林业研究所,北京 100091

摘要: 目的DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记,在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要作用。本研究将拟南芥去甲基化基因AtDME1导‘84K’杨基因组中,通过化学诱导表达实验,研究AtDME1基因在转基因杨树中的诱导表达特性,为建立杨树甲基化诱导变异体系,进而实现杨树品种改良等奠定良好基础。方法以白杨派优良品种84K杨无菌苗叶片为受体材料,采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtDME1基因导入‘84K’杨;经过潮霉素筛选、常规PCR检测及DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理,处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h,采用qRT-PCR检测处理叶片中外源基因AtDME1的表达量变化。结果本研究中,潮霉素分化筛选共获得了抗性芽224个,经生根筛选获得6株抗性植株,经分子检测证实这6株抗性植株均为转AtDME1基因植株,扩繁后分别标号为转基因AD-1 ~ 6。qRT-PCR检测结果显示,化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时,目的基因AtDME1的表达量基本达到最大值,效果持续至12 h后逐渐减弱。结论化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtDME1基因的表达,为进一步研究DME1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础,也为杨树化学诱导表达特性的研究做好了铺垫。

English Abstract

  • DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记,能够在生物体内稳定遗传,对动植物基因组的完整性、发育和环境响应等具有重要的调节作用[1-3]。DNA胞嘧啶甲基化的最终水平主要受DNA甲基转移酶和去甲基化酶协同作用的动态调节[4]。植物中DNA主动去甲基化是依靠DNA糖基化酶(DNA glycosylase)的活性,通过碱基切除修复(base excision repair,BER)途径完成[5]。研究发现,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中有DEMETER(DME)[6]、REPRESSOR OF SILENCING 1(ROS1)[7]、DEMETER-LIKE 2(DML2)和DEMETER-LIKE 3(DML3)[6, 8]4种DNA糖基化酶同源物参与植物基因组中的去甲基化。其中,DME基因编码的转葡糖基酶(DEMETER)能通过切除5-甲基胞嘧啶(5mC)来催化DNA去甲基化,从而能够激活胚乳印迹基因的表达,对种子活力起到重要的作用[6, 8]。研究表明,拟南芥中若没有DME介导的DNA去甲基化,其种子将无法正常发育[9]。目前只在双子叶植物中发现有DME,其主要在雌配子体的中央细胞和助细胞中表达[10]。研究表明,将编码表观遗传因子的基因过度表达,可提供另一种鉴定表观遗传靶基因和创建新型表观等位基因的策略[11]。杨树(Populus spp.)作为第一个被转化的二倍体木本植物,转入其中的基因能够被高效且稳定地表达,被称为转基因植物的模型;对其进行DNA甲基化水平改变的转基因研究已经获得了多效性的表型变化[12]

    Zuo等[13]利用细菌阻遏物LexA的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)和VP16的反式激活结构域开发的基于人类ER调节区域的诱导系统,称为XVE系统。XVE系统是一种高效的严格依赖于动物17-β-雌二醇诱导的植物表达载体,是比较理想的操纵基因表达和研究基因功能的化学诱导表达系统[14],已经应用于植物基因功能研究的多方面。目前,XVE诱导系统能够有效控制目的基因在拟南芥[13, 15-17]、烟草(Nicotiana tabacum[14, 18-19]、长春花(Catharanthus roseus[20]、水稻(Oryza sativa[21-22]、柑橘(Citrus reticulata[23]等植物中的表达,并且在拟南芥中已经通过XVE系统的应用得到了一系列的突变体[24]。pER8-DME1载体是依据XVE系统构建,研究证明17-β-雌二醇能够有效调控烟草中外源基因的表达[19]

    本研究利用农杆菌介导法将拟南芥去甲基化基因AtDME1导入‘84K’杨(Populus alba × P. glandulosa ‘84K’)基因组中,利用17-β-雌二醇调控外源基因AtDME1的表达,研究其在杨树中的诱导表达特性,为进一步研究基因的表观调控机制提供了基础。

    • 植物材料为‘84K’杨无菌苗。农杆菌菌株GV3101、植物表达载体pER8-DME1均由本实验室保存。Premix TaqTM酶购自TaKaRa公司(日本),引物由上海生工有限公司合成,DNA测序由Invitrogen公司(上海)完成。

    • 采用电击转化法将植物表达载体pER8-DME1(图1)转入农杆菌GV3101,经PCR鉴定后保菌。挑取上述菌株的单菌落,接种于2 mL LB液体培养基(含有50 mg/L壮观霉素(spectinomycin)和17 mg/L利福平)中,28 ℃过夜振荡培养。取上述菌液2 mL接种于100 mL与上述相同的LB液体培养基中再次振荡培养至OD600值为0.6 ~ 0.8。

      图  1  植物表达载体pER8-DME1载体结构图

      Figure 1.  Structure of plant expression vector pER8-DME1

      取继代培养4周的‘84K’杨无菌苗顶部第3 ~ 5个叶片,切成1.5 cm × 1.5 cm大小的叶盘,垂直主脉切2 ~ 3刀。将处理好的叶片放入摇好的菌液中侵染12 ~ 15 min,将叶片置于无菌滤纸上吸净表面菌液,接种于共培养培养基(MS + 0.5 mg/L BA +0.05 mg/L NAA)上暗培养 3 d后,转至筛选培养基(MS + 0.5 mg/L BA + 0.05 mg/L NAA + 特美汀(timentin)200 mg/L + 潮霉素(hygromycin)3 mg/L)上,在光照条件下培养(温度为28 ℃,16 h/8 h光周期,光照度1 500 ~ 2 000 lax)。当分化的芽长到1 ~ 2 cm时,将其转入生根筛选培养基(1/2MS + 0.02 mg/L NAA + 0.05 mg/L IBA + timentin 200 mg/L + hygromycin 3 mg/L)中进行生根筛选。

    • 用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,北京)提取转基因植株及对照叶片基因组DNA。根据已知pER8-DME1载体特异序列设计扩增HPT基因的HP引物,以及同时扩增部分HPT基因和AtDME1基因的HD引物(表1),用ABI Veriti 96孔梯度PCR仪(ABI,美国)进行PCR检测,总的反应体系为20 μL:Premix TaqTM 10 μL,Primer-F(10 μmol/L)0.5 μL,Primer-R(10 μmol/L)0.5 μL,DNA模板5 μL,加ddH2O至终体积20 μL。PCR反应参数为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性10 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸1 min 20 s,共35个循环;72 ℃终延伸7 min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测后,用Axygen公司(美国)琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化HD引物的扩增片段,连接到克隆载体pMDTM19-T Vector Cloning Kit(TaKaRa,日本),转化E. coli DH5α(TIANGEN,北京),经过蓝白斑筛选,挑取阳性克隆进行DNA序列测定。用DNAMAN 9.0软件(http://www.opdown.com/soft/116500.html)将测序得到的基因序列与目的基因序列进行比对。

      表 1  常规PCR检测相关引物序列

      Table 1.  Primer sequences of PCR

      引物名称
      Primer name
      检测基因
      Detecting gene
      扩增产物长度
      Amplification product length/bp
      引物序列 Primer sequence
      HPHPT843F: 5′-TAAATAGCTGCGCCGATGGT-3′
      R: 5′-GGTTTCCACTATCGGCGAGT-3′
      HDHPT ~ AtDME11 102F: 5′-CTGTCGGGCGTACACAAATC-3′
      R: 5′-GTGCATGTGATCCCGCTAAG-3′
    • 随机取1个转基因株系及未转化的‘84K’杨对照无菌苗叶片(第3 ~ 5片叶子),切成1.0 cm × 1.0 cm大小的叶盘,垂直主脉切2 ~ 3个伤口,平铺于加有100 μmol/L 17-β-雌二醇的不定芽分化培养基上,每个平板约放10个叶盘(叶背面朝下、保证叶盘完全接触培养基),2次重复,野生型对照处理0、12 h,转基因株系处理0、3、6、12、24、48、96、144 h。处理后随机各取5个叶盘,液氮冷冻后保存于− 80 ℃冰箱,用于RNA提取。

    • 用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab,北京)分别提取经雌激素诱导处理不同时间转基因株系的叶片的总RNA,1 μg总RNA用于cDNA合成。首先去除残留DNA,反应体系如下:5 × gDNA Eraser Buffer 2.0 μL,gDNA Eraser 1.0 μL,Total RNA 1 μg,RNase Free H2O补足10 μL,42 ℃金属浴2 min。向上述离心管中加入体系RNase Free H2O 4 μL,5 × PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 μL,RT Primer Mix 1 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL,混匀后37 ℃下反应15 min,85 ℃ 5 s终止反应,− 20 ℃保存备用。将反转录产物cDNA稀释5倍作为反应模板,参照TaKaRa公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明配制反应体系,总反应体系为20 μL,其中TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)10 μL,Primer-F(10 μmol/L)0.8 μL,Primer-R(10 μmol/L)0.8 μL,cDNA模板2 μL,用去离子水补足至20 μL。用Roche Light Cycle 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche,瑞士)进行qRT-PCR反应,反应程序为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃延伸30 s,40个循环;95 ℃变性5 s,60 ℃延伸1 min,95 ℃;50 ℃降温30 s。引物见表2。以杨树Actin基因为内参基因,每个样品进行6次重复,用2− ΔΔCT算法进行分析[17]

      表 2  Real-time PCR反应相关引物序列

      Table 2.  Relative primer sequences of Real-time PCR reaction

      基因
      Gene
      扩增产物长度
      Amplification product length/bp
      引物序列
      Primer sequence
      Actin195F: 5′- AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG -3′
      R: 5′- GCATCATCACAATCACTCTCCGA -3′
      DME1163F: 5′- GGGATTCTGCAACACTGGTG -3′
      R: 5′- AGAAGTCACCTCACTCCTGC -3′
    • 经过共培养培养基抗性筛选,约10 d后叶盘切口处产生小的突起,随后开始产生不定芽,约30 d后抗性不定芽长至0.4 cm左右(图2A),经过多次筛选,抗性芽伸长至1 cm左右时切下并转移到生根筛选培养基中,约10 d后部分抗性芽开始生根(图2B)。总计转化叶盘数约900个,在分化初筛培养基上产生的抗性芽数约224个,经生根筛选,最终获得6株潮霉素抗性植株。

      图  2  抗性芽及抗性植株的获得

      Figure 2.  Hygromycin resistant buds and resistant plants of AtDME1 transgenic P. alba × P. glandulosa ‘84K’

    • 提取野生型植株和6株抗性植株叶片总DNA,以质粒为阳性对照,以野生型‘84K’杨为阴性对照,进行PCR检测。HP引物扩增结果显示,获得的6株潮霉素抗性植株的DNA均可扩增出843 bp的目的条带,与预期目的条带大小相符(图3);为区别导入的AtDME1基因与杨树基因组内原有的DME1基因,设计HD引物扩增从HPT基因下游的119 bp到DME1基因上游的295 bp的序列,包含两基因间688 bp的间隔。PCR结果显示,上述6株HP基因阳性均能扩出一条1 102 bp大小的条带,与预测目的条带大小相符(图4)。以上结果证明,诱导表达系统及目的基因已成功导入‘84K’杨基因组,外源基因的遗传转化效率为2.68%。这6株阳性植株扩繁后分别编号为转基因株系AD-1 ~ 6。

      图  3  转DME1基因抗性植株的潮霉素抗性基因PCR检测

      Figure 3.  PCR detection of HPT gene in AtDME1 transgenic P. alba × P. glandulosa ‘84K’ plants

      图  4  抗性植株DME1基因PCR检测

      Figure 4.  PCR detection of HPT and AtDME1 gene in AtDME1 transgenic P. alba × P. glandulosa ‘84K’ plants

      切取图3中目的条带,经过胶回收纯化后连入pMDTM19-T Vector载体,挑取白色克隆进行DNA测序。测序结果表明,PCR产物序列与质粒序列比对结果相似度为100%,其中潮霉素抗性基因的测序长度为119 bp,AtDME1基因的测序长度为106 bp。测序结果进一步证实,所获得的6株潮霉素抗性植株为转AtDME1植株。

    • 为了研究转基因杨树中,外源基因表达水平受17-β-雌二醇处理时间调控的变化趋势,我们分别提取用雌激素诱导处理不同时间的转基因株系AD-1#离体叶片总RNA,并利用qRT-PCR检测AtDME1基因的表达情况。结果显示,用100 μmol/L的17-β-雌二醇处理后,野生型植株处理12 h与处理前一样,都没有目的基因的表达;转基因植株未经诱导时目的基因没有表达,诱导3 h时目的基因的表达量已基本达到最大值,之后增加趋势平缓,24 h时开始下降(图5)。以上结果说明,雌激素能够有效诱导转基因杨树中XVE系统诱导启动子的启动,使下游基因表达,且处理3 h时外源基因就有较高的表达量,处理12 h时表达量最高,但随着处理时间的延长,诱导表达效果减弱。

      图  5  不同时间处理下转基因植株AtDME1诱导表达量

      Figure 5.  Expression level of AtDME1 in leaves of transgenic P. alba × P. glandulosa ‘84K’ induced by different time treatments of 17-β-estradiol

    • 本研究利用农杆菌介导法,将受17-β-雌二醇调控的化学诱导启动子及AtDME1基因导入‘84K’杨基因组中,并利用qRT-PCR技术检测AtDME1基因的表达量随17-β-雌二醇诱导时间变化的趋势。结果表明,处理3 h时外源基因已经有较高的表达量,处理12 h时表达量最高,之后逐渐降低。说明化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控AtDME1基因在杨树中的表达。

      Zuo等[13]研究显示,用2 μmol/L的17-β-雌二醇处理拟南芥幼苗,目的基因的表达量随着处理时间的增加而逐渐上升,在24 h时达到最高后逐渐下降;代丽娟等[14]研究显示,用2 μmol/L的17-β-雌二醇处理烟草幼苗,在48 h时目的基因表达量最高;常英英等[19]研究显示,用50 μmol/L的17-β-雌二醇涂抹烟草叶片诱导瞬时表达,在12 h时表达量最高。而本研究结果显示,目的基因的表达量在3 h时就达到较高水平,这可能是由于三方面的原因:一是诱导剂浓度不同,本研究依据前期实验结果[19],采用100 μmol/L的17-β-雌二醇对转基因杨树叶片进行处理,所用的雌激素浓度是上述研究的2 ~ 50倍,可能导致诱导启动子响应时间提前;二是处理方式不同,本研究对转基因植株的离体叶片进行诱导处理,而上述研究是将雌激素加入幼苗培养基中或进行叶片涂抹的瞬时表达;三是处理对象不同,本研究首次在杨树中采用化学诱导表达的方式,不同于拟南芥、烟草等草本植物,可能由于物种的差异导致响应时间的不同。另外,随着诱导时间的延长,目的基因的表达量逐渐降低,这可能与17-β-雌二醇的降解有关,Leech等[25]研究表明,当暴露于290 ~ 720 nm之间的模拟太阳光时,光降解17-β-雌二醇最高能达到26%。此外,本研究发现,XVE系统在杨树中对目的基因AtDME1的调控强度低于其在烟草中对目的基因的调控强度[19],其原因可能是由于其表达方式上的差异所导致的,在烟草中所采用的是瞬时表达的方式,而本实验中所采用的是稳定表达的方式[26]。此外,本研究通过遗传转化,获得了潮霉素抗性芽224个,经生根筛选及分子检测最后获得了6个转基因植株,遗传转化效率仅为2.68%,低于以往‘84K’杨的遗传转化效率7%[27]。因为前期实验已经确定了最佳的潮霉素分化选择压[28],假阳性较高不可能是由于分化培养基中潮霉素选择压偏低导致的。其原因主要是由于叶盘筛选培养时边缘上翘导致部分非抗性的再生芽的产生,以及转化过程中出现了嵌合体[29]

      本研究在前人研究的基础上将受17-β-雌二醇调控的XVE系统及AtDME1基因成功整合到白杨派优良品种‘84K’杨基因组中,且分子检测证明AtDME1基因能够在化学诱导剂的诱导下表达,并且随诱导时间的不同表达量差异明显。由于植物不具有类似的激素系统[30],植物生长环境下外源基因并不表达,不会影响植物的正常生长发育。通过人为17-β-雌二醇处理,能够严格控制外源基因AtDME1的表达,进而能够通过对转基因植株诱导前后基因组甲基化状况以及表型性状的对比,排除转基因过程中由于其他因素干扰所导致的突变[14],为进一步研究DME1基因在杨树基因组去甲基化调控方面的作用机制奠定基础。

    • 本研究在前期研究[21]的基础上,将含有AtDME1基因的化学诱导表达系统转化农杆菌感受态GV3101细胞,通过叶盘法侵染,用含潮霉素的培养基筛选获得阳性植株;再通过PCR检测及DNA测序,获得了受化学诱导系统调控的转DME1基因‘84K’杨植株6株。同时通过诱导表达实验证明了诱导启动子在杨树中的有效性,以及调控外源基因表达的最适雌激素处理时间是3 h,为进一步研究基因的表观调控机制提供了基础。

参考文献 (30)

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