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杉木体细胞胚胎发生胚性愈伤组织诱导条件的优化

吴夏雷 韩超 孙宇涵 曹森 胡瑞阳 徐金良 郑会全 李云

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杉木体细胞胚胎发生胚性愈伤组织诱导条件的优化

    作者简介: 吴夏雷。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:wuxialei1993@163.com。 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号.
    通讯作者: 李云,博士,教授。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:yunli@bjfu.edu.cn。 地址:同上
  • 中图分类号: S722.3

Optimization of induction conditions for embryogenic callus of somatic embryogenesis in Cunninghamia lanceolata

图(3)表(3)
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-26
  • 录用日期:  2019-08-29
  • 网络出版日期:  2019-12-02

杉木体细胞胚胎发生胚性愈伤组织诱导条件的优化

    通讯作者: 李云, yunli@bjfu.edu.cn
    作者简介: 吴夏雷。主要研究方向:经济林木良种繁育。Email:wuxialei1993@163.com。 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号
  • 1. 林木分子设计育种高精尖创新中心,树木花卉育种生物工程国家林业和草愿局重点实验室,林木育种国家工程实验室,北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083
  • 2. 中国林业科学研究院华北林业实验中心,北京 102300
  • 3. 浙江省开化县林场,浙江 开化 324300
  • 4. 广东省林业科学研究院,广东 广州 510520

摘要: 目的优化杉木体细胞胚胎发生过程中胚性愈伤组织的诱导条件,探究基本培养基、供体母株基因型和外源添加剂对杉木体胚诱导的影响。方法以3个供体母株基因型(Z1、Z2、Z3)的杉木雌配子体(其未成熟合子胚处于裂生多胚期)为外植体,采用6种基本培养基及不同浓度的外源添加剂塞苯隆(TDZ)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理,并对诱导培养过程中的愈伤组织进行细胞学观察。结果以DCR为基本培养基,诱导培养效果最好,愈伤组织诱导率达70.74%,胚性愈伤组织的诱导率达17.36%;供体母株基因型对胚性愈伤组织诱导有较大影响,Z1基因型供体母株的雌配子体最适合用于诱导产生胚性愈伤组织,诱导率为14.73%;诱导培养时以DCR为基本培养基,添加蔗糖30 g/L、活性炭1 g/L、倍力凝5 g/L并附加植物生长调节剂2,4-D 1.5 mg/L、KT 0.4 mg/L,MeJA 1.2 μmol/L和TDZ 0.004 mg/L,杉木胚性愈伤组织的诱导率最高,达19.83%;仅需4d就可诱导产生胚性愈伤组织,不同阶段原胚团的结构和极性特征有明显差异。结论基本培养基、供体母株基因型和外源添加剂都会明显影响杉木体胚诱导培养,以Z1供体母株基因型的杉木雌配子体为外植体、DCR为培养基并组合添加MeJA和TDZ可明显提高杉木体胚诱导率。

English Abstract

  • 杉木(Cuiminghamia lanceolata)是中国南方特有的常绿针叶树种,其木材特性优良,产量较高,已被种植了3 000多年[1],总种植面积达到9 106 hm2,占中国林地面积的30%[2],在经济和生活中都占有重要位置。

    植物体细胞胚胎发生是指外植体经诱导培养形成胚性愈伤组织,胚性愈伤组织再通过成熟培养形成体细胞胚,体细胞胚继续生长发育成完整植株的过程[3],体细胞胚的原胚团(Proembryogenic masses,PEM)主要分为PEM I、II和III 3个阶段[4]。针叶树种体细胞胚胎发生的影响因素相对更加复杂,不同针叶树种在体细胞胚胎发生能力和最适培养条件方面都有明显的差异。席梦利[5]和施季森[6]最早进行杉木体胚发生的研究,利用杉木成熟合子胚、子叶和下胚轴等成熟材料为外植体进行体胚诱导,诱导率较低,不能达到大规模繁殖杉木优良种苗的要求。Zhou等[7]利用液体培养研究了杉木未成熟的合子胚体细胞胚胎发生的体系,研究发现脱落酸(ABA)和聚乙二醇(PEG)能够相互影响,促进体胚的成熟,其中ABA主要促进体细胞团的生长,而PEG主要促进原胚结构的生长。Hu等[8]较系统地研究了合子胚发育时期、外源添加剂等对杉木体胚发生的影响,结果表明处于裂生多胚期的雌配子体是最适宜诱导杉木胚性愈伤组织的材料,诱导率为12.44%,诱导率较低,仍具有进一步提高的潜力。

    体胚诱导培养作为体胚发生的第一步在杉木体胚发生体系中具有重要地位,外植体和基本培养基的选择、供体母株基因型以及植物外源添加剂等都是影响体胚诱导的重要因素[9-10]。不同基本培养基之间自身的组分和浓度有较大差异,杉木体胚发生需要重点考虑基本培养基中还原态氮特别是NH4+和NO3-的含量[11],但现有的杉木体胚发生体系研究中少有系统研究不同基本培养基影响的报道。植物激素对体胚发生有着至关重要的作用,研究表明生长素和细胞分裂素是最为关键的植物生长调节剂[12-13],塞苯隆(TDZ)作为植物细胞分裂素与激动素(KT)有相似效果[14],茉莉酸甲酯(MeJA)是与植物损伤相关的激素和信号分子,在组织培养外源添加时可以激发植物防御基因的表达,促使植物产生与受到机械损伤或被昆虫取食时相似的化学防御效果[15],近几年MeJA作为新型植物生长调节剂被运用到植物体细胞胚胎发生研究中,但还没有试验用于杉木的体胚诱导研究中。为提高杉木胚性愈伤组织诱导率,本研究以杉木未成熟合子胚为材料,针对杉木体胚发生诱导培养方面开展研究,以配制固体培养基进行培养的方式筛选最佳基本培养基,添加不同浓度的外源TDZ和MeJA组合处理,并对诱导过程中的愈伤组织进行细胞学观察,旨在进一步优化和提高杉木胚性愈伤组织诱导率,为选择诱导培养时添加合适的外源添加剂提供依据。

    • 试验材料采集于2017年7月12日,浙江开化县林场(29°08′52″N,118°24′55″E)的杉木种子园。外植体材料的供体母株基因型为中山039号、中山042号、中山047号(分别命名为Z1、Z2、Z3),这3个基因型已经过试验证明诱导效果较好。每个基因型采集发育正常,无明显病虫害,大小基本一致的50个球果(球果中的未成熟合子胚经解剖后显微观察处于裂生多胚期),采集后立即放入装有冰袋的泡沫箱中并尽快带回实验室,在4 ℃温度下的冰箱中保存1 ~ 4周后用于试验。

    • 从4 ℃冰箱取出球果后于流水下冲洗3 h,晾干。用灭菌的镊子剥离出种子,再将剥取的种子浸入75%乙醇中灭菌2 min,无菌水清洗3次后转移到已进行紫外灭菌的超净工作台中,用稀释10倍的84消毒液浸泡15 ~ 20 min,无菌水清洗5次,再将种子浸入到0.1%的升汞溶液中灭菌10 min,无菌水清洗5次后,接种于诱导培养基。因处于裂生多胚期的合子胚小且脆弱,难以从雌配子体中完整剥离,故以雌配子体为外植体进行接种,再用灭菌后的剪刀平剪一伤口,将种子半埋于诱导培养基中培养。

    • 配制6种基本培养基(GD、SH、DCR、BM、LM、MS)[16-18],取供体母株Z1、Z2、Z3的雌配子体接种于诱导培养基上。基本培养基的筛选试验中,诱导培养以6种不同的培养基为基本培养基,附加相同的蔗糖30 g/L、活性炭1 g/L、倍力凝5 g/L和相同浓度的植物生长调节剂2,4-D 1.5 mg/L、KT 0.4 mg/L,配制培养基时需调整pH值为5.8,将灭完菌后的培养基于超净工作台中分装入直径为6 cm的一次性无菌培养皿,过夜凝固完全后使用。每种培养基在配制后分装入54个皿(3个系号各18个皿),每个皿接8个雌配子体。

    • 以筛选出的最适培养基为基本培养基,附加相同的蔗糖30 g/L、活性炭1 g/L、倍力凝5 g/L、2,4-D 1.5 mg/L、KT 0.4 mg/L,再附加10种不同浓度组合的外源添加剂TDZ和MeJA处理进行诱导培养。每种培养基在配置后分装入24个皿,每个皿接6个雌配子体。

      培养条件为(25 ± 1)℃下遮光暗培养,每14 d继代一次,每天进行观察,记录初次诱导出胚性愈伤组织的天数,利用体式显微镜(型号Leica M250A)和倒置显微镜(型号Leica DMI4000B)进行观察和拍照记录,30 d后统计胚性愈伤组织的诱导率,愈伤组织继代两次后,挑选其中白色或白色略黄、松软、具有粘性的胚性愈伤组织进行增殖培养。

      $ \begin{align} &{\text{愈伤组织诱导率}} =\\ & \frac{\text{产生愈伤组织的雌配子体个数}}{\text{接种存活雌配子体总数}} \times 100\% \end{align} $

      $\begin{align} &{\text{胚性愈伤组织诱导率}} =\\ & \frac{\text{产生胚性愈伤组织的雌配子体个数}}{\text{接种存活雌配子体总数}} \times 100\% \end{align} $

    • 对统计得到的数据用Excel 2013进行整理,并用软件SPSS 20对数据进行分析,包括数据平均值、方差分析和多重比较(P < 0.05)。

    • 基本培养基的选择对杉木的体胚诱导有重要影响(表1),胚性愈伤组织诱导率最高的为DCR培养基,诱导率达17.36%。综合比较6种培养基发现,DCR和BM培养基具有较好的诱导效果,DCR培养基的愈伤组织诱导率为70.74%,与BM培养基差异不显著,但DCR培养基的胚性愈伤组织诱导率显著高于BM培养基,说明DCR培养基是杉木体细胞胚胎发生诱导培养的最佳选择。除DCR培养基外,BM培养基的胚性愈伤组织诱导率显著高于其他4种培养基,诱导率为16.14%,说明BM培养基也较适合杉木的体胚诱导培养。MS和GD培养基在愈伤组织诱导方面差异不显著,但GD培养基的胚性愈伤组织诱导率为12.02%,显著高于MS培养基,这两种培养基的诱导效果在6种培养基中属中等水平。SH和LM培养基的诱导效果较差,SH培养基的胚性愈伤组织的诱导率为6.94%,LM培养基为6.09%,胚性愈伤组织诱导率均较低且差异不显著,说明SH和LM培养基都不适合用于杉木的体胚诱导培养。

      表 1  不同基本培养基下的杉木胚性愈伤组织诱导率

      Table 1.  Induction rate of embryogenic callus of Cuiminghamia lanceolata under different basic media

      培养基类型Medium type 接种数/个Number/piece 愈伤组织诱导率Callus induction rate /% 胚性愈伤组织诱导率Embryogenic callus induction rate /%
      MS 430 46.99 b 9.76 c
      DCR 428 70.74 a 17.36 a
      LM 432 29.79 c 6.09 d
      BM 430 72.72 a 16.14 ab
      SH 427 34.73 c 6.94 d
      GD 428 49.46 b 12.02 b
      注:同列不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。Note: different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P < 0.05).
    • 统计分析诱导培养效果较好的4种基本培养基下愈伤组织和胚性愈伤组织诱导率,结果表明供体母株基因型对杉木体胚诱导有一定影响(表2),其中Z1基因型供体母株的愈伤组织和胚性愈伤组织诱导率最高,分别为62.87%和14.73%,显著高于Z2和Z3供体母株基因型。Z2基因型的胚性愈伤组织诱导率为13.34%,Z3基因型为13.39%,经显著性检验,Z2和Z3基因型胚性愈伤组织诱导率差异不显著。由结果可知,这3个供体母株基因型都较适合用于杉木胚性愈伤组织诱导,但还是存在差异,其中Z1供体母株的体胚诱导能力最佳。

      表 2  不同供体母株基因型的胚性愈伤组织诱导率

      Table 2.  Induction rates of embryogenic callus of different maternal genotypes

      供体母株
      基因型
      Maternal genotype
      接种数/个Number /piece 愈伤组织诱导率Callus induction rate /% 胚性愈伤组织诱导率Embryogenic callus induction rate /%
      Z1 576 62.87 a 14.73 a
      Z2 570 57.43 c 13.34 b
      Z3 571 59.14 b 13.39 b
      注:同列不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。Note: different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P < 0.05).
    • 外源添加不同浓度的MeJA和TDZ组合可有效提高杉木愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导率(表3)。只添加MeJA而不添加TDZ情况下(培养基PM2、PM5、PM8),MeJA的添加浓度对杉木愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导率有较大影响,诱导率总体表现出随着MeJA浓度的升高而升高的趋势,3种MeJA浓度添加下杉木愈伤组织诱导率均差异显著,当MeJA浓度为1.2 μmol/L时愈伤组织诱导率比对照组高出12.49%。在胚性愈伤组织诱导方面,MeJA浓度为0.4 μmol/L时与对照组相同,而MeJA浓度为0.8 μmol/L和1.2 μmol/L时,胚性愈伤组织诱导率相同,均显著高于对照组。说明当只添加MeJA时,较高浓度的MeJA对杉木体胚诱导培养的效果更佳。

      表 3  MeJA和TDZ对杉木愈伤组织形成的影响

      Table 3.  Effects of MeJA and TDZ on callus formation of Cuiminghamia lanceolata

      培养基编号
      No.
      外源添加剂 Exogenous additive 首次产生天数
      First generation days / d
      愈伤组织诱导率
      Callus induction rate /%
      胚性愈伤组织诱导率
      Embryogenic callus induction rate /%
      茉莉酸甲酯 MeJA/(μmol·L− 1 塞苯隆TDZ/(mg·L− 1
      PM1 0 0 5 61.67 ± 1.03 d 12.33 ± 0.74 c
      PM2 0.4 0 6 63.33 ± 0.50 cd 12.33 ± 0.57 c
      PM3 0.4 0.002 5 64.17 ± 1.07 cd 13.17 ± 0.63 bc
      PM4 0.4 0.004 4 67.50 ± 0.82 bcd 16.50 ± 0.47 ab
      PM5 0.8 0 5 67.50 ± 0.67 bcd 13.17 ± 0.63 bc
      PM6 0.8 0.002 5 73.33 ± 0.63 ab 14.00 ± 0.47 b
      PM7 0.8 0.004 5 71.67 ± 0.68 abc 17.33 ± 0.92 ab
      PM8 1.2 0 5 74.16 ± 1.20 ab 13.17 ± 0.63 bc
      PM9 1.2 0.002 5 79.17 ± 0.83 a 14.83 ± 0.50 b
      PM10 1.2 0.004 4 75.83 ± 0.57 ab 19.83 ± 0.74 a
      注:同列不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。Note: different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P < 0.05).

      在添加MeJA浓度为0.4 μmol/L条件下(培养基PM2 ~ 4),有无添加TDZ对杉木愈伤组织的诱导率影响不显著,但对胚性愈伤组织的诱导影响显著,在TDZ浓度为0.002 mg/L和0.004 mg/L时,杉木胚性愈伤组织诱导率分别为13.17%和16.50%,显著高于不添加TDZ时的诱导率,说明在低浓度MeJA条件下,适当添加TDZ能促进杉木胚性愈伤组织诱导。

      而在添加MeJA浓度为0.8 μmol/L条件下(培养基PM5 ~ 7),添加TDZ的浓度对诱导率有较大影响,TDZ浓度为0.002 mg/L时,愈伤组织诱导率最高,达73.33%,当TDZ浓度为0.004 mg/L时,愈伤组织诱导率表现出下降趋势,而胚性愈伤组织的诱导率表现出随TDZ的浓度升高而升高,从13.17%升高到17.33%,3种TDZ浓度下差异显著。添加MeJA浓度1.2 μmol/L条件下(培养基PM8 ~ 10),TDZ浓度的影响与上述表现相似,当TDZ浓度为0.002 mg/L时,愈伤组织诱导率最高,达79.17%,当TDZ的浓度为0.004 mg/L时,杉木的胚性愈伤组织诱导率达到最高19.83%。说明在较高MeJA浓度下,添加TDZ浓度为0.002 mg/L适合杉木愈伤组织的诱导,而添加TDZ浓度为0.004 mg/L适合杉木胚性愈伤组织的诱导。

      对比培养基PM4、PM7、PM10可知,外源添加MeJA对杉木体细胞胚胎发生诱导有更显著的影响,在添加相同浓度的TDZ条件下,杉木愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导率随着MeJA浓度的升高而升高,说明外源添加剂MeJA的影响作用较大,但同时添加MeJA和TDZ组合的诱导培养效果更好,在较低浓度的TDZ条件下,可适当提高MeJA添加浓度以促进杉木的体胚诱导。

    • 诱导培养过程中,利用体式显微镜和倒置显微镜进行观察和记录,以编号PM10培养基处理下,培养4 d后就可诱导产生愈伤组织(图1a),此时雌配子体质地坚硬、体积膨大,诱导出的胚性愈伤组织体积较小,晶亮半透明。显微观察发现此时的胚性愈伤组织多为细长形细胞,彼此开始联结形成致密的细胞团,但数量不多,原胚团多数处于PEM I时期(图1b)。诱导培养到第28天时,胚性愈伤组织形成较大的组织块,质地粘连紧密且表面有突起结构(图2a)。显微观察发现此时的胚性愈伤组织中细长形细胞进一步伸长且联结增多,细胞质更加稠密,围绕着细胞团中心形成辐射状,具有明显极性特征,原胚团多数处于PEM II和PEM III时期。说明以DCR为基本培养基且以编号PM10的培养基处理能够有效诱导杉木雌配子体产生胚性愈伤组织且对原胚团的发育和极性保持都具有较好的作用。

      图  1  诱导4 d时雌配子体体式镜及显微镜观察

      Figure 1.  Stereoscopic and microscopic observation of female gametophyte at 4 d induction

      图  2  诱导28 d时雌配子体体式镜及显微镜观察

      Figure 2.  Stereoscopic and microscopic observation of female gametophyte at 28 d induction

      而以LM为基本培养基,诱导培养到28 d时,得到的多为具有湿润、水状特点的非胚性愈伤组织,形状无规则且表面无突起结构(图3a)。显微观察发现非胚性愈伤组织的细胞排列杂乱无序,大小不一,细胞主要呈椭圆形或圆形,空泡化的细胞较多(图3b)。将得到的少量胚性愈伤组织继续培养,会从组织中间出现褐化现象,中心的组织质地变稀,但边上的组织还保持着半透明乳白色,仍具有突起的结构(图3c),显微观察发现原本具有明显极性的细胞团变得松散,细长形细胞数量和彼此间联结减少,仅有少数原胚团处于PEM II时期,胚性减弱(图3d)。将这种愈伤组织继续培养到第35天时,愈伤组织可继续增殖,但已整体变成黄褐色,质地稀疏易碎(图3e)。显微观察发现多为密集的细胞质聚集物团块,呈折叠状粘附在一起,基本不含细长状细胞,细胞聚集物无极性结构,失去胚性特征(图3f)。说明在杉木体细胞胚胎发生诱导时会产生胚性和非胚性两种结构差异明显的愈伤组织,且诱导过程中会出现褐化现象使胚性愈伤组织转变为非胚性或直接坏死,LM培养基不适宜作为杉木体胚诱导培养的基本培养基。

      图  3  LM培养基下杉木雌配子体的体胚诱导培养

      Figure 3.  Somatic embryo induction culture of female gametophyte of Cuiminghamia lanceolata under LM medium

    • 杉木体细胞胚胎发生诱导培养时,选取处于裂生多胚期的未成熟合子胚雌配子体为外植体,以DCR为基本培养基,同时添加蔗糖30 g/L、活性炭1 g/L、倍力凝5 g/L,并附加植物生长调节剂2,4-D 1.5 mg/L、KT 0.4 mg/L,MeJA 1.2 μmol/L和TDZ 0.004 mg/L,杉木胚性愈伤组织诱导率最高,可达19.83%,高于陈琴等的研究结果[19-20],在诱导培养的第4 d即可诱导得到胚性愈伤组织。

      不同种类的基本培养基对杉木体胚诱导有较大影响,其中以DCR为基本培养基时胚性愈伤组织诱导率最高,为17.36%,除DCR培养基外,BM培养基的胚性愈伤组织诱导率也较高,为16.14%,有研究发现胚性愈伤组织的诱导主要与培养基中的大量元素氮的含量有关[21-22],本试验中DCR和BM培养基的组分中含氮量均较低,说明杉木的体胚诱导培养需低含氮量的培养基。

      胡瑞阳等[8]研究发现杉木体胚发生能力主要受母本影响,父本的影响不显著。本试验结果显示Z1基因型供体母株(中山039)的胚性愈伤组织诱导率最高,为14.73%,显著高于其他个基因型的供体母株,与前人研究结果相符。由于3个供体母株基因型均为经过试验已知其效果较好(分别为13.72%、12.67%和12.33%),且直接利用胡瑞阳等[8]研究结论取未成熟合子胚处于裂生多胚期的杉木雌配子体为外植体,因此试验结果显示3个基因型供体母株的胚性愈伤组织诱导率均较高,达到13%以上,可用于今后的取材选择。

      外源添加MeJA和TDZ组合,可提高愈伤组织和胚性愈伤组织的诱导率,其中MeJA的浓度对诱导效果影响更大,总体表现出随着MeJA浓度的升高而升高的趋势,在施季森等[23]对体胚诱导的研究中发现MeJA浓度超过一定值后,体胚诱导率呈现下降趋势,畸形胚发生率也逐渐升高,本研究中外源添加的MeJA浓度较低,最高添加浓度仅为1.2 μmol/L,因此诱导率随MeJA浓度升高的变化规律有所不同,在今后的试验中,可以进一步优化MeJA浓度梯度,找到最适MeJA添加浓度。

      胚性愈伤组织是杉木体胚发生的必要阶段,杉木的原胚团发育经历了PEM I、PEM II和PEM III3个阶段,3个阶段的原胚团比例是体细胞胚胎发生潜力大小的关键。研究显示刚诱导出的胚性愈伤组织,原胚团多数处于PEM I时期,随着诱导培养时间延长,原胚团逐渐发育到PEM II和PEM III阶段,极性结构明显且数量多。在诱导效果较差的LM培养基上,可以观察到差异明显的胚性和非胚性愈伤组织,同时研究中还出现了胚性愈伤组织褐化现象,可能与培养基组分、合子胚活力和吸附剂含量有关,可进一步对褐化和胚性愈伤组织的胚性保持等方面开展研究。

参考文献 (23)

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