Improvement of insulin resistant HepG2 cells glycometabolism effect by polyphenol from the fruit of Viburnum sargentii
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摘要:目的探讨鸡树条荚蒾果多酚对HepG2细胞胰岛素抵抗（IR）模型的改善作用，以评价其降血糖活性。方法本研究采用高浓度胰岛素诱导，建立体外IR模型，并进行模型稳定性（细胞活性法）及可靠性（Z因子法）评估。试验设空白组、IR模型组、阳性对照（二甲双胍）组和荚蒾果多酚组，MTT法检测细胞活性；葡萄糖氧化酶法检测培养液葡萄糖含量，计算葡萄糖消 耗量；蒽酮法测定糖原含量；比色法检测细胞己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）活性，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）、葡萄糖六磷酸酶（G6PC）活性。结果10− 6 mol/L的胰岛素诱导处理HepG2细胞24 h是产生胰岛素抵抗模型的最适条件，且IR模型在12 ~ 36 h内有较高的稳定性和可靠性。0.10 ~ 1.00 mg/mL 荚蒾果多酚组的葡萄糖消耗量显著高于模型组（P < 0.05），24 h、0.50 mg/mL组的糖消耗量最高，为（3.49 ± 0.11）mmol/L，消耗率可达88.81%（P < 0.01）。与模型组对比，荚蒾果多酚可提高糖原的含量33.65%（P < 0.01），HK、PK活性可分别提高43.36%（P < 0.05）、48.41%（P < 0.01），对G6PC、PEPCK活性抑制率为分别为22.86%（P < 0.01）、17.33%（P < 0.05）。结论鸡树条荚蒾果多酚可提高IR- HepG2细胞的HK、PK活性，加快糖酵解，增加糖原含量；抑制G6PC、PEPCK活性，从而减少细胞内源性葡萄糖的产生。所以鸡树条荚蒾果多酚对胰岛素抵抗细胞的治疗具有一定效果。Abstract:ObjectiveThis study investigated the improvement of the polyphenol from the fruit of Viburnum sargentii (PVSK) on insulin resistance (IR) model of HepG2 cells, and to evaluate its hypoglycemic activity.MethodHigh concentration insulin was used to induce in vitro IR model, and the stability (cell activity method) and reliability (Z factor method) of the model were evaluated. Blank group, IR model group, positive control group (metformin) and PVSK group were set up. Cell viability was detected by MTT assay, glucose content in culture medium was detected by Glucose oxidase method and the consumption of glucose was clculated; glycogen content was determined by anthrone method; the activity of hexokinase (HK) and pyruvate kinase (PK) were determined by colorimetric method. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the activity of phosphoenolpyruvate kinase (PEPCK) and glucose hexaphosphatase (G6PC).ResultInsulin induction treatment of HepG2 cells at 10− 6 mol/L for 24 hours was the best condition for the production of insulin resistance model, and the IR model had high stability and reliability within 12 ~ 36 hours. 0.10 ~ 1.00 mg/mL PVSK polyphenol group had significantly higher glucose consumption than model group (P < 0.05). The highest glucose consumption was (3.49 ± 0.11) mmol/L in 24 h and 0.50 mg/mL groups, with a consumption rate of 88.81% (P < 0.01). Comparedwith model group, PVSK polyphenols could increase glycogen content by 33.65% (P < 0.01), HK and PK activity by 43.36% (P < 0.05) and 48.41% (P < 0.01), respectively. The inhibition rates of G6PC and PEPCK activity were 22.86% (P < 0.01) and 17.33% (P < 0.05), respectively.ConclusionPVSK could increase HK and PK activities of IR-HepG2 cells, accelerate glycolysis and increase glycogen content. Inhibiting the activity of G6PC and PEPCK can reduce the production of endogenous glucose. Therefore, the polyphenols of PVSK have a certain effect on the treatment of insulin resistance cells.
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鸡树条荚蒾（Viburnum sargentii）为忍冬科（Caprifoliaceae）荚蒾属（Viburnum）落叶灌木，天然资源颇为丰富，主要分布于我国东北、西北、华北地区，朝鲜、日本、欧洲等地也有分布[1-2]。其味甘、苦；性平；入肝、肾、肺、脾四经。果实中含绿原酸、儿茶素等多酚及黄酮化合物、多糖类等活性成分，且含量均高于叶和茎；含16种氨基酸，其中6种为人体必需氨基酸，占总量的24.81%；Fe、Cu、Zn、Mn等多种微量元素；此外还有VB1、VB2、VC [3]。其枝、叶、果实均可入药，具有痛经活络、活血消肿、化痰止咳之功效[4]。有文献研究表明其具有抗氧化[5]、抗炎[6-7]、抑菌[8]、止咳[9]，抗肿瘤[10]，降血糖[11]等功效；课题组前期已有研究得出鸡树条荚蒾果实的醇提物对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶有显著抑制作用[12]。
胰岛素抵抗（IR）是指胰岛素分泌量在正常水平时刺激靶细胞摄取利用葡萄糖的生理效应显著减弱，或者是靶细胞维持摄取利用葡萄糖的正常生理效应需要超常量的胰岛素，主要特征为糖代谢紊乱[13]。长期患病易引起白内障、贫血、中风及心血管病等并发症，降低生命质量，改善胰岛素抵抗可以降低此类风险的发生[14-15]糖代谢途径上有诸多关键限速酶，如：己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、葡萄糖六磷酸酶（G6PC）、磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK），酶活性的变化直接影响血液中葡萄糖含量；糖原是体内糖的储存形式，加快糖原合成可使血液中的葡萄糖以糖原形式储存在肝脏内[16-17]。调控糖代谢中的关键物质如：葡萄糖、糖原以及糖代谢途径中关键限速酶，可有效改善胰岛素抵抗，降低高血糖的发病率[18-19]。肝脏对葡萄糖摄取、储存及代谢中扮演关键角色，是胰岛素抵抗的重要靶器官；HepG2细胞源于人肝胚胎瘤细胞，是分化较好的人肝癌细胞，仍有肝细胞形态和功能，是较为常用的糖尿病药物筛选模型[20-21]。
目前国内关于鸡树条荚蒾的研究以园艺、观赏类为主[22]，对于其活性成分及功能性质的研究相对较少。本文以国内外研究为背景，选择IR的重要靶器官细胞作为探查工具，考察鸡树条荚蒾果多酚（PVSK）对细胞中葡萄糖消耗量、糖原含量以及糖代谢中主要酶活的影响，以表征其改善胰岛素抵抗的功能，为鸡树条荚蒾资源的高值化的利用及进一步加工提供参考，对拓展糖尿病预防药物的新材料具有探索意义。
1. 材料与方法
1.1 原 料
本试验所采用的原料鸡树条荚蒾果实由黑龙江萝北林业局林场提供。鸡树条荚蒾果多酚由实验室提取纯化，参考文献[23]，将提取物采用D101大孔树脂两次纯化，再进行冷冻干燥，得鸡树条条荚蒾果多酚，并以福林酚法测定提取物中多酚纯度为（69.43 ± 1.97）%。本试验所采用的细胞人肝癌细胞系（HepG2）由中科院上海细胞库提供。
1.2 细胞培养
将冻存的HepG2细胞在37 ℃水浴下迅速解冻，用培养基溶解，离心，弃去上清液，再用含10%胎牛血清的DMEM培养基（含双抗）转入培养瓶中，在37 ℃，5% 的CO2培养箱中培养，待细胞贴壁长满后，用胰酶消化，每3 d按1∶2比例传代，取对数生长期的细胞用于实验[24]。
1.3 细胞活力测定
选取对数生长期的细胞经胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，每孔按照3 × 104个细胞接种于96孔细胞板内。待细胞完全贴壁后，实验组每孔加入100 μL，浓度分别为2.50、2.00、1.50、1.00、0.50、0.10、0.05、0.01 mg/mL（分别编号为1 ~ 8）含药的培养液，每组复5孔，于37 ℃培养24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，使结晶充分溶解，采用酶标仪（EPOCH12，BioTek Instruments，Inc.，美国）于490 nm 处测定吸光值，以吸光值反映细胞活性。
1.4 胰岛素抵抗模型的建立
1.4.1 胰岛素浓度及作用时间的确定
将HepG2细胞制成单细胞悬液，以每孔3 × 104个细胞接种于96孔板，于37 ℃、5% CO2条件下培养细胞12 h待细胞贴壁，加入新鲜配制的胰岛素浓度分别为1 × 10− 4、1 × 10− 5、1 × 10− 6、1 × 10− 7、1 × 10− 8、1 × 10− 9、1 × 10− 10 mol/L，添加量均为100 μL，分别培养12、24、36、48 h，每组5个复孔，依据葡萄糖测定试剂盒的说明测定细胞上清液中葡萄糖的含量，并设置空白对照组计算葡萄糖消耗量。
Δm=n−m (1) M=(n−m)n×100% (2) 式中：
Δm为葡萄糖消耗量，mmol/L；M为葡萄糖消耗率，%；n为空白对照组葡萄糖含量，mmol/L；m为样品组葡萄糖含量，mmol/L。 1.4.2 IR-HepG2细胞模型可靠性评估
确定建立胰岛素抵抗模型的最佳方案后，采用0.05 mg/mL的二甲双胍分别处理IR-HepG2细胞12、24、36、48 h，测定不同时间的糖消耗量，进行Z因子分析。二甲双胍处理组为阳性组，未处理的IR-HepG2细胞为阴性组。评价细胞模型的可靠性及维持胰岛素抵抗状态的时间效应关系。
Z=1−3(δ阳+δ阴)|X阳−X阴| (3) 式中：δ阳为阳性组的标准差，δ阴为阴性组的平均值，X阳为阳性组的平均值，X阴为阴性组的平均值。
1.5 鸡树条荚蒾果多酚对IR-HepG2细胞糖代谢的影响
1.5.1 PVSK对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量及细胞存活率的影响
采用1.5中建立的胰岛素抵抗模型作为模型组，另设空白对照组（正常的HepG2细胞）、不同浓度的PVSK组分别为0.01、0.05、0.10、1.00 mg/mL，阳性对照组（0.05 mg/mL的二甲双胍），每组5个复孔，设置时间梯度12、24、36 h，测定PVSK干预后IR-HepG2细胞存活率及其培养基上清液中葡萄糖的含量，考察PVSK改善胰岛素抵抗能力。
1.5.2 PVSK对IR-HepG2细胞糖代谢中糖原及相关酶活的影响
测定PVSK对糖代谢中糖原、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）、葡萄糖六磷酸酶（G6PC）的变化。其含量均以蛋白量作为计量单位（参照BCA试剂盒说明书的方法进行测定），另设空白对照组、模型组及阳性对照组，评价PVSK对IR-HepG2细胞糖代谢的影响。
1.6 统计学分析
本文采用Excel 2016、Origin 8.6、SPSS 20.0进行绘图及数据分析，实验数据用（平均值 ± 标准误差）表示，采用Duncan’ s法进行组间差异显著性分析，P < 0.05为有统计学意义。
2. 试验结果
2.1 鸡树条荚蒾果多酚对HepG2细胞活性的影响
采用MTT法测定不同浓度的PVSK作用24 h后HepG2细胞活性，以确定PVSK安全给药范围。
由表1可知，PVSK的浓度在0.01 ~ 2.50 mg/mL范围内，随浓度递减，OD值升高，细胞活性提高。与空白组比较，当浓度为1.50 ~ 2.50 mg/mL时，细胞活性明显降低，当浓度在0.01 ~ 1.00 mg/mL时，对细胞生长繁殖基本无影响，生存率均大于80%，此结果与阎芙洁的研究结果接近[13]，后续胰岛素抵抗干预试验选0.01 ~ 1.00 mg/mL范围进行研究。
表 1 不同浓度的PVSK对HepG2细胞的影响Table 1. Effect of different concentrations of PVSK on HepG2 cell survival raten = 5 组别
Group质量浓度
Mass concen-tration/(mg·mL− 1)OD值
OD value细胞存活率
Cell survival rate/%空白组
Blank— 1.14 ± 0.04 100 对照组
Control— — 0 1 2.50 0.59 ± 0.09f 46.55 2 2.00 0.67 ± 0.06e 54.83 3 1.50 0.65 ± 0.09e 51.72 4 1.00 0.96 ± 0.12d 82.54 5 0.50 1.02 ± 0.04c 88.45 6 0.10 1.12 ± 0.10b 97.78 7 0.05 1.15 ± 0.07a 100.80 8 0.01 1.14 ± 0.08a 99.63 注：同列字母相同表示差异不显著（P > 0.05），字母相临表示差异显著（P < 0.05），字母相间表示差异极显著（P < 0.01）。Notes: the same letter in same column indicates that the difference is not significant (P > 0.05), the adjacent letters mean the difference is significant (P < 0.05), and the letters spacing indicate that the difference is extremely significant (P < 0.01). 2.2 建立胰岛素抵抗模型
2.2.1 确定胰岛素作用浓度和时间
分别设未添加胰岛素的空白对照组和不同浓度胰岛素组测得细胞葡萄糖消耗情况，确定建立胰岛素抵抗状态的条件。
由图1可知，相同胰岛素浓度条件下，作用时间越长，细胞葡萄糖消耗量整体呈增高趋势。同一时间下，12 h时，葡萄糖消耗量较低且变化趋势缓慢；而48 h时变化最为明显。胰岛素浓度在1 × 10− 9 ~ 1 × 10− 8 mol/L范围，不同时间下的葡萄糖消耗量均逐渐增高；与对照组比较，在1 × 10− 8 mol/L、作用12、24、36、48 h时，葡萄糖消耗量均显著提升。说明此时细胞未出现胰岛素抵抗，由此可知较低浓度的胰岛素对细胞的糖代谢有促进作用。
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图 1 胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响在同一时间下，其他各组分别与空白对照组进行比较，无字母标注表示无显著性差异（P > 0.05），字母a表示差异显著（P < 0.05），字母b表示差异极显著（P < 0.01）。下同。At the same time, the other groups were compared with the blank control group. No letter labels indicate no significant differences (P > 0.05), the letter a means the difference is significant (P < 0.05), and the letter b means that the difference is extremely significant (P < 0.01). The same below.Figure 1. Effects of insulin to glucose consumption of HepG2胰岛素浓度大于1 × 10− 8 mol/L时，葡萄糖消耗量呈现降低后又略升高的趋势。浓度为1 × 10− 6 mol/L时，葡萄糖消耗量在24、36、48 h时均出现最低值，分别为1.96、2.64、2.88 mmol/L，与空白对照组比较，分别降低45.10%、34.00%、35.14%，差异显著（P < 0.05），由此可知，高浓度胰岛素可使细胞出现明显的胰岛素抵抗表型。胰岛素处理36和48 h，细胞的糖消耗变化率低于24 h，可能是由于加入的培养基的胰岛素作用时间过长，细胞减少了对胰岛素受体底物的降解作用，部分胰岛素信号通路恢复，导致糖消耗量有所回升[25]。综合考虑时间和浓度的影响，选取胰岛素浓度为1 × 10− 6 mol/L、作用时间24 h，作为建立胰岛素抵抗模型的方案。
2.2.2 IR-HepG2细胞模型稳定性及可靠性评估
初步确定IR-HepG2细胞模型建立的方案后，继续培养IR-HepG2细胞，测定不同时间阳性组和阴性组葡萄糖消耗量并计算Z因子，以及此时IR-HepG2细胞的存活率。
由表2可知，分别继续培养IR-HepG2细胞12、24、36 h，Z值均大于0.5；48 h，Z值小于0.5。由于Z = 1，为理想状态下的最佳筛选模型；Z在0.5 ~ 1之间，是优秀的模型，有良好的分离度和重现性；Z在（0 ~ 0.5）之间，可以起到筛选作用，但可信度较低；Z为负值，则表明模型是失败的[26-27]。可见在胰岛素作用12、24、36 h后可作为良好的胰岛素抵抗药物的筛选模型。
表 2 IR-HepG2细胞模型可靠性及稳定性评估Table 2. Reliability and stability evaluation of IR-HepG2 cell modeln = 5 分组
Group阳性参照
Positive reference/(mmol·L− 1)阴性参照
Negative reference/(mmol·L− 1)Z因子
Z factor细胞存活率
Cell survival rate/%12 h 3.25 ± 0.058 2a 2.38 ± 0.033 1c 0.68 104.57 ± 5.92a 24 h 3.70 ± 0.079 3c 2.52 ± 0.026 8b 0.73 113.69 ± 3.35a 36 h 3.99 ± 0.037 4d 2.79 ± 0.112 0a 0.63 86.33 ± 6.96b 48 h 4.14 ± 0.086 9e 2.96 ± 0.139 2a 0.42 74.84 ± 6.67c 建模后继续培养12 ~ 36 h，细胞均可以保持80%以上存活率，24 h细胞数量达到最大值（113.69 ± 3.45）%，此后开始下降，48 h时存活率最低（74.84 ± 6.67）%；可能是由于高浓度胰岛素短时间内不影响细胞活性，但时间增长则会损伤细胞。综合考虑Z值及细胞活性，并确保试验的严密性及扩大筛选范围，后续试验选取12 ~ 36 h的给药时间。
2.3 鸡树条荚蒾果多酚对IR-HepG2细胞的影响
2.3.1 PVSK对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量及细胞活性的影响
根据细胞毒性试验、IR模型的建立及筛选的结果，选择0.00 ~ 1.00 mg/mL的PVSK分别作用于胰岛素抵抗细胞12、24、36 h，测定葡萄糖含量及细胞活性；同时设模型组、空白对照组和阳性对照组。
由图2可知，不同时间下，与正常组细胞比较，模型组IR-HepG2细胞对葡萄糖的消耗量显著降低（P < 0.05），提示经1 × 10− 6 mol/L胰岛素诱导后，产生胰岛素抵抗，可降低HepG2细胞对胰岛素的敏感性，减少细胞对葡萄糖的消耗；与模型组比较，PVSK各给药组和阳性对照组整体呈现增加IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的趋势。浓度为0.10 ~ 1.00 mg/mL，葡萄糖消耗量较高且与模型组差异显著，12 ~ 36 h葡萄糖消耗量均可达到80%以上；0.5 mg/mL，24 h 时葡萄糖消耗量最高为（3.49 ± 0.11）mmol/L，消耗率可达88.81%（P < 0.01）。可见PVSK能够提高单位胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量，改善胰岛素抵抗状态。
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图 2 PVSK对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响在同一时间下，其他各组分别与模型组进行比较，无字母标注表示无显著性差异（P > 0.05），字母a表示差异显著（P < 0.05），字母b表示差异极显著（P < 0.01）。At the same time, the other groups were compared with the modle group. No letter labels indicate no significant differences (P > 0.05), the letter a means the difference is significant (P < 0.05), and the letter b means that the difference is extremely significant (P < 0.01).Figure 2. Effects of PVSK on glucose consumption of IR-HepG2 cells由图3知，与空白组比较，同一培养时间下，各组分间细胞活性差异不明显，说明PVSK可保持IR-HepG2细胞活性。整体趋势表明24 h时细胞活性高于其他时间组，36 h时细胞活性最低。可判定24 h可作为PVSK改善胰岛素抵抗的给药时间。
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图 3 PVSK对IR-HepG2细胞活性的影响Figure 3. Effect of PVSK on cellular activity of IR-HepG2 cells2.3.2 鸡树条荚蒾果多酚对细胞糖代谢中糖原及主要酶活的影响
（1）蛋白质标准曲线的绘制。糖原含量及各种酶的活性均以蛋白质含量进行计量，采用BCA法，以标准品中的蛋白质含量（mg/mL）为横坐标，样品的吸光度（A）为纵坐标，绘制蛋白质的标准曲线，得线性回归方程为：y = 0.614 1x + 0.118 9（R2 = 0.999 1）。
（2）PVSK对IR-HepG2细胞中糖原含量及关键酶活的影响。根据2.3.1的试验结果，选择浓度为0.10 mg/mL（低）、0.50 mg/mL（中）、1.00 mg/mL（高）的PVSK作用于胰岛素抵抗细胞24 h，测定糖原含量及酶活性；同时设模型组、空白对照组和阳性对照组。结果如图4，PVSK作用24 h后，正常细胞中糖原含量最高；模型组糖原含量（7.68 ± 1.66）μg/mgprot，比对照组降低54.35%（P < 0.01）；药物作用24 h后，阳性对照组糖原含量为（11.65 ± 0.69）μg/mgprot，比模型组增加34.10%（P < 0.01）。随PVSK浓度的递增，糖原含量也呈现上升趋势，PVSK 1 mg/mL时，糖原含量最高为（11.57 ± 1.40）μg/mgprot，比模型组提高33.65%（P < 0.01），且与阳性对照组无显著性差异；表明PVSK可显著提高IR-HepG2细胞中糖原含量，使更多的葡萄糖转化为糖原贮存于肝脏中，缓解胰岛素抵抗。
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图 4 PVSK对糖原含量的影响与空白对照比较，b表示差异极显著（P < 0.01）；与模型组比较，*表示差异显著（P < 0.05），**表示差异极显著（P < 0.01）；与阳性对照比较，#表示差异显著（P < 0.05），##表示差异极显著（P < 0.01）；无标记表示无显著性差异（P > 0.05）。下同。Compared with the blank control, b means that the difference is extremely significant (P < 0.01); compared with the IR group, * means the difference is significant (P < 0.05), and ** means that the difference is extremely significant (P < 0.01); compared with the positive control, # means the difference is significant (P < 0.05), and ## means that the difference is extremely significant (P < 0.01); no mark means not significant difference (P > 0.05). The same as below.Figure 4. Effect of PVSK on glycogen content由图5可知，与空白对照组相比，模型组的两种酶活均显著降低；说明胰岛素的干预致使细胞形成胰岛素抵抗状态。PVSK对IR-HepG2细胞的PK、HK活性均有显著的改善作用；对于PK活性，PVSK浓度为1 mg/mL时，酶活为（102.93 ± 1.54）IU/gprot，比模型组提高48.41%（P < 0.01），且显著高于阳性对照组。对于HK，不同浓度的PVSK之间差异不显著，可能是PVSK影响HK活性不如PK活性灵敏，增大给药浓度梯度或许可以改善；PVSK浓度为1 mg/mL时，酶活为（4.36 ± 1.00）IU/gprot，比模型组提高43.36%（P < 0.05）。由此可初步判定，PVSK可显著提高IR-HepG2细胞中HK、PK活性，促进糖酵解过程，改善胰岛素抵抗。
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图 5 PVSK对糖代谢中HK、PK酶活的影响a表示差异显著（P < 0.05）。下同。a means the difference is significant (P < 0.05). The same below.Figure 5. Effect of PVSK on the activity of hexokinase and pyruvate kinase in glucose metabolism由图6可知，PVSK对糖异生过程中涉及到的两种关键酶活性影响，与对照组比较，模型组的两种酶活均显著增高；二甲双胍可降低酶活，抑制葡萄糖的合成，改善胰岛素抵抗状态。对于G6PC，PVSK可显著抑制其活性，且呈现剂量依赖关系，当浓度为1 mg/mL 时，酶活为（27.04 ± 0.93）IU/gprot，比模型组降低22.86%（P < 0.01）。对于PEPCK，与模型组对比，PVSK组的酶活有降低，当浓度为1 mg/mL 时，酶活为（9.09 ± 1.09）IU/gprot，比模型组降低17.33%（P < 0.05）。可得结论，PVSK可以抑制IR-HepG2细胞中G6PC、PEPCK的活性，对糖异生过程有一定的抑制效果。与二甲双胍组比较，PVSK组对两种酶的抑制率偏低，可能是由于PVSK改善胰岛素抵抗作用靶点的特异性决定的，有待于进一步研究。
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图 6 PVSK对糖代谢中PEPCK、G6PC酶活的影响Figure 6. Effects of PVSK on the activity of glucose hexaphosphate and phosphoenolpyruvate kinase in glucose metabolism3. 讨 论
关于荚蒾属植物降糖的研究，已发现同为荚蒾属且不同种类的多种植物均具有降血糖活性，如：Shao等[28-31]人用乙醇提取南方荚蒾（Viburnum fordiae）活性成分，并进行成分分离发现其中酚类糖苷、熊果苷、红景天苷等5种成分有α-葡萄糖苷酶抑制活性；Iwai等发现荚蒾（Viburnum dilatatum）. 果实的冻干粉，可使小鼠血浆中葡萄糖含量显著降低；且抑制α-葡萄糖苷酶活性的成分为花青素3-桑布糖苷以及5-咖啡酰奎宁酸[29]。Ma等[30]发现日本珊瑚树（Viburnum odoratissimum）可刺激IR-HepG2细胞中的葡萄糖吸收而不影响细胞活力；还可恢复地塞米松诱导的胰岛素抵抗3T3-L1细胞中的葡萄糖吸收。本文关于鸡树条荚蒾降糖活性的研究是在细胞水平上进行的药物筛选，可初步判定PVSK对胰岛素抵抗的细胞有一定的治疗作用，可将其制作为辅助食品进行高血糖的辅助治疗。以本文为参考，可进行进一步的小鼠实验、临床研究等，来探究其若作为单一的药品在活体内的成药效果。
胰岛素抵抗是导致高血糖发病的关键因素，肝脏及外周组织是胰岛素作用的靶组织，是IR产生的主要部位[18,32]。本研究中的HepG2细胞来源于肝细胞，是一种表型与肝细胞极为相似的肝胚胎瘤细胞株，保留了肝细胞的许多生物学特性，在高浓度的胰岛素干预下，HepG2 细胞表面胰岛素受体的数目下降，下降程度与胰岛素水平及刺激持续的时间呈正相关。本研究实验结果表明：10− 6 mol/L的胰岛素诱导处理HepG2细胞24 h是产生胰岛素抵抗模型的最适条件，且模型在12 ~ 36 h内有较高的稳定性和可靠性。
本文研究的关键酶G-6-PC和PEPCK是肝糖异生的限速酶；HK、PK是糖酵解中的关键酶，催化葡萄糖降解，促进细胞对葡萄糖的利用。糖代谢中酶的活性受胰岛素信号调节，高胰岛素能下调胰岛素信号分子表达，改变信号蛋白磷酸化修饰，干扰胰岛素信号正常转导[33-34]。所以胰岛素抵抗模型组中酶活性异常，将导致糖消耗量、糖原含量变化。试验结果表明：与模型组对比，PVSK的干预可显著提高IR-HepG2细胞的糖消耗量、糖原含量、HK活性、PK活性；同时对G6PC、PEPCK活性也一定的有抑制作用；因此PVSK可通过调节几种特定的酶蛋白使异常转导的胰岛素信号进行正常转导，改善胰岛素抵抗。相对于二甲双胍组对酶活的影响，PVSK组对G6PC、PEPCK活性的抑制率较低，可能是由于PVSK干预后，调节细胞糖代谢效应蛋白的合成或降解对两种酶活性的影响是间接的。PVSK在改善胰岛素抵抗中，信号转导、涉及到的靶蛋白及信号通路及途径有待于进一步深入研究[35-36]。
综上所述，鸡树条荚蒾果多酚可有效改善HepG2细胞胰岛素抵抗，对于探索改善Ⅱ型糖尿病的新策略具有潜在应用价值。同时丰富了荚蒾属植物的活性成分与功能研究，为该林业作物的进一步研究提供了新方向。
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图 1 胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响
在同一时间下，其他各组分别与空白对照组进行比较，无字母标注表示无显著性差异（P > 0.05），字母a表示差异显著（P < 0.05），字母b表示差异极显著（P < 0.01）。下同。At the same time, the other groups were compared with the blank control group. No letter labels indicate no significant differences (P > 0.05), the letter a means the difference is significant (P < 0.05), and the letter b means that the difference is extremely significant (P < 0.01). The same below.
Figure 1. Effects of insulin to glucose consumption of HepG2
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图 2 PVSK对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响
在同一时间下，其他各组分别与模型组进行比较，无字母标注表示无显著性差异（P > 0.05），字母a表示差异显著（P < 0.05），字母b表示差异极显著（P < 0.01）。At the same time, the other groups were compared with the modle group. No letter labels indicate no significant differences (P > 0.05), the letter a means the difference is significant (P < 0.05), and the letter b means that the difference is extremely significant (P < 0.01).
Figure 2. Effects of PVSK on glucose consumption of IR-HepG2 cells
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图 3 PVSK对IR-HepG2细胞活性的影响
Figure 3. Effect of PVSK on cellular activity of IR-HepG2 cells
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图 4 PVSK对糖原含量的影响
与空白对照比较，b表示差异极显著（P < 0.01）；与模型组比较，*表示差异显著（P < 0.05），**表示差异极显著（P < 0.01）；与阳性对照比较，#表示差异显著（P < 0.05），##表示差异极显著（P < 0.01）；无标记表示无显著性差异（P > 0.05）。下同。Compared with the blank control, b means that the difference is extremely significant (P < 0.01); compared with the IR group, * means the difference is significant (P < 0.05), and ** means that the difference is extremely significant (P < 0.01); compared with the positive control, # means the difference is significant (P < 0.05), and ## means that the difference is extremely significant (P < 0.01); no mark means not significant difference (P > 0.05). The same as below.
Figure 4. Effect of PVSK on glycogen content
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图 5 PVSK对糖代谢中HK、PK酶活的影响
a表示差异显著（P < 0.05）。下同。a means the difference is significant (P < 0.05). The same below.
Figure 5. Effect of PVSK on the activity of hexokinase and pyruvate kinase in glucose metabolism
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图 6 PVSK对糖代谢中PEPCK、G6PC酶活的影响
Figure 6. Effects of PVSK on the activity of glucose hexaphosphate and phosphoenolpyruvate kinase in glucose metabolism
表 1 不同浓度的PVSK对HepG2细胞的影响
Table 1 Effect of different concentrations of PVSK on HepG2 cell survival rate
n = 5 组别
Group质量浓度
Mass concen-tration/(mg·mL− 1)OD值
OD value细胞存活率
Cell survival rate/%空白组
Blank— 1.14 ± 0.04 100 对照组
Control— — 0 1 2.50 0.59 ± 0.09f 46.55 2 2.00 0.67 ± 0.06e 54.83 3 1.50 0.65 ± 0.09e 51.72 4 1.00 0.96 ± 0.12d 82.54 5 0.50 1.02 ± 0.04c 88.45 6 0.10 1.12 ± 0.10b 97.78 7 0.05 1.15 ± 0.07a 100.80 8 0.01 1.14 ± 0.08a 99.63 注：同列字母相同表示差异不显著（P > 0.05），字母相临表示差异显著（P < 0.05），字母相间表示差异极显著（P < 0.01）。Notes: the same letter in same column indicates that the difference is not significant (P > 0.05), the adjacent letters mean the difference is significant (P < 0.05), and the letters spacing indicate that the difference is extremely significant (P < 0.01). 
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表 2 IR-HepG2细胞模型可靠性及稳定性评估
Table 2 Reliability and stability evaluation of IR-HepG2 cell model
n = 5 分组
Group阳性参照
Positive reference/(mmol·L− 1)阴性参照
Negative reference/(mmol·L− 1)Z因子
Z factor细胞存活率
Cell survival rate/%12 h 3.25 ± 0.058 2a 2.38 ± 0.033 1c 0.68 104.57 ± 5.92a 24 h 3.70 ± 0.079 3c 2.52 ± 0.026 8b 0.73 113.69 ± 3.35a 36 h 3.99 ± 0.037 4d 2.79 ± 0.112 0a 0.63 86.33 ± 6.96b 48 h 4.14 ± 0.086 9e 2.96 ± 0.139 2a 0.42 74.84 ± 6.67c
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