Effects of nitrogen application on growth and triterpenoids accumulation of 1-year-old Cyclocarya paliurus
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摘要:目的研究施氮对青钱柳生长和三萜类积累的影响，为规范青钱柳药用人工林的栽培和提高药用植物单位面积的三萜产量提供理论依据。方法以1年生青钱柳苗为试材，共设置5个不同的施氮水平，包括：N1（0 g/株）、N2（1 g/株）、N3（3.4 g/株）、N4（6 g/株）和N5（10 g/株）。分别于5—8月的每月中下旬测定其苗高、地径、生物量，总三萜以及主要的3个三萜单体的含量。结果结果表明：（1）青钱柳苗高和地径的生长随着施N量的增加呈现先增加后减少的变化趋势，最大苗高和地径的净生长量在N4处理中获得，与对照N1相比，分别增加103.90%和57.58%；植株根系、茎杆、叶片生物量和总生物量积累的变化趋势与之相似，其中最大总生物量积累在N4处理中获得，达到7.24 g。（2）随着施氮量的增加，植株叶片中N含量出现线性增加（根系和茎杆较稳定），而C含量未发生明显变化，导致叶片中的C/N从20.42%线性下降到12.19%。（3）叶片是三萜积累的主要部位，叶片中阿江榄仁酸、青钱柳酸B、青钱柳甙Ⅰ及总三萜积累在各处理间呈现单峰变化趋势，均在相对低N条件下（N2）获得峰值，分别为2.45、0.73、0.44 、22.95 mg/g。另外，所检测的3个三萜单体中，含量最高的为阿江榄仁酸（0.73 mg/g，干质量），其后依次为青钱柳酸B（0.23 mg/g，干质量）和青钱柳甙I（0.12 mg/g，干质量）。（4）施氮显著影响了青钱柳中总三萜和三萜单体的单株产量，其中总三萜、阿江榄仁酸的单株产量的变化范围分别为95.21 ~ 279.45 mg/株、4.64 ~ 17.21 mg/株，均在相对低N条件下（N3）获得最高；总三萜和3个三萜单体的最低产量在N1或N5处理获得。结论施氮量在中等偏高水平时可以促进青钱柳幼苗的生长，而中等偏低的施氮量则能促进三萜类化合物的积累。Abstract:ObjectiveThe effects of nitrogen application on the growth and triterpenoids accumulation of Cyclocarya paliurus were studied in order to provide theoretical basis for regulating the cultivation of medicinal plantation and improving the triterpenoids yield per unit area of medicinal plants.MethodThe 1-year-old seedlings of C. paliurus were used as test materials under five different N levels, including N1 (0 g/plant), N2 (1 g/plant), N3 (3.4 g/plant), N4 (6 g/plant), N5 (10 g/plant). And the seedling height, ground diameter, biomass, total triterpenoid and three main triterpenoids were measured in the middle and late days of each month from May to August.Result(1) The seedling height and ground diameter growth of C. paliurus increased first and then decreased with increased N application, and the highest net growth of seedling height and basal diameter were got in treatment N4, increased by 103.90% and 57.58%, respectively compared with N1. Similar variation pattern was also observed for the biomass and total biomass accumulation in roots, stalks and leaves, and the greatest total biomass accumulation was got in treatment N4, reaching 7.24 g. (2) With the increase of N application, the N content in leaves of plants increased linearly (that in roots and stalks was comparatively stable), while the C content did not change significantly, resulting in the C/N in leaves decreased linearly, and ranged from 20.42% to 12.19%. (3) Leaf was the main accumulating organ in C. paliurus, and the largest total accumulation and three individual triterpenoids (arjunolic acid, cyclocaric acid B and cyclocarioside I) in leaf showed a single peak variation pattern, with the peak values of 2.45, 0.73, 0.44 and 22.95 mg/g, respectively under relatively low N condition (N2). In addition, among the three individual triterpenoids tested, the main individual triterpenoid was arjunolic acid (0.73 mg/g, dry mass), followed by cyclocaric acid B (0.23 mg/g, dry mass) and cyclocarioside I (0.12 mg/g, dry mass). (4) N application significantly affected the yield of total and three individual triterpenoids in C. paliurus and the triterpenoid and arjunolic acid per plant reached highest under treatment N3, ranged in 95.21−279.45 mg/plant and 4.64−17.21 mg/plant. The yield of total triterpenoid and three individual triterpenoids per plant were found lowest under treatment N1 or N5.ConclusionModerately high N application could promote the growth of C. paliurus seedlings, while moderately low N application could promote the accumulation of triterpenoid.
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青钱柳（Cyclocarya paliurus）为胡桃科（Juglandaceae）青钱柳属（Cyclocarya）单种属植物，是我国特有的药食同源珍稀植物[1]。民间长期以其叶作为茶饮，因其味甘而被称为“甜茶”“神茶”[2]。现代药理研究发现，青钱柳富含大量具有多种药理和保健功能的活性物质，如三萜类、黄酮类。三萜类化合物是青钱柳中一类主要的次生代谢产物，具有降三高和抗氧化等功效[3-5]。目前，国内学者已从青钱柳中分离得到多种三萜类化学成分[6-7]。王晓敏等[8]从青钱柳水提液中分离得到3个具有降血糖作用的三萜及皂苷类成分。Fang等[9]从青钱柳叶中分离出3种罕见的三萜苷和五环三萜酸，以及十一种已知的三萜，并且研究发现有几种三萜类化合物增强了胰岛素刺激3T3-L1脂肪细胞和C2C12肌管摄取葡萄糖的作用。然而，青钱柳的自然资源稀少，且自然繁育更新能力较差，多零星分布，导致可利用的自然资源非常有限[1, 10]。随着青钱柳产业化的推进，对青钱柳的需求逐渐增加，目前青钱柳主要以人工培育为主。
次生代谢产物的积累除了受植物本身遗传因素的控制，还受环境条件的影响[11]。萜类化合物在生物或者非生物环境胁迫下作为一种保护剂，在昆虫危害、病原微生物侵袭及养分胁迫等过程中起着重要的防御作用[12]。土壤养分是环境条件中重要的影响因素之一，关系到植株地下部分对养分的吸收和利用，因而萜类化合物的合成和积累会受到养分条件的直接调控[13]。氮是植物必需的大量元素，在氨基酸、蛋白质、核酸和辅酶等的合成过程中有不可代替的作用[14]。目前，施氮对青钱柳黄酮类化合物积累的影响已有许多报道。例如，Cronin等[15]和Groenbaek等[16]研究发现，随着施氮水平的增加，淡水植物和甘蓝（Brassica oleracea）中的山奈酚和总黄酮的含量呈现先上升后下降的变化模式。我们也发现，在较低施氮水平下，青钱柳叶片中黄酮积累量显著增加[17]。然而，作为青钱柳中除黄酮类化合物外的另一大类次生代谢产物—三萜类化合物受施氮影响的研究少有报道。本文通过对1年生青钱柳苗进行5种施氮处理，研究不同施氮量对青钱柳生长和次生代谢物质合成和积累的影响，以期为提高药用植物单位面积的三萜产量和发展新的农业生产实践提供参考。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
本试验选用浙江安吉种源1年生半同胞家系的青钱柳容器苗（培育环境和大小一致）作为供试材料，采用盆栽法研究施氮对青钱柳生长和三萜类化合物积累的影响。栽培基质为100 ~ 120 cm深的园土（pH为5.8、有机值总量为2.1 mg/kg和速效氮含量为30.2 mg/kg）与蛭石按体积比为1∶1混合。
1.2 实验设计
试验共包括5个不同的施氮处理，每个处理3个重复，每个处理15株幼苗。2016年3月将一年生幼苗移栽到21 cm × 15 cm × 18.5 cm（上口径 × 下口径 × 高）塑料盆中栽种，每盆一株，置于安徽农业大学的人工气候室（光强度、光周期、昼/夜温度和相对湿度分别为620 μmol/（m2·s）、12 h、25 ℃/15 ℃和65%）。5个试验处理的施N量分别为N1（CK不施N）、N2（1.0 g/株）、N3（3.4 g/株）、N4（6.0 g/株）、N5（10.0 g/株）。于5月初开始进行施氮试验，以多肽尿素（缓释肥）作为氮肥进行基施。每周喷施KH2PO4（1 500倍液），每半月喷施一次微肥（3 000倍液），每次叶面喷施约200 mL。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 苗高生长、地径和生物量积累的测定
分别于5—8月的每月中下旬测定青钱柳的苗高和地径，并于最后一次测定苗高和地径时测定不同处理下的生物量。将所有植株分成根系、茎杆、叶片3个部分，清洗干净后在70 ℃烘箱中烘干至恒质量，称质量后磨成粉末保存。植株的总生物量为根系、茎杆和叶片干质量之和。
1.3.2 C、N含量的测定
从上述不同器官的粉末植物样品中称取3 ~ 5 mg样品，用锡杯包样（2 mm × 5 mm），采用意大利Euro Vector EA3000元素分析仪对不同植物器官的C、N含量进行测定。
1.3.3 三萜类化合物的提取和测定
为了测定青钱柳不同器官中三萜类化合物的含量，从上述样品中称取约0.3 g放入250 mL索氏提取器中，并用石油醚在80 ℃水浴锅中回流提取4 h，以去除脂溶性成分。去杂后的样品在室温下自然晾干，作为提取三萜类的样品。本试验采用超声波辅助提取法[18]提取样品中的三萜类化合物。提取采用20 mL 70%乙醇溶液，在50 ℃条件下用1 000 W的超声提取45 min，重复提取2次，弃去残渣并将2次提取液合并。将合并后的提取液挥发至近干，用甲醇反复清洗残渣并定容至10 mL作为三萜含量测定的样品。
本试验参照舒任庚等[19]的文章采用比色法测定青钱柳中的总三萜含量。精确吸取0.5 mL提取液，于60 ℃水浴中挥发干溶剂，再先后加入0.5 mL 5%香草醛-冰醋酸和1.4 mL高氯酸，放置于70 ℃水浴中充分反应15 min，冷却后移至10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯反复清洗并定容，摇匀后在560 nm处测定吸光度（TU-1800 PC型紫外可见分光光度计，北京）。
本试验测定的三萜单体有青钱柳酸B、青钱柳甙Ⅰ和阿江榄仁酸3种。用Waters 2695 Alliance系列高效液相系统测定含量。其中青钱柳酸B用UVD 2996二极管阵列检测器检测，检测波长设为210 nm，流动相为A液（色谱纯甲醇）和B液（0.5%磷酸），梯度洗脱程序为：0 ~ 16 min，20% ~ 70%A；16 ~ 20 min，70% ~ 90%A；20 ~ 32 min，90%A；32 ~ 37 min，90% ~ 20%A；37 ~ 47 min，20%A。青钱柳甙Ⅰ和阿江榄仁酸的定量用2424 ELSD检测，流动相为A液（色谱纯甲醇）和B液（0.3%冰乙醇），漂移管的温度设为60 ℃，氮气流速设为2.4 L/min，梯度洗脱程序为：0 ~ 20 min，20% ~ 90%A；20 ~ 35 min，90%A；35 ~ 37 min，90% ~ 20%A；37 ~ 45 min，20%A。
1.4 数据分析
本试验用Excel 2016软件制图；采用SPSS 24.0软件进行单因素分析，分析结果表示在95%的置信区间内显著水平。
2. 结果与分析
2.1 青钱柳苗高、地径生长的差异
方差分析结果表明，不同施氮处理对青钱柳的苗高、地径影响显著（P < 0.05）。随着施氮量的增加，植株苗高净生长量在3.05 ~ 16.31 cm之间呈现先增加后减少的变化趋势；地径净生长量在各处理间呈现与苗高净生长量相似的变化趋势，其变化范围为1.56 ~ 0.36 mm（图1）。各处理间的苗高和地径净生长量，均于N4处理时达到最高，分别为16.31 cm、1.56 mm，与对照N1相比，分别高103.9%、57.58%；在N5处理时最低，分别为3.05 cm和0.36 mm，与对照N1相比，分别低了61.88%和63.64%。植株苗高和地径的总生长量在各处理间具有与净生长量相似的变化规律。结果表明，随着施氮量的增加，苗高的生长量明显增加，而对地径的促进作用不明显，但施氮量在中等偏高（N4）时，苗高和地径的净生长量均达到最大；高氮（N5）不利于植株苗高和地径的生长。
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图 1 不同施氮处理对青钱柳苗高（A）和地径（B）生长的影响不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05 level. The same below.Figure 1. Effects of different nitrogen application treatments on growth of seedling height (A) and ground diameter (B) of Cyclocarya paliurus2.2 青钱柳生物量积累的差异
不同施氮处理对青钱柳根系、茎杆、叶片及总生物量积累的影响，如表1所示。方差分析结果表明，施氮显著影响了青钱柳生物量的积累（P < 0.05）。随着施氮量的增加，青钱柳根系、茎杆、叶片中的生物量均呈现先增加后减少的变化趋势，变化范围分别为1.22 ~ 3.54 g、1.15 ~ 2.15 g、0.95 ~ 2.33 g，最大积累量在N4处理获得，这与苗高和地径生长的变化趋势基本一致（图1）。这种变化趋势在根系中尤其明显，适量施氮（N4）使生物量的积累达到最高，为190.02%。值得注意的是，最大叶片生物量积累在N2处理时获得，为对照N1的1.73倍，与叶片三萜产量的变化趋势一致。总生物量的积累在各处理间也具有与苗高和地径相似的变化规律，最高总生物量积累于N4处理达到最高，最低积累量在N5处理获得，与对照N1相比，分别增加89.53%、减少10.99%。
表 1 不同施氮处理对青钱柳生物量积累的影响Table 1. Effects of different nitrogen application treatments on biomass accumulation in different vegetative organs of Cyclocarya paliurusg 处理 Treatment 根系 Root 茎杆 Stalk 叶片 Leaf 总生物量 Toal biomass N1 1.22 ± 0.56 a 1.25 ± 0.38 a 1.35 ± 0.56 a 3.82 ± 1.60 a N2 1.85 ± 0.47 a 1.77 ± 0.34 ab 2.33 ± 0.47 b 5.95 ± 1.19 b N3 1.92 ± 0.64 a 2.15 ± 0.67 b 2.30 ± 0.64 b 6.37 ± 1.84 b N4 3.54 ± 0.60 b 2.08 ± 0.11 b 1.62 ± 0.26 ab 7.24 ± 0.93 b N5 1.30 ± 0.42 a 1.15 ± 0.35 a 0.95 ± 0.35 a 3.40 ± 0.42 a 注：同列相同小写字母表示处理间差异不显著，不同小写字母表示处理间差异显著（P < 0.05）。下同。Notes: the same lowercase letters in the same column indicate no significant difference between treatments, different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05). The same below. 2.3 不同器官C、N含量的差异
在5种不同的施氮水平下，植株根系、茎杆和叶片中的C、N含量和C/N，如表2所示。方差分析表明，施氮对根系、茎杆和叶片中的N含量影响显著（P < 0.05），其变化范围分别为1.11% ~ 2.17%、0.62% ~ 1.39%和2.09% ~ 3.23%。对于根系和茎杆而言，随着施氮量持续增加，在N4和N5处理下的N含量并未发生明显变化，甚至轻微下降。而各器官中的C含量则相对较稳定，且在39.22% ~ 42.57%之间变化幅度较小，除叶片中N5处理下C含量明显小于其他处理外，根系和茎杆中的C含量无显著性差异。随着施氮量的增大，植株各营养器官中N含量直线上升，使得C/N显著下降（P < 0.05）。植株根系和茎杆在各处理间的大小次序分别为N1 > N2 > N3 > N5 > N4和N1 > N2 > N3 > N5 > N4，而叶片中C/N在N1 ~ N5之间从20.42%线性下降到12.19%；与对照N1相比，根系、茎杆和叶片的C/N在N5处理条件下，分别减少47.80%、54.49%和40.30%。值得注意的是，根系和茎杆中的C/N与N含量一样，在N4和N5处理间并未发生明显的变化，而在叶片中则显著下降。
表 2 不同施氮水平下青钱柳苗不同部位的碳、氮及碳氮比（C/N）的变化Table 2. Variations of carbon, nitrogen, and carbon-to-nitrogen ratio (C/N) in different components of Cyclocarya paliurus seedlings under varied nitrogen application levels% 处理 Treatment 根系 Root 茎杆 Stalk 叶片 Leaf C N C/N C N C/N C N C/N N1 42.31 a 1.11 b 38.14 a 41.90 a 0.62 c 68.05 a 42.48 a 2.09 c 20.42 a N2 41.63 a 1.54 b 27.28 b 41.89 a 0.87 b 48.33 b 43.24 a 2.78 b 15.59 b N3 41.28 a 1.81 ab 23.36 bc 42.06 a 1.07 b 40.58 bc 42.39 a 2.72 b 15.59 b N4 39.31 a 2.17 a 18.16 c 41.55 a 1.39 a 30.20 c 42.57 a 2.85 b 14.95 b N5 41.04 a 2.11 a 19.91 c 42.22 a 1.38 a 30.97 c 39.22 b 3.23 a 12.19 c 2.4 三萜类化合物含量的差异
青钱柳各部位中总三萜和3个三萜单体含量在各处理间的变化，如图2所示。其中，青钱柳根系、茎杆和叶片中总三萜的变异范围分别为7.89 ~ 11.91 mg/g、8.52 ~ 13.22 mg/g和11.06 ~ 22.95 mg/g。方差分析结果表明，不同的施氮量明显影响了总三萜积累，但各处理间除N5处理外差异不显著。随着施氮量的增加，叶片中总三萜积累呈现单峰变化趋势，总三萜含量在N2处理获得最高（22.95 mg/g）（图2A）；而根系和茎杆中总三萜含量则呈现与叶片不同的变化趋势，即随着施N水平的增加而呈线性下降趋势（图2A）。各部位中的三萜单体积累在各处理间具有与总三萜相似的变化规律（P < 0.05，图2B、C、D），例如：在N2处理下的青钱柳叶中阿江榄仁酸积累达到最高，与对照N1相比，增加59.09%；而根系和枝干中阿江榄仁酸含量分别从0.15 mg/g线性降低到0.08 mg/g和0.22 mg/g线性降低到0.11 mg/g（图2B），分别降低了46.67%和50.0%。本研究还发现，阿江榄仁酸是所检测的3个三萜单体中含量最高的成分，总平均含量为0.73 mg/g（干质量），其次青钱柳酸B为0.23 mg/g（干质量）和青钱柳甙Ⅰ含量为0.12 mg/g（干质量）。另外，结果表明，青钱柳叶是积累三萜类化合物的主要部位，且明显高于根系和茎杆。
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图 2 不同施氮处理对青钱柳不同营养器官的总三萜和3种三萜单体积累的影响Figure 2. Effects of different nitrogen application treatments on the accumulation of total and individual triterpenoids in varied vegetative organs of Cyclocarya paliurus2.5 青钱柳三萜产量的差异
根据叶片生物量、植株总生物量与三萜积累量计算出青钱柳叶片三萜产量和单株三萜总产量（图3）。总三萜、阿江榄仁酸、青钱柳酸B和青钱柳甙Ⅰ的单株产量在各处理间的变化范围，分别为95.21 ~ 279.45 mg/株、4.64 ~ 17.21 mg/株、1.40 ~ 5.33 mg/株和0.43 ~ 3.36 mg/株。方差分析结果表明，不同施氮水平对单株总三萜和三萜单体产量产生了显著性影响（P < 0.05）。其中总三萜和阿江榄仁酸的单株产量随着施氮量的增加呈现先增加后减少的变化趋势，均在N4和N5处理时，单株产量达到最高和最低（图3A、B）。而青钱柳酸B和青钱柳甙Ⅰ的单株产量则在N2处理时，单株产量达到最高（图3C、D）。总体而言，中等施氮水平显著增加了青钱柳总三萜和3个三萜单体的单株产量，尤其是阿江榄仁酸的产量增加的最多，达到135.43%，其次是青钱柳酸B和青钱柳甙Ⅰ的产量分别增加92.42%和92.0%，最后是总三萜的产量，增加了65.10%。
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图 3 不同施氮处理对青钱柳叶和单株总三萜和3种三萜单体产量的影响Figure 3. Effects of different nitrogen application treatments on yield of total and individual triterpenoids in leaves and plants of Cyclocarya paliurus青钱柳叶片中的三萜产量在各处理间的变异趋势与三萜单株产量相似。叶片中阿江榄仁酸的产量在N2处理条件下增加的最多，达到173.21%，其次是青钱柳甙Ⅰ和青钱柳酸B的产量，分别增加145.24%和139.44%，最后是总三萜的产量增加了112.25%。总三萜和3种三萜单体的叶片产量在N5处理下均明显减少，减少量的范围在46.89% ~ 71.43%之间；其中青钱柳甙Ⅰ的叶产量减少的最多，其次是阿江榄仁酸的叶产量。
3. 讨 论
可利用氮素营养条件是影响植物初级代谢和次生代谢的重要因素[20-21]。一般来说，氮素限制对植物生长的影响往往大于光合作用，这使得在氮素浓度偏低的条件下无法满足初级代谢产物合成和光合作用的需求；随着氮素浓度的增加，光合作用合成的糖类大于植物生长的需求，多余的光合产物转而进入次生代谢途径[13, 22]。因此，通过氮素调控光合产物在植物体内不同代谢途径中的分配是提高药用植物次生代谢产物积累的有效途径。对于培育药用青钱柳而言，通过氮素调控确定一个合适的施肥量，既能满足植株快速生长的要求又有利于目标次生代谢产物积累，是今后定向培育青钱柳药用人工林的发展方向[23]。另外，青钱柳叶片是次生代谢产物的主要积累部位，需要系统研究关键养分条件对单位面积叶质量与产量的影响，从而筛选出优化的定向培育模式。关于青钱柳生长和次生代谢产物积累在不同施氮水平下的差异，相关试验研究表明，施氮在一定程度上会影响青钱柳次生代谢物质的积累[24-25]。金则新等[26]对养分条件不同的5个样地青钱柳叶片进行了测定和分析，结果表明，青钱柳叶片中青钱柳皂甙、总黄酮、生物碱等7种次生代谢产物的含量在各样地间存在差异，且相同成分在不同样地间也有差异。在本研究中，施氮显著影响了青钱柳叶片中三萜类化合物的含量（图2）。如随着施氮量的增加，总三萜呈现单峰变化的趋势，峰值在N2处理下获得，最小值在N5处理；阿江榄仁酸、青钱柳酸B和青钱柳甙Ⅰ在各处理间的变化趋势与总三萜相似，且均在N5处理时含量最低，这与之前在青钱柳黄酮类化合物中观测到的结果相同[17, 24]。由此可见，施氮会显著影响青钱柳中三萜类化合物的积累。根据碳素/营养平衡（carbon-nutrient balance, CNB）假说，施氮使光合速率提高，从而使以C为基础的次生代谢物质（如三萜类和黄酮类物质）的积累量增加，这已被植物体内黄酮类化合物积累的研究所证实[17]。我们的研究结果也部分证实了Nguyen等[27]的研究结论，即重度施氮不利于植物次生代谢产物的积累。
碳和氮代谢与植物的初级代谢和次生代谢途径紧密相连[28]。C/N平衡的变化影响着植物的生长和生理代谢过程，如参与氮同化的基因表达和诱导或者抑制参与次生代谢产物合成酶的活性[14, 17]。Grechi等[29]研究氮素对葡萄（Vitis vinifera）根茎中C/N平衡的影响，证实了植株根系、茎杆和叶片中的C/N在不同的施氮处理下发生变异。此外，在七子花（Heptacodium miconioides）和烟草（Nicotiana tabacum）中研究也发现，植物体内C/N与以碳为基础的次生代谢产物积累呈正相关[16, 30]。这些研究结果表明，土壤中植物可利用氮素的变化引起了青钱柳次生代谢产物积累的变异。Labat等[31]研究表明，中等偏低的施氮量改变了植物体内碳资源的分配，导致植物生长减缓，从而使得参与植物自我防御和保护的一些次生代谢产物在体内积累，如三萜类化合物。Paul等[32]的研究也证明了氮的消耗可以增加烟草叶片中氨基酸和碳水化合物的含量，从而增加植株体内次生代谢产物的含量。这些研究结果进一步说明，C/N平衡能够影响初级代谢和次生代谢中碳资源的分配，并反应在次生代谢产物的种类与含量（如三萜类）以及植物形态（如苗高和地径）等方面。在本研究中，各器官（根系、茎杆和叶片）中的C含量比较稳定，而N含量随着施氮量的增加而线性增加，导致C/N下降（表2）。由此可知，施氮改变了青钱柳苗体内的C/N平衡，与Grechi等[29]研究施氮影响葡萄藤中C/N平衡的结论一致。此外，以青钱柳叶片中阿江榄仁酸积累为例，在相对较低的施N水平（N2）下，叶片中C/N的含量较低，与对照N1相比，下降了23.65%，而阿江榄仁酸的含量达到最大，增加了59.09%，这表明施氮引起的C/N平衡改变了植株体内的碳资源分配，且极低或者偏高的施氮量（N1或者N4、N5）都不利于以C为基础的三萜类物质合成和积累（表2、图2）。这一结果与生长/分化平衡（growth-differentiation balance, GDB）假说所预测的结果一致[33-34]。根据GDB假说的预测，在养分资源极低的情况下，植物会将有限的养分优先分配到生长过程中，而不是次级代谢途径；当植物在中等养分条件下，生长受到限制，而对光合作用的影响较小，使充足的光合产物分配到次级代谢途径中；在高养分条件下，更多的光合产物被分配到植物生长过程中而不是次级代谢途径。然而，值得注意的是，叶片和非叶器官（根和茎）中三萜类的含量在各处理间呈现不同的变化模式。Buer等[35]研究表明，三萜类化合物可以通过植物的维管系统从合成部位长距离运输到远处的器官组织（如根尖）。因此，施氮对三萜类化合物积累的影响可能只反映在青钱柳的叶片部位，而不是茎杆和根系，这与本研究得出的结论一致，即叶片是三萜积累的主要部位。
青钱柳作为重要的药用植物资源，研究土壤养分对三萜类产量的影响至关重要。目前已有相关研究认为，有效的植物栽培措施是提高药用植物产量的有效途径[36]。在本研究中，总三萜和3个三萜单体的叶产量与三萜在叶片中积累的变化趋势一致，最高产量在N2处理获得（图3）。Deng等[17]研究也发现，相对低的施氮量有利于生长在田间的1年生青钱柳叶片中总黄酮和槲皮素含量的增加。本试验的结论再次证实了生长/分化平衡（GDB）假说的预测，即氮营养在中等偏低时，次生代谢物质的含物达到峰值[33-34]。为了获得单位面积上目标次生代谢产物的最高产量，还需要对田间的生长条件进行微调控[17，37]。由于野外条件与人工气候条件的环境因素有较大的差异，如光照强度、气温、水分以及土壤等，因此为了规范青钱柳药用林的栽培措施和获得高产量的三萜类成分，需要在野外条件下进行更多的研究，这些因素的相互作用可能会导致产生不同的结论。本研究中，在中等偏高的N条件下，总生物量积累最大，而导致最大单株总三萜产量和最高总三萜含量的变化趋势不一致。因此，了解土壤养分条件如何影响青钱柳生长与次生代谢产物积累之间的平衡关系，对于优化植株的生长条件和保持三萜类化合物的最高产量具有重要意义。
4. 结 论
5种不同的施氮水平显著影响青钱柳的生长和三萜类化合物的积累。中等偏高的施N量（N3、N4）更能促进青钱柳苗高、地径及生物量的增加，高氮（N5）或者不施氮（N1）不利于植株的生长；而中等偏低的施N量（N2），对总三萜和3种三萜单体的积累均有促进作用，有利于提高三萜类化合物的产量；高氮或者不施氮不利于三萜积累。因此，深入了解施氮对青钱柳生长和次生代谢产物合成与积累的影响，对优化青钱柳药用人工林的栽培条件和提高青钱柳目标次生代谢物质的产量具有重要意义。
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图 1 不同施氮处理对青钱柳苗高（A）和地径（B）生长的影响
不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。下同。Different lowercase letters indicate significant difference at P < 0.05 level. The same below.
Figure 1. Effects of different nitrogen application treatments on growth of seedling height (A) and ground diameter (B) of Cyclocarya paliurus
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图 2 不同施氮处理对青钱柳不同营养器官的总三萜和3种三萜单体积累的影响
Figure 2. Effects of different nitrogen application treatments on the accumulation of total and individual triterpenoids in varied vegetative organs of Cyclocarya paliurus
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图 3 不同施氮处理对青钱柳叶和单株总三萜和3种三萜单体产量的影响
Figure 3. Effects of different nitrogen application treatments on yield of total and individual triterpenoids in leaves and plants of Cyclocarya paliurus
表 1 不同施氮处理对青钱柳生物量积累的影响
Table 1 Effects of different nitrogen application treatments on biomass accumulation in different vegetative organs of Cyclocarya paliurus
g 处理 Treatment 根系 Root 茎杆 Stalk 叶片 Leaf 总生物量 Toal biomass N1 1.22 ± 0.56 a 1.25 ± 0.38 a 1.35 ± 0.56 a 3.82 ± 1.60 a N2 1.85 ± 0.47 a 1.77 ± 0.34 ab 2.33 ± 0.47 b 5.95 ± 1.19 b N3 1.92 ± 0.64 a 2.15 ± 0.67 b 2.30 ± 0.64 b 6.37 ± 1.84 b N4 3.54 ± 0.60 b 2.08 ± 0.11 b 1.62 ± 0.26 ab 7.24 ± 0.93 b N5 1.30 ± 0.42 a 1.15 ± 0.35 a 0.95 ± 0.35 a 3.40 ± 0.42 a 注：同列相同小写字母表示处理间差异不显著，不同小写字母表示处理间差异显著（P < 0.05）。下同。Notes: the same lowercase letters in the same column indicate no significant difference between treatments, different lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05). The same below. 
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表 2 不同施氮水平下青钱柳苗不同部位的碳、氮及碳氮比（C/N）的变化
Table 2 Variations of carbon, nitrogen, and carbon-to-nitrogen ratio (C/N) in different components of Cyclocarya paliurus seedlings under varied nitrogen application levels
% 处理 Treatment 根系 Root 茎杆 Stalk 叶片 Leaf C N C/N C N C/N C N C/N N1 42.31 a 1.11 b 38.14 a 41.90 a 0.62 c 68.05 a 42.48 a 2.09 c 20.42 a N2 41.63 a 1.54 b 27.28 b 41.89 a 0.87 b 48.33 b 43.24 a 2.78 b 15.59 b N3 41.28 a 1.81 ab 23.36 bc 42.06 a 1.07 b 40.58 bc 42.39 a 2.72 b 15.59 b N4 39.31 a 2.17 a 18.16 c 41.55 a 1.39 a 30.20 c 42.57 a 2.85 b 14.95 b N5 41.04 a 2.11 a 19.91 c 42.22 a 1.38 a 30.97 c 39.22 b 3.23 a 12.19 c
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