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可可球二孢的培养及其侵染橡胶木表面性能的研究

赵博识 于志明 张扬 漆楚生 唐睿琳 刘源松 王皓炜 韩祎昀

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可可球二孢的培养及其侵染橡胶木表面性能的研究

    作者简介: 赵博识。主要研究方向:木制复合材料。Email:zhaoboshi@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学材料学院.
    通讯作者: 于志明,教授,博士生导师。主要研究方向:新型人造板及高性能生物质复合材料。Email:yuzhiming@bjfu.edu.cn 地址:同上. 张扬,教授,硕士生导师。主要研究方向:木制复合材料与胶黏剂。Email:bjfuzhangyang@bjfu.edu.cn 地址:同上. 
  • 中图分类号: TS652

Growth of Lasiodiplodia theobromae and its effect on the surface properties of rubber wood

图(7)表(5)
计量
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-04
  • 录用日期:  2019-10-29
  • 网络出版日期:  2019-11-05

可可球二孢的培养及其侵染橡胶木表面性能的研究

    通讯作者: 于志明, yuzhiming@bjfu.edu.cn
    通讯作者: 张扬, bjfuzhangyang@bjfu.edu.cn
    作者简介: 赵博识。主要研究方向:木制复合材料。Email:zhaoboshi@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学材料学院
  • 北京林业大学材料科学与技术学院,北京 100083

摘要: 目的可可球二孢是导致橡胶木蓝变的主要菌种之一,对蓝变的研究大多以防治为主。本研究利用蓝变颜色的多样性将防治转化为诱导,以提高蓝变现象的利用价值。方法通过分析不同配比的察式培养基对可可球二孢菌落在培养基和橡胶木表面生长速度的影响,优选菌落适宜生长环境,并探究不同时间条件下菌落对橡胶木表面性能的影响。结果可可球二孢菌落的适宜生长环境为酵母膏9 g/L、葡萄糖20 g/L、pH值弱酸性、硫酸镁1.0 g/L、硫酸亚铁0.03 g/L、氯化钾0.2 g/L;随着时间的增加,橡胶木表面的染色面积比逐渐提高,颜色逐渐由红黄到蓝绿色系,整体颜色逐渐变暗,耐光色牢度逐渐提高,静态接触角提高了13.04%,动态接触角显著变大,表面粗糙度和耐磨性能逐渐降低。结论本研究制备出可可球二孢调色橡胶木,并利用不同时间梯度对橡胶木表面纹理和颜色进行调控,证明了生物方式加工木材的可行性,扩大了微生物在木材加工中的利用价值。

English Abstract

  • 蓝变是木材材性的主要缺陷之一,变色菌是导致木材蓝变的主要因素,易从锯材表面和原木端头侵入木材内部,导致深层变色,降低木材的加工利用价值[1]。橡胶木(Hevea brasiliensis)是我国热带地区重要的经济作物,广泛种植于海南、云南和广东等地,具有材质均匀稳定、色泽淡雅、花纹美观和易着色等优点,但橡胶木中糖类、蛋白质和灰分等含量较多,易引发蓝变等材性缺陷[2-3]

    可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)是导致橡胶木发生蓝变的最主要菌种,隶属于半知菌亚门腔孢纲球壳孢目球二孢属,主要分布于热带和亚热带地区,在我国海南和两广等地分布广泛[4-5]。可可球二孢菌丝粗壮,菌丝呈灰白色,分泌物为暗绿色,主要分布于边材薄壁组织、纤维及导管腔[6-7]。相关研究结果表明可可球二孢的生长主要与培养基组分、pH值、温度、湿度和光照等因素有关[8-9]

    目前,主要利用物理、化学和生物的方法防治橡胶木蓝变[10-12]。较少有学者利用蓝变现象对木材进行调色,作为一种生物加工木材的方式,实现蓝变现象的逆利用[13]。Liu等[14]利用可可球二孢对杨木(Populus spp.)单板进行染色,取得了良好的染色效果。杨思瑞等[15]利用蓝变杨木单板制备蓝变重组木,且蓝变重组木的密度、静曲强度、弹性模量和内结合强度均优于普通重组木。此外,花斑木是利用木材腐朽菌提高木材的装饰性能,花斑木的研究主要集中在易产生菌纹线的菌种的筛选、色素提取、花斑木的制备及应用等方面[16-19]。蓝变菌对木材的力学性能影响较小,颜色丰富,因而有广阔的研究价值。本研究主要利用可可球二孢菌落调色橡胶木,使木材变色由防治转为诱导,提高橡胶木表面的装饰效果。首先研究可可球二孢在不同配比的察式培养基上的生长繁殖规律,然后在橡胶木表面进行验证;并在适宜环境下探究不同时间下可可球二孢对橡胶木表面性能(染色面积比、色差、耐光色牢度、表面耐磨性能、表面粗糙度、接触角)的影响,有利于了解调色后橡胶木在二次加工利用时的难易程度,为后期产业化的研究奠定理论基础。

    • 可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)采购于中国林业菌种保藏中心(cfcc 87131),由2018版病原微生物实验室生物安全管理条例可知菌种对人体无害;PDA培养基培养,北京奥博星生物技术有限责任公司;橡胶木,海南宝星昌达装饰工程公司,直径20 cm,橡胶木属于阔叶材,心边材差异不明显,以直径中心为对称点,裁切为100 mm(弦向)× 100 mm(弦向)× 10 mm(径向)尺寸备用。

    • 为研究可可球二孢对橡胶木的染色效率,采用单因素实验,以表1中标准察式培养基各成分含量为基础,对其中各项生长因子进行改良,改良察式培养基成分如表2所示,当改变某一变量时,其余成分采用标准察式培养基含量配制,共进行9组单因素实验。

      表 1  标准察式培养基

      Table 1.  Standard czapek-dox medium

      培养基组分 Medium components 蔗糖 Sucrose 硝酸钠 NaNO3 磷酸氢二钾 K2HPO4 氯化钾 Kcl 硫酸镁 MgSO4 硫酸亚铁 FeSO4
      质量浓度(g·L−1) Mass concentration 30 3.0 1.0 0.50 0.50 0.01

      表 2  改良察式培养基的各组分含量

      Table 2.  Proportion of improved czapek-dox medium

      因子 Factor 变量名称 Variable 变量范围 Variable range
      营养因子
      Nutritional factor
      碳源 Carbon source 无、葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、半乳糖
      None, glucose, sucrose, starch, glycerol, galactose
      碳源质量浓度 Carbon mass concentration/(g·L−1) 0、10、20、30、40、50
      氮源 Nitrogen source 无、蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸钠、硫酸铵
      None, peptone, yeast extract, urea, NaNO3, (NH4)2SO4
      氮源质量浓度/(g·L−1) Nitrogen source mass concentration 0、3、6、9、12、15
      环境因子
      Environmental factor
      pH 4、5、6、7、8、9
      微量元素
      Trace element
      氯化钾 KCl/(g·L−1) 0、0.5、1、1.5、2、2.5
      磷酸氢二钾 K2HPO4/(g·L−1) 0、1、2、3、4、5
      硫酸亚铁 FeSO4/(g·L−1) 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05
      硫酸镁 MgSO4/(g·L−1) 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5

      利用PDA培养基在温湿度分别为28 ℃和80%的恒温恒湿培养箱(HWS-80B,天津宏诺设备有限公司)中对菌种进行扩大培养,菌丝培养3 d后布满培养基,7 d左右分泌色素至培养基表面备用。按表2依次配制察式培养基,并用5 mm打孔器取PDA培养基菌饼接种,经观察菌落在培养基表面生长近似为圆形。每6 h测试一次可可球二孢的菌落直径,利用十字交叉法记录,利用圆的面积公式计算菌落在不同时间下的生长面积,相邻时间间隔的面积差值与培养皿面积的百分数比值为菌落生长面积比,根据生长面积比的大小得到最优生长条件。此处生长面积指菌丝生长量,分泌物产生时间比菌丝生长时间慢5 d左右。

      为验证菌落在橡胶木表面的生长率与培养基中是否一致,选取不同氮源、碳源两种营养因子,配制液体察式培养基(不添加琼脂),利用上述方法得到菌落在橡胶木表面的生长速率,并与菌落在察式培养基中的生长情况对比。培养过程中利用海绵将液体察式培养基引流至木材表面,供可可球二孢稳定生长。

    • 将木材置于1.2.1中适宜生长的液体察式培养基中,以0、5、10、15、20和25 d为时间梯度调控菌落侵染橡胶木的程度,制备可可球二孢调色橡胶木,并对其进行灭菌处理,清除其表面菌丝及分泌物后,并对其表面性能进行测试。

    • 染色面积比利用Adobe Photoshop CS6软件进行表征,为了便于分析比较,根据对称性原则,以橡胶木任意10 cm边缘为长边,距长边3 cm处为宽边,取10 cm × 3 cm的长方形区域作为研究对象,利用软件中的快速选择工具等分别对染色区域和整块木块进行选区,通过菜单栏–窗口–直方图选项统计数据,分别读取染色区域和整块木块的像素个数SnS0,表面染色面积比 = (Sn/S0)× 100%。

    • 依据GB/T 17657–2013《人造板及饰面人造板理化性能试验方法》进行色差测试,样品尺寸为100 mm × 30 mm × 10 mm,利用手持测色仪(NH310,深圳三恩驰科技有限公司)在每个样品区间选取10个点进行测定,求平均值。以0 d时的橡胶木的颜色参数L0*a0*b0*为基准,∆L*、∆a*和∆b*分别为颜色的亮度、红绿和黄蓝的变化值,色差值∆E* = (∆L*2 + ∆a*2 + ∆b*21/2,并与色差评价单位NBS进行对比分析。NBS表示颜色在视觉上的差异,∆E*为1时等于1 NBS单位。NBS范围为0 ~ 0.5 时,色差感觉极微;0.50 ~ 1.51时,色差感觉轻微;1.5 ~ 3.0时,色差感觉明显;3.0 ~ 6.0时,色差很明显;6.0以上时,色差感觉强烈。

    • 依据GB/T 17657–2013《人造板及饰面人造板理化性能试验方法》进行耐光色牢度测试,样品尺寸为100 mm × 30 mm × 10 mm,耐光色牢度利用日晒气候实验仪(YG611,常州第二纺织仪器厂)测试。在2 500 W长弧氙灯照射4 h后,测定染色相同天数时,光照前后橡胶木的表面颜色色差。

    • 表面粗糙度依据GB/T 12472–2016《产品几何量技术规范(GPS)表面结构轮廓法木制件表面粗糙度参数及其数值》测定,表面粗糙度仪(TR200,吉泰科仪)取样长度为0.8 mm,测试范围为5 μm,每个样品测试5个点,主要测定参数Ra表示轮廓算术平均偏差,Rz表示微观不平度十点高度,Rq表示均方根粗糙度,Rsm表示轮廓单元的平均宽度,并计算标准差。

    • 依据GB/T 17657–2013《人造板及饰面人造板理化性能试验方法》进行表面耐磨性能测试,用180目的砂纸粘在滚轮上,耐磨仪的转速为60 r/min,依据标准GB/T 4893.4–85《家具表面漆膜附着力交叉切割测定法》,测定磨耗转数R 为100 r时,磨损前后橡胶木的前后质量m1(单位:mg)和m2(单位:mg),耐磨值F = (m1m2)/R × 100。

    • 接触角测定仪使用德国DataPhysics公司的设备测定,每秒12帧,测定范围0 ~ 340帧。

    • 图1为不同营养因子对可可球二孢生长速度的影响。由图1a可知:不同碳源(质量浓度为30 g/L)对可可球二孢的生长速度影响不同,添加糖类比不添加糖类的生长速度快,其中添加葡萄糖的培养基可可球二孢的生长速度最快,主要原因为葡萄糖为单糖,有利于可可球二孢的消化吸收。由图1b可知:随着葡萄糖质量浓度的升高,可可球二孢的生长速度逐渐加快,但质量浓度为20、30和40 g/L时的生长速度变化不大。从成本角度考虑,20 g/L时的效果较好。图1c为不同氮源(质量浓度为3.0 g/L)对可可球二孢生长速度的影响。由图1c可知:氮源为酵母膏时可可球二孢的生长速度较快,主要因为酵母膏中含有的有机营养物质有利于可可球二孢的生长。由图1d可得:随着氮源质量浓度的提高,可可球二孢的生长速度逐渐提高,质量浓度9 ~ 15 g/L时的生长速度变化不大,因此选择9 g/L为较优氮源质量浓度。

      图  1  不同营养因子对可可球二孢菌落生长速度的影响

      Figure 1.  Effects of different nutrition factors on the growth rate of Lasiodiplodia theobromae

    • 图2可知,当pH值为4、5和6时,菌落生长速度较快,其中pH值为4时菌落生长速度最快,因此弱酸性酸性培养基更有利于可可球二孢菌落的生长。

      图  2  pH值对可可球二孢菌落生长速度的影响

      Figure 2.  Effects of pH values on the growth rate of Lasiodiplodia theobromae

    • 图3为微量元素对可可球二孢菌落生长速度的影响。图3a表明:可可球二孢菌落生长速度随硫酸镁质量浓度的增加而加快,当质量浓度大于1 g/L时,菌落生长速度变化不大。图3b表明:可可球二孢菌落生长速度随硫酸亚铁质量浓度的增加呈现出先增加后减小的趋势,当0.03 g/L时,可可球二孢的生长速度最快。由图3c可知:氯化钾质量浓度为0.2 g/L时,可可球二孢的生长速度最快,质量浓度过高时对其生长有抑制作用。由图3d可知:磷酸氢二钾对可可球二孢的生长有抑制作用,不加磷酸氢二钾对其生长有促进作用。

      图  3  微量元素对可可球二孢菌落生长速度的影响

      Figure 3.  Effects of trace elements on the growth rate of Lasiodiplodia theobromae

    • 图4为在不同碳源和氮源培养基中,菌落在橡胶木表面的生长速度,由图4a可知:菌落在不同碳源为培养基的橡胶木表面生长时,葡萄糖对菌落的生长促进作用最强,蔗糖次之,加入碳源的菌落生长速率大于未添加碳源的培养基。由图4b可知:可可球二孢在不同氮源的橡胶木表面生长时,酵母膏对可可球二孢的生长促进作用最强,蛋白胨次之,尿素对可可球二孢的生长有抑制作用,与在培养基中的生长情况相符。因此,菌落在不同碳源和氮源的橡胶木表面生长情况与培养基中基本相符。

      图  4  可可球二孢在橡胶木表面的生长速度

      Figure 4.  Growth rate of Lasiodiplodia theobromae on rubber wood surface

    • 图5a ~ f分别为0、5、10、15、20、25 d时橡胶木表面的染色效果,5 d时的染色面积比为53.43%,随着时间的增加,染色面积逐渐提高,但提高速度逐渐降低,25 d的染色面积比为98.94%,染色效果由不均匀逐渐变均匀。因此,在15 d以上染色效果较均匀,在15 d以内时可以考虑定向培养可可球二孢调控表面图案的装饰效果。

      图  5  不同时间可可球二孢对橡胶木染色面积比的影响

      Figure 5.  Effects of Lasiodiplodia theobromae on area ratio of rubber wood surface at different time

    • 表3为可可球二孢调色橡胶木表面色差的变化。随着时间的增加,颜色参数∆L*、∆a*和∆b*值整体逐渐减小,且0 ~ 15 d的时候减小速度较快,15 ~ 25 d时减小速度较慢,说明颜色的亮度逐渐降低,且由暖色调的红黄系列变为冷色调的蓝绿系列。图5的上染颜色变化也符合此趋势。说明可可球二孢的色素及其分泌物首先在橡胶木表面不均匀着色,形成良好的纹理装饰效果,随时间的增长可可球二孢的色素逐渐增多,分泌逐渐均匀,整体颜色逐渐加深。

      表 3  不同时间可可球二孢对橡胶木表面色差的影响

      Table 3.  Effects of Lasiodiplodia theobromae on color difference of rubber wood surface at different time

      时间 Time/d L* a* b* E*
      0 0 0 0 0
      5 − 13.84 − 1.52 − 3.59 14.38
      10 − 23.91 − 6.02 − 10.47 26.78
      15 − 28.63 − 6.83 − 13.02 32.18
      20 − 29.61 − 7.33 − 13.21 33.24
      25 − 33.66 − 5.86 − 13.90 36.89
      注Notes:L0 = 57.84,a0 = 10.48,b0 = 21.37。
    • 表4为可可球二孢调色橡胶木的耐光色牢度。由表4中数据可得:光照前后颜色的亮度差值∆L*的绝对值呈逐渐减小的趋势,∆a*和∆b*变化波动较大,但色差∆E*数值逐渐降低。由色差∆E*的单位与NBS单位大致相同可知:0 d时,NBS数值大于6,色差感觉强烈;5 ~ 25 d时,NBS值在3 ~ 6之间,色差感觉明显;但10 ~ 20 d范围内,NBS值在1.5 ~ 3.0之间,色差感觉较小。0 d时,色差NBS值明显大于调色木材,说明可可球二孢产生的色素和分泌物耐光性能较好。

      表 4  不同时间可可球二孢对橡胶木表面耐光色牢度的影响

      Table 4.  Effects of Lasiodiplodia theobromae on light fastness of rubber wood surface at different time

      时间 Time/d L* a* b* E*
      0 − 12.50 2.83 2.03 12.98
      5 − 1.17 1.71 3.99 4.50
      10 − 0.36 − 0.92 − 1.63 1.91
      15 1.67 0.21 0.64 1.80
      20 − 0.55 2.34 1.76 2.98
      25 3.87 0.10 0.95 3.99
    • 表5为可可球二孢调色橡胶木的表面粗糙度。由表5可知:随着时间的增加,RaRzRq的值逐渐减小,其中主要数值Ra从0 d的11.769 μm下降到25 d的6.785 μm,降低了42.34%,说明橡胶木表面粗糙度逐渐减小;Rsm由0.150 mm提高至0.218 mm,提高了45.3%,说明橡胶木表面突起相对较少,表面趋于光滑,有利于表面的机械加工等。

      表 5  不同时间可可球二孢对橡胶木表面粗糙度的影响

      Table 5.  Effects of Lasiodiplodia theobromae on roughness of rubber wood surface at different time

      时间 Time/d Ra/μm Rz/μm Rq/μm Rsm/mm
      0 11.769 66.213 14.800 0.150
      5 11.718 63.842 14.583 0.158
      10 9.967 56.299 12.537 0.150
      15 8.266 44.415 10.137 0.193
      20 7.804 42.342 9.780 0.185
      25 6.785 35.593 8.466 0.218
    • 图6为可可球二孢调色橡胶木的表面耐磨性能。磨耗值由0 d时的45 mg/100r增加至25 d的1 296 mg/100r,其中0 ~ 15 d时,磨耗值增加缓慢,在15 ~ 25 d的范围内磨耗值增加速度较快。主要原因为0 ~ 15 d范围内可可球二孢生长逐渐布满橡胶木,菌落前期分泌色素较少,随着时间增加,菌落大量产生色素,与木材之间发生反应,同时色素与木材相比耐磨性能较差,磨耗值显著提高。被可可球二孢侵染后的橡胶木表面的耐磨性下降,有利于降低表面磨削时对刀具的损耗。

      图  6  可可球二孢菌落对橡胶木表面耐磨性能的影响

      Figure 6.  Effects of Lasiodiplodia theobromae on wear-resisting of rubber wood surface at different time

    • 图7为可可球二孢菌落对橡胶木表面接触角的影响。随时间的增加,调色后的橡胶木表面的静态接触角由115°提高至130°,提高了13.04%。动态接触角显著增大,即水滴渗透进入木材速度显著降低,原因可能为菌丝和色素等物质侵入木材内部时堵塞橡胶木的导管和纹孔等结构,在木材表面形成了一层“保护膜”,从而阻塞水滴深入通道,降低了橡胶木的渗透性,与纤维素酶对木材接触角的作用[20]有相似之处。

      图  7  可可球二孢菌落对橡胶木表面接触角的影响

      Figure 7.  Effects of Lasiodiplodia theobromae on contact angle of rubber wood surface at different time

    • (1)可可球二孢的适宜生长环境为酵母膏9 g/L,葡萄糖20 g/L,pH值为弱酸性,硫酸镁1.0 g/L,硫酸亚铁0.03 g/L,氯化钾0.2 g/L。

      (2)在适宜生长环境中,可可球二孢调色橡胶木在前期可形成较为自由的装饰纹理,逐渐形成均匀的染色效果;表面颜色逐渐由红黄到蓝绿色系,调色木材耐光色牢度显著下降,静态接触角提高了13.04%,动态接触角显著提高,表面粗糙度Ra降低了42.34%,有做表面装饰材料的潜能。

      (3)可可球二孢调色橡胶木与传统的木材调色方式相比,具有绿色、环保无污染的优点,是木材生物加工的一种方式。

参考文献 (20)

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