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过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究

王兵 程子义 张蕾 赵芝婧 陆海 刘頔

王兵, 程子义, 张蕾, 赵芝婧, 陆海, 刘頔. 过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
引用本文: 王兵, 程子义, 张蕾, 赵芝婧, 陆海, 刘頔. 过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
Wang Bing, Cheng Ziyi, Zhang Lei, Zhao Zhijing, Lu Hai, Liu Di. Tobacco overexpression Populus tomentosa mitochondria ascorbate peroxidase improving stress resistance[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
Citation: Wang Bing, Cheng Ziyi, Zhang Lei, Zhao Zhijing, Lu Hai, Liu Di. Tobacco overexpression Populus tomentosa mitochondria ascorbate peroxidase improving stress resistance[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390

过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
基金项目: 国家自然科学基金项目(31971618)
详细信息
    作者简介:

    王兵,博士。主要研究方向:树木分子生物学。Email:vipwb1519599@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者:

    陆海,教授,博士生导师。主要研究方向:杨树抗胁迫和木材发育。Email:luhai1974@bjfu.edu.cn 地址:同上

    刘頔,副教授。主要研究方向:植物发育生物学。Email:liudi@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S718.43; S792.117

Tobacco overexpression Populus tomentosa mitochondria ascorbate peroxidase improving stress resistance

  • 摘要:   目的  为了研究毛白杨线粒体APX(PtomtAPX)在抗逆过程中的作用,本研究对过表达PtomtAPX的转基因烟草进行抗逆研究。  方法  对过表达PtomtAPX烟草和野生型烟草进行干旱、盐、氧化胁迫处理后,测量相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量、APX活性、AsA消耗量、NADP/NADPH比值和SOD活性。  结果  通过对比转基因烟草植株与野生型植株的生长差异发现,在氧化胁迫、盐胁迫和干旱胁迫下,转PtomtAPX基因烟草的APX活性、相对含水量、叶绿素含量、AsA消耗量、NADP/NADPH比值升高量均明显高于野生型,其中转PtomtAPX基因烟草的APX活性为野生型的1.77倍,平均相对含水量为野生型的1.15倍,叶绿素含量为野生型的1.6倍,AsA消耗量为野生型的1.11倍,NADP/NADPH值为野生型的1.18倍,表明过表达PtomtAPX转基因植株清除活性氧的能力更强。  结论  在非生物胁迫下,PtomtAPX能消除H2O2,防止细胞损伤,在植物抗逆中发挥重要作用。
  • 图  1  PtomtAPX-OE烟草与野生型烟草在干旱环境下的应答反应

    CK为对照,II-1 ~ II-3为过表达烟草3个不同的株系。下同。CK is control,II-1 − II-3 represent the three different strains of overexpressed tobaccos. The same below.

    Figure  1.  Responses of overexpressed APX transgenic tobaccos and wild type under drought environment

    图  2  干旱胁迫下野生型与PtomtAPX-OE烟草的差异

    Figure  2.  Differences between wild type and APX-overexpressed tobaccos under drought stress

    图  3  干旱胁迫下PtomtAPX-OE烟草与野生型其他生理应答的差异

    Figure  3.  Differences in physiological responses of APX-overexpressed tobacco and wild type under drought stress

    图  4  盐胁迫对PtomtAPX-OE烟草与野生型烟草叶片的影响

    Figure  4.  Effects of salt stress on APX-overexpressed tobacco and wild type tobacco leaves

    图  5  氧化胁迫对PtomtAPX-OE烟草与野生型植株的影响

    Figure  5.  Effects of oxidative stress on APX-overexpressed tobacco and wild type plants

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    王保平, 李全发, 王明枝, 杨晓晖, 张秋英, 李慧, 李景文, 熊瑾, 李梅, 杨海龙, 詹亚光, 李俊清, 张克斌, 韩海荣, 李吉跃, 范文义, 朱金兆, 朱金兆, 耿晓东, 赵敏, 徐峰, 梁机, 王洁瑛, 王雪军, 吕建雄, 窦军霞, 秦瑶, 刘文耀, 李发东, 李俊清, 李妮亚, 陆熙娴, 陈晓阳, 尹立辉, 秦素玲, 陈素文, 赵宪文, 倪春, 李凤兰, 孙玉军, 刘雪梅, 陈晓阳, 李云, 唐黎明, 毕华兴, 于贵瑞, 欧国强, 乔杰, 沈有信, 刘桂丰, 齐实, 康峰峰, 李黎, 慈龙骏, 赵双菊, 李伟, 魏建祥, 宋献方, 王玉成, 文瑞钧, 马钦彦, 张桂芹, 李伟, 韦广绥, 任海青, 王雪, 黎昌琼, 刘伦辉, 蒋建平, 朱国平, 张万军, 丁霞, 周海江, 杨谦, , 孙涛, 宋清海, 李慧, 孙晓敏, 刘莹, 孙志强, 李宗然, 
    , .  毛白杨转rolB基因植株生根能力的研究 . 北京林业大学学报, 2005, 27(5): 54-58.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-31
  • 修回日期:  2020-04-02
  • 网络出版日期:  2020-07-13
  • 刊出日期:  2020-07-25

过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
    基金项目:  国家自然科学基金项目(31971618)
    作者简介:

    王兵,博士。主要研究方向:树木分子生物学。Email:vipwb1519599@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院

    通讯作者: 陆海,教授,博士生导师。主要研究方向:杨树抗胁迫和木材发育。Email:luhai1974@bjfu.edu.cn 地址:同上; 刘頔,副教授。主要研究方向:植物发育生物学。Email:liudi@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S718.43; S792.117

摘要:   目的  为了研究毛白杨线粒体APX(PtomtAPX)在抗逆过程中的作用,本研究对过表达PtomtAPX的转基因烟草进行抗逆研究。  方法  对过表达PtomtAPX烟草和野生型烟草进行干旱、盐、氧化胁迫处理后,测量相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量、APX活性、AsA消耗量、NADP/NADPH比值和SOD活性。  结果  通过对比转基因烟草植株与野生型植株的生长差异发现,在氧化胁迫、盐胁迫和干旱胁迫下,转PtomtAPX基因烟草的APX活性、相对含水量、叶绿素含量、AsA消耗量、NADP/NADPH比值升高量均明显高于野生型,其中转PtomtAPX基因烟草的APX活性为野生型的1.77倍,平均相对含水量为野生型的1.15倍,叶绿素含量为野生型的1.6倍,AsA消耗量为野生型的1.11倍,NADP/NADPH值为野生型的1.18倍,表明过表达PtomtAPX转基因植株清除活性氧的能力更强。  结论  在非生物胁迫下,PtomtAPX能消除H2O2,防止细胞损伤,在植物抗逆中发挥重要作用。

English Abstract

王兵, 程子义, 张蕾, 赵芝婧, 陆海, 刘頔. 过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
引用本文: 王兵, 程子义, 张蕾, 赵芝婧, 陆海, 刘頔. 过表达毛白杨线粒体APX基因烟草提高抗逆能力的研究[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
Wang Bing, Cheng Ziyi, Zhang Lei, Zhao Zhijing, Lu Hai, Liu Di. Tobacco overexpression Populus tomentosa mitochondria ascorbate peroxidase improving stress resistance[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
Citation: Wang Bing, Cheng Ziyi, Zhang Lei, Zhao Zhijing, Lu Hai, Liu Di. Tobacco overexpression Populus tomentosa mitochondria ascorbate peroxidase improving stress resistance[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(7): 33-39. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190390
  • 在环境胁迫下,植物会产生大量的活性氧(ROS),主要有H2O2、超氧阴离子O2−和一氧化氮等[1]。此外,ROS也是重要的信号分子,参与调节植物的许多生长发育过程,包括细胞程序性死亡、激素作用、病原体反应、压力感知和光合作用调节等[1-5]。然而ROS起着双重作用,活性氧浓度过高会导致细胞遭受不可逆转的破坏,最终致死[1, 5-6]

    在植物细胞中存在两种系统共同维持着ROS的稳定。当细胞内产生高浓度的ROS时,首先,SOD参与毒性较强的O2−转化为毒性较弱的H2O2[7],再通过CAT和抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH cycle)将H2O2清除,APX参与将H2O2催化形成H2O的过程[8]。APX的表达受到盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫等[9]多种环境刺激的调节,在这些逆境下,APX的活性明显增强[10]

    APX是一个多基因家族,定位在叶绿体基质、叶绿体类囊体、细胞质、微体以及线粒体[11-14]。不同细胞器中的H2O2主要是由自身的APX清除的[15-16]。小麦(Triticum aestivum)两个APX基因的表达受干旱胁迫的影响[17],5个水稻APX基因OsAPX 1、OsAPX 2、OsAPX 5、OsAPX 6、OsAPX 7的表达量增加[18]OsAPX 8的表达量呈现显著下降的趋势。受到盐胁迫时,水稻(Oryza sativaOsAPX 2、OsAPX 7和OsAPX 8这3个APX基因转录水平的表达出现明显的差异[19]。在高温和干旱的双重胁迫下,拟南芥APX1在蛋白水平和转录水平的表达量都表现出明显上升趋势,APX1的突变体、野生型拟南芥植株与受胁迫植株相比,上升趋势更为明显[20]。在植株中过表达APX基因通常可以增加植株在逆境中的抗性。转水稻APX2基因的拟南芥植株在盐胁迫下表现出更强的耐受性[21-22]。拟南芥APX在烟草中过表达可以促进烟草植株的抗性[23]

    本研究取野生型烟草植株和过表达PtomtAPX基因的烟草植株分别进行以下3种非生物胁迫处理:盐胁迫、干旱胁迫和氧化胁迫。测定并记录处理过程中的生理数据的变化,比较野生型植株与PtomtAPX-OE烟草植株的差异,更加深入地了解PtomtAPX在逆境中对植物生长的影响。

    • PtomtAPX-OE烟草植株由实验室前期工作所得[24],培养条件为25 ℃,光照时间16 h,光照强度为250 μmol/(m2∙s)。取长势相似且状态良好的野生型烟草与PtomtAPX-OE作为实验材料,分别进行盐胁迫、氧化胁迫和干旱胁迫处理,处理条件如下。

      对照植株浇水50 mL,干旱胁迫植株不浇水,盐胁迫植株用200 mmol/L NaCl含量的水浇灌50 mL,氧化胁迫植株是喷洒50 mmol/L甲基紫精(MV)溶液于烟草叶片上。

    • 取野生型和转基因烟草叶片,鲜质量记为Fw,饱和鲜质量用Tw表示,于80 ℃烘箱中烘干,干质量记为Dw。相对含水量RWC = (FwDw)/(TwDw) × 100%。

    • 选取PtomtAPX-OE和野生型烟草叶片,分别加入80%丙酮5 mL,DMSO 5 mL,水浴后冷却,定容至25 mL,空白对照为80%丙酮,分别测定OD663 nm和OD645 nm数值。

      叶绿素含量 = Chlt × 0.025 × 2.5/W

      Chlt = 8.02 × OD663 nm + 20.21 × OD645 nm

      W = Fw(1 − RWC)

      式中:W为叶片干质量,Chlt为叶绿素总含量。

    • 分别称量PtomtAPX-OE和野生型烟草叶片0.5 g,用液氮研磨,分别吸取625 μL 0.1% TCA和0.5% TBA溶液625 μL加入研磨液中,沸水加热10 min,常温冷却,用转速为8 000 r/min离心10 min;同时用0.5% TBA为空白对照,分别在OD660 nm和OD532 nm下进行测定吸光值。

    • Bradford法测定总蛋白含量。

    • 取3 mL活性测定反应液(0.1 mmol/L EDTA, 50 mmol/L磷酸缓冲液,pH 7.0,0.5 mmol/L ASA,0.1 mmol/L H2O2)于试管中,加酶蛋白提取液50 μL。空白对照为不加AsA的反应液,每隔1 min记录1次OD290 nm,连续记录5次。

    • 取4 mL活性测定反应液(2.25 mmol/L NBT,0.1 mmol/L EDTA, 13 mmol/L Met,60 μmol/L核黄素,50 mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液)于试管中,加酶蛋白提取液20 μL,以未加酶液的磷酸缓冲液A0为空白对照,测定OD560 nm的变化。

    • 按照AsA试剂盒的说明书操作。

    • 采用试剂盒(amplex red hydrogen peroxide/peroxidase assay)测定H2O2含量。

    • 采用EnzyChrom NADP/NADPH Assay试剂盒测定NADP/NADPH的比值。

    • 干旱胁迫下,野生型植株与PtomtAPX-OE植株的含水量分别下降62.4%和47.4%;比较叶绿素含量发现PtomtAPX-OE植株是野生型植株的1.6倍;可溶性总蛋白明显下降;细胞内MDA的增加量为野生型的55.1%(图1)。

      图  1  PtomtAPX-OE烟草与野生型烟草在干旱环境下的应答反应

      Figure 1.  Responses of overexpressed APX transgenic tobaccos and wild type under drought environment

      在干旱胁迫下,H2O2含量及APX活性都有显著变化。PtomtAPX-OE植株的H2O2上升量为野生型的50.4%,APX活性的平均增加值是野生型的1.77倍。APX活性的上升会导致AsA消耗量的增加,在受到干旱胁迫后野生型植株AsA的消耗量为52.2%,而转基因植株的AsA消耗量为63.5%(图2)。

      图  2  干旱胁迫下野生型与PtomtAPX-OE烟草的差异

      Figure 2.  Differences between wild type and APX-overexpressed tobaccos under drought stress

      AsA的再生由NADPH作为电子供体,在受到干旱胁迫后,野生型植株与PtomtAPX-OE植株NADP/NADPH值、SOD值均出现了显著的上升,NADP/NADPH值分别升高1.18和3.36倍,转基因植株SOD值的升高值为野生型的1.81倍(图3)。

      图  3  干旱胁迫下PtomtAPX-OE烟草与野生型其他生理应答的差异

      Figure 3.  Differences in physiological responses of APX-overexpressed tobacco and wild type under drought stress

    • 在受到盐胁迫后,野生型和PtomtAPX-OE植株的可溶性总蛋白、相对含水量及叶绿素含量下降,MDA含量、APX活性、NADP/NADPH比值、SOD酶活性出现了显著的上升。转基因植株中,可溶性总蛋白含量比野生型高23.1%,APX活性升高81.7%,SOD酶活性升高57.7%,MDA含量升高2.5倍,相对含水量下降22.2%,叶绿素含量降低为野生型的47.2%。在野生型植株中,MDA含量升高3.7倍,APX活性升高19%,SOD酶活性升高44.8%,相对含水量下降33.2%(图4)。

      图  4  盐胁迫对PtomtAPX-OE烟草与野生型烟草叶片的影响

      Figure 4.  Effects of salt stress on APX-overexpressed tobacco and wild type tobacco leaves

    • 本研究发现,在氧化胁迫下,野生型植株NADP/NADPH升高64%,APX活性升高38.5%。在PtomtAPX-OE植株中,叶绿素含量为野生型的1.78倍。APX活性升高91%,相对含水量降低值比野生型低14.8%,SOD酶活性升高值比野生型高52%,MDA升高值为野生型的55.3%,可溶性总蛋白的降低值为野生型的28%,H2O2升高值仅为野生型的48.2%(图5)。

      图  5  氧化胁迫对PtomtAPX-OE烟草与野生型植株的影响

      Figure 5.  Effects of oxidative stress on APX-overexpressed tobacco and wild type plants

      与干旱胁迫和盐胁迫类似,植株在受到氧化胁迫后,PtomtAPX-OE和野生型植株的可溶性总蛋白、相对含水量及叶绿素含量大幅度下降,分别为野生型的28%、14.8%及1.78倍,MDA含量、APX活性、NADP/NADPH比值、SOD酶活性出现了显著的上升。野生型植株中,APX活性升高38.5%,NADP/NADPH比值升高64%。PtomtAPX-OE植株中,MDA升高值为野生型的55.3%,APX活性升高91%,NADP/NADPH比值升高2.48倍。SOD酶活性升高值比野生型高52%。

    • 有研究表明,胁迫环境中产生的ROS会严重影响植株的正常生长,其中细胞膜受损较为严重[25-27]。由于ROS的大量产生,活性氧消除体系的代谢效率与植株在逆境中的抗性紧密相关[28-30]。在植物逆境应答中,AsA对于维持APX清除H2O2的能力至关重要[31-32]

      本研究通过比较野生型与PtomtAPX-OE植株中可溶性总蛋白含量、相对含水量、叶绿素含量等生理反应的相关指标,发现转基因植株在受到胁迫处理后均升高。这些指标检测结果和之前的研究结果几乎一致[26]。MDA含量明显较低,作为细胞损伤程度的指标丙二醛[27],在干旱胁迫、盐胁迫和氧化胁迫后,过表达烟草中的增加值明显比野生型少,表明烟草有消除胁迫所造成的损伤的能力。此外更多的AsA消耗量,升高的SOD酶活性,降低的H2O2含量,增大的NADP/NADPH比值,表明PtomtAPX具有H2O2清除能力,这使得细胞损伤较小,在逆境中的耐性更强。

      以上结果表明,PtomtAPX-OE提高了烟草的抗逆性,能够有效降解H2O2,对烟草的抗逆具有重要作用。这一结论为PtomtAPX基因在毛白杨中的研究奠定了研究基础,为后续研究提供了方向。

参考文献 (32)

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