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生防细菌对油茶炭疽病病原菌的抑制作用

张平 李朝阳 赵清泉 王立海 马玲

张平, 李朝阳, 赵清泉, 王立海, 马玲. 生防细菌对油茶炭疽病病原菌的抑制作用[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
引用本文: 张平, 李朝阳, 赵清泉, 王立海, 马玲. 生防细菌对油茶炭疽病病原菌的抑制作用[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
Zhang Ping, Li Chaoyang, Zhao Qingquan, Wang Lihai, Ma Ling. Inhibition effects of biocontrol bacteria strains on the pathogen of Camellia oleifera anthracnose[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
Citation: Zhang Ping, Li Chaoyang, Zhao Qingquan, Wang Lihai, Ma Ling. Inhibition effects of biocontrol bacteria strains on the pathogen of Camellia oleifera anthracnose[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409

生防细菌对油茶炭疽病病原菌的抑制作用

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
基金项目: 国家“十三五”重点研发项目(2017YFD0600101),双一流创新人才培养专项(000/41113102)
详细信息
    作者简介:

    张平。主要研究方向:林木病害生物防治。Email:ifedu@126.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林木保护技术创新中心

    通讯作者:

    马玲,教授,博士生导师。主要研究方向:林木病虫害综合防治。Email:maling@163.com 地址:同上

Inhibition effects of biocontrol bacteria strains on the pathogen of Camellia oleifera anthracnose

  • 摘要:   目的  从酸浆果实内分离筛选出对油茶炭疽病病原果生刺盘孢具有拮抗作用的内生细菌,并了解该菌对油茶炭疽病病原菌的抑菌机制,以期为油茶炭疽病的田间防治提供理论依据。  方法  本研究通过组织分离法从果实中分离出细菌14株, 通过平板对峙法筛选得到对油茶炭疽病病原菌具有显著抑制作用的细菌3株,菌株依次命名为DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13。结合菌株形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列比对分析,对菌株进行了鉴定。在上述试验基础上,判定生防菌株能否产生蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶,通过显微镜观察3株细菌的无菌上清发酵液对病原菌丝的生长情况,并在室内测定了油茶盆栽苗的防治效果。  结果  3株细菌无菌发酵上清液均能抑制油茶炭疽病病原菌丝的正常生长,使其尖端膨大,畸变,扭曲。可产生蛋白酶和纤维素酶,不能产生β-1,3-葡聚糖酶;5个梯度的无菌发酵上清液(0.6 × 108、1.0 × 108、1.4 × 108、1.8 × 108、2.2 × 108 cfu/mL)与对照相比,对油茶炭疽病病原菌抑菌效果显著(P < 0.05),抑菌率最高达到81.14%。其中,菌株(DLSB-4)5个梯度的无菌发酵上清液对油茶盆栽苗的防治效果分别达到40.2%、43.9%、57.7%、68.7%和71.1%,差异显著(P < 0.05),且无菌发酵上清液的含量与防治效果呈正相关。  结论  3株细菌通过自身产生拮抗作用酶来抑制果生刺盘孢病原菌菌丝的生长,降低油茶炭疽病的发病率和病情指数。
  • 图  1  菌株的形态

    A、B、C菌株分别为DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13. Strains A, B and C are DLSB-1, DLSB-4 and DLSB-13, respectively.

    Figure  1.  Morphology of strains

    图  2  菌株DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13的系统发育树

    Figure  2.  Phylogenetic tree of strains DLSB-1, DLSB-4 and DLSB-13

    图  3  3株芽孢杆菌产蛋白酶的能力

    CK 为无菌水处理;A、B、C分别为菌株DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13. CK is sterile water control; strains A, B and C are DLSB-1, DLSB-4 and DLSB-13, respectively.

    Figure  3.  Ability of 3 strains of Bacillus to produce protease

    图  4  3株芽孢杆菌产纤维素酶的能力

    CK 为无菌水处理;A、B、C分别为菌株DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13. CK is sterile water control; strains A, B and C are DLSB-1, DLSB-4 and DLSB-13, respectively.

    Figure  4.  Ability of 3 strains of Bacillus to produce cellulolytic enzymes

    图  5  3株芽孢杆菌产β-1,3-葡聚糖酶的能力

    CK 为无菌水处理;A、B、C分别为菌株DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13. CK is sterile water control; strains A, B and C are DLSB-1, DLSB-4 and DLSB-13, respectively.

    Figure  5.  Ability of 3 strains of Bacillus to produce β-1,3-dextranase

    图  6  芽孢杆菌无菌发酵上清液对油茶炭疽病菌的抑菌活性

    CK1. PDA培养基;CK2. 60%高效多菌灵600倍液;A. DLSB-1;B. DLSB-4;C. DLSB-13。CK1, PDA medium; CK2, 600 times solution of 60% high-efficiency carbendazim ; A, DLSB-1; B, DLSB-4; C, DLSB-13.

    Figure  6.  Inhibition activity of Bacillus sterile fermentative liquid on Colletotrichum fructicola

    图  7  芽孢杆菌无菌发酵上清液对油茶炭疽病菌的抑菌效果

    CK1为PDA液体培养基;CK2为60%高效多菌灵600倍液。T1. 0.6 × 108 cfu/mL;T2. 1.0 × 108 cfu/mL;T3. 1.4 × 108 cfu/mL;T4. 1.8 × 108 cfu/mL;T5.2.2 × 108 cfu/mL。不同的小写字母表示组间处理的显著性差异。下同。CK1, PDA liquid medium; CK2, 600 times solution of 60% high-efficiency carbendazim; T1, 0.6 × 108 cfu/mL; T2, 1.0 × 108 cfu/mL; T3, 1.4 × 108 cfu/mL; T4, 1.8 × 108 cfu/mL; T5, 2.2 × 108 cfu/mL. Different lowercase letters indicate significant differences between treatments. The same below.

    Figure  7.  Inhibition effects of Bacillus sterile fermentative liquid on Colletotrichum fructicola

    图  8  芽孢杆菌无菌发酵上清液对病原菌菌丝生长的影响

    CK为正常生长的菌丝;A、B和C为受到抑制的菌丝。CK is normally growing hyphae; A, B and C are suppressed hyphae.

    Figure  8.  Effects of Bacillus sterile fermentative liquid on mycelia growth

    图  9  不同处理无菌发酵上清液及空白处理后的油茶叶片病斑形态

                         CK. 无菌水处理。CK, sterile water control.

    Figure  9.  Different treatments of sterile fermentative liquid and blank treatment of leaf lesions

    表  1  3株细菌的生理生化特性

    Table  1.   Physiological and biochemical characteristics of three bacteria

    测试项目 Testing item结果 Result
    DLSB-1DLSB-4DLSB-13
    革兰氏染色 Gram stain + + +
    甲基红 Methy red
    柠檬酸盐利用 Citrate utilization
    精氨酸双水解 Agrinine dihydrolase
    明胶液化 Gelatin liquefaction + + +
    V-P测定 V-P reaction + + +
    反硝化 Nitrate to N2 + + +
    D-果糖 D-fructose + + +
    D-半乳糖 D-galactose + + +
    D-甘露醇 D-mannitol + + +
    D-木糖 D-xylose
    山梨醇 Sorbitol + + +
    酪氨酸 Tyrosine + + +
    酯酶 Esterase + + +
    石蕊牛奶 Litmus milk + + +
    好氧性 Aerobic +、– +、– +、–
    最高耐盐20% Growth in 20% NaCl + + +
    最高致死温度80 ℃
    The highest lethal temperature of 80 ℃
    最高生长温度45 ℃
    The highest growth temperature of 45 ℃
    + + +
    注:“+”表示阳性或者生长;“–”表示反应阴性或者不生长。Notes: “+” means positive or growth; “–” means negative or no growth.
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    表  2  细菌无菌发酵上清液对油茶炭疽病的防治效果

    Table  2.   Inhibition effects of sterile fermentative liquid about strain on Camellia oleifera anthracnose

    处理 Treatment发病率 Rate of disease/%病情指数 Disease index保护效果 Protection effect/%
    T1 35.3 ± 3.2 b 42.2 ± 2.1 b 40.2 ± 2.3 e
    T2 32.4 ± 0.9 c 39.6 ± 3.2 b 43.9 ± 3.2 d
    T3 30.8 ± 2.1 d 29.9 ± 3.8 c 57.7 ± 2.9 c
    T4 29.8 ± 4.5 d 22.1 ± 5.0 d 68.7 ± 3.5 b
    T5 27.5 ± 3.4 e 20.4 ± 2.1 d 71.1 ± 4.3 a
    CK 75.6 ± 2.6 a 68.5 ± 2.3 a
    注:CK 为无菌水处理;不同的小写字母表示处理之间的显着性差异。Notes: CK is sterile water control; different lowercase letters indicate significance differences between treatments.
    下载: 导出CSV
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    [19] 冶民生, 盖颖, 王岩, 柳新伟, 侯旭, 高鹏, 孙宇瑞, 张学俭, 李云成, 张文娟, 李绍才, 何磊, 谢响明, 王盛萍, 张金凤, 李永慈, 贺庆棠, 蒋佳荔, 罗菊春, 朱妍, 廖学品, 何静, 吴玉英, 孙海龙, 康向阳, 申卫军, 唐守正, 成仿云, 马道坤, 冯仲科, 王文棋, 张华丽, 陆佩玲, 昌明, 关文彬, 张志强, 吕建雄, 崔保山, 李吉跃, 于晓南, 李小飞, 杨志荣, 张桂莲, 孙阁, 何权, 路婷, 蒋湘宁, 史剑波, 赵广杰, 静洁, 关毓秀, 王军辉, 石碧, 吴斌, 张平冬, 王尚德, 彭少麟, 蒲俊文, 马克明, 张满良, 陈永国, 汪燕, 赵燕东, 孙晓霞, 刘国华, 余新晓, 胡文忠, 林威, 汪西林, .  黄孢原毛平革菌预处理麦草生物制浆的研究 . 北京林业大学学报,
    [20] 张文娟, 盖颖, 张学俭, 谢响明, 李云成, 孙宇瑞, 高鹏, 李永慈, 王岩, 李绍才, 侯旭, 何磊, 柳新伟, 张金凤, 贺庆棠, 朱妍, 罗菊春, 王盛萍, 冶民生, 蒋佳荔, 张志强, 关文彬, 孙海龙, 申卫军, 康向阳, 李吉跃, 廖学品, 昌明, 成仿云, 唐守正, 吕建雄, 王文棋, 冯仲科, 陆佩玲, 何静, 张华丽, 马道坤, 崔保山, 吴玉英, 张平冬, 路婷, 关毓秀, 赵广杰, 孙阁, 静洁, 吴斌, 蒋湘宁, 史剑波, 张桂莲, 何权, 于晓南, 石碧, 杨志荣, 李小飞, 王军辉, 王尚德, 赵燕东, 马克明, 孙晓霞, 张满良, 蒲俊文, 彭少麟, 陈永国, 汪燕, 林威, 余新晓, 胡文忠, 刘国华, 汪西林.  黄绿木霉菌代谢产物对杨树烂皮病菌抑菌能力的研究 . 北京林业大学学报,
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-10-14
  • 修回日期:  2020-04-03
  • 网络出版日期:  2020-10-16

生防细菌对油茶炭疽病病原菌的抑制作用

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
    基金项目:  国家“十三五”重点研发项目(2017YFD0600101),双一流创新人才培养专项(000/41113102)
    作者简介:

    张平。主要研究方向:林木病害生物防治。Email:ifedu@126.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林木保护技术创新中心

    通讯作者: 马玲,教授,博士生导师。主要研究方向:林木病虫害综合防治。Email:maling@163.com 地址:同上

摘要:   目的  从酸浆果实内分离筛选出对油茶炭疽病病原果生刺盘孢具有拮抗作用的内生细菌,并了解该菌对油茶炭疽病病原菌的抑菌机制,以期为油茶炭疽病的田间防治提供理论依据。  方法  本研究通过组织分离法从果实中分离出细菌14株, 通过平板对峙法筛选得到对油茶炭疽病病原菌具有显著抑制作用的细菌3株,菌株依次命名为DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13。结合菌株形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列比对分析,对菌株进行了鉴定。在上述试验基础上,判定生防菌株能否产生蛋白酶、纤维素酶和β-1,3-葡聚糖酶,通过显微镜观察3株细菌的无菌上清发酵液对病原菌丝的生长情况,并在室内测定了油茶盆栽苗的防治效果。  结果  3株细菌无菌发酵上清液均能抑制油茶炭疽病病原菌丝的正常生长,使其尖端膨大,畸变,扭曲。可产生蛋白酶和纤维素酶,不能产生β-1,3-葡聚糖酶;5个梯度的无菌发酵上清液(0.6 × 108、1.0 × 108、1.4 × 108、1.8 × 108、2.2 × 108 cfu/mL)与对照相比,对油茶炭疽病病原菌抑菌效果显著(P < 0.05),抑菌率最高达到81.14%。其中,菌株(DLSB-4)5个梯度的无菌发酵上清液对油茶盆栽苗的防治效果分别达到40.2%、43.9%、57.7%、68.7%和71.1%,差异显著(P < 0.05),且无菌发酵上清液的含量与防治效果呈正相关。  结论  3株细菌通过自身产生拮抗作用酶来抑制果生刺盘孢病原菌菌丝的生长,降低油茶炭疽病的发病率和病情指数。

English Abstract

张平, 李朝阳, 赵清泉, 王立海, 马玲. 生防细菌对油茶炭疽病病原菌的抑制作用[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
引用本文: 张平, 李朝阳, 赵清泉, 王立海, 马玲. 生防细菌对油茶炭疽病病原菌的抑制作用[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
Zhang Ping, Li Chaoyang, Zhao Qingquan, Wang Lihai, Ma Ling. Inhibition effects of biocontrol bacteria strains on the pathogen of Camellia oleifera anthracnose[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
Citation: Zhang Ping, Li Chaoyang, Zhao Qingquan, Wang Lihai, Ma Ling. Inhibition effects of biocontrol bacteria strains on the pathogen of Camellia oleifera anthracnose[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190409
  • 油茶(Camellia oleifera)属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia),常绿小乔木或灌木,被称为世界四大木本食用油料树种之一,为我国乡土树种,主要分布于长江流域及以南各地的高山、丘陵地带[1]。油茶种子榨出的茶油为优质食用油,油酸等不饱和脂肪酸含量高达90%,其营养价值可与橄榄油相媲美[2]。人工种植的油茶在生长过程中经常会遭遇各种病害,因此,引起的油茶减产是制约油茶产业发展的关键因素。油茶炭疽病为油茶的主要病害之一,通常造成减产10% ~ 30%,严重时高达40%以上[3]。油茶的整个生长周期均易被油茶炭疽病原菌的侵染,油茶植株被侵染后,发病顺序为先枝梢、叶片、果实,再花芽、叶芽,最后传至花上,其中果实和叶片发病最早, 且出现的病斑最明显[4-6]。后期病斑中心变为灰褐色,四周为黑褐色,同生黑色小点,枝梢皮层纵裂,严重时造成油茶枯萎死亡。

    用于防治植物病害的微生物主要有拮抗细菌、拮抗放线菌和拮抗真菌。拮抗细菌的种类繁多,其中多种芽孢杆菌属(Bacillus)细菌被广泛的应用于各个领域中[7]。这些细菌存在于植物体内或根际土壤中,能产出多种拮抗作用酶,具有广谱的抑菌活性和促生作用[8-9]。芽孢杆菌防治植物病害的重要作用机制为诱导植物抗病性。并且,芽孢杆菌在营养匮乏的条件下可产生内生芽孢,内生芽孢对多种不良环境有极强的抵抗力,能经受高温、紫外线、多种化学药物和电离辐射等不利因素[10-12]。魏蜜等[13]从堆肥中筛选出的一株芽孢杆菌,研究发现该菌对6种油茶病害的病原菌菌丝生长均具有显著的抑制作用,说明芽孢杆菌是防治植物病害的重要菌株来源。高月庭等[14]从油茶叶片内分离出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),并对油茶炭疽病进行防治试验,结果表明:当枯草芽孢杆菌为1010 cfu/mL时,防治效果最好,油茶叶片生长量最高,组合施用比单一施用效果更好。相关研究结果也表明,相比单一接种芽孢杆菌或油茶炭疽病菌,同时接种两者对油茶植株体内防御酶活性的影响最大,这也说明逆境压力会影响芽孢杆菌的抗性诱导[15]

    目前,防治油茶炭疽病的主要措施为种植抗性品种和化学防治。但长期使用化学农药,会使病原菌产生抗药性,导致防治效果降低,不能从根本上控制病害,并且农药残留会影响生态环境 [8]。在提倡美丽中国的今天,环保、生态的防治措施成为主要发展方向,生物防治措施正具备这些优点,弥补了化学防治的缺点,是进行植物病害防治的必然趋势。植物内生芽孢杆菌具有安全、抗逆性强、易定殖等优势,成为研究预防植物病害的热点[16]

    本研究的目的是通过菌丝生长抑制法、室内盆栽苗防效等试验,从酸浆(Physali alkekengi)果实上分离筛选出对油茶炭疽病菌具有拮抗作用的内生细菌,用于油茶炭疽病的防治。以期为油茶炭疽病的大田应用提供理论依据,对提高油茶产量及油茶产业的可持续发展具有重要意义。

    • 肉汁胨培养基制作方法:琼脂10 g加至1 000 mL蒸馏水加热至溶解,加入牛肉浸膏3 g、蛋白胨15 g、蔗糖10 g搅拌均匀,定容至1 000 mL,高温高压灭菌。

      β-1,3-葡聚糖培养基制作方法,有改良[17]:K2HPO4 12.59 g,KH2PO4 4.76 g,MgSO4·7H2O 0.35 g,FeSO4·7H2O 0.007 g,酵母粉3.5 g,琼脂12.6 g,茯苓粉2.8 g,苯胺兰70 mg,蒸馏水700 mL。121 ℃高压灭菌20 min,冷却后储存备用。

      羧甲基纤维素(CMC)钠培养基制作方法,有改良[18]:CMC-Na 3.5 g,MgSO4·7H2O 0.07 g,(NH42SO4 0.35 g,K2HPO4 0.175 g,琼脂14 g,蒸馏水700 mL。121 ℃高压灭菌20 min,冷却后储存备用。提前配制质量浓度为0.3 mg/ mL刚果红试剂,2 mol/L NaCl溶液。

      酪蛋白培养基制作方法,有改良[19]:酵母粉3.5 g,NaCl 3.5 g,琼脂12.6 g,蒸馏水630 mL,分装至锥形瓶,121 ℃高压灭菌20 min后冷却至45 ~ 50 ℃。另外取盒装脱脂牛奶(无菌)70 mL加热至45 ~ 50 ℃,将两液混合均匀后倒平板,即成酪蛋白培养基。将平板倒置,使表面水分干燥后备用。

    • 主要试剂:细菌DNA提取试剂盒(Omega Bio-Tek公司D3350),胶回收试剂(Promega公司),生理生化药剂(北京路桥技术股份有限公司)。

      菌株来源:浙江农林大学林业和生物技术学院。

    • 新鲜酸浆果实表面用自来水冲洗干净后,使用蒸馏水继续冲洗20 s,置于超净工作台中自然晾干。随后进行表面消毒处理:(1)置于75%酒精浸泡1 min后,使用无菌水冲洗3次。(2)置于3%次氯酸钠中浸泡2 min后,使用无菌水冲洗5次。(3)置于超净工作台自然晾干后备用。取少量最后一次漂洗用的无菌水涂于肉汁胨培养基上,培养7 d后观察有无菌落形成,以检验消毒是否彻底。使用灭菌刀片将酸浆果实切成小块,露出内部组织。使用灭菌镊子将小块组织分别置于肉汁胨培养基中,每皿3 ~ 4块。在26 ℃条件下培养7 d,每12 h观察一次,如有菌落长出则编号记录。待培养皿中长出相应的菌落后,采用平板划线法对细菌进行纯化。

      采用平板对峙法对有抑菌活性的细菌进行初筛:取直径5 mm的油茶炭疽病病原菌菌饼,倒置于PDA培养基中央,在菌饼两侧等距接入已纯化好的细菌,每株细菌重复3次,对照只含有油茶炭疽病病原菌菌饼,在人工霉菌培养箱中倒置培养7 d。通过抑菌圈的大小判断细菌对油茶炭疽病病原菌的拮抗能力,将拮抗能力较强的菌株进行编号并斜面保存。

      选取上述3株抑菌能力最大的细菌分别接于肉汁胨培养基上,培养72 h后观察形态特征(包括菌落的大小、形状、颜色、透明度、气味)。对3株细菌进行常规生理生化特征鉴定。将测序结果在NCBI中进行Blast比对后,从GenBank数据库中下载相近属种菌株的标准序列,利用MEGA 7.0软件基于Neighbour-joining(邻接法)构建系统发育树。

    • (1)β-1,3-葡聚糖酶测定:将细菌呈品字形接种于β-1,3-葡聚糖培养基中,每株细菌3次重复,26 ℃条件下在培养箱中培养4 d。培养基中的茯苓粉含有β-1,3-葡聚糖,与苯胺蓝结合呈蓝色,故β-1,3-葡聚糖培养基也呈蓝色。在细菌中β-1,3-葡聚糖酶的作用下,培养基中β-1,3-葡聚糖被水解,蓝色消失并出现透明圈。透明圈的出现表明该细菌可产生β-1,3-葡聚糖酶,透明圈越大,则β-1,3-葡聚糖酶活性越大。

      (2)纤维素酶测定:将细菌呈品字形接种于羧甲基纤维素钠(CMC)培养基中,每株细菌3次重复,在26 ℃条件下培养3 d后,在培养基中加入2 mL刚果红试剂,轻轻摇动平板,使药液铺满培养基表面,放置15 min。将刚果红试剂倒去,加入2 mL 7%NaCl溶液,使NaCl溶液铺满整个培养基表面,放置15 min。倒去NaCl溶液,若细菌产生纤维素酶则会出现透明圈。刚果红的作用是结合培养基中的多糖底物,使培养基呈红色。若细菌产生纤维素酶,可将多糖底物分解,刚果红不能与之结合,NaCl溶液的作用是洗脱掉结合不牢的刚果红,故会产生透明圈。有透明圈产生表明该菌会产生纤维素酶,透明圈越大则纤维素酶活性越大。

      (3)蛋白酶测定:将细菌呈品字形接种于酪蛋白培养基中,每株细菌3次重复,26 ℃条件下培养36 h。细菌产生的蛋白酶会水解培养基中的蛋白质,出现透明的水解圈,菌株的颜色、形态也会产生变化。若酪蛋白培养基上产生水解圈,则该菌有产生蛋白酶的能力。

    • 挑取菌体接种到肉汁胨液体培养基中,置于恒温振荡培养箱中在转速180 r/min,26 ℃条件下振荡培养3 d。使用紫外分光光度计测定出菌悬液的5个梯度(0.6 × 108、1.0 × 108、1.4 × 108、1.8 × 108、2.2 × 108 cfu/mL),菌悬液用0.22 μm细菌过滤器滤掉菌体得到无菌发酵上清液。无菌发酵上清液在每个平板表面预先涂布20 μL后,将直径5 mm的油茶炭疽病病原菌菌饼接种在PDA平板中间,以单独接种病原菌菌饼的作空白对照,每个处理3重复,在霉菌培养箱26 ℃条件下恒温培养5 d。挑取病原菌边缘处的菌丝,在光学显微镜下观察菌丝的形态特征,记录并拍照。并以十字交叉法测量病菌的直径,按照公式计算无菌发酵上清液对病原菌菌落生长的抑制率,抑制率(%) = (对照组菌落直径 − 处理组菌落直径)/(对照组菌落直径 − 菌饼直径) × 100%。

    • 将菌株DLSB-4接种至肉汁胨液体培养基后,在26 ℃、180 r/min条件下振荡培养48 h。用0.22 μm细菌过滤器滤掉菌体,将菌株DLSB-4无菌上清使用无菌水稀释为5个梯度,对照组为清水。每个处理取25 mL无菌发酵上清液对油茶苗叶片喷雾处理,每个重复6株。叶片表面水分干燥后,用灭菌针将油茶叶片表皮刺破,每个叶片刺6个伤口,在每个伤口中间位置放置一个5 mm油茶炭疽病菌饼,使用铝箔包裹叶片,黑暗保湿72 h后,将菌饼去除。于30 d后,根据叶片的病情指数,计算各浓度无菌发酵上清液对油茶炭疽病的防治效果。将油茶炭疽病发病程度分为4级:0级:无病;1级:10%以下叶面积发病;2级:11% ~ 20%叶面积发病;3级:21% ~ 40%叶面积发病;4级:40%以上叶面积发病[20]。病情指数 = [∑(病级株数 × 代表值)/(总株数 × 最高病级代表值)] × 100%,防效(%)= (对照病情指数 − 处理病情指数)/对照病情指数 × 100%。

    • 使用Origin2018(教育版)对所有统计数据进行分析,单因素ANOVA和Duncan对处理组和对照组进行多重比较,P值0.05表示各组间差异显著性。

    • 将分离出的细菌与油茶炭疽病菌平板对峙筛选中,共得到拮抗细菌7株,其中菌株DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13对病原菌产生的抑菌圈最大,有明显的拮抗作用。3株细菌分别在肉汁胨培养基培养48 h后,菌株DLSB-1的菌落为圆形,呈微黄色,不透明,中心表面有隆起褶皱,边缘不整齐,有臭味。菌株DLSB-4的菌落为圆形,呈微黄色,表面较为光滑,无褶皱,边缘不整齐。菌株DLSB-13的菌落为圆形,呈白色,表面平整光滑,边缘整齐(图1)。

      图  1  菌株的形态

      Figure 1.  Morphology of strains

      3株细菌的理化性质基本相同(表1)。革兰氏染色均呈阳性;均能够利用果糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇作为碳源;明胶液化、V-P测定、反硝化、酪氨酸双水解、酯酶、石蕊牛奶试验均为阳性。好氧性试验表明3株细菌均为严格需氧或兼性厌氧。在耐盐性试验中,3株细菌均在含有20% NaCI培养基中生长。在45 ℃条件下能良好的生长。3株细菌通过生理生化特性还不能鉴定出具体种类,需结合16S rDNA基因序列测定结果。

      表 1  3株细菌的生理生化特性

      Table 1.  Physiological and biochemical characteristics of three bacteria

      测试项目 Testing item结果 Result
      DLSB-1DLSB-4DLSB-13
      革兰氏染色 Gram stain + + +
      甲基红 Methy red
      柠檬酸盐利用 Citrate utilization
      精氨酸双水解 Agrinine dihydrolase
      明胶液化 Gelatin liquefaction + + +
      V-P测定 V-P reaction + + +
      反硝化 Nitrate to N2 + + +
      D-果糖 D-fructose + + +
      D-半乳糖 D-galactose + + +
      D-甘露醇 D-mannitol + + +
      D-木糖 D-xylose
      山梨醇 Sorbitol + + +
      酪氨酸 Tyrosine + + +
      酯酶 Esterase + + +
      石蕊牛奶 Litmus milk + + +
      好氧性 Aerobic +、– +、– +、–
      最高耐盐20% Growth in 20% NaCl + + +
      最高致死温度80 ℃
      The highest lethal temperature of 80 ℃
      最高生长温度45 ℃
      The highest growth temperature of 45 ℃
      + + +
      注:“+”表示阳性或者生长;“–”表示反应阴性或者不生长。Notes: “+” means positive or growth; “–” means negative or no growth.

      将3株细菌的16S rDNA序列输入GenBank数据库中进行Blast比对分析,找出同源性较高的相似菌株序列。使用MEGA 5.0软件对3株细菌与其他相似菌株进行比对分析,并构建系统发育树(图2)。DLSB-1与菌株枯草芽孢杆菌聚在同一分支,遗传距离最近,支持率为90%;DLSB-4与菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)聚在同一分支,遗传距离最近,支持率为97%;DLSB-13与菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis聚在同一分支,遗传距离最近,支持率97%。综合相似性比对的结果、形态学和生理生化性状,鉴定细菌DLSB-1为枯草芽孢杆菌,DLSB-4为解淀粉芽孢杆菌,DLSB-13为地衣芽孢杆菌。

      图  2  菌株DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13的系统发育树

      Figure 2.  Phylogenetic tree of strains DLSB-1, DLSB-4 and DLSB-13

    • 芽孢杆菌DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13生长过程中均能产生蛋白酶(图3),使培养基出现透明的水解圈,其中DLSB-1产生的水解圈大于DLSB-4和DLSB-13,DLSB-4产生的水解圈最小,且DLSB-1和DLSB-13的菌落形态发生变化,菌落面积变大。羧甲基纤维素(CMC)钠培养基上(图4),3株菌均能正常生长,使菌落周围的刚果红颜色消失而形成透明圈,透明圈大小相似。在β-1,3-葡聚糖酶显色反应中(图5),3株菌均不能使培养基的蓝色消失,说明3株菌没有产生β-1,3-葡聚糖酶的能力。

      图  3  3株芽孢杆菌产蛋白酶的能力

      Figure 3.  Ability of 3 strains of Bacillus to produce protease

      图  4  3株芽孢杆菌产纤维素酶的能力

      Figure 4.  Ability of 3 strains of Bacillus to produce cellulolytic enzymes

      图  5  3株芽孢杆菌产β-1,3-葡聚糖酶的能力

      Figure 5.  Ability of 3 strains of Bacillus to produce β-1,3-dextranase

    • 本试验通过菌丝生长抑制法,测定出3株芽孢杆菌不同梯度无菌发酵上清液对病原菌的抑菌活性。试验结果表明(图6),3株芽孢杆菌DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13无菌发酵上清液均能抑制油茶炭疽病病原菌丝的生长,在26 ℃条件下培养5 d后,病原菌菌落变小,菌丝不能正常向外扩展。3株芽孢杆菌无菌发酵上清液对油茶炭疽病病原菌的抑制效果显著(P < 0.05)(图7),其中菌株DLSB-1在1.8 × 108 cfu/mL的抑菌率达到最大值为69.67%,菌株DLSB-4在1.4 × 108 cfu/mL的抑菌率达到最大值为81.14%,随后趋于稳定,差异不显著(P > 0.05), 菌株DLSB-13在1.8 × 108 cfu/mL的抑菌率达到最大值为75.4%。而对照2(60%高效多菌灵600倍液)的抑菌率为27.86%,并且3株芽孢杆菌无菌发酵上清液的抑菌活性均优于60%高效多菌灵。

      图  6  芽孢杆菌无菌发酵上清液对油茶炭疽病菌的抑菌活性

      Figure 6.  Inhibition activity of Bacillus sterile fermentative liquid on Colletotrichum fructicola

      图  7  芽孢杆菌无菌发酵上清液对油茶炭疽病菌的抑菌效果

      Figure 7.  Inhibition effects of Bacillus sterile fermentative liquid on Colletotrichum fructicola

    • 挑取抑菌带边缘的病原菌菌丝放置在显微镜下观察发现(图8):3株芽孢杆菌无菌发酵上清液所抑制的病原菌菌丝均发生畸变,表现为扭曲、折叠、变形、断裂,菌丝顶端或中部异常膨大,呈泡囊状。

      图  8  芽孢杆菌无菌发酵上清液对病原菌菌丝生长的影响

      Figure 8.  Effects of Bacillus sterile fermentative liquid on mycelia growth

    • 使用芽孢杆菌DLSB-4的不同浓度无菌发酵上清液对接种病原菌后的盆栽苗进行喷雾处理,于30 d后统计油茶叶片的病情指数和防治效果(表2)。5个浓度无菌发酵上清液的病情指数与对照组相比差异显著(P < 0.05),病情指数大小依次为:CK > T1 > T2 > T3 > T4 > T5。T1与T2相比病情指数相似,无显著性差异(P > 0.05);T3与T2相比病情指数下降9.7,差异显著(P < 0.05);T4与T3相比病情指数下降了7.8,差异显著(P < 0.05),T4与T5相比病情指数无显著性差异(P > 0.05)。在一定程度上,随着芽孢杆菌无菌发酵上清液浓度的增加,病斑的数量和直径大小逐渐缩小(图9)。5个梯度无菌发酵上清液均表现出了较好的防治效果,防治效果依次为:T5 > T4 > T3 > T2 > T1,防治效果与病情指数呈明显负相关,随着无菌发酵上清液浓度的增加,防治效果明显上升。

      表 2  细菌无菌发酵上清液对油茶炭疽病的防治效果

      Table 2.  Inhibition effects of sterile fermentative liquid about strain on Camellia oleifera anthracnose

      处理 Treatment发病率 Rate of disease/%病情指数 Disease index保护效果 Protection effect/%
      T1 35.3 ± 3.2 b 42.2 ± 2.1 b 40.2 ± 2.3 e
      T2 32.4 ± 0.9 c 39.6 ± 3.2 b 43.9 ± 3.2 d
      T3 30.8 ± 2.1 d 29.9 ± 3.8 c 57.7 ± 2.9 c
      T4 29.8 ± 4.5 d 22.1 ± 5.0 d 68.7 ± 3.5 b
      T5 27.5 ± 3.4 e 20.4 ± 2.1 d 71.1 ± 4.3 a
      CK 75.6 ± 2.6 a 68.5 ± 2.3 a
      注:CK 为无菌水处理;不同的小写字母表示处理之间的显着性差异。Notes: CK is sterile water control; different lowercase letters indicate significance differences between treatments.

      图  9  不同处理无菌发酵上清液及空白处理后的油茶叶片病斑形态

      Figure 9.  Different treatments of sterile fermentative liquid and blank treatment of leaf lesions

    • 本研究选用酸浆果实作为生防菌的分离对象。酸浆又称为菇娘,在我国南北方均有分布,全株可入药,长期以来一直是我国传统医药中的重要草药,广泛应用于治疗风湿病、牙痛、咽喉痛、真菌感染和糖尿病等[21],同时它的果实甜酸可口,深受人们喜爱[22]。我们推测酸浆果实的抗菌、消炎功效与其内生菌及次生代谢物质有关。另外,油茶与酸浆的产地有部分重合,生境相似,因此选择酸浆的果实进行研究。

      目前,国内关于油茶炭疽病拮抗内生菌的筛选方法主要以平板对峙法为主,但是平板对峙法的筛选环境与实际应用中有明显的差异,生防菌的实际防治效果与植物所处环境及生防菌的定殖能力有关[23]。因此,许多研究人员会对植物内生菌进行分离。本研究采用组织分离法对酸浆果实内生细菌进行了分离,其中有3株细菌抑菌效果较好。综合菌株的形态学特征、生理生化特性和16S rDNA的序列比对分析结果,分离得到的3株细菌为同一属,即芽孢杆菌属。其中,菌株DLSB-1与枯草芽孢杆菌聚在同一分支,支持率仅为90%,有可能该菌株为新属或新科。在一些相似的研究中,孟庆敏等[24]同样采用组织分离法对油茶炭疽病具有拮抗活性的内生细菌进行了分离,并对抑菌物质进行分离和结构鉴定,发现该菌产生60多种丰原素同系物,对油茶炭疽病病原菌抑菌效果显著。

      本次试验中使用不同梯度的细菌无菌发酵上清液在平板上测试了对油茶炭疽病菌的抑制作用。试验中的对照2选用目前田间防治油茶炭疽病常用的药剂60%高效多菌灵,用以比较细菌无菌发酵上清液与化学农药防治效果的差异。结果表明,5个梯度的无菌发酵上清液均对病原菌产生良好的抑制效果,抑菌率显著高于化学药剂。但这只是在理想条件下得出的结果,在本次盆栽防效试验得出的结果与平板对峙的结果一致,说明该株细菌有进一步开发的价值。在一些关于枯草芽孢杆菌类似的报道中,徐广春等[25]从枯草芽孢杆菌提取出表面活性剂,对苹果树和梨树病害的防治均有显著效果。陆燕等 [26] 等研究了一株解淀粉芽孢杆菌41B-1,对患有白绢病(Sclerotium rolfsii)的花生植株进行灌根处理,防治效果达93.3%。生防菌发挥其拮抗作用需处于适宜的环境以及良好的定殖能力,如果环境条件不适宜,则生防菌无法体现出其防治效果。许多研究显示,生防菌在室内条件的试验中的防治效果较好,但在田间条件试验中的防治效果却不理想。陈志谊等[27]等研究发现,生防菌在不同地区以及不同年分对水稻纹枯病(Thanatephorus cucumeris)的防治效果有较大差异。Rajkumar等[28]通过筛选生防菌株的试验发现,使用盆栽幼苗进行生防效果测定,相比使用离体叶片筛选出的生防菌更准确。而使用菌株无菌发酵上清液在田间施用与活体菌相比更不易受环境的影响。本研究后续选择菌株DLSB-1进行大田试验,进一步验证该菌株的田间防治效果。

      葡聚糖、纤维素和蛋白等物质是真菌细胞壁的重要组成部分,一些芽孢杆菌可以产生β-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶等多种拮抗作用酶,在酶的作用下会使真菌的细胞壁受损,这是芽孢杆菌防治真菌病害的重要机制之一。其中β-1,3-葡聚糖酶能使真菌细胞壁中的葡聚糖产生水解,使得细胞壁的部分功能受到破坏[29]。Denning等[30]研究发现,芽孢杆菌可以产生棘白霉素类化合物干扰真菌细胞壁中葡聚糖的正常产生。在本研究中,发现处理后的病原菌菌丝发生畸形,增粗、断裂,推测其原因可能是芽孢杆菌产生的某种活性物质,使菌丝的细胞壁遭到破坏,从而抑制了菌丝的生长。因此,检测有无拮抗作用酶的产生,可以判断这3株细菌有无拮抗真菌的能力。本研究3株生防芽孢杆菌均具有产生纤维素酶和蛋白酶的能力,但未发现产生β-1,3-葡聚糖酶的能力。另外,本研究仅对芽孢杆菌产生的拮抗作用酶进行了定性研究,没有对酶定量测定。

    • 本研究从酸浆果实内分离并筛选出3株细菌,通过菌株形态学、生理生化特征以及16S rDNA序列比对分析,鉴定出DLSB-1为枯草芽孢杆菌,DLSB-4为解淀粉芽孢杆菌,DLSB-13为地衣芽孢杆菌。通过选择性培养基证实3株生防菌株自身可以产生纤维素酶和蛋白酶,不能产生β-1,3-葡聚糖酶,并且无菌发酵上清液可以抑制病原菌菌丝生长,抑制后的菌丝形态表现为扭曲、畸形、增粗。通过盆栽防效试验表明,菌株DLSB-4无菌发酵上清液有效降低油茶炭疽病的蔓延,进而减少发病率。

参考文献 (30)

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