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松壳黄酮提取工艺及其抗氧化活性

符群 郐滨 李璐 刘磊 王梦丽

符群, 郐滨, 李璐, 刘磊, 王梦丽. 松壳黄酮提取工艺及其抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
引用本文: 符群, 郐滨, 李璐, 刘磊, 王梦丽. 松壳黄酮提取工艺及其抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
Fu Qun, Kuai Bin, Li Lu, Liu Lei, Wang Mengli. Extraction technology of flavonoids from pine shell and its antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
Citation: Fu Qun, Kuai Bin, Li Lu, Liu Lei, Wang Mengli. Extraction technology of flavonoids from pine shell and its antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452

松壳黄酮提取工艺及其抗氧化活性

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
基金项目: 国家重点研发计划项目(2016YFC0500307-07)
详细信息
    作者简介:

    符群,博士,高级工程师。主要研究方向:天然产物分离与制备及功能性质研究。Email:nefufuqun@163.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

  • 中图分类号: S789.5;S791.247

Extraction technology of flavonoids from pine shell and its antioxidant activity

  • 摘要:   目的  红松是东北地区重要的经济型树种,其松壳中所含的化学成分具有多种生物活性,特别是黄酮含量极为丰富,是一类天然抗氧化剂,而松壳多被视为废弃物被送至垃圾场填埋或焚烧,导致资源的浪费。因此深入研究松壳黄酮对红松的开发利用具有现实指导意义。  方法  以红松松壳为原料,采用响应面法优化超声波辅助低共熔溶剂提取松壳中黄酮类化合物的工艺,并对提取物的抗氧化活性进行了研究。  结果  松壳黄酮最佳提取工艺参数为:DES含水量40%、超声功率200 W、提取时间30 min、提取温度为60 ℃、固液比(w/v)为1∶55,此条件下黄酮得率为(9.838 ± 0.211)%,较醇提法提高69%。低共熔溶剂黄酮提取物对DPPH•、ABTS+•及•OH清除率的IC50分别为(5.195 ± 0.039)μg/mL、(9.528 ± 0.132)μg/mL、(151.860 ± 0.238)μg/mL,较醇提黄酮分别降低40.98%、52.94%、11.59%。以HepG2细胞建立H2O2氧化损伤模型,黄酮浓度在0.1 ~ 0.5 mg/mL范围内,对HepG2受损细胞具有保护作用,存在显著的剂效关系,且低共熔溶剂所提黄酮的保护作用优于醇提黄酮。  结论  采用绿色环保的低共熔溶剂可高效提取松壳黄酮,且提取物能够保持良好的抗氧化活性。
  • 图  1  各因素对黄酮得率的影响

    Figure  1.  Effects of various factors on the yield of flavonoids

    图  2  提取温度与提取时间相交互对黄酮得率影响

    Figure  2.  Interaction effects of extraction temperature and extraction time on the yield of flavonoids

    图  7  超声功率与固液比相交互对黄酮得率影响

    Figure  7.  Interaction effects of ultrasonic power and solid liquid ratio on the yield of flavonoids

    图  3  提取温度与超声功率相交互对黄酮得率影响

    Figure  3.  Interaction effects of extraction temperature and ultrasonic power on the yield of flavonoids

    图  4  提取温度与固液比相交互对黄酮得率影响

    Figure  4.  Interaction effects of extraction temperature and solid liquid ratio on the yield of flavonoids

    图  5  提取时间与超声功率相交互对黄酮得率影响

    Figure  5.  Interaction effects of extraction time and ultrasonic power on the yield of flavonoids

    图  6  提取时间与固液比的交互作用对黄酮得率影响

    Figure  6.  Interaction effects of extraction time and solid liquid ratio on the yield of flavonoids

    图  8  松壳黄酮对DPPH自由基清除率的影响

    Figure  8.  Effects of pine shell flavones on DPPH radical scavenging rate

    图  9  松壳黄酮对ABTS自由基清除率的影响

    Figure  9.  Effects of pine shell flavones on ABTS radical scavenging rate

    图  10  松壳黄酮对羟基自由基清除率的影响

    Figure  10.  Effects of pine shell flavones on hydroxyl radical scavenging rate

    图  11  松壳黄酮对H2O2诱导细胞损伤的保护作用

    t检验法进行分析。同系列中实验组与对照组对比,**表示差异极显著(P < 0.01),*表示差异显著(P < 0.05)。Analysing by t test method, compared experimental group with control in same series, ** means very significant difference (P < 0.01), * means significant difference (P < 0.05).

    Figure  11.  Protective effects of pine shell flavones onH2O2 induced cell injury

    表  1  响应面实验设计及结果

    Table  1.   Experimental design of response surface methodology and the results

    序号 No.提取温度
    Extraction temperature/℃
    提取时间
    Extraction time/
    min
    超声功率
    Ultrasonic power/
    W
    固液比
    Solid liquid ratio/
    (g·mL− 1)
    黄酮得率
    Flavonoid yield/%
    1 40 20 200 1∶50 8.417
    2 60 20 200 1∶50 8.841
    3 40 40 200 1∶50 8.340
    4 60 40 200 1∶50 8.709
    5 50 30 150 1∶40 7.660
    6 50 30 250 1∶40 7.925
    7 50 30 150 1∶60 9.095
    8 50 30 250 1∶60 9.286
    9 40 30 200 1∶40 7.803
    10 60 30 200 1∶40 8.258
    11 40 30 200 1∶60 9.097
    12 60 30 200 1∶60 9.323
    13 50 20 150 1∶50 7.994
    14 50 40 150 1∶50 8.111
    15 50 20 250 1∶50 8.168
    16 50 40 250 1∶50 8.360
    17 40 30 150 1∶50 8.289
    18 60 30 150 1∶50 8.580
    19 40 30 250 1∶50 9.076
    20 60 30 250 1∶50 9.320
    21 50 20 200 1∶40 7.795
    22 50 40 200 1∶40 7.302
    23 50 20 200 1∶60 9.323
    24 50 40 200 1∶60 9.138
    25 50 30 200 1∶50 9.785
    26 50 30 200 1∶50 9.712
    27 50 30 200 1∶50 9.891
    28 50 30 200 1∶50 9.860
    29 50 30 200 1∶50 9.790
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    表  2  回归模型方差分析

    Table  2.   Variance analysis of regression model

    方差来源
    Source of variance
    平方和
    Sum of squares
    自由度
    Degree of freedom
    均方
    Mean square
    F
    F value
    P
    P value
    模型 Model 15.16 14 1.08 21.99 < 0.000 1**
    Z1 0.34 1 0.34 6.84 0.020 4*
    Z2 0.028 1 0.028 0.56 0.465 1
    Z3 0.48 1 0.48 9.79 0.007 4**
    Z4 6.05 1 6.05 122.85 < 0.000 1**
    Z1 × Z2 7.913 × 10− 4 1 7.913 × 10− 4 0.016 0.900 9
    Z1 × Z3 5.445 × 10− 4 1 5.445 × 10− 4 0.011 0.917 7
    Z1 × Z4 0.013 1 0.013 0.27 0.614 2
    Z2 × Z3 1.407 × 10− 3 1 1.407 × 10− 3 0.029 0.868 2
    Z2 × Z4 0.024 1 0.024 0.48 0.499 2
    Z3 × Z4 1.378 × 10− 3 1 1.378 × 10− 3 0.028 0.869 5
    $Z_1^2 $ 1.18 1 1.18 23.90 0.000 2**
    $Z_2^2 $ 4.91 1 4.91 99.82 < 0.000 1**
    $Z_3^2 $ 3.17 1 3.17 64.49 < 0.000 1**
    $Z_4^2 $ 3.02 1 3.02 61.29 < 0.000 1**
    残差 Residual 0.69 14 0.049
    失拟项 Lack of fit 0.64 10 0.064 5.77 0.062 9
    纯误差 Pure error 0.045 4 0.011
    总和 Total 15.85 28
    注:**为差异极显著(P < 0.01),*为差异显著(P < 0.05)。Notes: ** means very significant difference ( P < 0.01), * means significant difference ( P < 0.05)。
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    , 王瑛, 王华芳, 于京民2, 刘玉军, 尹伟伦, 王建中, 王晓楠, 张志翔, 孙建华, 张兴杰, 沈应柏, 李镇宇, 陈卫平, 张庆, 王民中, 王玉春, 丁霞, 林善枝, 刘艳, 李凤兰, 刘玉军, 呼晓姝, 陶凤杰, 杨伟光, 汪植, 蒋平, 马建海, 付瑞海, 赵新丽.  苹果多酚的超声波提取及抗氧化作用研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 137-141.
    [19] 段旭良, 王莉, 程堂仁, 周章义, 李艳华, 胡晓丹, 熊丹, 金莹, 贺窑青, 欧阳杰, 姚娜, 胡海英, 孙青, 王丰俊, 李莉, 乔海莉, 张玲, 范丙友, 孙月琴, 郝晨, 雷庆哲, 石娟, 陈佳, 曲红, 刘丽, 隋金玲, 李在留, 刘美芹, 张香, 陈发菊, 骆有庆, 续九如, 尹伟伦, 骆有庆, 冯菁, 路端正, 王建中, 张艳霞, 阎伟, 郭锐, 冯秀兰, 尹伟伦, 郑彩霞, 陆海, 周燕, 李云, 陈晓阳, 张志毅, 李凤兰, 武彦文, 张德权, 孙爱东, 赵亚美, 田呈明, 沈昕, 康向阳, 王华芳, 姜金仲, 王晓东, 马钦彦, 安新民, 赵蕾, 梁华军, 李忠秋, 高述民, 胡德夫, 孙爱东, 郝俊, 骆有庆, 胡晓丹, 梁宏伟, 王百田, 骆有庆, 蒋湘宁, 阎晓磊, 郑永唐, 卢存福, 沈繁宜, 吴晓成, 史玲玲, 武海卫, 王瑛, 温秀凤3, 骈瑞琪, 张志翔, 于京民2, 冯晓峰, 刘玉军, 李凯, 王冬梅, 王华芳, 王建中, 王晓楠, 郭晓萍, 吴坚, 王玉兵, 谢磊, 赵兵, 高荣孚, 崔彬彬
    , 冯仲科, 严晓素, 尹伟伦, 邹坤, 呼晓姝, 刘艳, 沈应柏, 杨伟光, 陶凤杰, 丁霞, 陈卫平, 王民中, 孙建华, 刘玉军, 李凤兰, 王玉春, 张庆, 张兴杰, 林善枝, 李镇宇, 蒋平, 赵新丽, 马建海, 付瑞海, 汪植.  响应面法优化超声波辅助提取桑叶多糖的工艺研究 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 142-146.
    [20] 马文辉, 
    王保平, 侯亚南, 李景文, 王明枝, 张一平, 殷亚方, 李梅, 杨海龙, 詹亚光, 黄国胜, 杜华强, 符韵林, 张秋英, 李慧, 龙玲, 李全发, 刘震, 宋小双, 杨晓晖, 李景文, 熊瑾, 饶良懿, 李吉跃, 徐峰, 韩海荣, 梁机, 秦瑶, 赵敏, 陆熙娴, 朱金兆, 朱金兆, 刘文耀, 李发东, 耿晓东, 李妮亚, 窦军霞, 李俊清, 吕建雄, 陈晓阳, 范文义, 王雪军, 李俊清, 尹立辉, 王洁瑛, 张克斌, 孙玉军, 唐黎明, 李云, 乔杰, 陈素文, 陈晓阳, 慈龙骏, 齐实, 于贵瑞, 赵宪文, 刘桂丰, 李黎, 秦素玲, 沈有信, 刘雪梅, 倪春, 康峰峰, 毕华兴, 欧国强, 李凤兰, 王玉成, 刘伦辉, 赵双菊, 王雪, 宋献方, 任海青, 李伟, 蒋建平, 魏建祥, 朱国平, 文瑞钧, 黎昌琼, 韦广绥, 张桂芹, 马钦彦, 李伟, 周海江, 孙涛, 丁霞, , 宋清海, 张万军, 李慧, 杨谦, 孙晓敏, 刘莹, 孙志强, 李宗然, 
    , .  杜仲全叶深度综合利用技术路线研究 . 北京林业大学学报, 2005, 27(5): 115-117.
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-09
  • 修回日期:  2020-01-07
  • 网络出版日期:  2020-06-13
  • 刊出日期:  2020-09-07

松壳黄酮提取工艺及其抗氧化活性

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
    基金项目:  国家重点研发计划项目(2016YFC0500307-07)
    作者简介:

    符群,博士,高级工程师。主要研究方向:天然产物分离与制备及功能性质研究。Email:nefufuqun@163.com 地址:150040黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

  • 中图分类号: S789.5;S791.247

摘要:   目的  红松是东北地区重要的经济型树种,其松壳中所含的化学成分具有多种生物活性,特别是黄酮含量极为丰富,是一类天然抗氧化剂,而松壳多被视为废弃物被送至垃圾场填埋或焚烧,导致资源的浪费。因此深入研究松壳黄酮对红松的开发利用具有现实指导意义。  方法  以红松松壳为原料,采用响应面法优化超声波辅助低共熔溶剂提取松壳中黄酮类化合物的工艺,并对提取物的抗氧化活性进行了研究。  结果  松壳黄酮最佳提取工艺参数为:DES含水量40%、超声功率200 W、提取时间30 min、提取温度为60 ℃、固液比(w/v)为1∶55,此条件下黄酮得率为(9.838 ± 0.211)%,较醇提法提高69%。低共熔溶剂黄酮提取物对DPPH•、ABTS+•及•OH清除率的IC50分别为(5.195 ± 0.039)μg/mL、(9.528 ± 0.132)μg/mL、(151.860 ± 0.238)μg/mL,较醇提黄酮分别降低40.98%、52.94%、11.59%。以HepG2细胞建立H2O2氧化损伤模型,黄酮浓度在0.1 ~ 0.5 mg/mL范围内,对HepG2受损细胞具有保护作用,存在显著的剂效关系,且低共熔溶剂所提黄酮的保护作用优于醇提黄酮。  结论  采用绿色环保的低共熔溶剂可高效提取松壳黄酮,且提取物能够保持良好的抗氧化活性。

English Abstract

符群, 郐滨, 李璐, 刘磊, 王梦丽. 松壳黄酮提取工艺及其抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
引用本文: 符群, 郐滨, 李璐, 刘磊, 王梦丽. 松壳黄酮提取工艺及其抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
Fu Qun, Kuai Bin, Li Lu, Liu Lei, Wang Mengli. Extraction technology of flavonoids from pine shell and its antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
Citation: Fu Qun, Kuai Bin, Li Lu, Liu Lei, Wang Mengli. Extraction technology of flavonoids from pine shell and its antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2020, 42(8): 141-149. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190452
  • 红松(Pinus koraiensis)又名海松、果松、韩松,属常绿针叶乔木,是温带针阔混交林的树种之一。红松主要分布在长白山和小兴安岭地区,是我国较重要的经济型林木,也是东北地区十分珍贵的重要树种[1]。红松的松壳、松仁、松塔及松针中含有多种活性成分[2-3],研究发现松壳中的黄酮、多糖、萜类化合物和多酚类化合物富含多种药理成分,可应用于风湿病、肠炎、高血压、神经衰弱、便秘等病症的防治,具有多种生物活性[4-5]。目前松壳作为废弃物可作为活性炭等生物质热解原料,Chen等[6]报道松籽壳是生物能源的潜在来源,而其作为高附加值的开发利用尚未形成产业规模。

    黄酮类物质是自然界中广泛存在的一类化合物,其药理作用大多数归因于其抗氧化活性。一般情况下,黄酮抗氧化性能的机制主要是自由基清除作用和过渡金属离子螯合作用。就其自由基清除作用而言,随着酚羟基活性降低,黄酮类化合物提供氢原子,苯氧基自由基产物离体化,黄酮类化合物可预防活性氧对各种疾病的损害。另一方面,黄酮类化合物可以螯合过渡金属,在一定条件下通过芬顿反应促进还原形式的羟基自由基形成,从而达到抗氧化的作用[7-9]

    低共熔溶剂(deep eutectic solvents,DES)是指由一定化学计量比的氢键受体同氢键供体组合成的低共熔混合物,如季铵盐同酰胺、羧酸、多元醇等化合物组合,其特点是混合物凝固点显著低于各组分纯物质的熔点[10]。其理化性质与离子液体极度相似,如不可燃性,不挥发性,高粘度等。且低成本,组分易得,体系制备简单和毒性更低,故其可作为离子液体的替代品[11]

    近年来,随着分离技术水平的提高,国内外学者对红松中黄酮类化合物的研究逐渐增多,目前松壳黄酮的提取多采用传统方法,如加速溶剂法、超声提取法、微波提取法、超临界流体法、酶法等[12-15]。本研究采用超声辅助低共熔溶剂提取技术,低共熔溶剂具有绿色环保、可持续性、可生物降解性、低毒性和可调节的溶剂极性。特别是它们对不同极性的天然化合物的增溶能力,联合超声波特有的空化作用、机械效应及热效应加快提取物的溶解,两种提取方法协同使提取物充分溶出,提高得率,缩短提取时间,降低制备成本。以Design-Expert软件对实验条件进行设计及优化,获得最优的提取工艺条件,通过对醇提黄酮及Vc抗氧化指标的测定,对比低共熔溶剂黄酮抗氧化活性,为红松资源的功能活性物质研究提供参考。

    • 红松松壳:2018年采于萝北县林业局。

      人肝肿瘤细胞株HepG2:购于上海细胞库。

      试剂:芦丁(≥95%)上海源叶有限公司。硝酸铝,无水乙醇,氯化胆碱,柠檬酸等为国产分析纯。DPPH,ABTS,胰蛋白酶,MTT,DMSO美国sigma公司。DMEM高糖培养基,胎牛血清美国Hyclone公司。

      仪器:AL-1041C分析天平METTLER TOLEDO公司。T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。JY96-IIN超声波破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司。90-2型定时恒温磁力搅拌器 上海精科实业有限公司。

    • 准确称取0.100 0 g芦丁标准品溶于含水量为40%的DES(氯化胆碱:柠檬酸物质的量比为1:1)中,定容至50 mL容量瓶,得到芦丁标准品储备液。分别配制成0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/mL的系列芦丁标准液。取1 mL上述系列浓度芦丁标准液,加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,摇匀后静置5 min,加入0.6 mL 10% Al(NO33溶液,摇匀后静置6 min,加入2 mL 40% NaOH,室温下静置15 min,以DES为空白对照,于510 nm处测定其吸光度[16]。以溶液质量浓度(C1)为横坐标(X),吸光度(A)为纵坐标(Y)绘制标准曲线,得到线性回归方程:Y = 2.558X + 0.017,R2 = 0.999 1。

    • 取适量提取液,按照1.2.1的方法测定其吸光度,重复3次,吸光值带入回归方程,求出样品溶液中黄酮的质量浓度,计算黄酮得率:

      $$ Y_1 = ({C_2 V} /M) \times 100 {\text{%}} $$ (1)

      式中:Y1为黄酮得率(%);C2为提取液质量浓度(mg/mL);V为提取液体积;M 为松壳的质量(mg)。

    • 红松壳去杂,粉碎后过40目筛,准确称取1.00 g松壳粉末于三角瓶中,加入50 mL 90%乙醇,在超声功率200 W、提取时间30 min、提取温度60 ℃、固液比 (w/v)1∶50条件下进行提取,每因素水平条件平行3次。

    • 红松壳去杂,粉碎后过40目筛,准确称取1.00 g松壳粉末于三角瓶中,以超声辅助DES提取松壳黄酮。分别考察含水量(30%、35%、40%、45%、50%)、超声功率(100、150、200、250、300 W)、提取时间(10、20、30、40、50、60 min)、提取温度(30、40、50、60、70、80 ℃)、固液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80)对黄酮得率的影响,每因素水平条件平行3次。

    • 在单因素实验的基础上,运用Design-Expert 8.0.6软件程序,根据Box-Behnken中心组合法,建立回归模型,得到超声辅助低共熔溶剂法最佳提取工艺。

    • 两种松壳黄酮提取液经D101大孔树脂纯化后,冷冻干燥备用。

    • 配置不同质量浓度的松壳黄酮50 µL与50 µL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合后摇匀,静置30 min(避光),于波长517 nm处测定吸光值(Ai1)。以80%乙醇溶液作参比,测定50 µL黄酮提取液和50 µL 80%乙醇溶液混合的吸光(Aj1)、(Ao1),参考下式计算DPPH自由基清除率[17]

      $$ {\rm{DPPH}} {\text{•}} {\text{的清除率}}\ = \left( {1 - \frac{{A_{\rm{i}{\rm{1}}} - A_{\rm{j}{\rm{1}}}}}{{A_{{\rm{o1}}}}}} \right) \times 100\% $$ (2)
    • 将7 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L K2S2O8溶液混合,暗处放置24 h。再用无水乙醇稀释得ABTS储备液,配置不同质量浓度的松壳黄酮50 µL与100 µL ABTS溶液混合,避光静置8 min,于734 nm波长处测定吸光值(Ai2)、(Aj2)、(Ao2),参考下式计算ABTS自由基清除率[18]

      $$ {\rm ABTS+}{\text{•}} {\text{的清除率}}\ = \left( {1 - \frac{{A_{\rm{i}{\rm{2}}} - A_{\rm{j}{\rm{2}}}}}{{A_{\rm{o}{\rm{2}}}}}} \right) \times 100\% $$ (3)
    • 向酶标板中加入50 µL不同质量浓度的松壳黄酮,50 µL浓度为9 mmol/L的FeSO4溶液和50 µL浓度为9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液,最后加入50 µL浓度为8.8 mmol/L的过氧化氢溶液启动反应。将反应体系置于37 ℃条件下反应0.5 h后于510 nm处测定吸光(Ai3)、(Aj3)、(Ao3)。按下式计算羟自由基的清除率[19]

      $$ {\text{•}} {\rm{OH }}{\text{的清除率}}\ = \left( {1 - \frac{{{{A}}_{\rm{i}{\rm{3}}} - A_{\rm{j}{\rm{3}}}}}{{A_{\rm{o}{\rm{3}}}}}} \right) \times 100\% $$ (4)
    • (1)H2O2诱导的HepG2细胞氧化损伤模型建立。用DMEM高糖培养基与胎牛血清以9∶1(v / v)的比例配制完全培养液,在37 ℃ 5% CO2条件下培养,经胰酶消化制成细胞悬液,细胞计数10− 8个/L。将细胞接种于96孔板中,200 μL/孔,37 ℃ 5% CO2条件下培养,当细胞贴壁占瓶底的80%时,弃上清,用PBS缓冲液清洗2次,再加新鲜配制的含0、200、400、600、800、1 000、1 200 μmol/L的H2O2的培养液100 μL/孔,每组3个复孔,继续培养6 h,同时设正常培养的细胞作对照。同期在显微镜下观察细胞的形态学变化,吸出培养基后,每孔加入10 µL MTT,在37 ℃ 5% CO2条件下避光培养4 h后,吸去上层清液,加入100 µL DMSO,溶解紫色甲瓒。570 nm处测吸光值,计算各组细胞存活率[20]。通过细胞存活率及其形态观察确定最佳H2O2浓度,由此建立HepG2细胞最佳氧化损伤模型。

      (2)松壳黄酮对细胞存活率得影响。分别加入含有0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的松壳黄酮培养基100 µL,对照组及模型组加入相同体积的完全培养基,24 h后,吸出培养基。加入浓度为800 µmol/L的H2O2 培养基(对照组除外)继续培养6 h后,吸出上层清液。每孔加入10 µL MTT,在37 ℃ 5% CO2条件下避光培养4 h后,吸出上清液,加入100 µL DMSO,溶解紫色甲瓒。570 nm处测吸光值,计算细胞存活率:

      细胞存活率 =(实验组OD值 − 模型组OD值)/(对照组OD值 − 模型组OD值)× 100%

    • 图1可知,DES体系中水分含量对黄酮提取得率有显著影响。含水量过低DES难以渗透到植物细胞中,过高则会减少DES与黄酮的相互作用,降低黄酮得率,因此选择最适含水量为40%。超声波提取过程中随着超声功率的增加,空化作用产生的冲击波会破坏细胞壁,促使黄酮化合物溶出,而超声功率的继续增加,则会影响黄酮结构,使黄酮溶解量下降,提取得率降低,因此选择最适超声功率为200 W。随着提取时间的延长和提取温度的升高,萃取溶剂扩散,加速目标化合物的传质,DES与松壳中的黄酮充分接触,使黄酮溶出更彻底,但长时间的高温导致提取液中的黄酮成分不稳定,发生热降解等副反应,且容易氧化,因此选择70 °C条件下提取30 min。固液比较小易达到萃取平衡,即黄酮化合物未被完全提取出,虽然大量的DES溶剂可以提高目标化合物的浸出率,但会导致溶剂的浪费和萃取过程的复杂性,因此选择最适固液比1∶50 。

      图  1  各因素对黄酮得率的影响

      Figure 1.  Effects of various factors on the yield of flavonoids

    • 以黄酮得率为响应值,设计提取温度,提取时间,超声功率,固液比四因素三水平实验,实验设计水平与结果见表1

      表 1  响应面实验设计及结果

      Table 1.  Experimental design of response surface methodology and the results

      序号 No.提取温度
      Extraction temperature/℃
      提取时间
      Extraction time/
      min
      超声功率
      Ultrasonic power/
      W
      固液比
      Solid liquid ratio/
      (g·mL− 1)
      黄酮得率
      Flavonoid yield/%
      1 40 20 200 1∶50 8.417
      2 60 20 200 1∶50 8.841
      3 40 40 200 1∶50 8.340
      4 60 40 200 1∶50 8.709
      5 50 30 150 1∶40 7.660
      6 50 30 250 1∶40 7.925
      7 50 30 150 1∶60 9.095
      8 50 30 250 1∶60 9.286
      9 40 30 200 1∶40 7.803
      10 60 30 200 1∶40 8.258
      11 40 30 200 1∶60 9.097
      12 60 30 200 1∶60 9.323
      13 50 20 150 1∶50 7.994
      14 50 40 150 1∶50 8.111
      15 50 20 250 1∶50 8.168
      16 50 40 250 1∶50 8.360
      17 40 30 150 1∶50 8.289
      18 60 30 150 1∶50 8.580
      19 40 30 250 1∶50 9.076
      20 60 30 250 1∶50 9.320
      21 50 20 200 1∶40 7.795
      22 50 40 200 1∶40 7.302
      23 50 20 200 1∶60 9.323
      24 50 40 200 1∶60 9.138
      25 50 30 200 1∶50 9.785
      26 50 30 200 1∶50 9.712
      27 50 30 200 1∶50 9.891
      28 50 30 200 1∶50 9.860
      29 50 30 200 1∶50 9.790

      利用Design-Expert软件进行优化,提取温度(Z1),提取时间(Z2),超声功率(Z3),固液比(Z4)二次多项式回归拟合,得到黄酮得率(Y2)对4个因素的回归方程为:

      $$ \begin{aligned} \;\\ \;\;\;Y_2 = &9.85 + 0.17Z_1 - 0.048Z_2 + 0.20Z_3 + 0.71Z_4 - \\ &0.014Z_1Z_2 - 0.012Z_1Z_3 - 0.057Z_1Z_4 + 0.019Z_2Z_3 + \\ &0.077Z_2Z_4 - 0.019Z_3Z_4 - 0.43{Z_1^2} - 0.87{Z_2^2} - \\ &0.70{Z_3^2} - 0.68{Z_4^2} \end{aligned} $$

      方差分析结果见表2。由表2可得,模型F值为21.99,P < 0.01,说明该模型极显著,失拟项P > 0.05,说明不显著。R2 = 0.956 5,校正决定系数RAdj2= 0.913 0,说明拟合度好,回归方程与实际情况较吻合,可以反应响应值的变化,可靠性高,实验误差相对较小。因此可用多项式回归方程对实验结果进行分析和预测。

      表 2  回归模型方差分析

      Table 2.  Variance analysis of regression model

      方差来源
      Source of variance
      平方和
      Sum of squares
      自由度
      Degree of freedom
      均方
      Mean square
      F
      F value
      P
      P value
      模型 Model 15.16 14 1.08 21.99 < 0.000 1**
      Z1 0.34 1 0.34 6.84 0.020 4*
      Z2 0.028 1 0.028 0.56 0.465 1
      Z3 0.48 1 0.48 9.79 0.007 4**
      Z4 6.05 1 6.05 122.85 < 0.000 1**
      Z1 × Z2 7.913 × 10− 4 1 7.913 × 10− 4 0.016 0.900 9
      Z1 × Z3 5.445 × 10− 4 1 5.445 × 10− 4 0.011 0.917 7
      Z1 × Z4 0.013 1 0.013 0.27 0.614 2
      Z2 × Z3 1.407 × 10− 3 1 1.407 × 10− 3 0.029 0.868 2
      Z2 × Z4 0.024 1 0.024 0.48 0.499 2
      Z3 × Z4 1.378 × 10− 3 1 1.378 × 10− 3 0.028 0.869 5
      $Z_1^2 $ 1.18 1 1.18 23.90 0.000 2**
      $Z_2^2 $ 4.91 1 4.91 99.82 < 0.000 1**
      $Z_3^2 $ 3.17 1 3.17 64.49 < 0.000 1**
      $Z_4^2 $ 3.02 1 3.02 61.29 < 0.000 1**
      残差 Residual 0.69 14 0.049
      失拟项 Lack of fit 0.64 10 0.064 5.77 0.062 9
      纯误差 Pure error 0.045 4 0.011
      总和 Total 15.85 28
      注:**为差异极显著(P < 0.01),*为差异显著(P < 0.05)。Notes: ** means very significant difference ( P < 0.01), * means significant difference ( P < 0.05)。

      对回归模型显著性分析可知,超声功率和固液比对黄酮得率影响极显著(P < 0.01),提取温度对黄酮得率影响显著(P < 0.05),提取时间及各因素交互作用对黄酮得率影响不显著,由F值可得各因素对得率的影响顺序为固液比 > 超声功率 > 提取温度 > 提取时间。

    • 图2 ~ 7可知,各因素两两交互作用响应面曲面较平缓,等高线图接近圆形,对响应值影响不显著(P > 0.05),但是单因素对松壳黄酮得率影响极显著(P < 0.001),响应面曲面较陡峭,等高线图呈椭圆形。因此超声功率、提取时间、提取温度和固液比均对黄酮得率有影响。

      图  2  提取温度与提取时间相交互对黄酮得率影响

      Figure 2.  Interaction effects of extraction temperature and extraction time on the yield of flavonoids

      图  7  超声功率与固液比相交互对黄酮得率影响

      Figure 7.  Interaction effects of ultrasonic power and solid liquid ratio on the yield of flavonoids

      图  3  提取温度与超声功率相交互对黄酮得率影响

      Figure 3.  Interaction effects of extraction temperature and ultrasonic power on the yield of flavonoids

      图  4  提取温度与固液比相交互对黄酮得率影响

      Figure 4.  Interaction effects of extraction temperature and solid liquid ratio on the yield of flavonoids

      图  5  提取时间与超声功率相交互对黄酮得率影响

      Figure 5.  Interaction effects of extraction time and ultrasonic power on the yield of flavonoids

      图  6  提取时间与固液比的交互作用对黄酮得率影响

      Figure 6.  Interaction effects of extraction time and solid liquid ratio on the yield of flavonoids

    • 通过响应面分析得到超声辅助低共熔溶剂提取松壳黄酮最佳工艺条件为:提取温度60 ℃,超声功率206.5 W,提取时间29.9 min,固液比1∶54.8,此条件下计算得到的黄酮得率为(9.838 ± 0.434)%。

      为实际操作中更便于产业化控制,调整最佳工艺为:含水量40%、超声功率200 W、提取时间30 min、提取温度60 ℃、固液比1∶55。在此条件下,经3次平行实验,测得黄酮得率为(9.838 ± 0.211)%,实际含量与模型预测值的误差为0.192%,证明模型理论预测值与实际值拟合效果良好。

    • 图8可知,在1 ~ 45 µg/mL的质量浓度范围内,DES黄酮提取物、乙醇提取物及VC对DPPH自由基的清除率均随质量浓度的升高而增加。当质量浓度为1 µg/mL时,DES法所提取的黄酮清除自由基的能力与VC的能力相近,且高于乙醇提取物2倍。随着质量浓度逐渐增加,3种样品清除DPPH自由基的能力呈现同一趋势,即DES提取液清除能力强于乙醇提取物,且与VC相近。清除DPPH自由基的IC50分别为:DES提取物(5.195 ± 0.039) µg/mL、乙醇提取物(8.803 ± 0.502) µg/mL,VC对照组(4.403 ± 0.450) µg/mL。IC50随着清除能力的升高而降低,因此清除能力的大小顺序为VC > DES黄酮提取物 > 乙醇黄酮提取物。

      图  8  松壳黄酮对DPPH自由基清除率的影响

      Figure 8.  Effects of pine shell flavones on DPPH radical scavenging rate

    • 图9可知,随着样品质量浓度的增加(1 ~ 45 µg/mL),其ABTS自由基的清除率均持续增加。DES提取物、乙醇提取物及对照品VC 在质量浓度为45 µg/mL时,均达到最大值,清除率分别为93.02%、90.43%、93.88%。整个浓度区间内,DES清除ABTS自由基的曲线十分逼近对照品VC的曲线。但在10 ~ 30 µg/mL的质量浓度范围内,DES提取物的清除率明显高于乙醇提取物。在20 µg/mL质量浓度时,DES提取物清除率是超声清除率的1.67倍。清除ABTS自由基的IC50分别为:DES提取物(9.528 ± 0.132) µg/mL、乙醇提取物(20.248 ± 0.052) µg/mL,对照组VC 的IC50(7.231 ± 0.561) µg/mL。因此DES提取的黄酮化合物对ABTS自由基清除效果显著高于乙醇提取的黄酮化合物(P < 0.05)。

      图  9  松壳黄酮对ABTS自由基清除率的影响

      Figure 9.  Effects of pine shell flavones on ABTS radical scavenging rate

    • 图10可知,在50 ~ 400 µg/mL的质量浓度范围内,DES提取物和乙醇提取物对羟基自由基的清除效果相似,且均低于VC。当样品质量浓度为350 µg/mL时,VC的清除能力趋于平稳,DES与乙醇的黄酮提取物均呈现上升趋势。虽然黄酮提取物对羟基自由基的清除效果弱于VC,但DES提取物清除效率略高于乙醇提取物。清除羟基自由基的IC50分别为:DES提取物(151.860 ± 0.238)µg/mL、乙醇提取物(171.770 ± 0.402)µg/mL,清除能力的大小顺序VC > DES黄酮提取物 > 乙醇黄酮提取物。

      图  10  松壳黄酮对羟基自由基清除率的影响

      Figure 10.  Effects of pine shell flavones on hydroxyl radical scavenging rate

    • 800 µmol/L H2O2 处理HepG2细胞6 h,细胞存活率为(59.03 ± 2.18)%。经过松壳黄酮提取物培养的细胞,存活率明显有提高。

      图11可知,随着黄酮质量浓度的增加,细胞存活率逐渐升高。在0.1 ~ 0.5 mg/mL的质量浓度范围内,细胞存活率随着DES黄酮提取物质量浓度的增加,呈现持续增长的趋势。乙醇提取物较DES提取物对受损细胞的保护作用低。且在0.4 ~ 0.5 mg/mL的质量浓度区域内,细胞存活率下降,说明此质量浓度的乙醇提取物对细胞可能存在一定毒害作用,抑制细胞增长。

      图  11  松壳黄酮对H2O2诱导细胞损伤的保护作用

      Figure 11.  Protective effects of pine shell flavones onH2O2 induced cell injury

    • 采用超声辅助低共熔溶剂提取松壳中黄酮类化合物,得到最佳提取工艺条件DES含水量40%,提取温度60 ℃、超声功率200 W、提取时间30 min、固液比1∶55。此条件下黄酮得率为(9.838 ± 0.211)%,较醇提法提高69%。

      本文研究了低共熔黄酮提取物和乙醇黄酮提取物对DPPH•、ABTS+•及•OH的清除能力,并以VC作为阳性对照。结果表明,低共熔溶剂黄酮提取物对DPPH•、ABTS+•及•OH的清除率较醇提黄酮分别提高40.98%、52.94%、11.59%。以HepG2细胞建立H2O2氧化损伤模型,黄酮质量浓度在0.1 ~ 0.5 mg/mL范围内,对HepG2受损细胞具有保护作用,且低共熔黄酮提取物作用效果优于醇提黄酮,这说明松壳黄酮具有抗氧化活性,可作为天然抗氧化剂应用于食品、药品中。

      综上所述,红松松籽壳中黄酮含量丰富,是活性很强的一类天然抗氧化剂,在食品及药品方面具有潜在的应用价值,对红松资源的开发利用具有现实指导意义。

参考文献 (20)

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