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几种辅助提取方式对蓝莓原花青素浸提效果及抗氧化活性的影响

国田 张娜 符群 柴洋洋 郭庆启

国田, 张娜, 符群, 柴洋洋, 郭庆启. 几种辅助提取方式对蓝莓原花青素浸提效果及抗氧化活性的影响[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
引用本文: 国田, 张娜, 符群, 柴洋洋, 郭庆启. 几种辅助提取方式对蓝莓原花青素浸提效果及抗氧化活性的影响[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
Guo Tian, Zhang Na, Fu Qun, Chai Yangyang, Guo Qingqi. Effects of several assisted extraction methods on extraction effect and antioxidant activity of proanthocyanins from blueberry[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
Citation: Guo Tian, Zhang Na, Fu Qun, Chai Yangyang, Guo Qingqi. Effects of several assisted extraction methods on extraction effect and antioxidant activity of proanthocyanins from blueberry[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466

几种辅助提取方式对蓝莓原花青素浸提效果及抗氧化活性的影响

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项(2572018BA09),哈尔滨市科技局科技创新人才项目(2017RAQXJ012),中央财政支持地方高校发展专项
详细信息
    作者简介:

    国田。主要研究方向:森林食品资源利用。Email:guotian777@163.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路东北林业大学林学院

    通讯作者:

    郭庆启,博士,副教授。主要研究方向:天然产物化学。Email:qingqiguo@vip.163.com 地址:同上

  • 中图分类号: TS255.2;S789.5

Effects of several assisted extraction methods on extraction effect and antioxidant activity of proanthocyanins from blueberry

  • 摘要:   目的  以大兴安岭野生蓝莓为原料,研究有机溶剂浸提法、超声波辅助、微波辅助和光波辅助提取方式对蓝莓原花青素和酚类物质的浸提效果、化学结构以及抗氧化活性的影响。  方法  采用分光光度法分别测定4种方式处理后浸提液中的原花青素、总酚、总黄酮和花青素等酚类物质含量,通过红外光谱分析4种方式提取溶液的结构变化,通过扫描电镜观察原料蓝莓经不同方式处理后残渣的微观结构,并测定4种提取液的总还原能力、DPPH•、ABTS+•和•OH的清除能力。  结果  微波辅助法提取原花青素得率最高为(15.72 ± 0.03)mg/g。通过红外光谱发现4种方式提取的蓝莓原花青素在化学结构上没有明显变化,扫描电镜观察发现,微波辅助法处理后的提取残渣表面孔隙和褶皱较明显。微波辅助法和光波辅助法提取液中总酚、总黄酮、花青素和原花青素含量较高,与普通溶剂浸提法相比差异显著(P < 0.05)。将不同方式提取液的蓝莓原花青素调至相同浓度30 μg/mL,总还原能力和DPPH•清除能力差异不显著(P > 0.05),DPPH•清除率均在97%以上。•OH清除能力的大小顺序为:溶剂浸提法 > 微波辅助提取法 > 光波辅助提取法 > 超声辅助提取法。超声波辅助法对ABTS+•清除效果最差,溶剂浸提法最强。  结论  同一浓度下溶剂浸提法的提取液的抗氧化活性较强,但微波辅助法提取的原花青素得率最高且抗氧化活性与溶剂浸提法的差异不显著(P > 0.05)。微波由于具有较强的离子极化和偶极旋转作用,因此可以在较短的时间内促进原花青素的浸提,并且微波处理后的原花青素的化学结构和抗氧化功能变化差异不显著,因此4种方式中微波辅助法较为适合提取蓝莓原花青素。通过对比超声波、微波、光波处理单独进行时的得率和超声波、微波、光波处理后再次浸提的得率,发现超声波、微波、光波处理在提取过程中处于主导作用。
  • 图  1  溶剂法提取条件单因素优化

    Figure  1.  Single factor optimization of solvent extraction conditions

    图  2  4种提取方式蓝莓原花青素平均聚合度

    Figure  2.  Average degree of polymerization of blueberry proanthocyanidins by four extraction methods

    图  3  4种提取方式蓝莓原花青素红外光谱分析

    Figure  3.  Infrared spectroscopy analysis of blueberry proanthocyanidins with four extraction methods

    图  4  4种提取方式提取残渣扫描电镜观察

    Figure  4.  Scanning electron microscope observation of extraction residues in four extraction methods

    表  1  3种提取方式处理功率对蓝莓原花青素得率的影响

    Table  1.   Effects of power of three extraction methods on the yield of proanthocyanidins from blueberries

    超声功率
    Ultrasonic
    power/W
    超声时间
    Ultrasonic action
    time/min
    超声得率
    Ultrasound yield/
    (mg·g−1)
    超声后再次浸提时间
    Re-extraction time after
    ultrasound/min
    超声后浸提总得率
    Total yield after ultrasound
    extraction/(mg·g−1)
    260 30 9.16 ± 0.15a 30 11.33 ± 0.02a
    320 30 9.85 ± 0.09b 30 12.45 ± 0.11b
    400 30 11.58 ± 0.06c 30 14.32 ± 0.05c
    480 30 12.06 ± 0.16c 30 14.65 ± 0.01d
    560 30 12.7 ± 0.02d 30 14.67 ± 0.02d
    640 30 12.73 ± 0.01d 30 14.7 ± 0.04d
    微波功率
    Microwave
    power/W
    微波时间
    Microwave action
    time/min
    微波得率
    Microwave yield/
    (mg·g−1)
    微波后再次浸提时间
    Re-extraction time after
    microwave/min
    微波后浸提总得率
    Total yield after microwave
    extraction/(mg·g−1)
    200 1 6.65 ± 0.03a 59 11.75 ± 0.01a
    250 1 7.16 ± 0.05b 59 12.02 ± 0.01b
    300 1 8.63 ± 0.03c 59 13.68 ± 0.04c
    350 1 9.83 ± 0.03d 59 15.59 ± 0.03d
    400 1 9.62 ± 0.02e 59 15.01 ± 0.02e
    450 1 9.17 ± 0.01f 59 13.42 ± 0.04f
    光波功率
    Light wave
    power/W
    光波时间
    Light wave action
    time/min
    光波得率
    Light wave yield/
    (mg·g−1)
    光波后再次浸提时间
    Re-extraction time after
    light wave/min
    光波后浸提总得率
    Total yield after light wave
    extraction/(mg·g−1)
    200 10 8.36 ± 0.05a 50 12.87 ± 0.02a
    280 10 8.76 ± 0.09b 50 13.36 ± 0.01b
    360 10 10.01 ± 0.06c 50 14.88 ± 0.05c
    440 10 9.93 ± 0.06d 50 14.91 ± 0.02c
    520 10 9.23 ± 0.01e 50 14.68 ± 0.02d
    600 10 9.01 ± 0.02f 50 14.12 ± 0.04e
    注:表中同列小写字母不同表示差异显著(P < 0.05)。下同。Notes: different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P < 0.05). Same as below.
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    表  2  3种提取方式处理时间对蓝莓原花青素得率的影响

    Table  2.   Effects of the time of three extraction methods on the yield of proanthocyanidins from blueberries

    超声功率
    Ultrasonic
    power/W
    超声时间
    Ultrasonic action
    time/min
    超声得率
    Ultrasound yield/
    (mg·g−1)
    超声后再次浸提时间
    Re-extraction time after
    ultrasound/min
    超声后浸提总得率
    Total yield after ultrasound
    extraction/(mg·g−1)
    480 10 5.68 ± 0.03a 50 11.29 ± 0.06a
    480 20 8.97 ± 0.05b 40 11.59 ± 0.04b
    480 30 12.21 ± 0.03c 30 14.61 ± 0.09c
    480 40 13.08 ± 0.11d 20 14.86 ± 0.12d
    480 50 14.57 ± 0.02e 10 14.81 ± 0.04d
    480 60 14.8 ± 0.07f 0 14.8 ± 0.07d
    微波功率
    Microwave
    power/W
    微波时间
    Microwave action
    time/min
    微波得率
    Microwave yield/
    (mg·g−1)
    微波后再次浸提时间
    Re-extraction time after
    microwave/min
    微波后浸提总得率/
    Total yield after microwave
    extraction/(mg·g−1)
    350 0.5 6.78 ± 0.03a 59.5 12.25 ± 0.01a
    350 1 9.67 ± 0.03b 59 15.69 ± 0.04b
    350 1.5 9.82 ± 0.02c 58.5 15.72 ± 0.03b
    350 2 9.73 ± 0.04b 58 15.43 ± 0.02c
    350 2.5 9.02 ± 0.05d 57.5 14.34 ± 0.02d
    350 3 8.12 ± 0.02e 57 13.94 ± 0.05e
    光波功率
    Light wave
    power/W
    光波时间
    Light wave action
    time/min
    光波得率
    Light wave yield/
    (mg·g−1)
    光波后再次浸提时间
    Re-extraction time after
    light wave/min
    光波后浸提总得率/
    Total yield after light wave
    extraction/(mg·g−1)
    360 4 7.64 ± 0.02a 56 12.02 ± 0.04a
    360 6 8.15 ± 0.02b 54 13.83 ± 0.05b
    360 8 9.01 ± 0.04c 52 14.93 ± 0.03c
    360 10 10.12 ± 0.03d 50 15.07 ± 0.02d
    360 12 10 ± 0.05e 48 14.63 ± 0.06e
    360 14 9.23 ± 0.02f 46 14.05 ± 0.04f
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    表  3  4种提取方式溶液中酚类物质含量

    Table  3.   Contents of phenols in solutions of four extraction methods

    提取方法 Extraction method酚类物质 Phenolics
    总酚
    Total phenols/(mg·g−1)
    总黄酮
    Total flavonoids/(mg·g−1)
    花青素
    Anthocyanin/(mg·g−1)
    原花青素
    Proanthocyanidins/(mg·g−1)
    溶剂浸提法
    Solvent extraction method
    28.05 ± 0.70a 3.38 ± 0.08a 3.66 ± 0.18a 10.31 ± 0.10a
    超声波辅助法
    Ultrasonic assisted extraction method
    31.73 ± 0.53b 4.17 ± 0.07b 4.07 ± 0.12b 14.81 ± 0.10b
    微波辅助法
    Microwave assisted extraction method
    33.06 ± 0.73b 4.19 ± 0.15b 4.23 ± 0.16b 15.64 ± 0.12c
    光波辅助法
    Light wave assisted extraction method
    32.32 ± 0.73b 4.27 ± 0.12b 4.26 ± 0.18b 14.98 ± 0.10b
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    表  4  4种提取方式提取液抗氧化能力

    Table  4.   Antioxidant ability of the extracts from 4 extraction methods

    提取方法 Extraction methodFRAPDPPH•/%ABTS+•/%•OH/%
    溶剂浸提法 Solvent extraction method1.37 ± 0.06a98.69 ± 1.03a66.86 ± 2.36a57.20 ± 1.14a
    超声波辅助法 Ultrasonic assisted extraction method1.31 ± 0.07a97.89 ± 1.20a58.97 ± 1.85b49.33 ± 1.51b
    微波辅助法 Microwave assisted extraction method1.35 ± 0.07a98.85 ± 1.02a64.88 ± 1.45a55.30 ± 0.99a
    光波辅助法 Light wave assisted extraction method1.33 ± 0.05a98.57 ± 1.49a60.43 ± 1.19b51.41 ± 1.45b
    注:FRAP为总还原能力。Note: FRAP, ferric ion reducing antioxidant power.
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    , 王瑛, 王华芳, 于京民2, 刘玉军, 尹伟伦, 王建中, 王晓楠, 张志翔, 孙建华, 张兴杰, 沈应柏, 李镇宇, 陈卫平, 张庆, 王民中, 王玉春, 丁霞, 林善枝, 刘艳, 李凤兰, 刘玉军, 呼晓姝, 陶凤杰, 杨伟光, 汪植, 蒋平, 马建海, 付瑞海, 赵新丽.  苹果多酚的超声波提取及抗氧化作用研究 . 北京林业大学学报,
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-13
  • 修回日期:  2020-03-10
  • 网络出版日期:  2020-09-21

几种辅助提取方式对蓝莓原花青素浸提效果及抗氧化活性的影响

doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
    基金项目:  中央高校基本科研业务费专项(2572018BA09),哈尔滨市科技局科技创新人才项目(2017RAQXJ012),中央财政支持地方高校发展专项
    作者简介:

    国田。主要研究方向:森林食品资源利用。Email:guotian777@163.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路东北林业大学林学院

    通讯作者: 郭庆启,博士,副教授。主要研究方向:天然产物化学。Email:qingqiguo@vip.163.com 地址:同上
  • 中图分类号: TS255.2;S789.5

摘要:   目的  以大兴安岭野生蓝莓为原料,研究有机溶剂浸提法、超声波辅助、微波辅助和光波辅助提取方式对蓝莓原花青素和酚类物质的浸提效果、化学结构以及抗氧化活性的影响。  方法  采用分光光度法分别测定4种方式处理后浸提液中的原花青素、总酚、总黄酮和花青素等酚类物质含量,通过红外光谱分析4种方式提取溶液的结构变化,通过扫描电镜观察原料蓝莓经不同方式处理后残渣的微观结构,并测定4种提取液的总还原能力、DPPH•、ABTS+•和•OH的清除能力。  结果  微波辅助法提取原花青素得率最高为(15.72 ± 0.03)mg/g。通过红外光谱发现4种方式提取的蓝莓原花青素在化学结构上没有明显变化,扫描电镜观察发现,微波辅助法处理后的提取残渣表面孔隙和褶皱较明显。微波辅助法和光波辅助法提取液中总酚、总黄酮、花青素和原花青素含量较高,与普通溶剂浸提法相比差异显著(P < 0.05)。将不同方式提取液的蓝莓原花青素调至相同浓度30 μg/mL,总还原能力和DPPH•清除能力差异不显著(P > 0.05),DPPH•清除率均在97%以上。•OH清除能力的大小顺序为:溶剂浸提法 > 微波辅助提取法 > 光波辅助提取法 > 超声辅助提取法。超声波辅助法对ABTS+•清除效果最差,溶剂浸提法最强。  结论  同一浓度下溶剂浸提法的提取液的抗氧化活性较强,但微波辅助法提取的原花青素得率最高且抗氧化活性与溶剂浸提法的差异不显著(P > 0.05)。微波由于具有较强的离子极化和偶极旋转作用,因此可以在较短的时间内促进原花青素的浸提,并且微波处理后的原花青素的化学结构和抗氧化功能变化差异不显著,因此4种方式中微波辅助法较为适合提取蓝莓原花青素。通过对比超声波、微波、光波处理单独进行时的得率和超声波、微波、光波处理后再次浸提的得率,发现超声波、微波、光波处理在提取过程中处于主导作用。

English Abstract

国田, 张娜, 符群, 柴洋洋, 郭庆启. 几种辅助提取方式对蓝莓原花青素浸提效果及抗氧化活性的影响[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
引用本文: 国田, 张娜, 符群, 柴洋洋, 郭庆启. 几种辅助提取方式对蓝莓原花青素浸提效果及抗氧化活性的影响[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
Guo Tian, Zhang Na, Fu Qun, Chai Yangyang, Guo Qingqi. Effects of several assisted extraction methods on extraction effect and antioxidant activity of proanthocyanins from blueberry[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
Citation: Guo Tian, Zhang Na, Fu Qun, Chai Yangyang, Guo Qingqi. Effects of several assisted extraction methods on extraction effect and antioxidant activity of proanthocyanins from blueberry[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20190466
  • 蓝莓(Vaccinium uliginosum)属杜鹃花科(Ericaceae)越橘属植物,又称越橘、蓝浆果,是新兴的木本小浆果类保健果树[1],主要分布在我国的长白山及大小兴安岭林区。蓝莓果实较小近球形一般呈蓝色、紫色或黑色,口感酸甜。蓝莓除了含有常规的营养物质以外,还富含原花青素、叶酸、黄酮醇、花色苷等天然活性成分[2-3]。研究表明蓝莓具有多种生理活性功能,如抗氧化、抗炎、抗癌以及提高免疫力等,因此被认为是膳食结构中抗氧化剂的最佳来源之一[4-5]

    原花青素又名缩合鞣质,是一种黄烷醇单体及其聚合体的多酚类化合物,广泛存在于植物的果实、表皮以及根和叶片中[6]。其由不同数量的儿茶素、棓儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素或是没食子酸聚合而成。原花青素是一种良好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂,具有极强的抗氧化活性,其作用的机制是原花青素结构中具有多个酚羟基在体内释放H+,与自由基竞争性地结合,自由基链式反应被阻断,从而保护脂质不被氧化,Zdunczyk[7]和Toshiaki[8]的研究表明,原花青素具有很强的抗氧化能力,且纯度越高抗氧化能力越强,其中二聚体的活性最强。

    原花青素目前已经成为抗氧化活性物质以及功能性食品领域重要的研究对象,国内外对于原花青素的研究较多集中在其抗氧化、抗炎以及生理活性等功能性方面。在原花青素提取和纯化技术方面,研究也较为全面,但对于不同方法提取的原花青素的结构及功能性质是否出现变化则鲜见报道。微波和超声波法提取是近年来常见的提取方式[9-11],已广泛应用于天然产物及生物活性物质提取等领域[12-13]。本研究的目的是立足于有机溶剂浸提法,以其为对照,分别考察超声波处理、微波处理、光波处理对蓝莓原花青素浸提效果的影响,比较前期辅助方式与后期溶剂浸提两者在提取过程中哪种作用方式处于主导作用,并且比较不同提取方式制备出的原花青素的相关理化指标和抗氧化功能,进一步比较和分析几种方式浸提效果差异的原因及对抗氧化功能的影响,旨在为蓝莓原花青素的提取及高效利用提供参考。

    • 野生蓝莓冻果购自大兴安岭超越野生浆果开发有限公司,于−18 ℃冷藏。3,5-二硝基水杨酸(分析纯,天津市光复精细化工研究所);没食子酸标准品(纯度99.2%,中国食品药品检定研究所);芦丁标准品(纯度98.0%,中国食品药品检定研究所);2,2-联氮—双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐(ABTS+)自由基标准品(纯度98.0%,美国Sigma公司);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基标准品(纯度 > 90.0%,美国Sigma公司);(+)-儿茶素标准品(纯度90.0%,上海源叶生物技术有限公司)。其余所用试剂均为分析纯。

    • TU1900紫外−可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);EL20梅特勒−托利多pH计(梅特勒−托利多仪器(上海)有限公司);FT/IR-480傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司);SCIENTZ-IIDM微波光波超声波萃取仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);JSM-7500F扫描电镜(日本电子);D5A离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);Scientz-18N冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

    • 将蓝莓冻果在50 ℃下烘干至恒质量,粉碎后过60目筛,密封后于−20 ℃储存备用。准确称取一定质量的蓝莓粉原料,按一定的料液比与某一浓度的乙醇溶液相混合,在一定温度条件下浸提一段时间后,4 000 r/min下离心10 min,取上清液进行原花青素含量的测定,以原花青素得率为指标,确定溶剂法提取的最佳工艺条件。

      以溶剂法确定的乙醇浓度、料液比和提取温度参数条件为基础,分别进行超声波辅助法、微波辅助法和光波辅助法提取蓝莓原花青素的提取功率以及提取时间的研究,并比较3种提取方式在最优条件下的得率以及处理后再次浸提原花青素得率的增加情况。

    • 以没食子酸为标准品,采用Folin-Ciocalteus法[14]测定总酚含量;以芦丁为标准品,采用硝酸铝比色法[15]测定总黄酮含量;采用pH示差法[16]测定花青素含量;以儿茶素为标准品,采用香草醛−盐酸法[17]进行原花青素含量的测定。

    • 分别配制物质的量浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 μmol/mL的儿茶素乙酸溶液。分别取1 mL,加入含有0.5%香草醛和4%盐酸乙酸溶液5 mL,混匀在20 ℃下反应5 min后在500 nm下测定吸光度。得到标准曲线y = 7.149x − 0.025 4,R2 = 0.999,式中:y为吸光度值;x为儿茶素物质的量浓度。取1 mL适当稀释后的样品乙酸溶液按照上述操作进行,根据标准曲线计算得出儿茶素浓度和物质的量浓度,计算原花青素的平均聚合度[18]

    • 将4种辅助方式提取的蓝莓提取液真空冷冻干燥,按2%的比例将提取液粉末与溴化钾混合研磨压片,首先在红外光谱仪中对纯溴化钾薄片进行背景扫描,然后在扫描波数为400 ~ 4 000 cm−1的条件下对含有样品的溴化钾薄片进行扫描[19]

    • 将4种提取液的蓝莓原花青素调至相同浓度30 μg/mL,总还原能力的测定采用铁离子还原法[20]进行总还原能力的测定。以无水乙醇为参比,进行DPPH•清除能力的测定[21],以蒸馏水为参比进行ABTS+•清除能力的测定[22]。按照文献[23]的方法,根据实际试验条件略有改动,进行•OH清除能力的测定。

    • 将4种提取方式处理后的蓝莓提取液离心后的残渣,真空冻干。用E-1010型离子溅射镀膜仪在样品表面喷金后进行扫描电镜观察。

    • 普通溶剂浸提蓝莓原花青素的单因素试验结果如图1所示。

      图  1  溶剂法提取条件单因素优化

      Figure 1.  Single factor optimization of solvent extraction conditions

      试验结果表明,溶剂浸提法的最优条件是温度55 ℃,料液比(wv)1∶30,乙醇浓度60%,提取时间60 min,此时蓝莓原花青素得率为(10.33 ± 0.18)mg/g。以溶剂法确定的提取温度、料液比和乙醇浓度为参数,分别采用超声波、微波和光波处理不同的时间后测定原花青素的得率,并且测定3种方法分别作用后再结合溶剂浸提法使总提取时间为60 min后的原花青素得率,测定结果如下表1 ~ 2

      表 1  3种提取方式处理功率对蓝莓原花青素得率的影响

      Table 1.  Effects of power of three extraction methods on the yield of proanthocyanidins from blueberries

      超声功率
      Ultrasonic
      power/W
      超声时间
      Ultrasonic action
      time/min
      超声得率
      Ultrasound yield/
      (mg·g−1)
      超声后再次浸提时间
      Re-extraction time after
      ultrasound/min
      超声后浸提总得率
      Total yield after ultrasound
      extraction/(mg·g−1)
      260 30 9.16 ± 0.15a 30 11.33 ± 0.02a
      320 30 9.85 ± 0.09b 30 12.45 ± 0.11b
      400 30 11.58 ± 0.06c 30 14.32 ± 0.05c
      480 30 12.06 ± 0.16c 30 14.65 ± 0.01d
      560 30 12.7 ± 0.02d 30 14.67 ± 0.02d
      640 30 12.73 ± 0.01d 30 14.7 ± 0.04d
      微波功率
      Microwave
      power/W
      微波时间
      Microwave action
      time/min
      微波得率
      Microwave yield/
      (mg·g−1)
      微波后再次浸提时间
      Re-extraction time after
      microwave/min
      微波后浸提总得率
      Total yield after microwave
      extraction/(mg·g−1)
      200 1 6.65 ± 0.03a 59 11.75 ± 0.01a
      250 1 7.16 ± 0.05b 59 12.02 ± 0.01b
      300 1 8.63 ± 0.03c 59 13.68 ± 0.04c
      350 1 9.83 ± 0.03d 59 15.59 ± 0.03d
      400 1 9.62 ± 0.02e 59 15.01 ± 0.02e
      450 1 9.17 ± 0.01f 59 13.42 ± 0.04f
      光波功率
      Light wave
      power/W
      光波时间
      Light wave action
      time/min
      光波得率
      Light wave yield/
      (mg·g−1)
      光波后再次浸提时间
      Re-extraction time after
      light wave/min
      光波后浸提总得率
      Total yield after light wave
      extraction/(mg·g−1)
      200 10 8.36 ± 0.05a 50 12.87 ± 0.02a
      280 10 8.76 ± 0.09b 50 13.36 ± 0.01b
      360 10 10.01 ± 0.06c 50 14.88 ± 0.05c
      440 10 9.93 ± 0.06d 50 14.91 ± 0.02c
      520 10 9.23 ± 0.01e 50 14.68 ± 0.02d
      600 10 9.01 ± 0.02f 50 14.12 ± 0.04e
      注:表中同列小写字母不同表示差异显著(P < 0.05)。下同。Notes: different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P < 0.05). Same as below.

      表 2  3种提取方式处理时间对蓝莓原花青素得率的影响

      Table 2.  Effects of the time of three extraction methods on the yield of proanthocyanidins from blueberries

      超声功率
      Ultrasonic
      power/W
      超声时间
      Ultrasonic action
      time/min
      超声得率
      Ultrasound yield/
      (mg·g−1)
      超声后再次浸提时间
      Re-extraction time after
      ultrasound/min
      超声后浸提总得率
      Total yield after ultrasound
      extraction/(mg·g−1)
      480 10 5.68 ± 0.03a 50 11.29 ± 0.06a
      480 20 8.97 ± 0.05b 40 11.59 ± 0.04b
      480 30 12.21 ± 0.03c 30 14.61 ± 0.09c
      480 40 13.08 ± 0.11d 20 14.86 ± 0.12d
      480 50 14.57 ± 0.02e 10 14.81 ± 0.04d
      480 60 14.8 ± 0.07f 0 14.8 ± 0.07d
      微波功率
      Microwave
      power/W
      微波时间
      Microwave action
      time/min
      微波得率
      Microwave yield/
      (mg·g−1)
      微波后再次浸提时间
      Re-extraction time after
      microwave/min
      微波后浸提总得率/
      Total yield after microwave
      extraction/(mg·g−1)
      350 0.5 6.78 ± 0.03a 59.5 12.25 ± 0.01a
      350 1 9.67 ± 0.03b 59 15.69 ± 0.04b
      350 1.5 9.82 ± 0.02c 58.5 15.72 ± 0.03b
      350 2 9.73 ± 0.04b 58 15.43 ± 0.02c
      350 2.5 9.02 ± 0.05d 57.5 14.34 ± 0.02d
      350 3 8.12 ± 0.02e 57 13.94 ± 0.05e
      光波功率
      Light wave
      power/W
      光波时间
      Light wave action
      time/min
      光波得率
      Light wave yield/
      (mg·g−1)
      光波后再次浸提时间
      Re-extraction time after
      light wave/min
      光波后浸提总得率/
      Total yield after light wave
      extraction/(mg·g−1)
      360 4 7.64 ± 0.02a 56 12.02 ± 0.04a
      360 6 8.15 ± 0.02b 54 13.83 ± 0.05b
      360 8 9.01 ± 0.04c 52 14.93 ± 0.03c
      360 10 10.12 ± 0.03d 50 15.07 ± 0.02d
      360 12 10 ± 0.05e 48 14.63 ± 0.06e
      360 14 9.23 ± 0.02f 46 14.05 ± 0.04f

      不同提取方式的蓝莓原花青素得率高低顺序为微波辅助法 > 光波辅助法 > 超声波辅助法 > 溶剂浸提法,最佳提取方法(微波辅助法)蓝莓原花青素的得率约是溶剂浸提法的1.5倍。在溶剂浸提法优化后的料液比、乙醇浓度和时间的条件下对其他3种方法进行功率和时间的单因素优化。超声波辅助法主要是利用超声的空化效应、热效应以及机械效应来破坏植物的细胞膜和细胞结构,加速溶剂向固体物质中的渗透,使天然植物成分快速释放,缩短提取时间并提高提取率[24]。作为一种电磁波,微波能短时间将极性分子极化,促进分子间的氢键断裂和分子间的碰撞以及破坏细胞膜。还能使有效成分与溶剂充分接触,从而提高原花青素的提取率。光波的迅速致热,使细胞内溶物沸腾,加快植物细胞的破裂更有利于原花青素的提取。当超声波、微波和光波只单独进行并未再次浸提时,超声波辅助法在功率480 W、超声时间60 min时原花青素含量为(14.8 ± 0.07)mg/g提取效果最好。当超声波、微波和光波作用后再次进行浸提后,光波辅助法在功率360 W光波作用时间10 min时提取效果最好,得率为(15.07 ± 0.02)mg/g。微波功率为350 W提取1 min,再使用溶剂法浸提59 min,为蓝莓原花青素最佳提取工艺条件。

      在原花青素提取方面,浸提法是最传统的方法,但普通溶剂浸提法的提取效率较低,所以在研究中多采用一些辅助提取方式。如微波辅助提取技术、超临界萃取技术和超声波辅助提取技术,加快溶剂向细胞内的扩散和有效成分的溶出,显著提高原花青素溶出速率,缩短提取时间,提高得率。刘静[25]使用了浸提法提取、微波提取工艺和超声波提取工艺3种工艺,提取蓝莓叶片中的原花青素并进行了优化,对其提取率进行了比较。通过对比3种提取工艺的单因素试验以及正交优化设计,确定了最佳蓝莓叶片中原花青素的提取工艺,通过比较3种提取方法的提取率得出微波法 > 超声波法 > 溶剂浸提法。陈茵茹[26]使用了有机溶剂法、超声波辅助法、超声微波双辅助法提取葡萄籽原花青素,超声微波双辅助法在提取工艺条件为乙醇浓度70.3%、固液比1∶14.6、40 ℃条件下超声功率400 W、超声时间30 min,再在微波功率400 W、辐射30 s的条件下,葡萄籽原花青素的平均得率最高为7.62 mg/g。

      超声波辅助法在超声功率480 W、超声时间40 min再次浸提20 min时得率最高(14.86 ± 0.12)mg/g,超声波单独作用时的得率为(13.08 ± 0.11)mg/g,提取比例占总量的88.02%。光波辅助法最佳提取工艺为光波功率360 W,光波时间10 min再次浸提50 min时得率为(15.07 ± 0.02)mg/g,光波单独作用时得率为(10.12 ± 0.03)mg/g,提取比例占总量的67.15%。微波辅助法最佳提取工艺为,微波功率350 W、微波时间1 min,再次浸提59 min时得率最为(15.69 ± 0.04)mg/g,微波单独作用时得率为(9.67 ± 0.03)mg/g,提取比例占总量的61.63%。对比超声波辅助法、微波辅助法和光波辅助法再次浸提前后的得率和提取比例,可以得出超声波、微波、光波处理在提取过程中起主导作用。

    • 分别采用Folin-Ciocalteus法、硝酸铝比色法、pH示差法、香草醛-盐酸法测定4种方法提取液中的总酚含量、总黄酮含量、花青素含量、原花青素含量,对比4种方式提取液酚类物质的差异,结果如表3所示。

      表 3  4种提取方式溶液中酚类物质含量

      Table 3.  Contents of phenols in solutions of four extraction methods

      提取方法 Extraction method酚类物质 Phenolics
      总酚
      Total phenols/(mg·g−1)
      总黄酮
      Total flavonoids/(mg·g−1)
      花青素
      Anthocyanin/(mg·g−1)
      原花青素
      Proanthocyanidins/(mg·g−1)
      溶剂浸提法
      Solvent extraction method
      28.05 ± 0.70a 3.38 ± 0.08a 3.66 ± 0.18a 10.31 ± 0.10a
      超声波辅助法
      Ultrasonic assisted extraction method
      31.73 ± 0.53b 4.17 ± 0.07b 4.07 ± 0.12b 14.81 ± 0.10b
      微波辅助法
      Microwave assisted extraction method
      33.06 ± 0.73b 4.19 ± 0.15b 4.23 ± 0.16b 15.64 ± 0.12c
      光波辅助法
      Light wave assisted extraction method
      32.32 ± 0.73b 4.27 ± 0.12b 4.26 ± 0.18b 14.98 ± 0.10b

      4种提取方式提取液中总酚、总黄酮、花青素和原花青素含量随提取方法的不同而有所变化。4种提取方式中微波辅助法和光波辅助法总酚含量较高,其中微波辅助法的提取液中总酚的含量最高(33.06 ± 0.73)mg/g。4种方法提取液中超声波辅助法、微波辅助法和光波辅助法总黄酮含量差异不显著(P > 0.05),光波辅助法含量最高(4.27 ± 0.12)mg/g。光波辅助法和微波辅助法的提取液花青素含量较高,分别是(4.26 ± 0.18)mg/g和(4.23 ± 0.16)mg/g;溶剂法最低(3.66 ± 0.18)mg/g。微波辅助法提取的原花青素含量最高(15.64 ± 0.12)mg/g。4种方式的提取液中总酚、总黄酮、花青素和原花青素4种酚类物质含量变化趋势基本一致,超声波辅助法、微波辅助法和光波辅助法差异不显著(P > 0.05)。造成这种结果的原因可能是经过超声波、微波和光波处理,蓝莓中的酚类物质可以充分的释放出来,使酚类物质的含量增加,与普通溶剂法相比差异显著(P < 0.05)。

    • 通过测定4种提取方式的提取液中蓝莓原花青素的平均聚合度和红外光谱,分析4种提取方式的蓝莓原花青素结构之间的差异,探究不同提取方式对结构的影响。测定结果如图23所示。

      图  2  4种提取方式蓝莓原花青素平均聚合度

      Figure 2.  Average degree of polymerization of blueberry proanthocyanidins by four extraction methods

      图  3  4种提取方式蓝莓原花青素红外光谱分析

      Figure 3.  Infrared spectroscopy analysis of blueberry proanthocyanidins with four extraction methods

      图2可知,4种提取方法平均聚合度都在4.0 ~ 4.4之间差异不显著(P > 0.05),提取方式对蓝莓原花青素的平均聚合度影响不大。用傅里叶变换红外光谱仪对4种方法提取的蓝莓原花青素提取液进行红外光谱分析。由图3红外光谱分析可知,4种方式提取液结构无明显差异,说明超声波、微波和光波对蓝莓原花青素的结构无明显破坏作用。3 424 cm−1处的单峰是•OH的伸缩振动,谱带明显(强、宽)可推测提取液中含有羟基基团,且羟基数目较多。2 931 cm−1处是苯环的C—H伸缩振动。Soto等[27]指出,1 400 ~ 2 000 cm−1范围的峰表征该结构所具有芳香族特性,1 403 、1 527 、1 627 cm−1处的峰是芳香环C=C键的结构。1 234 cm−1处的峰是C—O键的弯曲振动,1 072 cm−1处可能是C—O—C伸缩振动吸收峰,817 cm−1可能是苯环上的=C—H面外弯曲振动吸收峰。蓝莓原花青素的特征骨架振动主要集中在1 000 ~ 1 800 cm−1和700 ~ 850 cm−1。蓝莓原花青素红外谱图在1 520 ~ 1 540 cm−1处有单峰,这说明蓝莓原花青素是以原花青定为主的原花青素。在770 ~ 780 cm−1处有单峰779 cm−1,而在730 cm−1处没有吸收峰,这证明了是以(表)儿茶素为主要基础单元,而不是以(表)没食子儿茶素为主要基础单元的原花青素中的平面构象[28]。通过以上对红外谱图的分析,说明了蓝莓提取后的产物主要是由(表)儿茶素的结构单元构成的原花青定类聚合物。甲氧基中C—H、羟基、C—O和芳烃骨架C=C键均为酚类的特征基团,可见4种辅助方法提取液中含有羟基、苯环、甲氧基和含氧杂环等特征基团。陈茵茹[26]对比了溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和超声微波双辅助提取法得到的葡萄籽原花青素粗品并进行纯化,对纯化产物进行了红外光谱分析后发现原花青素结构没有明显差异,说明微波和超声波对葡萄籽原花青素结构无明显破坏作用。因此,对比蓝莓原花青素聚合度的变化和蓝莓原花青素的红外光谱图可见,不同提取方式对蓝莓原花青素化学结构有一定影响但差异不大。

    • 将4种提取方式提取液的蓝莓原花青素调至相同的浓度为30 μg/mL,以总还原能力、DPPH•、ABTS+•以及•OH清除能力为考察指标,进行4种方法提取液的抗氧化能力比较,结果如表4所示。

      表 4  4种提取方式提取液抗氧化能力

      Table 4.  Antioxidant ability of the extracts from 4 extraction methods

      提取方法 Extraction methodFRAPDPPH•/%ABTS+•/%•OH/%
      溶剂浸提法 Solvent extraction method1.37 ± 0.06a98.69 ± 1.03a66.86 ± 2.36a57.20 ± 1.14a
      超声波辅助法 Ultrasonic assisted extraction method1.31 ± 0.07a97.89 ± 1.20a58.97 ± 1.85b49.33 ± 1.51b
      微波辅助法 Microwave assisted extraction method1.35 ± 0.07a98.85 ± 1.02a64.88 ± 1.45a55.30 ± 0.99a
      光波辅助法 Light wave assisted extraction method1.33 ± 0.05a98.57 ± 1.49a60.43 ± 1.19b51.41 ± 1.45b
      注:FRAP为总还原能力。Note: FRAP, ferric ion reducing antioxidant power.

      DPPH•清除试验可以提供一个试样与稳定自由基反应的信息,是筛选抗氧化活性物质普遍采用的一项指标,因而广泛用于衡量抗氧化剂清除自由基的能力[29]。将4种辅助方法的提取液原花青素调至相同浓度30 μg/mL后,不同提取方法的总还原能力和DPPH•清除能力差异不显著(P > 0.05),4种提取方式的提取液都表现出很高的DPPH•清除能力,清除率均在97%以上。•OH清除能力的大小顺序为普通溶剂浸提法 > 微波辅助提取法 > 光波辅助提取法 > 超声辅助提取法。目前ABTS+•清除法已经广泛应用于测定亲脂和亲水性物质的总抗氧化能力。超声波辅助法对ABTS+•清除效果最差,溶剂法最强。ABTS+•和•OH清除试验中4种提取方式差异基本一致,溶剂浸提法与超声波辅助法、溶剂浸提法与光波辅助法,超声波辅助法与微波辅助法,微波辅助法与光波辅助法差异显著(P < 0.05)。相同浓度下,4种提取方式的提取液对DPPH•的清除能力最强高于ABTS+•和•OH。综合以上抗氧化试验,普通溶剂浸提法表现出最强的抗氧化能力,微波辅助法和光波辅助法的抗氧化能力相近,但微波辅助法更好。出现这种差异的原因可能是微波、光波和超声波对提取液中的抗氧化成分结构造成了一定的破坏,而溶剂法最为温和,因此溶剂浸提法提取液抗氧化活性要高于其他3种,但微波辅助法与溶剂浸提法抗氧化能力的差异不显著(P > 0.05)。抗氧化能力的差异也可能与蓝莓原花青素提取液中原花青素物质种类、含量以及原花青素的聚合度有关[30]

    • 通过扫描电镜观察普通溶剂浸提法、超声波辅助法、微波辅助法和光波辅助法提取液离心后的残渣冷冻干燥粉末来分析4种方法对结构的影响,结果如图4所示。

      图  4  4种提取方式提取残渣扫描电镜观察

      Figure 4.  Scanning electron microscope observation of extraction residues in four extraction methods

      采用扫描电镜观察不同方法的蓝莓原花青素提取液离心后的残渣的微观结构变化,进一步分析4种辅助提取方法提取技术的机制。由扫描电镜的结果可以看出,4种提取方式的提取残渣具有明显差异。普通溶剂浸提法表面褶皱较平,且孔隙较少。经过超声波、微波和光波处理的其他3种残渣的微观结构表面粗糙褶皱增多,孔隙增加,有利于物料内部原花青素类物质以及其他酚类物质的传质过程。微波处理后的褶皱幅度较大,孔隙较多,微波的热效应使结构破碎的更加膨松,粗糙松散。光波处理后孔隙较大,褶皱没有微波处理的粗糙松散。超声波处理后的结构褶皱均匀,细碎多孔。结构松散褶皱多有利于蓝莓中原花青素和其他酚类物质的浸出,因此微波辅助法提取率要高于其他3种。微波和光波的热效应不同于超声波的机械振动,微波和光波使结构破坏的更松散褶皱幅度更大更粗糙,而超声波使结构破坏的更加细碎均匀没有微波和光波彻底,这也可能导致了微波辅助和光波辅助的提取液中的抗氧化物质遭到了一定的破坏,使得抗氧化活性略低于普通溶剂浸提法和超声辅助法。

    • 比较溶剂浸提法、超声波辅助法、微波辅助法和光波辅助法处理对蓝莓原花青素的提取效果、酚类物质含量、化学结构和抗氧化功能的影响,蓝莓原花青素得率从高到低依次为微波辅助法 > 光波辅助法 > 超声波辅助法 > 溶剂浸提法。经过超声波、微波和光波处理的提取液,其原花青素含量、总酚含量、总黄酮含量和花青素含量都高于普通溶剂浸提法,微波辅助法最高。对比超声波辅助法、微波辅助法和光波辅助法再次浸提前后的得率、提取比例和提取效率,可以得出超声波、微波、光波处理在提取过程中起主导作用,浸提起到次要作用。4种方法提取液调至同一原花青素浓度30 μg/mL后,总还原能力和DPPH•清除能力差异不显著(P > 0.05),DPPH•清除率均在97%以上。•OH清除能力的大小顺序为普通溶剂浸提法 > 微波辅助提取法 > 光波辅助提取法 > 超声辅助提取法。超声波辅助法对ABTS+•清除效果最差,溶剂法浸提法最强。总体来看溶剂浸提法的抗氧化活性最好,但微波辅助法与溶剂浸提法抗氧化能力的差异不显著(P > 0.05)。通过红外光谱发现超声波、微波和光波对提取液中原花青素以及其他酚类物质的成分均没有明显破坏,扫描电镜观察结果显示,微波辅助法褶皱更加松散,褶皱幅度更大,对提取物结构破坏更彻底,更有利于原花青素以及其他酚类物质的浸出。

参考文献 (30)

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