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松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析

盛东萍 张晓阳 冯梦婷 叶建仁 邱秀文

盛东萍, 张晓阳, 冯梦婷, 叶建仁, 邱秀文. 松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
引用本文: 盛东萍, 张晓阳, 冯梦婷, 叶建仁, 邱秀文. 松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
Sheng Dongping, Zhang Xiaoyang, Feng Mengting, Ye Jianren, Qiu Xiuwen. Construction and its function analysis of RNA interference vector of cytochrome cyp-13A11 gene in Bursaphelenchus xylophilus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
Citation: Sheng Dongping, Zhang Xiaoyang, Feng Mengting, Ye Jianren, Qiu Xiuwen. Construction and its function analysis of RNA interference vector of cytochrome cyp-13A11 gene in Bursaphelenchus xylophilus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025

松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
基金项目: 国家自然科学基金项目(31660205),江西省林业厅林业科技创新项目(201711)
详细信息
    作者简介:

    盛东萍。主要研究方向:森林病理学研究。Email:1973661421@qq.com 地址:332005 江西省九江市前进东路551号

    通讯作者:

    邱秀文,博士,副教授。主要研究方向:森林病理学研究。Email:qiuxiuwen3@163.com 地址:同上

Construction and its function analysis of RNA interference vector of cytochrome cyp-13A11 gene in Bursaphelenchus xylophilus

  • 摘要:   目的  构建松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,研究cyp-13A11基因的功能,为松材线虫病的生物防治提供理论依据。  方法  本文通过设计特异性引物,扩增松材线虫cyp-13A11基因片段,构建至pEASY-T1干扰载体上并转入Trans1-T1大肠杆菌菌株。采用浸泡法对松材线虫进行RNA干扰,通过qRT-PCR检测cyp-13A11基因的表达,将干扰后的线虫分别接种至长满灰葡萄孢菌丝的培养皿中和黑松苗上,测定RNA干扰后线虫的取食、繁殖、致病力和干扰效率等指标。  结果  成功构建了带有pEASY-T1干扰载体的Trans1-T1菌株并且能够合成cyp-13A11 dsRNA,通过RNA干扰抑制了松材线虫cyp-13A11基因的表达。松材线虫RNA干扰后接种至灰葡萄孢第3天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积较小,ddH2O处理松材线虫取食面积达到了整体的2/3;接种第6天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积为整体的1/3,而ddH2O处理松材线虫已将灰葡萄孢菌丝取食殆尽。ddH2O处理松材线虫的繁殖数量比cyp-13A11 dsRNA处理高4.28倍。松材线虫接种至黑松苗第10天,ddH2O处理黑松发病率为22.2%,而cyp-13A11 dsRNA处理黑松发病率为5.6%;接种至20天,ddH2O处理的黑松发病率为44.4%,cyp-13A11 dsRNA处理的黑松发病率为33.3%;直至接种30天,ddH2O和cyp-13A11 dsRNA处理的黑松全部枯萎,发病率达到100%。  结论  成功构建了松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,cyp-13A11基因表达沉默后影响了松材线虫的取食,降低了松材线虫的繁殖能力和致病力。
  • 图  1  松材线虫cyp-13A11基因的克隆

    Figure  1.  Cloning of cyp-13A11 gene from Bursaphelenchus xylophilus

    图  2  Trans1-T1表达菌株PCR验证

    Figure  2.  PCR verification of Trans1-T1 expression strain

    图  3  cyp-13A11基因dsRNA合成结果

    Figure  3.  Double-stranded RNA synthesis of cyp-13A11 gene

    图  4  RNA干扰后cyp-13A11基因表达量

    不同字母表示不同处理间差异显著性(P < 0.01)。下同。Different letters indicate significant differences between treatments (P < 0.01). The same below.

    Figure  4.  Expression level of cyp-13A11 gene after RNAi treatment

    图  5  松材线虫在灰葡萄孢上的取食情况

    A. 接种3 d;B. 接种6 d。对照组:ddH2O浸泡松材线虫;RNAi处理组:cyp-13A11 dsRNA浸泡松材线虫。下同。A,inoculated for three days; B,inoculated for six days. Control group,Bursaphelenchus xylophilus soaked in ddH2O; RNAi treatment group,Bursaphelenchus xylophilus soaked in cyp-13A11 dsRNA. The same below.

    Figure  5.  Feeding condition of Bursaphelenchus xylophilus on Botrytis cinerea

    图  6  RNA干扰对松材线虫繁殖的影响

    Figure  6.  Effects of RNA interference on the reproduction of Bursaphelenchus xylophilus

    图  7  不同接种处理第20天黑松发病情况

    Figure  7.  Symptoms of Pinus thunbergii seedlings after 20 days inoculation

    表  1  不同接种处理黑松的发病情况

    Table  1.   Disease status of Pinus thunbergii under different treatments

    接种时间
    Inoculating
    time/d
    黑松发病率 Wilting rate of Pinus thunbergii/%
    对照组1
    Control group 1
    RNAi处理组
    RNAi treatment group
    对照组2
    Control group 2
    1005.622.2
    20033.344.4
    300100.0100.0
    注:对照组1:cyp-13A11dsRNA接种至黑松苗;RNAi:cyp-13A11 dsRNA干扰后的线虫悬液接种至黑松苗;对照组2:ddH2O浸泡后的线虫悬液接种至黑松苗。Notes: control group 1, cyp-13A11 dsRNA is inoculated into Pinus thunbergii; RNAi, the suspension of nematodes after interference with cyp-13A11 dsRNA is inoculated into Pinus thunbergii; control group 2, the ddH2O soaked nematode suspension is inoculated into Pinus thunbergii.
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    , 冯晓峰, 王玉兵, 郭晓萍, 严晓素, 温秀凤3, 王华芳, 赵兵, 骈瑞琪, 于京民2, 冯仲科, 张志翔, 邹坤, 杨伟光, 李镇宇, 呼晓姝, 张兴杰, 林善枝, 王民中, 王玉春, 李凤兰, 丁霞, 刘玉军, 孙建华, 张庆, 陶凤杰, 刘艳, 陈卫平, 沈应柏, 蒋平, 付瑞海, 赵新丽, 马建海, 汪植.  松材线虫入侵对马尾松林植物群落功能的影响 . 北京林业大学学报, 2007, 29(5): 114-120.
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-20
  • 修回日期:  2020-04-09
  • 网络出版日期:  2020-12-24
  • 刊出日期:  2021-02-05

松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
    基金项目:  国家自然科学基金项目(31660205),江西省林业厅林业科技创新项目(201711)
    作者简介:

    盛东萍。主要研究方向:森林病理学研究。Email:1973661421@qq.com 地址:332005 江西省九江市前进东路551号

    通讯作者: 邱秀文,博士,副教授。主要研究方向:森林病理学研究。Email:qiuxiuwen3@163.com 地址:同上

摘要:   目的  构建松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,研究cyp-13A11基因的功能,为松材线虫病的生物防治提供理论依据。  方法  本文通过设计特异性引物,扩增松材线虫cyp-13A11基因片段,构建至pEASY-T1干扰载体上并转入Trans1-T1大肠杆菌菌株。采用浸泡法对松材线虫进行RNA干扰,通过qRT-PCR检测cyp-13A11基因的表达,将干扰后的线虫分别接种至长满灰葡萄孢菌丝的培养皿中和黑松苗上,测定RNA干扰后线虫的取食、繁殖、致病力和干扰效率等指标。  结果  成功构建了带有pEASY-T1干扰载体的Trans1-T1菌株并且能够合成cyp-13A11 dsRNA,通过RNA干扰抑制了松材线虫cyp-13A11基因的表达。松材线虫RNA干扰后接种至灰葡萄孢第3天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积较小,ddH2O处理松材线虫取食面积达到了整体的2/3;接种第6天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积为整体的1/3,而ddH2O处理松材线虫已将灰葡萄孢菌丝取食殆尽。ddH2O处理松材线虫的繁殖数量比cyp-13A11 dsRNA处理高4.28倍。松材线虫接种至黑松苗第10天,ddH2O处理黑松发病率为22.2%,而cyp-13A11 dsRNA处理黑松发病率为5.6%;接种至20天,ddH2O处理的黑松发病率为44.4%,cyp-13A11 dsRNA处理的黑松发病率为33.3%;直至接种30天,ddH2O和cyp-13A11 dsRNA处理的黑松全部枯萎,发病率达到100%。  结论  成功构建了松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,cyp-13A11基因表达沉默后影响了松材线虫的取食,降低了松材线虫的繁殖能力和致病力。

English Abstract

盛东萍, 张晓阳, 冯梦婷, 叶建仁, 邱秀文. 松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
引用本文: 盛东萍, 张晓阳, 冯梦婷, 叶建仁, 邱秀文. 松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
Sheng Dongping, Zhang Xiaoyang, Feng Mengting, Ye Jianren, Qiu Xiuwen. Construction and its function analysis of RNA interference vector of cytochrome cyp-13A11 gene in Bursaphelenchus xylophilus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
Citation: Sheng Dongping, Zhang Xiaoyang, Feng Mengting, Ye Jianren, Qiu Xiuwen. Construction and its function analysis of RNA interference vector of cytochrome cyp-13A11 gene in Bursaphelenchus xylophilus[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(1): 96-102. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200025
  • 松材线虫病又称松树枯萎病(pine wilt disease),是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的一种国际性重大检疫病害[1]。该病害具有发病部位隐蔽、传播蔓延迅速、致死率高、危害范围广和防治难度大等特点,因此又被称为松树中的“癌症”[2]。我国于1982年在南京中山陵首次发现松材线虫病[3],疫区范围已扩大到安徽、江西、云南、贵州、广东、湖南、陕西、四川、天津、辽宁、浙江、福建、湖北、广西以及重庆等19个省区市(国家林业和草原局2019年第4号公告),造成的经济损失达上千亿元。松材线虫病的危害和扩散趋势严重威胁着我国松林、众多重要的风景名胜区以及三峡库区的生态安全[4-5]。松材线虫分子致病机理还不清楚,导致松材线虫病防控难以取得突破性进展。

    2011年Kikuchi等测定了松材线虫全基因组序列[6],这为松材线虫病致病机理及相关致病基因的研究奠定了良好基础。细胞色素P450(cytochrome p450,CYP450)广泛存在于生物体中,是一类结构和功能相似的血红素同工酶,催化生物体内一系列的氧化代谢反应,参与类固醇、脂肪酸、前列腺素、保幼激素和蜕皮激素等内源化合物的合成,同时在药物及杀虫剂等外源有害物质的解毒过程中具有重要作用[7-10]。松材线虫基因组中含有76个CYP450基因,研究表明这些基因在线虫代谢有害物质的解毒过程中发挥了重要作用[6]。然而,松材线虫细胞色素CYP450基因的具体功能目前还不清楚。

    RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由外源或内源双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)启动,在核糖核酸内切酶的作用下将RNA分子切割为小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),然后与mRNA的同源序列特异性结合,在RNA聚合酶的催化下合成新的dsRNA,再由核酸内切酶剪切产生新的siRNA,与mRNA结合后产生新的siRNA,如此经过多次循环,沉默信号逐渐放大,从而引起功能基因表达沉默的现象[11-14]。RNA干扰技术是研究基因功能的重要工具,已被广泛应用于研究动物[15-16]、植物[17]、线虫[18]相关基因的功能。我们前期研究表明,松材线虫入侵黑松后其cyp-13A11基因表达量显著上调,说明该基因在松材线虫致病过程中发挥了重要作用[19]。然而,松材线虫cyp-13A11基因的具体功能目前还不明确。因此,本文以pMD19-T质粒构建了松材线虫cyp-13A11基因dsRNA表达载体,通过浸泡法检测cyp-13A11基因沉默对松材线虫的取食、繁殖和致病力的影响,为探明cyp-13A11基因的功能提供理论依据。

    • 供试松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)分离自江西省九江市的黑松病木,将松材线虫接种至长满灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的PDA(potato dextrose agar)培养基上,25 ℃恒温培养5 d,采用贝尔曼漏斗法分离线虫,用无菌水清洗3次后将线虫收集至1.5 mL的无菌离心管中,备用。

    • 采用天根生化科技有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(RNAprep pure tissue kit)提取松材线虫总RNA,经紫外分光光度计测定浓度后电泳检测RNA质量。将提取的总RNA按照TaKaRa公司反转录试剂盒(Prime script 1st strand cDNA synthesis kit)说明书进行反转录,合成松材线虫cDNA。

    • 以上述合成的cDNA为模板,cyp-13A11-F(5′-CAGGGTTACCCGTTCTTA-3′)和cyp-13A11-R(5′-TGATTCCCATCTTTCAGG-3′)为引物,进行PCR反应。反应条件为:94 ℃ 5 min预变性,94 ℃ 30 s,60 ℃ 34 s,72 ℃ 1 min,35个循环,72 ℃ 10 min延伸。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测分析后,按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒的使用说明书进行切胶回收。回收片段与pEASY-T1载体(北京全式金生物技术有限公司)连接,取10 μL过夜连接产物与100 μL大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞混匀,后均匀涂布于含有100 μL/mL Amp+的LB固体培养基上,37 ℃恒温培养过夜,挑取白色菌落进行菌液PCR。将PCR扩增产物送至上海生工公司测序,以确认cyp-13A11基因片段是否插入pEASY-T1载体。

    • 以上述构建的表达载体为模板,使用带有T7启动子的引物(cyp-13A11-T7F:5′- TAATACGACTCACTATAGGGCAGGGTTACCCGTTCTTA-3′;cyp-13A11-R:5′- TGATTCCCATCTTTCAGG-3′;cyp-13A11-F:5′- CAGGGTTACCCGTTCTTA-3′;cyp-13A11- T7R:5′- TAATACGACTCACTATAGGGTGATTCCCATCTTTCAGG-3′)进行PCR反应,程序为:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后,按照MEGAscript RNAi kit protocol试剂盒说明书合成dsRNA,使用紫外分光光度计测定合成的dsRNA浓度,凝胶电泳检测dsRNA的完整性。

    • 松材线虫用无菌水清洗后浸泡于0.9%的硫酸链霉素溶液中,2 000 r/min离心3 min,将收集的松材线虫制成悬液。分别吸取80 μL(约3 200条)线虫悬液至等体积的cyp-13A11 dsRNA溶液和ddH2O中,置于转速为80 r/min的摇床中25 ℃浸泡48 h。

      分别收集浸泡在ddH2O和dsRNA溶液中的松材线虫,用无菌水清洗3次后,从中挑取30对成虫接种至长满灰葡萄孢的培养皿上,每个处理接种3皿,25 ℃恒温培养6 d,拍照观察松材线虫取食灰葡萄孢的情况。培养6 d后用贝尔曼漏斗法分离不同处理的松材线虫,2 000 r/min离心3 min,弃上清收集线虫并在显微镜下统计每皿线虫的数量。

      cyp-13A11 dsRNA干扰后的线虫采用人工皮接法分别接种至3年生黑松上,每株接种50 μL(约2 000条)线虫悬液,分别将等体积ddH2O浸泡后的线虫悬液和cyp-13A11 dsRNA溶液(无线虫)接种至黑松作为对照。每个处理接种9株松苗,观察发病情况,持续30 d,定期统计发病率。

    • 分别提取cyp-13A11 dsRNA溶液和ddH2O浸泡后松材线虫的总RNA,按照prime script 1st strand cDNA synthesis kit(TaKaRa)试剂盒的使用说明反转录合成cDNA的第一条链。依据GenBank上已发表的松材线虫cyp-13A11基因序列(登录号:NM_067303.1)设计qPCR引物:cyp-13A11-qPCR-F(5′-TGCTGCTCAATGTGCCTC-3′)和cyp-13A11-qPCR-R(5′-GACTATTGCGAATCCCACG-3′),以Actin基因为内参照,采用transstart green qPCR supermix(北京全式金生物技术有限公司)试剂盒进行qRT-PCR,测定松材线虫cyp-13A11基因的干扰效率,每个实验重复3次。

    • 实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行差异显著性分析。

    • 以松材线虫总RNA反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增。扩增结束后,将PCR产物加入1%琼脂糖凝胶中检测分析,结果如图1所示,扩增片段大小介于1 200 ~ 1 300 bp之间,与预期大小1 269 bp相符。PCR产物按AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明进行切胶回收,4 ℃保存备用。

      图  1  松材线虫cyp-13A11基因的克隆

      Figure 1.  Cloning of cyp-13A11 gene from Bursaphelenchus xylophilus

    • 将克隆的松材线虫cyp-13A11基因片段连接至pEASY-T1载体,连接产物转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中,均匀涂布于含有Amp、IPTG、Xgal的固体LB培养基平板上,37 ℃培养12 h,挑取白色菌落进行菌液PCR。取10 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图2所示,电泳条带明亮清晰,大小与目的条带一致。同时将PCR产物送上海生工测序,将测序结果与NCBI网站的已知序列进行BLAST比对分析,发现二者之间的序列同源性为99.19%,表明松材线虫cyp-13A11基因已成功克隆至pEASY-T1载体。

      图  2  Trans1-T1表达菌株PCR验证

      Figure 2.  PCR verification of Trans1-T1 expression strain

    • 以构建的RNA干扰表达载体为模板,按照MEGAscript RNAi kit protocol试剂盒说明书步骤合成松材线虫cyp-13A11基因dsRNA。经紫外分光光度计检测,合成的dsRNA浓度为2.6 μg/μL。取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳,检测结果如图3所示,目的条带明亮、单一,并且与预期片段大小一致,说明合成的dsRNA可用于后续的基因沉默实验。

      图  3  cyp-13A11基因dsRNA合成结果

      Figure 3.  Double-stranded RNA synthesis of cyp-13A11 gene

    • 采用qRT-PCR检测RNA干扰对松材线虫cyp-13A11基因表达量的影响,结果如图4所示,将对照组的cyp-13A11基因的表达量设定为1,RNAi处理组松材线虫cyp-13A11基因的表达量为0.01,与对照组相比其表达量下调显著(P < 0.01),表明dsRNA干扰可有效抑制松材线虫cyp-13A11基因的表达。

      图  4  RNA干扰后cyp-13A11基因表达量

      Figure 4.  Expression level of cyp-13A11 gene after RNAi treatment

    • 松材线虫经ddH2O和dsRNA浸泡处理后接种至长满灰葡萄孢的培养基上,25 ℃恒温培养6天。松材线虫取食情况如图5所示,接种第3天ddH2O处理的线虫取食面积明显大于cyp-13A11 dsRNA处理的取食面积(图5A);接种第6天对照组松材线虫已将灰葡萄孢取食殆尽,而cyp-13A11 dsRNA处理组的培养基表面仍存在大量灰葡萄孢菌丝(图5B)。采用贝尔曼漏斗法收集培养6天后的线虫并统计其数量。由图6可知,cyp-13A11 dsRNA处理组与对照组的线虫数量分别为2 040和8 733条。上述结果表明对cyp-13A11基因的干扰影响了松材线虫取食和繁殖。

      图  5  松材线虫在灰葡萄孢上的取食情况

      Figure 5.  Feeding condition of Bursaphelenchus xylophilus on Botrytis cinerea

      图  6  RNA干扰对松材线虫繁殖的影响

      Figure 6.  Effects of RNA interference on the reproduction of Bursaphelenchus xylophilus

    • 将干扰后和对照组的松材线虫接种至3年生的黑松上,观察黑松发病情况并统计其发病率。结合发病率和发病情况(表1图7)可知,在接种10 d后,与ddH2O浸泡线虫处理相比,cyp-13A11 dsRNA浸泡线虫处理的黑松发病率减少了16.6%;在接种20 d后,ddH2O浸泡线虫处理黑松发病率为44.4%,而cyp-13A11 dsRNA浸泡线虫处理黑松发病率为33.3%;直至接种30 d,接种ddH2O和cyp-13A11 dsRNA浸泡线虫的黑松全部枯萎,发病率达到100%。与此同时,接种cyp-13A11 dsRNA溶液的黑松在整个实验期间生长状况良好,发病率为零。以上结果表明,将松材线虫cyp-13A11基因进行干扰后,线虫的致病能力减弱。

      表 1  不同接种处理黑松的发病情况

      Table 1.  Disease status of Pinus thunbergii under different treatments

      接种时间
      Inoculating
      time/d
      黑松发病率 Wilting rate of Pinus thunbergii/%
      对照组1
      Control group 1
      RNAi处理组
      RNAi treatment group
      对照组2
      Control group 2
      1005.622.2
      20033.344.4
      300100.0100.0
      注:对照组1:cyp-13A11dsRNA接种至黑松苗;RNAi:cyp-13A11 dsRNA干扰后的线虫悬液接种至黑松苗;对照组2:ddH2O浸泡后的线虫悬液接种至黑松苗。Notes: control group 1, cyp-13A11 dsRNA is inoculated into Pinus thunbergii; RNAi, the suspension of nematodes after interference with cyp-13A11 dsRNA is inoculated into Pinus thunbergii; control group 2, the ddH2O soaked nematode suspension is inoculated into Pinus thunbergii.

      图  7  不同接种处理第20天黑松发病情况

      Figure 7.  Symptoms of Pinus thunbergii seedlings after 20 days inoculation

    • 松材线虫入侵松树后,寄主会产生一系列的防御反应,分泌出大量的蒎浠类和芳香族化合物等次生代谢产物,以抑制松材线虫的入侵[20]。在植物病原线虫的寄生过程中,对有害物质的解毒作用是线虫适应寄主体内环境的重要生理过程,也是线虫能否成功寄生的关键。因此,松材线虫为了能成功寄生于松树体内,必须通过解毒基因代谢转化松树产生的有毒代谢产物。有研究表明,CYP450基因在松树线虫的解毒过程中发挥了重要作用[6]。本研究成功构建松材线虫cyp-13A11基因干扰载体,通过RNAi方法对松材线虫cyp-13A11基因进行干扰,发现cyp-13A11基因沉默后松材线虫对灰葡萄孢的取食面积减小,线虫繁殖数量下降了76.6%。Benenati等通过显微注射方法对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的cyp-31A3和cyp-31A2基因进行了RNA干扰,发现这两个基因沉默后对线虫卵壳的形成和胚胎的发育具有重要的影响[21]。我们推测松材线虫cyp-13A11基因干扰后不利于虫卵的发育,进而影响了线虫的繁殖和取食速度。

      在接种前期(10 d),cyp-13A11基因干扰对松材线虫致病力的影响较为明显,接种干扰后松材线虫的黑松发病率仅为5.6%,而接种ddH2O浸泡松材线虫的黑松发病率为22.2%;在接种中期(20 d),接种RNA干扰后和ddH2O浸泡松材线虫的黑松发病率差距较小;在接种后期(30 d),接种松材线虫处理的黑松发病率均达到100%。由此可知,在接种前期,cyp-13A11基因干扰可以明显降低松材线虫的致病力,但随着接种时间的推移,干扰效果逐渐下降。我们的前期研究发现,RNAi对松材线虫F1 ~ F5代干扰效果明显,但对F6及以后代干扰效果较小[22]。因此,我们推测随着接种时间的推移,cyp-13A11基因RNA干扰效果逐渐消失,导致在接种后期cyp-13A11 dsRNA处理和ddH2O浸泡处理的黑松发病率趋于一致。大量研究显示,CYP450基因参与代谢过程和抗性机制主要通过表达量上调来实现。Maja等[23]研究表明,当秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)受到外源有毒物质侵害时,其cyp-33D3基因的表达量上调显著。王璇等将松材线虫接种至5年生的马尾松上,发现松材线虫cyp-33C9和cyp-33C4基因的表达量上调,推测松材线虫CYP450基因可能参与了松材线虫蒎烯类物质代谢过程,可能是松材线虫致病相关基因之一[24]。目前关于线虫CYP450基因功能的报道相对较少,其研究主要集中在CYP450基因表达量方面。我们通过RNA干扰技术对松材线虫cyp-13A11基因的功能进行了研究,结果表明cyp-13A11基因表达被沉默后,减缓了松材线虫的取食速度,降低了松材线虫的繁殖能力和致病力,说明CYP450基因在松材线虫繁殖和致病过程中都具有重要作用,这为进一步阐明松材线虫分子致病机理提供了数据支撑,同时为松材线虫的生物防治提供了理论依据。然而,cyp-13A11基因对松材线虫繁殖和致病力的具体调节机制还不清楚,需要进一步深入研究。

    • 本研究成功构建了松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,通过RNA干扰抑制了松材线虫cyp-13A11基因的表达。研究结果表明cyp-13A11基因表达沉默后减缓了松材线虫的取食速度,线虫的繁殖数量也显著下降(P < 0.001)。在松材线虫接种至黑松前期(10 d)和中期(20 d),cyp-13A11 dsRNA处理黑松的发病率比ddH2O处理分别降低了16.6%和11.1%,而在接种后期(30 d),RNA干扰对松材线虫致病力没有影响,两个处理的黑松发病率均达到了100%。

参考文献 (24)

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