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青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应

刘峻玲 梁珂豪 苗雅慧 胡安妮 孙永江 张凌云

刘峻玲, 梁珂豪, 苗雅慧, 胡安妮, 孙永江, 张凌云. 青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
引用本文: 刘峻玲, 梁珂豪, 苗雅慧, 胡安妮, 孙永江, 张凌云. 青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
Liu Junling, Liang Kehao, Miao Yahui, Hu Anni, Sun Yongjiang, Zhang Lingyun. Characteristics of PwUSP1 in Picea wilsonii and its response to drought and salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
Citation: Liu Junling, Liang Kehao, Miao Yahui, Hu Anni, Sun Yongjiang, Zhang Lingyun. Characteristics of PwUSP1 in Picea wilsonii and its response to drought and salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063

青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
基金项目: 农业部转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08009003-002)
详细信息
    作者简介:

    刘峻玲。主要研究方向:林木抗逆生理与分子生物学。 Email:liujunling022@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学林学院

    通讯作者:

    张凌云,教授。主要研究方向:经济林栽培生理及林木逆境生理与分子生物学。Email:lyzhang@bjfu.edu.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S718.43;S791.189

Characteristics of PwUSP1 in Picea wilsonii and its response to drought and salt stress

  • 摘要:   目的  USPs蛋白(universal stress proteins)是一类胁迫相关类蛋白,被广泛报道参与了植物应对非生物胁迫的过程。本研究通过对青杄中PwUSP1基因进行功能分析及验证,探索PwUSP1在植物应对盐和干旱胁迫时的作用,从而为未来通过转基因工程提高青杄对非生物胁迫的耐受性提供候选基因。  方法  通过瞬时转化烟草叶片实验揭示PwUSP1在细胞中的定位;利用酵母双杂实验鉴定PwUSP1自身能否形成同源二聚体;通过农杆菌侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwUSP1过表达株系。通过测定干旱和盐胁迫下过表达株系(L1、L7)及野生型(WT)和空载体(VC)株系的存活率、失水率,来分析比较不同株系对于干旱和盐胁迫的耐受能力;通过二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮锉蓝(NBT)染色,测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)以及丙二醛(MDA)的含量,研究PwUSP1发挥作用的生理机制。  结果  烟草亚细胞定位实验表明,PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中。酵母双杂结果显示PwUSP1蛋白自身能够形成同源二聚体。利用qRT-PCR检测转基因拟南芥,成功获得两个稳定纯合的株系(L1、L7)进行进一步分析。在盐和干旱胁迫下,相对于WT和VC,过表达PwUSP1能够显著提高植物对盐和干旱的耐受能力,表现出更高的存活率和更低的失水率,且显著降低了植株中过氧化氢、超氧阴离子的累积,提高了SOD、POD和CAT活性,抑制了MDA的积累。  结论  青杄PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中且自身能够形成同源二聚体,在干旱和盐胁迫条件下,PwUSP1通过增强植物的ROS清除能力及抑制膜脂氧化损伤来提高植物对非生物胁迫的耐受性。
  • 图  1  PwUSP1蛋白的亚细胞定位

    a、e. GFP通道;b、f. RFP通道;c、g. 白光通道;d、h. 融合图像。pCAMBIA1205空载体为空载体对照,GFP-PwUSP1为具有PwUSP1的融合蛋白。标尺为50 μm。a, e, GFP field; b, f, RFP field; c, g, bright field; d, h, merged pictures. pCAMBIA1205 empty vector indicates the empty vector control, GFP-PwUSP1 indicates the fusion protein with PwUSP1. Bar is 50 μm.

    Figure  1.  Sub-cellular localization of PwUSP1

    图  2  PwUSP1的同源二聚体鉴定

    Figure  2.  Yeast two hybrid screening of PwUSP1

    图  3  过表达株系的鉴定及盐胁迫下,野生型、空载体、PwUSP1过表达植株的生长状况及存活率

    WT. 野生型;VC. 空载体株系;L1、L7. PwUSP1过表达株系。a. 盐胁迫前,盐胁迫6 d及10 d的生长状态;b. WT、VC、L1和L7中PwUSP1相对表达量;c. 盐胁迫10 d后的存活率。不同字母表示在Dunnett检验下差异显著(P < 0.05)。下同。WT, wild type; VC, empty vector strain; L1, L7, PwUSP1 overexpression strains. a, growth situations before salt stress, under salt stress for 6 days and 10 days, respectively; b, relative expression of PwUSP1 in WT, VC, L1 and L7; c, survival rates after salt stress for 10 days. Different letters indicate significant differences at P < 0.05 level by Duncan’s multiple range test. The same below.

    Figure  3.  Identification of overexpressed plants and the growth situations and survival rates of wide type (WT), empty vector (VC) and PwUSP1 overexpressed plants (L1, L7) under salt stress

    图  4  干旱胁迫下,野生型、空载体、PwUSP1过表达植株的生长状况、存活率及相对含水量

    a. 干旱胁迫前,干旱胁迫20 d及复水3 d的生长状态;b. 干旱胁迫后的存活率;c. 干旱胁迫后离体叶片的相对含水量。a, growth situations under the full supplied water condition, drought stress for 20 days, and rewatered for 3 days; b, survival rates after drought stress; c, relative water contents of isolated leaves under drought stress.

    Figure  4.  Growth situations, survival rates and relative water contents of WT, VCand PwUSP1 overexpressed plants (L1, L7) under drought stress

    图  5  盐、干旱胁迫下野生型、空载体、过表达植株中的ROS水平及MDA含量

    a. NBT染色;b. DAB染色;c. 丙二醛含量;d. SOD活性;e. POD活性;f. CAT活性。a, NBT staining; b, DAB staining; c, MDA content; d, SOD activity; e, POD activity ; f, CAT activity.

    Figure  5.  ROS accumulation and MDA contents of WT, VCand PwUSP1 overexpressed plants (L1, L7) under salt and drought stress

    表  1  引物序列

    Table  1.   Primer sequence

    用途 Application引物名称 Primer name序列 Sequence(5′−3′)
    载体构建Vector construction PwUSP1-1205-F CGGAATTCATGGAGAGTGGGGAGCATAG
    PwUSP1-1205-R GGGGTACCCTATATTACTGATAGGTCTCCA
    PwUSP1-AD-F-EcoR I CCGGAATTCATGGAGAGTGGGGAGCATAG
    PwUSP1-AD-R-BamH I CGCGGATCCGTATTACTGATAGGTCTCCAGCC
    PwUSP1-BD-F-EcoR I CCGGAATTCATGGAGAGTGGGGAGCATAG
    PwUSP1-BD-R-BamH I CGCGGATCCGTATTACTGATAGGTCTCCAGCC
    qRT-PCR PwUSP1-RT-F GAGAGTGGGGAGCATAGATGG
    PwUSP1-RT-R CCGCCATGCGACAGAGATGTA
    Actin2/8-RT-F TAACATTGTGCTCAGTGGTG
    Actin2/8-RT-R ACGACCTTAATCTTCATGCT
    注:引物中的下划线表示酶切位点。Note: underline in the primers indicates digestion site.
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-03-09
  • 修回日期:  2020-04-20
  • 网络出版日期:  2020-10-20

青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
    基金项目:  农业部转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08009003-002)
    作者简介:

    刘峻玲。主要研究方向:林木抗逆生理与分子生物学。 Email:liujunling022@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学林学院

    通讯作者: 张凌云,教授。主要研究方向:经济林栽培生理及林木逆境生理与分子生物学。Email:lyzhang@bjfu.edu.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S718.43;S791.189

摘要:   目的  USPs蛋白(universal stress proteins)是一类胁迫相关类蛋白,被广泛报道参与了植物应对非生物胁迫的过程。本研究通过对青杄中PwUSP1基因进行功能分析及验证,探索PwUSP1在植物应对盐和干旱胁迫时的作用,从而为未来通过转基因工程提高青杄对非生物胁迫的耐受性提供候选基因。  方法  通过瞬时转化烟草叶片实验揭示PwUSP1在细胞中的定位;利用酵母双杂实验鉴定PwUSP1自身能否形成同源二聚体;通过农杆菌侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwUSP1过表达株系。通过测定干旱和盐胁迫下过表达株系(L1、L7)及野生型(WT)和空载体(VC)株系的存活率、失水率,来分析比较不同株系对于干旱和盐胁迫的耐受能力;通过二氨基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮锉蓝(NBT)染色,测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)以及丙二醛(MDA)的含量,研究PwUSP1发挥作用的生理机制。  结果  烟草亚细胞定位实验表明,PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中。酵母双杂结果显示PwUSP1蛋白自身能够形成同源二聚体。利用qRT-PCR检测转基因拟南芥,成功获得两个稳定纯合的株系(L1、L7)进行进一步分析。在盐和干旱胁迫下,相对于WT和VC,过表达PwUSP1能够显著提高植物对盐和干旱的耐受能力,表现出更高的存活率和更低的失水率,且显著降低了植株中过氧化氢、超氧阴离子的累积,提高了SOD、POD和CAT活性,抑制了MDA的积累。  结论  青杄PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中且自身能够形成同源二聚体,在干旱和盐胁迫条件下,PwUSP1通过增强植物的ROS清除能力及抑制膜脂氧化损伤来提高植物对非生物胁迫的耐受性。

English Abstract

刘峻玲, 梁珂豪, 苗雅慧, 胡安妮, 孙永江, 张凌云. 青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
引用本文: 刘峻玲, 梁珂豪, 苗雅慧, 胡安妮, 孙永江, 张凌云. 青杄PwUSP1基因特征及对干旱和盐胁迫的响应[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
Liu Junling, Liang Kehao, Miao Yahui, Hu Anni, Sun Yongjiang, Zhang Lingyun. Characteristics of PwUSP1 in Picea wilsonii and its response to drought and salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
Citation: Liu Junling, Liang Kehao, Miao Yahui, Hu Anni, Sun Yongjiang, Zhang Lingyun. Characteristics of PwUSP1 in Picea wilsonii and its response to drought and salt stress[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200063
  • 广泛逆境胁迫蛋白USP(universal stress protein)最早发现于大肠杆菌中,由于其在二维电泳凝胶上的迁移率而被命名为c13.5蛋白[1],之后,在古细菌、细菌、植物和动物中鉴定出2 000多种USP蛋白,USP蛋白被广泛发现之后,就以该蛋白来命名其同源蛋白超家族,即USPA超家族[2]。根据USP蛋白结合ATP的能力可将USP蛋白大致分为两类[3],第一类的USP在其C端包含一个ATP结合位点,并具有5个β链和4个β链组成的α/β核心结构α-螺旋结构[4],而第二类USP则缺少ATP结合位点,USP结构域没有ATP结合残基和ATP结合活性[5]。USP蛋白的C端存在USP结构域,该结构域由140至160个保守氨基酸组成,并且在细胞防御信号传导、抗氧化应激反应中发挥重要的作用[1-2, 6-7]。目前,对于USP蛋白的研究主要集中在模式植物和作物中,已经在玉米(Zea mays)、木豆(Cajanus cajan)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、番茄(Solanum pennellii)、海蓬子(Salicornia brachiata)等植物中发现了USP蛋白[8-12]

    干旱、盐碱等非生物胁迫严重影响了植物的生长发育以及自然分布,已成为制约我国农业、林业生产发展的重要因素。为了应对非生物胁迫,植物在漫长的进化过程中形成了复杂的自我调控机制,而USP蛋白在其中发挥了关键的作用。比如,在拟南芥中过表达USP基因HRU1,能够提高植物在缺氧环境下的耐受能力,HRU1通过调节细胞中的过氧化氢含量来参与植物应对缺氧胁迫的过程[9]。在拟南芥中,USP还能以“分子伴侣”的形式存在于植物细胞质中,参与植物应对氧化胁迫的过程[13]。在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达盐生植物海蓬子USP基因SbUSP可以增强植物细胞的ROS清除能力,从而显著提高烟草的耐盐性[14]。此外,还有报道显示番茄中的USP蛋白(SpUSP)和棉花(Gossypium arboreum)中的USP蛋白(GUSP)同样也显著提高了植物对盐胁迫的耐受能力[10, 15]。这表明USP蛋白在参与多种植物应对盐胁迫的过程中发挥了重要的作用。除盐胁迫外,在番茄中过表达SpUSP还能够提高植物对于干旱胁迫的耐受能力,在干旱条件下,SpUSP通过上调植物中的ABA含量以促使植物关闭气孔减弱蒸腾作用[10]。此外在干旱胁迫后,棉花中USP基因GUSP1和GUSP2在植物的根、茎、叶中的表达量上调,并且表明GUSP1和GUSP2极有可能在叶绿体中发挥作用[16]。目前对于USP蛋白的研究主要集中在微生物中,在植物中虽然也发现了大量的USP蛋白,但对其具体功能的阐述依旧是稀少且不够清晰的。USP蛋白在不同植物中的广泛分布暗示了它们在植物生长发育中的重要作用,但其在植物中的生理和生化功能还需进一步探索[17]

    青杆(Picea wilsonii)为松科(Pinaceae)云杉属植物,是我国特有的针叶树种,也是我国重要的造林树种和园林绿化树种。青杄适宜生长在凉爽湿润的气候以及排水良好的微酸性土壤环境中,其对干旱及盐胁迫等非生物逆境胁迫的响应研究较少。之前关于青杄的研究,多集中于群落生态和育苗栽培等方面,但随着生物技术的发展,利用生物学手段对青杄的研究也有了一定的进展[18]。本课题组已经发现PwUSP1具有USP家族典型的UspA结构域和ATP结合位点,且PwUSP1在青杄的根、茎、叶、针叶、花粉、种子中均有表达,在根和花粉中表达量最高,同时,PwUSP1受干旱胁迫和盐胁迫的诱导表达上调,推测该基因有可能在青杄逆境胁迫响应中发挥作用[19]。本研究通过亚细胞定位检测了PwUSP1在细胞中的表达位置,并通过将PwUSP1异源转化模式植物拟南芥来研究其在参与植物应对非生物胁迫过程中的作用。在未来的基因工程中,PwUSP1或许可以作为一个候选基因来调控转基因青杄对于非生物胁迫的耐受能力。

    • 野生型拟南芥Col-0(WT)的种子为实验室所留存。野生型拟南芥、过表达株系及转pCAMBIA1205空载体株系(VC)的种子用5%的次氯酸钠溶液消毒,然后播到MS培养基上生长。4 ℃暗处理3 d后,将其放入光照培养箱中生长,温度为21 ℃,16 h光照/8 h黑暗,相对湿度60% ~ 70%,生长14 d后移到土(营养土与蛭石(vv)为1∶1)中继续生长。本氏烟草在温度25 ℃、湿度60%、光照每天16 h的条件下培养5 ~ 6周后,用于亚细胞定位实验。

    • PwUSP1的CDS全长构建到pCAMBIA1205载体上,酶切位点为EcoR I和Kpn I,设计引物PwUSP1-1205-F和PwUSP1-1205-R(表1),将构建好的35S-PwUSP1融合载体,转入到GV3103农杆菌感受态,通过花序侵染法转化拟南芥[20],侵染后得到的T0代种子播种在含有40 μg/mL潮霉素和50 μg/mL羧苄青霉素的固体MS培养基上,当植株长出2片子叶和2片真叶时,将其移到土里继续生长,收集阳性植株的T1代种子作为不同的株系,用同样的方法,一直筛选到T3代,筛选出的稳定纯合的阳性植株为Line1(L1)、Line7(L7),WT和VC株系作为对照。用TRI pure Reagent试剂盒(艾德莱,北京)提取各个株系叶片的RNA,用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行cDNA的反转录,利用Quant one step qRT-PCR Kit(SYBR Green)(FP303)(天根,北京)试剂盒进行实时定量PCR,选取拟南芥Actin基因作为内参基因[21]。通过qRT-PCR检测过表达株系中PwUSP1的表达量情况,实验分别设置3次生物学重复,3次技术重复。引物序列见表1

      表 1  引物序列

      Table 1.  Primer sequence

      用途 Application引物名称 Primer name序列 Sequence(5′−3′)
      载体构建Vector construction PwUSP1-1205-F CGGAATTCATGGAGAGTGGGGAGCATAG
      PwUSP1-1205-R GGGGTACCCTATATTACTGATAGGTCTCCA
      PwUSP1-AD-F-EcoR I CCGGAATTCATGGAGAGTGGGGAGCATAG
      PwUSP1-AD-R-BamH I CGCGGATCCGTATTACTGATAGGTCTCCAGCC
      PwUSP1-BD-F-EcoR I CCGGAATTCATGGAGAGTGGGGAGCATAG
      PwUSP1-BD-R-BamH I CGCGGATCCGTATTACTGATAGGTCTCCAGCC
      qRT-PCR PwUSP1-RT-F GAGAGTGGGGAGCATAGATGG
      PwUSP1-RT-R CCGCCATGCGACAGAGATGTA
      Actin2/8-RT-F TAACATTGTGCTCAGTGGTG
      Actin2/8-RT-R ACGACCTTAATCTTCATGCT
      注:引物中的下划线表示酶切位点。Note: underline in the primers indicates digestion site.
    • PwUSP1的CDS全长构建到带有GFP(绿色荧光蛋白)的pCAMBIA1205载体上,将构建好的GFP-PwUSP1融合载体,转入到GV3103农杆菌感受态中,然后与阳性对照RACK1A-RFP质粒共转[22],注射烟草叶片下表皮。48 h后在共聚焦显微镜下观察并拍照。

    • 设计引物PwUSP1-AD-F-EcoR I、PwUSP1-AD-R-BamH I、PwUSP1-BD-F-EcoR I和PwUSP1-BD-R-BamH I(表1),将构建好的pGADT7-PwUSP1与空pGBKT7、pGBKT7-PwUSP1与空pGADT7、pGADT7-PwUSP1与pGBKT7-PwUSP1分别共转AH109酵母感受态中,均匀涂在SD/-Trp/-His二缺板上,以pGBKT7-53+pGADT7-T为阳性对照,以pGBKT7+pGADT7为阴性对照,生长3 ~ 4 d后,分别挑选单克隆,用无菌水稀释,分别吸取3 μL左右的菌液滴于三缺板(SD/-Trp/-His/-Leu)中,培养2 ~ 3 d后,吸取菌液滴在加X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Leu/-Ade四缺板上,培养3 ~ 4 d,观察拍照。

    • 以WT和VC为对照,选择L1和L7为阳性过表达株系。将4个株系的种子用5%的次氯酸钠溶液消毒20 min,然后无菌水清洗6次,播到MS培养基上,每个株系均播种100 颗种子。生长14 d后,将不同株系的拟南芥移至土(营养土∶蛭石=1∶1)中继续生长,生长14 d后,盐处理为200 mmol/L NaCl溶液连续处理10 d。干旱处理为所有株系先干旱20 d,再复水3 d。盐处理的株系分别在第6天和第10天观察,并在第10天统计各株系存活率。干旱处理的株系分别在第20天和第23天观察,并在第23天统计各株系存活率。所有实验均重复3次

    • 将每个株系的种子播到MS培养基上正常生长14 d,每个株系均播种100颗种子,再移到营养土中生长。以正常生长的株系为对照组,实验组用200 mmol/L的盐溶液处理6 d或者干旱14 d。分别取WT、VC、L1、L7这 4种株系的相同位置的莲座叶,每个植株取东西南北莲座叶共8片,3个植株作为1个生物学重复,每组实验设置3个生物学重复。取对照组和实验组每种株系的叶片作为材料,酶活性及丙二醛(MDA)的含量均使用南京建成公司的试剂盒进行测定,MDA采用TBA法(A003-1-2)进行测定。超氧化物歧化酶(SOD)采用羟胺法(A001-1-1)进行测定。过氧化氢酶(CAT)采用可见光法(A007-1-1)进行测定。过氧化物酶(POD)采用比色法(A084-3-1)进行测定。MDA含量、SOD、CAT、POD酶活性的计算方法均按照说明书进行。通过取正常生长的4种株系的叶片,在空气中暴露2 h,每半小时称量叶片鲜质量来测定叶片含水量。

    • 通过DAB和NBT染色来检测不同处理下过表达株系和WT及VC株系中过氧化氢和超氧离子的积累。DAB染色采用DAB显色试剂盒(20x)(Solarbio,北京),NBT染色采用NBT显色试剂盒(Solarbio,北京),具体染色方法按照说明书进行。取正常生长条件下和不同处理后的各个株系的叶片,浸泡在DAB和NBT染液中2 h。染色后,将叶片浸泡在95%乙醇溶液中洗去叶绿素,然后拍照。每组实验均重复3次。

    • 利用SPSS 22.0软件进行方差分析,利用SigmaPlot 10.0进行作图。单因素方差分析采用Dunnett检验,P < 0.05为差异显著。

    • 通过瞬时转化烟草实验,本研究确定了PwUSP1在细胞中的定位。将PwUSP1构建到带有GFP标签的pCAMBIA1205载体上,即GFP-PwUSP1,作为实验组。瞬时转化空载体的烟草叶片作为阴性对照组,RACK1A-RFP作为内参基因共转。结果表明,pCAMBIA1205空载体的GFP信号在细胞核、细胞质、细胞膜中都有分布(图1a),表明GFP- pCAMBIA1205可正常表达。GFP-PwUSP1融合载体的GFP信号同样也分布在细胞核、细胞质和细胞膜中(图1e),且细胞核、细胞质和细胞膜的绿色荧光与内参RACK1A-RFP红色荧光重合(图1h),说明PwUSP1蛋白定位在细胞核、细胞质和细胞膜中。

      图  1  PwUSP1蛋白的亚细胞定位

      Figure 1.  Sub-cellular localization of PwUSP1

    • 通过酵母双杂实验,本研究验证了PwUSP1能否自身形成同源二聚体。将pGADT7-PwUSP1与空pGBKT7、pGBKT7-PwUSP1与空pGADT7、pGADT7-PwUSP1与pGBKT7-PwUSP1以及阳性对照pGBKT7-53 + pGADT7-T和阴性对照pGBKT7 + pGADT7分别共转AH109酵母感受态中,在二缺培养基上涂板,5种组合均能在SD/-Trp/-His板上生长,说明质粒已转入酵母感受态中。将在二缺培养基上生长状态良好的酵母转接到三缺培养基上,发现阴性对照不能生长,而阳性对照和实验组PwUSP1-pGADT7 + PwUSP1-pGBKT7能生长。将在三缺培养基上生长好的酵母转接到事先涂布100 μL X-α-Gal的四缺培养基上,发现阳性对照以及实验组PwUSP1-pGADT7 + PwUSP1-pGBKT7酵母菌株均能生长并呈蓝色,其他均无法正常生长(图2),则说明了PwUSP1蛋白自身能够形成同源二聚体。

      图  2  PwUSP1的同源二聚体鉴定

      Figure 2.  Yeast two hybrid screening of PwUSP1

    • 本研究获得多个拟南芥PwUSP1转化株系,通过qRT-PCR分析,发现在L1和L7中PwUSP1表达量相对较高(图3b),因此,我们选择了L1和L7进行下一步表型实验。为了检测PwUSP1的过表达是否影响植物的耐盐性,本研究进行了盐胁迫下的成苗实验。实验结果表明,在200 mmol/L NaCl处理第6天时,WT和VC的叶片明显变黄并且开始枯萎,且随着盐胁迫处理时间的增加,WT和VC叶片的萎黄现象逐渐加剧,盐胁迫处理10 d后野生型和空载体拟南芥株系大量死亡,存活率低于45%。而过表达拟南芥株系在盐胁迫处理期间,相对于WT和VC,其叶片只出现少量的萎黄现象,且存活率高于90%(图3a3c)。这些结果表明,过表达PwUSP1会增强植物的耐盐能力。

      图  3  过表达株系的鉴定及盐胁迫下,野生型、空载体、PwUSP1过表达植株的生长状况及存活率

      Figure 3.  Identification of overexpressed plants and the growth situations and survival rates of wide type (WT), empty vector (VC) and PwUSP1 overexpressed plants (L1, L7) under salt stress

    • 为了评估过表达PwUSP1是否能提高植物的耐旱能力,本研究进行了干旱胁迫下的成苗实验。实验结果表明,干旱处理20 d后,WT和VC严重萎蔫,大量植株死亡,而过表达株系的萎蔫程度显著低于WT和VC。复水3 d后,WT和VC的萎蔫状况并没有恢复,其复水后的存活率低于20%,而过表达株系在复水后多数叶片的萎蔫状况得到缓解,且存活率高于90%(图4a4b)。通过将离体的叶片于空气中脱水处理2 h,我们统计了不同株系的叶片失水率。在2 h的脱水处理过程中,每个株系的含水量都显著下降,但是WT和VC的含水量下降的幅度更大,在2 h时,过表达株系的相对含水量在45%左右,而WT和VC的相对含水量在25%左右(图4c)。以上结果表明,过表达PwUSP1能够显著提高植物的耐旱能力。

      图  4  干旱胁迫下,野生型、空载体、PwUSP1过表达植株的生长状况、存活率及相对含水量

      Figure 4.  Growth situations, survival rates and relative water contents of WT, VCand PwUSP1 overexpressed plants (L1, L7) under drought stress

    • 干旱和盐胁迫通常会导致植物细胞中ROS的积累。为了检测在干旱和盐胁迫后过表达PwUSP1对植物ROS通路的影响,本研究通过DAB和NBT染色检测了不同株系中过氧化氢和超氧离子的积累含量。在正常生长条件下,所有株系的植物都仅展现出轻微染色,不同株系之间没有明显差异。但是,当干旱和盐处理后,相比于WT和VC,过表达株系的DAB和NBT染色明显更浅(图5a5b)。此外,本研究还检测了不同株系中SOD、POD和CAT的活性以及MDA的含量。结果显示,在正常条件下,过表达株系中酶活性和MDA的含量与WT和VC没有明显差异,但是在干旱和盐处理后,相比于过表达株系,WT和VC株系表现出明显更低的酶活性和更高的MDA积累(图5c ~ 5f)。这些结果表明,过表达PwUSP1能够显著提高抗氧化酶的活性并且增强了植物的ROS清除能力。

      图  5  盐、干旱胁迫下野生型、空载体、过表达植株中的ROS水平及MDA含量

      Figure 5.  ROS accumulation and MDA contents of WT, VCand PwUSP1 overexpressed plants (L1, L7) under salt and drought stress

    • 在前人的研究中,本课题组发现青杄PwUSP1具有UspA结构域和ATP结合位点,且在盐和干旱胁迫处理后,表达量显著上调,推测PwUSP1可能参与了植物响应外界非生物胁迫的过程[19]。由于目前针叶树遗传转化体系的建立较为困难,所以本研究借助模式植物拟南芥研究了PwUSP1的功能,证实了PwUSP1能够增强植物的耐盐能力和耐旱能力。

      在本研究中,我们通过瞬时转化烟草实验证明了PwUSP1定位于细胞核、细胞质与细胞膜(图1)。这与之前所报道的在其他物种中的USP蛋白的定位情况有所不同。比如,拟南芥USP蛋白AtUSP定位于细胞核和细胞质中,并可能在冷胁迫条件下在细胞核和细胞质中发挥重要作用[23]。在盐生植物海蓬子中,亚细胞定位实验结果表明SbUSP定位于细胞质和细胞膜中[14];而番茄(Solanum lycopersicum)中的SpUSP则被发现仅定位在细胞核和细胞膜中[10]。这可能是由于不同物种的USP蛋白虽然其结构域均较保守,但受物种差异的影响会出现定位不同的现象,且暗示了PwUSP1可能在细胞内具有更广泛的功能和作用。在微生物中,发现USP蛋白在大肠杆菌中既能自身形成同源二聚体,也能与其他蛋白形成异源二聚体,并且两者可以相互转化[24]。研究发现,拟南芥中AtUSP存在多种形式,包括单体、二聚体、三聚体和低聚复合物,当植物暴露于热激或氧化环境时,细胞内的氧化还原状态发生变化,从而使AtUSP从低分子量向高分子量复合体转变[9]。在本研究中,酵母双杂实验显示,PwUSP1自身能够形成同源二聚体(图2),这表明PwUSP1可以二聚体的形式在细胞中发挥作用,但PwUSP1是否在体内还存在其他形式,还需要进一步研究。

      为了验证PwUSP1的功能,本研究通过异源转化模式植物拟南芥研究其参与植物应对非生物胁迫过程中所发挥的作用。结果显示,在干旱和盐胁迫处理后,过表达株系的生长状况均显著优于野生型植株。盐处理10 d后,过表达株系存活率比野生型高出50%左右(图3a3c)。在干旱处理14 d时复水,过表达株系的存活率与野生型株系没有显著差异,而随着干旱时间延长,在干旱处理20 d时再复水后,过表达株系的存活率比野生型高出80%左右(图4a4b)。叶片失水实验显示,过表达株系的叶片相对含水量高于野生型株系20%左右(图4c)。此外,在正常生长条件下,过表达株系和野生型植株的开花时间、果荚大小和株高均没有显著差异(图S1),这些结果证明了PwUSP1在参与植物响应非生物胁迫的过程中发挥着正向调控的作用,且未影响正常生长条件下的植株生长发育和产量。在其他植物中,也有报道USP蛋白参与的逆境响应。比如,在拟南芥中过表达海棠(Malus sieversiiUSP基因MsUSPA能够显著提高植物的耐旱性[25]。在陆地棉(Gossypium hirsutum)中,研究人员鉴定发现了两个USP基因GhUSP1GhUSP2,这两个USP基因对盐胁迫十分敏感,受盐胁迫显著诱导[16]

      在受到非生物胁迫后,植物中的线粒体、叶绿体等细胞器会产生大量的活性氧物质(ROS),ROS主要包括过氧化氢和超氧阴离子等,过多的ROS积累会对植物细胞膜造成严重的氧化损害。此外,MDA也是膜脂过氧化的重要产物之一,其大量积累会进一步加剧细胞膜的损伤[26-27]。植物体内对活性氧的清除方式主要是通过酶促和非酶促两大系统,酶促活性氧清除系统包括过氧化物酶(POD),氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等,这些抗氧化酶在细胞的不同位置中相互作用,共同参与ROS的清除,以降低活性氧对细胞的伤害[27]。目前研究表明,USP蛋白对ROS的清除具有重要的作用。在大肠杆菌UspA突变株细菌中过表达Slrd2基因能提高对H2O2的抗性[28]。在拟南芥中过表达AtUSP基因可以增加植株对热激和氧化胁迫的耐受性[13]。本研究也发现,在干旱胁迫和盐胁迫后,野生型株系的染色程度比过表达株系更深,说明积累了更多的过氧化氢和超氧阴离子。此外,我们还测定了不同株系中SOD、POD、CAT的活性。结果发现,在干旱胁迫和盐胁迫后,4种株系的SOD、POD、CAT活性都有所升高,但过表达株系的上升趋势要明显高于野生型株系。通过测定4种株系中的MDA含量,我们发现,在干旱胁迫和盐胁迫后,过表达株系的MDA含量要明显低于野生型株系(图5)。这些结果表明,过表达PwUSP1能够增强细胞的ROS清除能力和抑制膜脂过氧化,以此来提高植物对于干旱和盐胁迫的耐受性,并且PwUSP1作为一个正调控基因参与植物应对非生物胁迫,且未影响正常条件下的生长发育过程。从这个角度来看,PwUSP1基因未来可以作为一个重要的育种基因,一方面可以提高受体植物对干旱和盐胁迫的耐受能力,同时不会影响植株的正常生长发育进程,但更深入的作用机制还需要进一步的探索。

    • 本研究发现PwUSP1定位于细胞核、细胞质和细胞膜中,并且自身能够形成同源二聚体。在植物中过表达PwUSP1能够提高逆境后的抗氧化酶的活性,降低ROS和MDA的积累,从而提高植物对干旱和盐胁迫的耐受能力,PwUSP1能够正向调控植物应对非生物胁迫。

参考文献 (28)

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