Expression and function analysis of histidine kinase gene PaHK3a of poplar ‘84K’
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摘要:目的 干旱、高盐等逆境胁迫严重影响了植物的生长发育。研究表明，组氨酸激酶在植物逆境响应中起重要作用。本研究对银腺杨‘84K’组氨酸激酶基因PaHK3a在不同组织的表达模式分析，检测了其对生长素、细胞分裂素等植物激素处理下及人工干旱、盐碱等非生物胁迫下的表达，结合干旱、盐碱条件下丙二醛（MDA）及保护酶活性等生化指标，对该基因的功能进行了初步鉴定，为杨树抗逆分子育种研究奠定基础。方法 以‘84K’杨无菌苗为材料，通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析PaHK3a基因在不同组织的表达模式。对‘84K’杨无菌苗进行浓度为10 mmol/L植物激素处理（ABA、6-BA、IBA、GA3及水杨酸（SA））及非生物胁迫处理（42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG6000），采用qRT-PCR技术分析PaHK3a基因对不同植物激素及非生物胁迫的表达响应；进一步对温室‘84K’杨进行自然干旱处理（6、8、10 d）、200 mmol/L NaCl（2、4、6 d）处理，测定不同胁迫时间点叶片PaHK3a基因的表达，以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性及MDA含量，并分析PaHK3a基因表达与生理指标的相关性，初步鉴定杨树PaHK3a基因的功能。结果 qRT-PCR结果显示，PaHK3a基因在叶片中表达量最高，根部中等，茎段最低。与正常条件下相比，在高温、低温、NaCl及PEG模拟干旱处理时，PaHK3a基因表达量与对照相比明显增高，分别为对照的2.63、1.49、1.54、1.58倍。用IBA诱导处理时，基因表达量与对照相比差异不大，而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时，基因表达量与对照相比均呈现显著下调。在温室干旱、盐碱胁迫处理过程中，PaHK3a基因表达均显著高于对照，呈现先上升后下降的表达模式，MDA含量也呈现类似的趋势，而SOD活性则随处理时间的延长而持续升高，POD活性在干旱胁迫时先上升后下降，而高盐胁迫时呈上升趋势。生理指标与PaHK3a基因表达量相关系分析发现，在干旱和盐胁迫下，PaHK3a基因表达量与叶片MDA含量、SOD活性和POD活性均呈正相关。结论 PaHK3a基因在‘84K’杨根茎叶中均有表达，且叶中表达量最高；PaHK3a基因表达受细胞分裂素6-BA、GA3及ABA及SA等植物激素的负调控，同时，受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控；温室人工干旱盐碱胁迫过程中，PaHK3a基因表达量升高，且与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性均具有正相关性。研究结果初步显示，杨树PaHK3a基因参与杨树植物激素激素信号响应，并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。Abstract:Objective Abiotic stresses such as drought and salt seriously affect the growth and development of plants. Previous studies showed that histidine kinase played an important role during the process of plants responsing to abiotic stresses. In this study, we analyzed the expression of histidine kinase gene (PaHK3a) in roots, stems and leaves of poplar ‘84K’ (Poplus alba × P. glandulosa ‘84K’). And the expression of PaHK3a in leaves of in vitro ‘84K’ plants under various plant hormones and abiotic stresses was also detected. Together with the malondialdehyde (MDA) contents, superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) activities in leaves of poplar ‘84K’ in green house, the function of PaHK3a was preliminary proposed. The results in this study laid a foundation for molecular breeding of poplar for resistance.Method Using in vitro poplar ‘84K’ as materials, the expression of PaHK3a gene in different organs, under plant hormone treatments (10 mmol/L ABA, 10 mmol/L 6-BA, 10 mmol/L IBA, 10 mmol/L GA3 and 10 mmol/L SA) and various abiotic stress conditions (42 ℃, 0 ℃, 200 mmol/L NaCl, and 5% PEG6000), was analyzed by qRT-PCR. Meanwhile, the expression of PaHK3a in leaves of green house grown poplar ‘84K’ plants under drought (6, 8, 10 d) and salt stress (2, 4, 6 d) was also detected, and the MDA contents, SOD and POD activities were measured, and the correlation between expression of PaHK3a gene and physiological indicators was analyzed to determine the function of PaHK3a preliminarily.Result The expression of PaHK3a gene was highest in leaves, medium in roots and lowest in stems. The qRT-PCR results showed that the transcriptional levels of PaHK3a gene were about 2.63, 1.49, 1.54, 1.58 times of control, respectively under 42 ℃, 0 ℃, 200 mmol/L NaCl, and 5% PEG treatments. Under IBA treatment, the transcripts of PaHK3a were not significantly different from control. The expression of PaHK3a was down-regulated under the treatments of 6-BA, ABA, GA3 and SA, respectively. At different stress times of drought and salt treatment, the PaHK3a gene in leaves of greenhouse grown ‘84K’ plants increased significantly, with the style of increased first and then decreased; and the MDA content in leaves also had the similar style. SOD and POD activity were measured in drought and high salt, MDA content increased first and then decreased; SOD activity in leaves increased constantly during drought and salt stresses, and POD activity first increased and then decreased under drought stress, while increased constantly during salt stress. The correlation analysis between physiological indexes and PaHK3a gene expression found that under drought and salt stress, the expression of PaHK3a gene was positively correlated with MDA content, SOD activity and POD activity in leaves.Conclusion The PaHK3a was expressed in roots, stems and leaves of poplar ‘84K’, with highest expression in leaves. The expression of PaHK3a was down-regulated by exogenous cytokinin (6-BA, GA3) and stress related plant hormones (ABA, SA), and up-regulated by temperature, salt and drought stresses. During the process of drought and salt stresses, the expression of PaHK3a increased significantly, with the increase of MDA content, SOD activity and POD activity, and it was positively correlated with MDA content, SOD activity and POD activity in leaves. Our results indicate that PaHK3a is involved in the response of poplar to plant hormones and plays an important role in poplar response to abiotic stresses.
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Keywords:
- P. alba × P. glandulosa ‘84K’ /
- histidine kinase /
- gene expression /
- abiotic stress
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细胞分裂素是一类重要的调控激素，不仅参与植物生长发育的调节，而且在低温、干旱及高盐等非生物胁迫的逆境反应中也发挥重要作用[1-4]。植物细胞分裂素是通过双组分系统（TCS）进行信号转导的[5-6]。双组分系统最早是在细菌中发现的，后来研究人员发现在拟南芥（Arabidopsis thaliana）等其他真核生物中也存在双组分系统[7-8]。研究表明，拟南芥的双组分系统由组氨酸激酶蛋白（HK）、组氨酸磷酸转移蛋白（HPt）和反应调节蛋白（RR）共同组成[9-10]。
组氨酸蛋白激酶属于组氨酸蛋白激酶家族，能与细胞分裂素结合，对植物生长发育进行调节。在拟南芥中有3个组氨酸蛋白激酶基因−AHK2、AHK3和AHK4（CER1）。其中，AHK3
对植物叶片的衰老和细胞分化起主导作用[11-13]，AHK4对植物根的发育具有明显的调控作用[14]，AHK2和AHK3共同调控拟南芥种子萌发及芽的生长[15]。另外，组氨酸蛋白激酶基因在植物抵御低温、干旱及高盐等非生物胁迫中也发挥重要作用[3-4]。在进行植株脱水耐受性研究时发现，ahk2和ahk3单个突变体比野生型植株和ahk4突变体表现出较高的脱水耐受性，并且ahk2/ahk3和ahk3/ahk4双重突变体比单突变的脱水耐受性强[16]。低温胁迫时，ahk2/ahk3和ahk3/ahk4双重突变体比野生型植株具有较高的抗寒性[17]，而ahk2和ahk3单突变体较野生型植株具有更强的耐干旱、盐胁迫、低温和强光等非生物胁迫的能力[3,17-18]。另外，通过萌发试验发现ahk2、ahk3、ahk4单突变体对外源ABA高度敏感，说明其在ABA信号传导中起负调控作用[3]。在毛果杨（Populus trichocarpa）基因组中鉴定出1个AHK2同源基因PtHK2、2个AHK3同源基因PtHK3a和 PtHK3b，且PtHK3a和PtHK3b基因的核苷酸同源性为91.98%、氨基酸同源性为90.39%，另外，以PtHK3b基因为对照，PtHK3a基因在938 ~ 967 bp间缺失。研究表明，毛果杨PtHK2、PtHK3a和 PtHK3b在杨树形成层发育过程中具有重要调控作用[19]。然而，组氨酸蛋白激酶基因是否参与林木抗逆反应尚未见报道。 银腺杨‘84K’（P. alba × P. glandulosa ‘84K’）是我国从韩国引进的白杨派优良品种，生长快、材质好、抗性强、适应性广，是优良的绿化、生态和用材树种。且因其易于组培及遗传转化，成为林木基因工程的理想材料。‘84K’杨基因组中有2个AHK3的同源基因PaHK3a和PaHK3b，本论文报道了PaHK3a基因功能研究的结果。本研究通过检测 ‘84K’杨组培苗在生长素、细胞分裂素等植物激素处理及高温、低温等非生物胁迫下的表达，结合温室人工干旱、盐处理条件下丙二醛（MDA）及保护酶活性等生化指标，初步确定了该基因的功能，为杨树抗逆分子育种奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
银腺杨‘84K’组培苗、温室‘84K’杨植株；RNA提取试剂盒购自Aidlab公司（北京）；Premix TaqTM酶购、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自Takara公司（日本）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）的测定试剂盒均购自索莱宝公司（北京）。
1.2 试验方法
1.2.1 PaHK3a基因在‘84K’杨不同器官的表达
‘84K’杨生根培养28 d后，取根部所有组织、茎部中断、叶片自上而下第3 ~ 5片功能叶，且每个组织部位均取3个生物学重复。采用EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab，北京）分别提取‘84K’杨植株叶片、茎段、根系总RNA，并用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）（takara，日本）试剂盒进行反转录，合成单链cDNA。设计PaHK3a基因实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物PaHK3a-q-F和PaHK3a-q-R（表1）将合成的cDNA稀释10倍作为实时定量PCR模板，参照TB GreenTM Premix Ex TaqTM II（TliRNaseH Plus）（TaKaRa，日本）试剂盒说明配制反应体系：TB Green Premix TaqII（TliRNaseH Plus）（1 ×）10 μL，Primer-F（10 μmol/L）0.8 μL，Primer-R（10 μmol/L）0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O补足至20 μL。利用Roche Light Cycle 480Ⅱ型荧光定量PCR仪（Roche，瑞士）进行qRT-PCR反应，反应程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环；熔解曲线为95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min。并以Actin为内参基因，采用2−ΔΔCT算法计算PaHK3a基因的相对表达量[20]。
表 1 qRT-PCR引物序列Table 1. Primer sequences of qRT-PCR引物名称
Primer name引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)产物长度
Product length/bpPaHK3a-q-F CTCAGTTTCTTGCTACAGTTTCCC 243 PaHK3a-q-R ACATCATCCATTATTGCCCTCA Actin-F AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG 193 Actin-R GCATCATCACAATCACTCTCCGA 1.2.2 ‘84K’杨植物激素处理和非生物胁迫处理
将‘84K’杨组培苗上部（3 cm左右）切下，无菌条件下转接到生根培养基(1/2MS + 0.02 mg/L NAA + 0.05 mg/L IBA)中，培养于温度24 ℃、光周期16 h/8 h（光照/黑暗）、光照强度为50 μmol/(m2·s)人工气候培养室，生长28 d后，选取根、叶片生长状态一致的‘84K’杨组培苗，转移到装有5 mL的1/2MS液体培养基的玻璃管（直径4 cm，高20 cm），使组培苗适应水培条件，培养5 d后对组培苗进行处理。
非生物胁迫处理分别为42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG 6000；激素处理为将组培苗转移到添加有10 μmol/L的植物激素（ABA、6-BA、IBA、GA3及SA）的液体1/2MS培养基中，以培养于1/2MS液体培养基中的组培苗为对照。处理时间为3 h，每个处理3个生物学重复，处理后取成熟叶片，液氮速冻用于后续试验。
1.2.3 PaHK3a基因的表达分析
参照1.2.1方法，对非生物胁迫处理和植物激素处理‘84K’杨植株叶片中PaHK3a基因的表达进行检测。
1.2.4 ‘84K’杨温室人工干旱、盐胁迫处理
将生长28 d后的‘84K’杨组培苗移栽到直径20 cm的花盆中（营养土∶蛭石（v∶v） = 3∶1），置于全自动日光温室中培养。3个月后，选取生长一致的健康植株进行胁迫处理。盐胁迫处理为向各植株营养钵中浇200 mmol/L NaCl，以正常浇水为对照，连续处理2、4和6 d。在干旱胁迫试验中，向各植株中加入充足的水，然后持续干旱6、8和10 d，以正常浇水为对照。每个处理3次重复，对各植株从第2片由上至下选取3片叶子（固定上午09:00取样），分管装成0.1 g（鲜质量）于2 mL的离心管，于液氮速冻后置于−80 ℃超低温冰箱保存备用。
1.2.5 干旱、盐胁迫下PaHK3a基因的表达分析生化指标的测定
提取干旱、高盐不同处理时间的叶片总RNA，反转录为cDNA，利用qRT-PCR技术进行分析（具体步骤同1.2.1）。另外，用球磨仪将样品研磨成粉末，采用索莱宝（北京）MDA含量测定试剂盒和SOD、POD活性测定试剂盒对样品进行测定，具体步骤均根据试剂盒说明书操作。
1.2.6 数据处理
采用Excel对数据进行整理及制图，SPSS 23.0进行单因素方差分析（P < 0.05）。
2. 结果与分析
2.1 PaHK3a基因在‘84K’杨不同组织的表达分析
对PaHK3a基因在‘84K’杨组培苗根、茎、叶3个器官中的表达量进行了检测。结果表明，PaHK3a基因在茎中表达量最低，根中表达量高于茎，在完全展开叶中表达量最高。其中，茎中表达量为根表达量的73%，叶的表达量为根表达量的1.96倍（图1）。
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图 1 PaHK3a基因在‘84K’杨根、茎和叶中的表达情况*表示差异显著，P < 0.05；**表示差异极显著，P < 0.01。下同。* means significant difference, P < 0.05; ** means very significant difference, P < 0.01. The same below.Figure 1. Expression of PaHK3a in roots, stems and leaves of ‘84K’ poplar2.2 PaHK3a基因在非生物胁迫处理和激素诱导处理下的表达
高温、低温、盐胁迫和干旱胁迫条件下，‘84K’杨组培苗叶片中PaHK3a基因表达量均明显高于对照，并且在高温处理下PaHK3a基因的表达量最高，为对照的2.63倍，在低温、高盐及PEG处理时，基因表达量分别为对照的1.49、1.54、1.58倍（图2）。以上结果说明，‘84K’杨PaHK3a基因参与了高温、低温、盐胁迫和干旱胁迫等非生物胁迫的响应，在杨树的逆境胁迫反应过程中起作用。
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图 2 非生物胁迫处理下‘84K’杨叶片PaHK3a基因的表达差异CK. 对照；HT. 42 ℃高温处理；LT. 0 ℃低温处理。下同。CK, control; HT, 42 ℃ high temperature treatment; LT, 0 ℃ low temperature treatment. The same below.Figure 2. Expression differences of PaHK3a in ‘84K’leaves under abiotic stressesPaHK3a基因对不同植物激素的反应有所差异。生长素IBA处理时，‘84K’杨组培苗叶片中PaHK3a基因表达量与对照相似，而其他激素处理时，PaHK3a基因表达量均不同程度的低于对照，其中，6-BA、ABA、GA3、SA处理时，PaHK3a基因表达量分别为对照的52%、50%、41%、75%（图3）。可见外源6-BA、ABA、GA3及SA能够抑制杨树PaHK3a基因的表达，说明PaHK3a基因参与植物激素响应。
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图 3 不同植物激素处理下‘84K’杨叶片PaHK3b基因的表达差异Figure 3. Expression differences of PaHK3a in ‘84K’ leaves under several plant hormone treatments2.3 温室干旱、盐胁迫下PaHK3a基因的表达
我们进一步检测了温室生长的‘84K’杨叶片中PaHK3a基因在干旱、盐胁迫下的表达情况。由图4可得，在自然干旱及NaCl胁迫下，PaHK3a基因表达量均随着胁迫时间增加呈先上升后下降的趋势。在干旱胁迫时，PaHK3a基因表达量在处理8 d时最高，为对照的2.9倍，6和10 d时，PaHK3a基因表达量为对照的1.1、1.8倍。在盐胁迫时，PaHK3a基因表达量在处理4 d时最高，为对照的2.5倍，2和6 d时，PaHK3a基因表达量为对照的1.4、1.7倍。因此可得，PaHK3a基因在逆境胁迫响应程度不同。
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图 4 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐胁迫（B）下叶片PaHK3a基因表达量Figure 4. Expression of PaHK3a in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse2.4 温室干旱、盐胁迫下 ‘84K’杨MDA含量及保护酶活性
在温室干旱和盐胁迫过程中，‘84K’杨叶片MDA含量均显著高于对照，且均呈现先上升后下降的趋势（图5）。干旱胁迫8 d时，‘84K’杨叶片MDA 含量最高，为对照的2.0倍。干旱胁迫6和10 d时，叶片MDA的含量分别为对照的1.4、1.6倍。盐胁迫4 d时，‘84K’杨叶片MDA含量最高，为对照的2.5倍。盐胁迫2和6 d时，MDA的含量分别为对照的1.5、1.7倍。由此可见，在温室干旱胁迫6 d、盐胁迫2 d后，‘84K’杨叶片内MDA含量已与对照有显著差异，说明此时干旱及盐胁迫已经对杨树叶片细胞脂膜造成了损害。
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图 5 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐（B）胁迫下叶片MDA的含量Figure 5. MDA contents in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse在植物受到干旱、高盐等逆境胁迫时，会通过提高SOD、POD等保护酶活性，保护细胞免受伤害。在温室干旱、盐胁迫时，‘84K’杨叶片SOD活性均随着胁迫时间延长而呈现上升趋势（图6）。在干旱胁迫6 d时，‘84K’杨叶片SOD活性与对照相比无显著性差异，干旱胁迫8和10 d时，‘84K’杨叶片SOD活性显著高于对照，分别为对照的1.9、2.0倍。在盐胁迫2和4 d时，‘84K’杨叶片SOD的含量分别为对照的1.7、2.5倍，均显著高于对照，在盐胁迫6 d时，‘84K’杨叶片SOD活性达对照的2.9倍。
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图 6 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐胁迫（B）下叶片SOD活性Figure 6. SOD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse温室干旱胁迫时，‘84K’杨叶片POD活性呈现先上升后下降的趋势。干旱胁迫6 d时，‘84K’杨叶片POD活性显著高于对照，为对照的1.1倍，干旱胁迫8 d时，POD活性最高，为对照的1.4倍，之后，POD活性下降，为对照的1.1倍，但也显著高于对照。在盐胁迫2 d后，‘84K’杨叶片POD活性显著高于对照，为对照的1.1倍，盐胁迫4、6 d，‘84K’杨叶片POD活性继续升高，分别为对照的1.3和1.4倍。最高为对照的1.4倍（图7）。因此，干旱胁迫及盐胁迫下，‘84K’杨通过提高其叶片保护酶活性来保护自身从而减少伤害。
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图 7 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐胁迫（B）下叶片POD活性Figure 7. POD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse2.5 温室干旱、盐胁迫下PaHK3a基因表达与生理指标的相关性分析
运用SPSS软件对干旱、盐胁迫下PaHK3a基因表达与生理指标的相关性进行研究。结果显示（表2），干旱、盐胁迫下，PaHK3a基因的相对表达量和3个生理指标均呈正相关性。干旱胁迫下，PaHK3a基因的相对表达量与POD活性呈显著相关，且相关性最强，与MDA含量、SOD活性也具有较高的相关性。盐胁迫下，PaHK3a基因与MDA含量呈极显著相关，且相关性最强，与SOD活性相关性较高，而与POD活性相关性中等。因此可得，在不同胁迫下，PaHK3a基因相对表达量与生理指标的相关性存在差异。
表 2 干旱、盐胁迫下PaHK3a基因表达与生理指标相关性分析Table 2. Correlation analysis between expression of PaHK3a and physiological indexes under drought and salt stresses生理指标
Physiological index干旱胁迫
Drought stress盐胁迫
Salt stressMDA 0.901 0.994** SOD 0.791 0.734 POD 0.954* 0.690 3. 讨 论
组氨酸激酶基因作为细胞分裂素受体编码基因，能够响应细胞分裂素等植物激素信号，进而调控植物的生长发育[21-22]。本研究中，外源植物细胞分裂素6-BA、GA3处理下，‘84K’杨叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量与对照相比显著下降，说明该基因能够响应外源植物细胞分裂素信号，且为负调控；而在IBA处理下，PaHK3a基因表达并无显著变化，即该基因不受植物生长素的调控。
近年来的研究表明，组氨酸激酶基因在植物非生物逆境胁迫响应中发挥重要作用[3,23]。拟南芥组氨酸激酶AHK3参与其对干旱、高盐及冷胁迫的抗逆反应[3,17]，转玉米（Zea mays）组氨酸激酶基因ZmHK9的拟南芥抗旱性明显增强[24]。SA是植物防卫反应的重要内源植物激素，作为一种信号分子，在植物生物胁迫响应过程中发挥重要作用[25-26]。ABA在植物抗逆胁迫反应，及在生物胁迫和非生物胁迫中均具有重要调控作用的植物激素。在SA及ABA处理下，‘84K’杨叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量与对照相比显著下降，说明PaHK3a受这两类植物激素的负调控。进一步的试验也发现，‘84K’杨组培苗在PEG模拟干旱及NaCl胁迫下，其叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量均显著上升，说明PaHK3a参与了杨树抗旱耐盐的响应，且通过ABA及SA途径的负调节提高其对逆境胁迫耐受性。
温室土壤自然干旱胁迫6 d及盐胁迫处理2 d，‘84K’杨叶片MDA含量就显著上升，同时POD活性也显著上升，干旱胁迫6 d、盐胁迫2 d时SOD活性也显著上升。植物受到外界非生物胁迫时，会产生大量活性氧，导致脂膜氧化形成MDA，MDA能引起细胞膜和酶活性受到损害，严重破坏了细胞膜结构及其生理功能，是植物受到胁迫损伤的生化标记物[27-29]。同时，植物通过增加体内SOD、POD等保护酶活性来清除活性氧[30-31]。因此，在温室干旱胁迫6 d、盐胁迫2 d时，‘84K’杨已经受到了胁迫损伤。此时，其叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量均显著上升；随后在干旱胁迫8、10 d和盐胁迫4、6 d时，MDA含量均增强，SOD、POD活性也增强，表明此时受胁迫程度加深，且PaHK3a基因表达量也增加。另外，干旱胁迫10 d、盐胁迫6 d时表达量虽有下降，但也高于对照。同时，本研究通过PaHK3a基因表达量与生理指标相关性分析发现，PaHK3a基因表达量与MDA含量、SOD和POD活性均呈正相关性。因此，在温室干旱、盐胁迫下‘84K’杨叶片PaHK3a表达与叶片胁迫相关的生化标记物MDA含量、保护酶活性变化密切相关。研究结果再次说明，组氨酸激酶基因PaHK3a参与了杨树非生物胁迫响应。
4. 结 论
‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a在其根、茎、叶中均有表达，且在叶片中表达量最高；PaHK3a基因的表达受外源植物细胞分裂素6-BA、GA3及外源ABA、SA的负调控；同时，受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控；温室人工干旱盐碱胁迫过程中，PaHK3a基因表达与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性的变化密切相关。因此，杨树PaHK3a基因以负调控的方式参与杨树植物细胞分裂素信号响应，并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。
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图 1 PaHK3a基因在‘84K’杨根、茎和叶中的表达情况
*表示差异显著，P < 0.05；**表示差异极显著，P < 0.01。下同。* means significant difference, P < 0.05; ** means very significant difference, P < 0.01. The same below.
Figure 1. Expression of PaHK3a in roots, stems and leaves of ‘84K’ poplar
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图 2 非生物胁迫处理下‘84K’杨叶片PaHK3a基因的表达差异
CK. 对照；HT. 42 ℃高温处理；LT. 0 ℃低温处理。下同。CK, control; HT, 42 ℃ high temperature treatment; LT, 0 ℃ low temperature treatment. The same below.
Figure 2. Expression differences of PaHK3a in ‘84K’leaves under abiotic stresses
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图 3 不同植物激素处理下‘84K’杨叶片PaHK3b基因的表达差异
Figure 3. Expression differences of PaHK3a in ‘84K’ leaves under several plant hormone treatments
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图 4 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐胁迫（B）下叶片PaHK3a基因表达量
Figure 4. Expression of PaHK3a in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse
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图 5 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐（B）胁迫下叶片MDA的含量
Figure 5. MDA contents in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse
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图 6 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐胁迫（B）下叶片SOD活性
Figure 6. SOD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse
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图 7 ‘84K’杨温室干旱（A）及盐胁迫（B）下叶片POD活性
Figure 7. POD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse
表 1 qRT-PCR引物序列
Table 1 Primer sequences of qRT-PCR
引物名称
Primer name引物序列(5′→3′)
Primer sequence (5′→3′)产物长度
Product length/bpPaHK3a-q-F CTCAGTTTCTTGCTACAGTTTCCC 243 PaHK3a-q-R ACATCATCCATTATTGCCCTCA Actin-F AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG 193 Actin-R GCATCATCACAATCACTCTCCGA 
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表 2 干旱、盐胁迫下PaHK3a基因表达与生理指标相关性分析
Table 2 Correlation analysis between expression of PaHK3a and physiological indexes under drought and salt stresses
生理指标
Physiological index干旱胁迫
Drought stress盐胁迫
Salt stressMDA 0.901 0.994** SOD 0.791 0.734 POD 0.954* 0.690
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