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‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析

鲁俊倩 武舒 钟姗辰 张伟溪 苏晓华 张冰玉

鲁俊倩, 武舒, 钟姗辰, 张伟溪, 苏晓华, 张冰玉. ‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
引用本文: 鲁俊倩, 武舒, 钟姗辰, 张伟溪, 苏晓华, 张冰玉. ‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
Lu Junqian, Wu Shu, Zhong Shanchen, Zhang Weixi, Su Xiaohua, Zhang Bingyu. Expression and function analysis of histidine kinase gene PaHK3a of poplar ‘84K’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
Citation: Lu Junqian, Wu Shu, Zhong Shanchen, Zhang Weixi, Su Xiaohua, Zhang Bingyu. Expression and function analysis of histidine kinase gene PaHK3a of poplar ‘84K’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070

‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
基金项目: 国家自然基金项目(31770710),转基因生物新品种培育重大课题(2018ZX08020002)
详细信息
    作者简介:

    鲁俊倩。主要研究方向:林木遗传育种。Email:lujq115@163.com 地址:100091北京市海淀区青龙桥街道中国林业科学研究院国家重点实验室

    通讯作者:

    张冰玉,博士,研究员。主要研究方向:林木遗传育种。Email:byzhang@caf.ac.cn 地址:同上

  • 中图分类号: S792.11

Expression and function analysis of histidine kinase gene PaHK3a of poplar ‘84K’

  • 摘要:   目的  干旱、高盐等逆境胁迫严重影响了植物的生长发育。研究表明,组氨酸激酶在植物逆境响应中起重要作用。本研究对银腺杨‘84K’组氨酸激酶基因PaHK3a在不同组织的表达模式分析,检测了其对生长素、细胞分裂素等植物激素处理下及人工干旱、盐碱等非生物胁迫下的表达,结合干旱、盐碱条件下丙二醛(MDA)及保护酶活性等生化指标,对该基因的功能进行了初步鉴定,为杨树抗逆分子育种研究奠定基础。  方法  以‘84K’杨无菌苗为材料,通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析PaHK3a基因在不同组织的表达模式。对‘84K’杨无菌苗进行浓度为10 mmol/L植物激素处理(ABA、6-BA、IBA、GA3及水杨酸(SA))及非生物胁迫处理(42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG6000),采用qRT-PCR技术分析PaHK3a基因对不同植物激素及非生物胁迫的表达响应;进一步对温室‘84K’杨进行自然干旱处理(6、8、10 d)、200 mmol/L NaCl(2、4、6 d)处理,测定不同胁迫时间点叶片PaHK3a基因的表达,以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性及MDA含量,并分析PaHK3a基因表达与生理指标的相关性,初步鉴定杨树PaHK3a基因的功能。  结果  qRT-PCR结果显示,PaHK3a基因在叶片中表达量最高,根部中等,茎段最低。与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG模拟干旱处理时,PaHK3a基因表达量与对照相比明显增高,分别为对照的2.63、1.49、1.54、1.58倍。用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈现显著下调。在温室干旱、盐碱胁迫处理过程中,PaHK3a基因表达均显著高于对照,呈现先上升后下降的表达模式,MDA含量也呈现类似的趋势,而SOD活性则随处理时间的延长而持续升高,POD活性在干旱胁迫时先上升后下降,而高盐胁迫时呈上升趋势。生理指标与PaHK3a基因表达量相关系分析发现,在干旱和盐胁迫下,PaHK3a基因表达量与叶片MDA含量、SOD活性和POD活性均呈正相关。  结论  PaHK3a基因在‘84K’杨根茎叶中均有表达,且叶中表达量最高;PaHK3a基因表达受细胞分裂素6-BA、GA3及ABA及SA等植物激素的负调控,同时,受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控;温室人工干旱盐碱胁迫过程中,PaHK3a基因表达量升高,且与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性均具有正相关性。研究结果初步显示,杨树PaHK3a基因参与杨树植物激素激素信号响应,并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。
  • 图  1  PaHK3a基因在‘84K’杨根、茎和叶中的表达情况

    *表示差异显著,P < 0.05;**表示差异极显著,P < 0.01。下同。* means significant difference, P < 0.05; ** means very significant difference, P < 0.01. The same below.

    Figure  1.  Expression of PaHK3a in roots, stems and leaves of ‘84K’ poplar

    图  2  非生物胁迫处理下‘84K’杨叶片PaHK3a基因的表达差异

    CK. 对照;HT. 42 ℃高温处理;LT. 0 ℃低温处理。下同。CK, control; HT, 42 ℃ high temperature treatment; LT, 0 ℃ low temperature treatment. The same below.

    Figure  2.  Expression differences of PaHK3a in ‘84K’leaves under abiotic stresses

    图  3  不同植物激素处理下‘84K’杨叶片PaHK3b基因的表达差异

    Figure  3.  Expression differences of PaHK3a in ‘84K’ leaves under several plant hormone treatments

    图  4  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐胁迫(B)下叶片PaHK3a基因表达量

    Figure  4.  Expression of PaHK3a in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

    图  5  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐(B)胁迫下叶片MDA的含量

    Figure  5.  MDA contents in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

    图  6  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐胁迫(B)下叶片SOD活性

    Figure  6.  SOD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

    图  7  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐胁迫(B)下叶片POD活性

    Figure  7.  POD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

    表  1  qRT-PCR引物序列

    Table  1.   Primer sequences of qRT-PCR

    引物名称
    Primer name
    引物序列(5′→3′)
    Primer sequence (5′→3′)
    产物长度
    Product length/bp
    PaHK3a-q-F CTCAGTTTCTTGCTACAGTTTCCC 243
    PaHK3a-q-R ACATCATCCATTATTGCCCTCA
    Actin-F AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG 193
    Actin-R GCATCATCACAATCACTCTCCGA
    下载: 导出CSV

    表  2  干旱、盐胁迫下PaHK3a基因表达与生理指标相关性分析

    Table  2.   Correlation analysis between expression of PaHK3a and physiological indexes under drought and salt stresses

    生理指标
    Physiological index
    干旱胁迫
    Drought stress
    盐胁迫
    Salt stress
    MDA0.9010.994**
    SOD0.7910.734
    POD0.954*0.690
    下载: 导出CSV
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    [20] 李国平, 张煜星, 施婷婷, 李贤军, 张展羽, 程金新, 黄心渊, 王志玲, 赵俊卉, 崔彬彬, 江泽慧, 周志强, 宗世祥, 陈伟, 曹伟, 雷相东, 肖化顺, 刘志军, 周国模, 徐剑琦, 程丽莉, 刘智, 杜官本, 于寒颖, 雷霆, 张彩虹, 丁立建, 张璧光, 王海, 王正, 雷洪, 张则路, 苏淑钗, 曹金珍, 黄群策, 吴家森, 关德新, 骆有庆, 刘童燕, 李云, 张贵, 杨谦, 郝雨, 苏里坦, 张璧光, 王正, 郭广猛, 李云, 吴家兵, 姜培坤, 常亮, 方群, 宋南, 贺宏奎, 张大红, 张佳蕊, 张书香, 王勇, 刘大鹏, 张国华, 秦广雍, 黄晓丽, 张慧东, 金晓洁], 周晓燕, 许志春, 刘彤, 李文军, 陈晓光, 秦岭, 张金桐, 姜静, 高黎, 蔡学理, 李延军, 刘海龙, 苏晓华, 于兴华, 张弥, 陈燕, 姜金仲, 刘建立, 冯慧, 尹伟伦, 王德国, 王安志, 张冰玉, 陈绪和, 周梅, 成小芳, 王谦, 朱彩霞, 聂立水, 陈建伟3, 金昌杰, 张勤, 亢新刚, 冯大领, 张连生, 梁树军, 崔国发, 胡君艳, 韩士杰, 姚国龙.  核盘菌EPSP合酶基因在大肠杆菌中的表达 . 北京林业大学学报, 2006, 28(6): 103-108.
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-03-16
  • 修回日期:  2020-06-09
  • 网络出版日期:  2020-12-26
  • 刊出日期:  2021-02-24

‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
    基金项目:  国家自然基金项目(31770710),转基因生物新品种培育重大课题(2018ZX08020002)
    作者简介:

    鲁俊倩。主要研究方向:林木遗传育种。Email:lujq115@163.com 地址:100091北京市海淀区青龙桥街道中国林业科学研究院国家重点实验室

    通讯作者: 张冰玉,博士,研究员。主要研究方向:林木遗传育种。Email:byzhang@caf.ac.cn 地址:同上
  • 中图分类号: S792.11

摘要:   目的  干旱、高盐等逆境胁迫严重影响了植物的生长发育。研究表明,组氨酸激酶在植物逆境响应中起重要作用。本研究对银腺杨‘84K’组氨酸激酶基因PaHK3a在不同组织的表达模式分析,检测了其对生长素、细胞分裂素等植物激素处理下及人工干旱、盐碱等非生物胁迫下的表达,结合干旱、盐碱条件下丙二醛(MDA)及保护酶活性等生化指标,对该基因的功能进行了初步鉴定,为杨树抗逆分子育种研究奠定基础。  方法  以‘84K’杨无菌苗为材料,通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析PaHK3a基因在不同组织的表达模式。对‘84K’杨无菌苗进行浓度为10 mmol/L植物激素处理(ABA、6-BA、IBA、GA3及水杨酸(SA))及非生物胁迫处理(42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG6000),采用qRT-PCR技术分析PaHK3a基因对不同植物激素及非生物胁迫的表达响应;进一步对温室‘84K’杨进行自然干旱处理(6、8、10 d)、200 mmol/L NaCl(2、4、6 d)处理,测定不同胁迫时间点叶片PaHK3a基因的表达,以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性及MDA含量,并分析PaHK3a基因表达与生理指标的相关性,初步鉴定杨树PaHK3a基因的功能。  结果  qRT-PCR结果显示,PaHK3a基因在叶片中表达量最高,根部中等,茎段最低。与正常条件下相比,在高温、低温、NaCl及PEG模拟干旱处理时,PaHK3a基因表达量与对照相比明显增高,分别为对照的2.63、1.49、1.54、1.58倍。用IBA诱导处理时,基因表达量与对照相比差异不大,而在6-BA、ABA、GA3及SA处理时,基因表达量与对照相比均呈现显著下调。在温室干旱、盐碱胁迫处理过程中,PaHK3a基因表达均显著高于对照,呈现先上升后下降的表达模式,MDA含量也呈现类似的趋势,而SOD活性则随处理时间的延长而持续升高,POD活性在干旱胁迫时先上升后下降,而高盐胁迫时呈上升趋势。生理指标与PaHK3a基因表达量相关系分析发现,在干旱和盐胁迫下,PaHK3a基因表达量与叶片MDA含量、SOD活性和POD活性均呈正相关。  结论  PaHK3a基因在‘84K’杨根茎叶中均有表达,且叶中表达量最高;PaHK3a基因表达受细胞分裂素6-BA、GA3及ABA及SA等植物激素的负调控,同时,受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控;温室人工干旱盐碱胁迫过程中,PaHK3a基因表达量升高,且与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性均具有正相关性。研究结果初步显示,杨树PaHK3a基因参与杨树植物激素激素信号响应,并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。

English Abstract

鲁俊倩, 武舒, 钟姗辰, 张伟溪, 苏晓华, 张冰玉. ‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
引用本文: 鲁俊倩, 武舒, 钟姗辰, 张伟溪, 苏晓华, 张冰玉. ‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a的表达及功能分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
Lu Junqian, Wu Shu, Zhong Shanchen, Zhang Weixi, Su Xiaohua, Zhang Bingyu. Expression and function analysis of histidine kinase gene PaHK3a of poplar ‘84K’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
Citation: Lu Junqian, Wu Shu, Zhong Shanchen, Zhang Weixi, Su Xiaohua, Zhang Bingyu. Expression and function analysis of histidine kinase gene PaHK3a of poplar ‘84K’[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 46-53. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200070
  • 细胞分裂素是一类重要的调控激素,不仅参与植物生长发育的调节,而且在低温、干旱及高盐等非生物胁迫的逆境反应中也发挥重要作用[1-4]。植物细胞分裂素是通过双组分系统(TCS)进行信号转导的[5-6]。双组分系统最早是在细菌中发现的,后来研究人员发现在拟南芥(Arabidopsis thaliana)等其他真核生物中也存在双组分系统[7-8]。研究表明,拟南芥的双组分系统由组氨酸激酶蛋白(HK)、组氨酸磷酸转移蛋白(HPt)和反应调节蛋白(RR)共同组成[9-10]

    组氨酸蛋白激酶属于组氨酸蛋白激酶家族,能与细胞分裂素结合,对植物生长发育进行调节。在拟南芥中有3个组氨酸蛋白激酶基因−AHK2、AHK3和AHK4(CER1)。其中,AHK3对植物叶片的衰老和细胞分化起主导作用[11-13]AHK4对植物根的发育具有明显的调控作用[14]AHK2和AHK3共同调控拟南芥种子萌发及芽的生长[15]。另外,组氨酸蛋白激酶基因在植物抵御低温、干旱及高盐等非生物胁迫中也发挥重要作用[3-4]。在进行植株脱水耐受性研究时发现,ahk2和ahk3单个突变体比野生型植株和ahk4突变体表现出较高的脱水耐受性,并且ahk2/ahk3和ahk3/ahk4双重突变体比单突变的脱水耐受性强[16]。低温胁迫时,ahk2/ahk3和ahk3/ahk4双重突变体比野生型植株具有较高的抗寒性[17],而ahk2和ahk3单突变体较野生型植株具有更强的耐干旱、盐胁迫、低温和强光等非生物胁迫的能力[3,17-18]。另外,通过萌发试验发现ahk2、ahk3、ahk4单突变体对外源ABA高度敏感,说明其在ABA信号传导中起负调控作用[3]。在毛果杨(Populus trichocarpa)基因组中鉴定出1个AHK2同源基因PtHK2、2个AHK3同源基因PtHK3aPtHK3b,且PtHK3aPtHK3b基因的核苷酸同源性为91.98%、氨基酸同源性为90.39%,另外,以PtHK3b基因为对照,PtHK3a基因在938 ~ 967 bp间缺失。研究表明,毛果杨PtHK2、PtHK3aPtHK3b在杨树形成层发育过程中具有重要调控作用[19]。然而,组氨酸蛋白激酶基因是否参与林木抗逆反应尚未见报道。

    银腺杨‘84K’(P. alba × P. glandulosa ‘84K’)是我国从韩国引进的白杨派优良品种,生长快、材质好、抗性强、适应性广,是优良的绿化、生态和用材树种。且因其易于组培及遗传转化,成为林木基因工程的理想材料。‘84K’杨基因组中有2个AHK3的同源基因PaHK3aPaHK3b,本论文报道了PaHK3a基因功能研究的结果。本研究通过检测 ‘84K’杨组培苗在生长素、细胞分裂素等植物激素处理及高温、低温等非生物胁迫下的表达,结合温室人工干旱、盐处理条件下丙二醛(MDA)及保护酶活性等生化指标,初步确定了该基因的功能,为杨树抗逆分子育种奠定基础。

    • 银腺杨‘84K’组培苗、温室‘84K’杨植株;RNA提取试剂盒购自Aidlab公司(北京);Premix TaqTM酶购、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自Takara公司(日本);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的测定试剂盒均购自索莱宝公司(北京)。

    • ‘84K’杨生根培养28 d后,取根部所有组织、茎部中断、叶片自上而下第3 ~ 5片功能叶,且每个组织部位均取3个生物学重复。采用EASY spin Plus 植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab,北京)分别提取‘84K’杨植株叶片、茎段、根系总RNA,并用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(perfect real time)(takara,日本)试剂盒进行反转录,合成单链cDNA。设计PaHK3a基因实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)引物PaHK3a-q-F和PaHK3a-q-R(表1)将合成的cDNA稀释10倍作为实时定量PCR模板,参照TB GreenTM Premix Ex TaqTM II(TliRNaseH Plus)(TaKaRa,日本)试剂盒说明配制反应体系:TB Green Premix TaqII(TliRNaseH Plus)(1 ×)10 μL,Primer-F(10 μmol/L)0.8 μL,Primer-R(10 μmol/L)0.8 μL,cDNA模板2 μL,ddH2O补足至20 μL。利用Roche Light Cycle 480Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche,瑞士)进行qRT-PCR反应,反应程序为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,40个循环;熔解曲线为95 ℃ 5 s,65 ℃ 1 min。并以Actin为内参基因,采用2−ΔΔCT算法计算PaHK3a基因的相对表达量[20]

      表 1  qRT-PCR引物序列

      Table 1.  Primer sequences of qRT-PCR

      引物名称
      Primer name
      引物序列(5′→3′)
      Primer sequence (5′→3′)
      产物长度
      Product length/bp
      PaHK3a-q-F CTCAGTTTCTTGCTACAGTTTCCC 243
      PaHK3a-q-R ACATCATCCATTATTGCCCTCA
      Actin-F AAACTGTAATGGTCCTCCCTCCG 193
      Actin-R GCATCATCACAATCACTCTCCGA
    • 将‘84K’杨组培苗上部(3 cm左右)切下,无菌条件下转接到生根培养基(1/2MS + 0.02 mg/L NAA + 0.05 mg/L IBA)中,培养于温度24 ℃、光周期16 h/8 h(光照/黑暗)、光照强度为50 μmol/(m2·s)人工气候培养室,生长28 d后,选取根、叶片生长状态一致的‘84K’杨组培苗,转移到装有5 mL的1/2MS液体培养基的玻璃管(直径4 cm,高20 cm),使组培苗适应水培条件,培养5 d后对组培苗进行处理。

      非生物胁迫处理分别为42 ℃高温、0 ℃低温、200 mmol/L NaCl和5% PEG 6000;激素处理为将组培苗转移到添加有10 μmol/L的植物激素(ABA、6-BA、IBA、GA3及SA)的液体1/2MS培养基中,以培养于1/2MS液体培养基中的组培苗为对照。处理时间为3 h,每个处理3个生物学重复,处理后取成熟叶片,液氮速冻用于后续试验。

    • 参照1.2.1方法,对非生物胁迫处理和植物激素处理‘84K’杨植株叶片中PaHK3a基因的表达进行检测。

    • 将生长28 d后的‘84K’杨组培苗移栽到直径20 cm的花盆中(营养土∶蛭石(vv) = 3∶1),置于全自动日光温室中培养。3个月后,选取生长一致的健康植株进行胁迫处理。盐胁迫处理为向各植株营养钵中浇200 mmol/L NaCl,以正常浇水为对照,连续处理2、4和6 d。在干旱胁迫试验中,向各植株中加入充足的水,然后持续干旱6、8和10 d,以正常浇水为对照。每个处理3次重复,对各植株从第2片由上至下选取3片叶子(固定上午09:00取样),分管装成0.1 g(鲜质量)于2 mL的离心管,于液氮速冻后置于−80 ℃超低温冰箱保存备用。

    • 提取干旱、高盐不同处理时间的叶片总RNA,反转录为cDNA,利用qRT-PCR技术进行分析(具体步骤同1.2.1)。另外,用球磨仪将样品研磨成粉末,采用索莱宝(北京)MDA含量测定试剂盒和SOD、POD活性测定试剂盒对样品进行测定,具体步骤均根据试剂盒说明书操作。

    • 采用Excel对数据进行整理及制图,SPSS 23.0进行单因素方差分析(P < 0.05)。

    • PaHK3a基因在‘84K’杨组培苗根、茎、叶3个器官中的表达量进行了检测。结果表明,PaHK3a基因在茎中表达量最低,根中表达量高于茎,在完全展开叶中表达量最高。其中,茎中表达量为根表达量的73%,叶的表达量为根表达量的1.96倍(图1)。

      图  1  PaHK3a基因在‘84K’杨根、茎和叶中的表达情况

      Figure 1.  Expression of PaHK3a in roots, stems and leaves of ‘84K’ poplar

    • 高温、低温、盐胁迫和干旱胁迫条件下,‘84K’杨组培苗叶片中PaHK3a基因表达量均明显高于对照,并且在高温处理下PaHK3a基因的表达量最高,为对照的2.63倍,在低温、高盐及PEG处理时,基因表达量分别为对照的1.49、1.54、1.58倍(图2)。以上结果说明,‘84K’杨PaHK3a基因参与了高温、低温、盐胁迫和干旱胁迫等非生物胁迫的响应,在杨树的逆境胁迫反应过程中起作用。

      图  2  非生物胁迫处理下‘84K’杨叶片PaHK3a基因的表达差异

      Figure 2.  Expression differences of PaHK3a in ‘84K’leaves under abiotic stresses

      PaHK3a基因对不同植物激素的反应有所差异。生长素IBA处理时,‘84K’杨组培苗叶片中PaHK3a基因表达量与对照相似,而其他激素处理时,PaHK3a基因表达量均不同程度的低于对照,其中,6-BA、ABA、GA3、SA处理时,PaHK3a基因表达量分别为对照的52%、50%、41%、75%(图3)。可见外源6-BA、ABA、GA3及SA能够抑制杨树PaHK3a基因的表达,说明PaHK3a基因参与植物激素响应。

      图  3  不同植物激素处理下‘84K’杨叶片PaHK3b基因的表达差异

      Figure 3.  Expression differences of PaHK3a in ‘84K’ leaves under several plant hormone treatments

    • 我们进一步检测了温室生长的‘84K’杨叶片中PaHK3a基因在干旱、盐胁迫下的表达情况。由图4可得,在自然干旱及NaCl胁迫下,PaHK3a基因表达量均随着胁迫时间增加呈先上升后下降的趋势。在干旱胁迫时,PaHK3a基因表达量在处理8 d时最高,为对照的2.9倍,6和10 d时,PaHK3a基因表达量为对照的1.1、1.8倍。在盐胁迫时,PaHK3a基因表达量在处理4 d时最高,为对照的2.5倍,2和6 d时,PaHK3a基因表达量为对照的1.4、1.7倍。因此可得,PaHK3a基因在逆境胁迫响应程度不同。

      图  4  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐胁迫(B)下叶片PaHK3a基因表达量

      Figure 4.  Expression of PaHK3a in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

    • 在温室干旱和盐胁迫过程中,‘84K’杨叶片MDA含量均显著高于对照,且均呈现先上升后下降的趋势(图5)。干旱胁迫8 d时,‘84K’杨叶片MDA 含量最高,为对照的2.0倍。干旱胁迫6和10 d时,叶片MDA的含量分别为对照的1.4、1.6倍。盐胁迫4 d时,‘84K’杨叶片MDA含量最高,为对照的2.5倍。盐胁迫2和6 d时,MDA的含量分别为对照的1.5、1.7倍。由此可见,在温室干旱胁迫6 d、盐胁迫2 d后,‘84K’杨叶片内MDA含量已与对照有显著差异,说明此时干旱及盐胁迫已经对杨树叶片细胞脂膜造成了损害。

      图  5  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐(B)胁迫下叶片MDA的含量

      Figure 5.  MDA contents in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

      在植物受到干旱、高盐等逆境胁迫时,会通过提高SOD、POD等保护酶活性,保护细胞免受伤害。在温室干旱、盐胁迫时,‘84K’杨叶片SOD活性均随着胁迫时间延长而呈现上升趋势(图6)。在干旱胁迫6 d时,‘84K’杨叶片SOD活性与对照相比无显著性差异,干旱胁迫8和10 d时,‘84K’杨叶片SOD活性显著高于对照,分别为对照的1.9、2.0倍。在盐胁迫2和4 d时,‘84K’杨叶片SOD的含量分别为对照的1.7、2.5倍,均显著高于对照,在盐胁迫6 d时,‘84K’杨叶片SOD活性达对照的2.9倍。

      图  6  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐胁迫(B)下叶片SOD活性

      Figure 6.  SOD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

      温室干旱胁迫时,‘84K’杨叶片POD活性呈现先上升后下降的趋势。干旱胁迫6 d时,‘84K’杨叶片POD活性显著高于对照,为对照的1.1倍,干旱胁迫8 d时,POD活性最高,为对照的1.4倍,之后,POD活性下降,为对照的1.1倍,但也显著高于对照。在盐胁迫2 d后,‘84K’杨叶片POD活性显著高于对照,为对照的1.1倍,盐胁迫4、6 d,‘84K’杨叶片POD活性继续升高,分别为对照的1.3和1.4倍。最高为对照的1.4倍(图7)。因此,干旱胁迫及盐胁迫下,‘84K’杨通过提高其叶片保护酶活性来保护自身从而减少伤害。

      图  7  ‘84K’杨温室干旱(A)及盐胁迫(B)下叶片POD活性

      Figure 7.  POD activity in leaves of ‘84K’ under drought (A) and salt (B) stresses in greenhouse

    • 运用SPSS软件对干旱、盐胁迫下PaHK3a基因表达与生理指标的相关性进行研究。结果显示(表2),干旱、盐胁迫下,PaHK3a基因的相对表达量和3个生理指标均呈正相关性。干旱胁迫下,PaHK3a基因的相对表达量与POD活性呈显著相关,且相关性最强,与MDA含量、SOD活性也具有较高的相关性。盐胁迫下,PaHK3a基因与MDA含量呈极显著相关,且相关性最强,与SOD活性相关性较高,而与POD活性相关性中等。因此可得,在不同胁迫下,PaHK3a基因相对表达量与生理指标的相关性存在差异。

      表 2  干旱、盐胁迫下PaHK3a基因表达与生理指标相关性分析

      Table 2.  Correlation analysis between expression of PaHK3a and physiological indexes under drought and salt stresses

      生理指标
      Physiological index
      干旱胁迫
      Drought stress
      盐胁迫
      Salt stress
      MDA0.9010.994**
      SOD0.7910.734
      POD0.954*0.690
    • 组氨酸激酶基因作为细胞分裂素受体编码基因,能够响应细胞分裂素等植物激素信号,进而调控植物的生长发育[21-22]。本研究中,外源植物细胞分裂素6-BA、GA3处理下,‘84K’杨叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量与对照相比显著下降,说明该基因能够响应外源植物细胞分裂素信号,且为负调控;而在IBA处理下,PaHK3a基因表达并无显著变化,即该基因不受植物生长素的调控。

      近年来的研究表明,组氨酸激酶基因在植物非生物逆境胁迫响应中发挥重要作用[3,23]。拟南芥组氨酸激酶AHK3参与其对干旱、高盐及冷胁迫的抗逆反应[3,17],转玉米(Zea mays)组氨酸激酶基因ZmHK9的拟南芥抗旱性明显增强[24]。SA是植物防卫反应的重要内源植物激素,作为一种信号分子,在植物生物胁迫响应过程中发挥重要作用[25-26]。ABA在植物抗逆胁迫反应,及在生物胁迫和非生物胁迫中均具有重要调控作用的植物激素。在SA及ABA处理下,‘84K’杨叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量与对照相比显著下降,说明PaHK3a受这两类植物激素的负调控。进一步的试验也发现,‘84K’杨组培苗在PEG模拟干旱及NaCl胁迫下,其叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量均显著上升,说明PaHK3a参与了杨树抗旱耐盐的响应,且通过ABA及SA途径的负调节提高其对逆境胁迫耐受性。

      温室土壤自然干旱胁迫6 d及盐胁迫处理2 d,‘84K’杨叶片MDA含量就显著上升,同时POD活性也显著上升,干旱胁迫6 d、盐胁迫2 d时SOD活性也显著上升。植物受到外界非生物胁迫时,会产生大量活性氧,导致脂膜氧化形成MDA,MDA能引起细胞膜和酶活性受到损害,严重破坏了细胞膜结构及其生理功能,是植物受到胁迫损伤的生化标记物[27-29]。同时,植物通过增加体内SOD、POD等保护酶活性来清除活性氧[30-31]。因此,在温室干旱胁迫6 d、盐胁迫2 d时,‘84K’杨已经受到了胁迫损伤。此时,其叶片组氨酸激酶基因PaHK3a表达量均显著上升;随后在干旱胁迫8、10 d和盐胁迫4、6 d时,MDA含量均增强,SOD、POD活性也增强,表明此时受胁迫程度加深,且PaHK3a基因表达量也增加。另外,干旱胁迫10 d、盐胁迫6 d时表达量虽有下降,但也高于对照。同时,本研究通过PaHK3a基因表达量与生理指标相关性分析发现,PaHK3a基因表达量与MDA含量、SOD和POD活性均呈正相关性。因此,在温室干旱、盐胁迫下‘84K’杨叶片PaHK3a表达与叶片胁迫相关的生化标记物MDA含量、保护酶活性变化密切相关。研究结果再次说明,组氨酸激酶基因PaHK3a参与了杨树非生物胁迫响应。

    • ‘84K’杨组氨酸激酶基因PaHK3a在其根、茎、叶中均有表达,且在叶片中表达量最高;PaHK3a基因的表达受外源植物细胞分裂素6-BA、GA3及外源ABA、SA的负调控;同时,受温度胁迫、盐胁迫、水分胁迫等非生物胁迫正调控;温室人工干旱盐碱胁迫过程中,PaHK3a基因表达与叶片MDA含量、SOD活性、POD活性的变化密切相关。因此,杨树PaHK3a基因以负调控的方式参与杨树植物细胞分裂素信号响应,并在抗逆境胁迫过程中发挥重要调控作用。

参考文献 (31)

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