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杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析

王雪怡 顾咏梅 张雪梅 姜廷波 刘焕臻

王雪怡, 顾咏梅, 张雪梅, 姜廷波, 刘焕臻. 杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
引用本文: 王雪怡, 顾咏梅, 张雪梅, 姜廷波, 刘焕臻. 杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
Wang Xueyi, Gu Yongmei, Zhang Xuemei, Jiang Tingbo, Liu Huanzhen. Bioinformatics and stress response expression analysis of poplar HSF family genes[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
Citation: Wang Xueyi, Gu Yongmei, Zhang Xuemei, Jiang Tingbo, Liu Huanzhen. Bioinformatics and stress response expression analysis of poplar HSF family genes[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159

杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
基金项目: 转基因生物新品种培育重大专项(2018ZX08020002)
详细信息
    作者简介:

    王雪怡。主要研究方向:林木抗性育种研究。Email:1368736882@qq.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者:

    刘焕臻,讲师。主要研究方向:林木抗性育种研究。Email:zhenzhen_0522@163.com 地址:同上

  • 中图分类号: S722.3+6

Bioinformatics and stress response expression analysis of poplar HSF family genes

  • 摘要:   目的  探究小黑杨热激转录因子HSF在应答高温和高盐胁迫时发挥的关键作用。保守结构域和顺式作用元件预测等对杨树HSF转录因子家族基因进行生物信息学分析。本研究以小黑杨为材料,经过37 ℃高温胁迫半个月后观察其形态变化;将小黑杨在37 ℃下分别处理0、12、24、48 h,采用RT-qPCR对小黑杨组织中的PsnHSFs基因进行时空表达分析;将小黑杨于150 mmol/L NaCl胁迫分别处理0、24 h,通过RNA-seq分析PsnHSFs基因的相对表达量变化,并通过RT-qPCR进行验证。  结果  通过结构特征和系统发育比较将29个HSF转录因子家族基因分成A、B和C三个亚家族,各亚家族分别包含18、10和1个HSF基因;HSF编码的氨基酸序列长度介于209 ~ 595之间,均为亲水性蛋白;其N端具有高度保守的DBD结构域,由三个保守基序构成;HSF基因启动子序列中包含DRE core、ABRE和TC-rich等多种顺式作用元件。小黑杨经37 ℃高温处理后其株高仅为对照的76.51%,叶片呈卷曲状,叶表面粗糙,叶面积显著减小且苗干多侧枝柔软无韧性。RT-qPCR与RNA-seq结果表明,PsnHSFs被高温、高盐胁迫诱导表达。高温处理后其株高仅为对照的76.51%,叶片呈卷曲状,叶表面粗糙,叶面积显著减小且苗干多侧枝柔软无韧性。RT-qPCR与RNA-seq结果表明,PsnHSFs被高温、高盐胁迫诱导表达。家族基因以及揭示HSF参与木本植物胁迫应答的分子机制调控具有参考意义。
  • 图  1  杨树与拟南芥HSF家族基因系统进化树

    Figure  1.  Phylogenetic tree of HSF family in poplar and Arabidopsis thaliana

    图  2  PtrHSFs结构域分析

    A. 杨树PtrHSFs基本结构图;B. 杨树PtrHSFs中DBD保守结构域;C. 杨树PtrHSFs氨基酸序列20个保守基序。A, basic structure of PtrHSFs of poplar; B, DBD conservative domain in PtrHSFs of poplar; C, there are 20 conserved amino acid sequences of PtrHSFs in poplar.

    Figure  2.  PtrHSFs domain analysis

    图  3  小黑杨高温胁迫生长状态

    A. 小黑杨非胁迫和胁迫生长状态;a为对照,b、c、d为37 ℃高温处理小黑杨;B. 小黑杨对照和高温胁迫处理半个月的株高。数据均为平均值 ± 标准差;星号表示胁迫处理植株与非胁迫处理植株之间的差异性,*、**、***分别表示在P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001水平上差异显著。下同。A, non-stress and stress growth state of P. simonii × P. nigra; a, control; b, c, d, P. simonii × P. nigra trees under 37 ℃ high temperature treatment; B, plant height of P. simonii × P. nigra under control and HT for half a month. The data annotation in the picture is average value ± SD; the asterisk indicates that the difference between stressed and non-stressed plants. *, **, *** indicate significant difference at P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001 level, respectively. The same below.

    Figure  3.  Growth state of P. simonii × P. nigra under high temperature stress

    图  4  小黑杨高温胁迫叶片状态

    A.形态学上端向下第3片到第11片小黑杨叶片;B.小黑杨第6片叶表面;a.对照;b、c、d. 37 ℃高温处理小黑杨。A, the 3rd to 11th leaves of P. simonii × P. nigra from apical side; B, surface of the 6th leaf of P. simonii × P. nigra; a, control; b, c, d, P. simonii × P. nigra under 37 ℃ high temperature treatment.

    Figure  4.  Leaf state of P. simonii × P. nigra under high temperature stress

    图  5  小黑杨PsnHSFs转录因子基因高温胁迫下相对表达量

    Figure  5.  Relative expression level of PsnHSFs transcription factor genes in P. simonii × P. nigra under high temperature stress

    图  6  小黑杨PsnHSFs应答盐胁迫热谱图分析

    C1 ~ C4. 对照组的4个生物学重复;N1 ~ N4. 处理组的4个生物学重复。C1−C4, four biological repeats in control; N1−N4, four biological repeats in treatment group.

    Figure  6.  Thermogram analysis of PsnHSFs genes responsing to salt stress of P. simonii × P. nigra

    图  7  小黑杨PsnHSFs基因应答盐胁迫定量分析

    Figure  7.  Quantitative analysis of PsnHSFs genes responsing to salt stress in P. simonii × P. nigra

    表  1  小黑杨PsnHSFs转录因子基因定量引物

    Table  1.   Quantitative primers for PsnHSFs transcription factor genes of Populus simonii × P. nigra

    基因名称 Gene name基因编号 Gene ID正向引物(5′—3′) Forward primer (5′−3′)反向引物(3′—5′) Reverse primer (3′−5′)
    PsnHSF1 Potri.001G108100.1 CTACGATGGCGGCATCAGCTG CAGCTGATGCCGCCATCGTAG
    PsnHSF2 Potri.001G138900.1 GCTTAGGACTATCAGTCGGCG CCTCTTAAGCCTCTCTACCTC
    PsnHSF3 Potri.001G273700.1 CCCAACACCATCACCAGCACT GATTATCTTCTGAGAGTGCAG
    PsnHSF4 Potri.001G320900.1 CCTACTTTTGTTGAACACCTT TACTGTGATTTTCCACAAGAC
    PsnHSF5 Potri.002G048200.1 ATGAATCCATATCTAACAGTG GTATCATGTAAACCTTCCATC
    PsnHSF6 Potri.002G124800.1 CAGCTCAGCCACAAGTAGCCA GTGAATCACACCAGTTGTTGG
    PsnHSF7 Potri.003G095000.1 GCTTAGGATTATCAGTCGGCG CTTCCTCGAGCCCAAATTTCC
    PsnHSF8 Potri.004G042600.1 GCGAGCCCAGCACGTTTCCAG CTAGTTCCATTTTCTCTCTTC
    PsnHSF9 Potri.004G062300.1 GTATCTTTTGTGACCCGAGTG GAAGTCACCGTCTGATTATCC
    PsnHSF10 Potri.005G214800.1 GATCTAGTAGAGGTGGTGGTG CATACCCTTGCATTTCCAACG
    PsnHSF11 Potri.006G049200.1 GGACTAACAAGCAACAACCTA CTAGTAAGCTCAGTGCTCAAG
    PsnHSF12 Potri.006G115700.1 GGAGAGATTGGTTCATCAAGG GTGATGTTTCTCCAATCAGGC
    PsnHSF13 Potri.006G148200.1 ATGAATACAAGAGAAATGCAG CTTCAACTCATTGAGACTATC
    PsnHSF14 Potri.006G226800.1 GACATCTCTCACAGACCACAC CTAAGCCTTACAATCTCTGCC
    PsnHSF15 Potri.007G043800.1 GACAGCGGCTGCGTCTCCGAC GACGTTGACGTGGACCCCAGG
    PsnHSF16 Potri.008G157600.1 CATCTTCTCAAGAGTATTAGG CTTGCTTGTCTCGCCTTAATC
    PsnHSF17 Potri.009G068000.1 CAATATCCCAGCACCATCACC CTGAGAGGGCAGTTAGGATAT
    PsnHSF18 Potri.010G082000.1 CTCCTCAAACTCAGACTTCTC CTTCACTAGTTCCACCATTAG
    PsnHSF19 Potri.010G104300.1 CTCAGGGCACAGACAATCGAA CTCAACTTCCTTCCAGAGACC
    PsnHSF20 Potri.011G051600.1 GTGAGCCTAGTATGTTTCCAG CAGTTCAAGTTTCTCTCTTCG
    PsnHSF21 Potri.011G071700.1 CATACAGCAAACTATAGTGTC GTATAGATAACCAATTCTAGG
    PsnHSF22 Potri.012G138900.1 GCCATGGTGAAAACGTCGTCG CTCTTCATCTCCGTCAACTCC
    PsnHSF23 Potri.013G079800.1 CTGTTCATGGTAACCTACCAC TCTAACAAGTTCCTGCATGAG
    PsnHSF24 Potri.014G027100.1 CAGCTCAGCCACAAGTAGCTA GAGAGATGCTGGTTCTGCTTG
    PsnHSF25 Potri.014G141400.1 GTTCTCCAATTGCAAACCTGG CAACATGGCACACTTCTTCAC
    PsnHSF26 Potri.015G141100.1 GTGGCGACGGTGGCGCAAGTG CCGGCGAAGAACTCCTCGTCG
    PsnHSF27 Potri.016G056500.1 CATGGTCTAGCAAGCAACAAC GTAAGCTCAGTGCTCAAGACC
    PsnHSF28 Potri.017G059600.1 CTGCTTTTGTTGAACATCTTG AGAACTACAGTGATTTTCGAC
    PsnHSF29 Potri.T137400.1 CTGAAGAATATAGTTCGCAGG CATAATTATATCTTCATCATC
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    表  2  杨树HSF转录因子基因理化性质

    Table  2.   Physical and chemical properties of HSF transcription factor genes in poplar

    基因名称
    Gene name
    基因编号
    Gene ID
    基因群
    Gene
    group
    氨基酸个数
    Amino acid
    number
    连锁群
    Linkage
    group
    蛋白分子质量
    Molecular mass
    of protein/Da
    等电点
    Isoelectric
    point (PI)
    脂肪指数
    Aliphatic
    index (AI)
    不稳定系数
    Instability
    index (II)
    总平均亲水性
    Grand average of
    hydropathicity
    (GRAVY)
    PtrHSF1 Potri.001G108100.1 B2b 343 Chr01 36 826.6 4.71 69.15 55.66 −0.559
    PtrHSF2 Potri.001G138900.1 A1d 595 Chr01 65 369.3 5.51 74.57 64.08 −0.532
    PtrHSF3 Potri.001G273700.1 B4d 270 Chr01 31 292.3 7.15 70.37 56.72 −0.610
    PtrHSF4 Potri.001G320900.1 A5b 490 Chr01 54 702.7 6.01 70.67 56.61 −0.770
    PtrHSF5 Potri.002G048200.1 A7b 359 Chr02 41 148.3 5.13 67.41 57.79 −0.808
    PtrHSF6 Potri.002G124800.1 B4a 364 Chr02 40 440.7 8.15 73.90 51.74 −0.468
    PtrHSF7 Potri.003G095000.1 A1a 507 Chr03 55 694.9 4.61 70.81 58.55 −0.601
    PtrHSF8 Potri.004G042600.1 A1 209 Chr04 24 028.4 9.50 70.53 57.40 −0.655
    PtrHSF9 Potri.004G062300.1 A4a 407 Chr04 46 642.1 4.91 62.04 57.47 −0.843
    PtrHSF10 Potri.005G214800.1 A7a 359 Chr05 40 692.4 5.37 61.42 66.48 −0.914
    PtrHSF11 Potri.006G049200.1 B3 226 Chr06 26 377.0 9.06 76.77 51.80 −0.753
    PtrHSF12 Potri.006G115700.1 A3 444 Chr06 49 881.0 4.86 66.94 61.80 −0.634
    PtrHSF13 Potri.006G148200.1 A9 430 Chr06 48 496.8 5.40 73.23 51.38 −0.626
    PtrHSF14 Potri.006G226800.1 A2 388 Chr06 43 856.9 4.70 73.30 56.80 −0.592
    PtrHSF15 Potri.007G043800.1 B1 285 Chr07 31 018.9 4.57 59.58 37.61 −0.853
    PtrHSF16 Potri.008G157600.1 A6b 348 Chr08 40 084.0 4.90 75.89 57.84 −0.692
    PtrHSF17 Potri.009G068000.1 B4b 272 Chr09 31 530.7 7.19 72.68 57.32 −0.586
    PtrHSF18 Potri.010G082000.1 A6a 358 Chr10 41 335.3 4.90 67.21 55.43 −0.788
    PtrHSF19 Potri.010G104300.1 A8b 392 Chr10 44 690.9 4.42 70.61 43.14 −0.705
    PtrHSF20 Potri.011G051600.1 A1 211 Chr11 24 383.6 9.79 63.84 53.41 −0.772
    PtrHSF21 Potri.011G071700.1 A4a 406 Chr11 46 266.6 5.02 66.28 54.95 −0.793
    PtrHSF22 Potri.012G138900.1 B2a 301 Chr12 33 366.2 4.77 67.94 50.83 −0.667
    PtrHSF23 Potri.013G079800.1 A1b 499 Chr13 55 091.5 5.62 65.03 57.66 −0.619
    PtrHSF24 Potri.014G027100.1 B4c 368 Chr14 41 038.2 8.17 68.10 52.12 −0.564
    PtrHSF25 Potri.014G141400.1 A4b 443 Chr14 50 781.7 6.17 65.15 62.50 −0.806
    PtrHSF26 Potri.015G141100.1 B2c 286 Chr15 31 751.8 4.86 80.66 50.80 −0.470
    PtrHSF27 Potri.016G056500.1 B3b 228 Chr16 26 486.0 7.30 71.84 55.59 −0.732
    PtrHSF28 Potri.017G059600.1 A5a 485 Chr17 54 386.4 5.84 69.01 57.90 −0.752
    PtrHSF29 Potri.T137400.1 C1 339 Scaffold-294 37 981.9 5.27 77.05 51.81 −0.409
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    表  3  杨树HSF家族基因启动子顺式作用元件

    Table  3.   Cis-acting elements of HSF family gene promoter in poplar

    作用元件 Acting element序列 Sequence功能 Function
    Gap-box CAAATGAA(A/G)A 光响应元件的一部分 Part of light responsive element
    Box4 ATTAAT 与光相关的保守DNA模块的一部分 Part of a conserved DNA module involved in light
    DRE core GCCGAC 脱水反应元件 Dehydration responsive element
    MYC CATTTG 参与低温反应 Involved in chilling response
    MYB CAACCA MYB 结合位点 MYB binding site
    ARE AAACCA 无氧诱导所必需的 Essential for anaerobic induction
    ABRE ACGTG 参与脱落酸反应 Involved in abscisic acid responsiveness
    TGACG-motif TGACG 参与了MeJA反应 Involved in MeJA-responsiveness
    TC-rich repeats ATTCTCTAAC 参与防御和压力反应 Involved in defense and stress responsiveness
    TCA-element CCATCTTTTT 参与水杨酸反应 Involved in salicylic acid responsiveness
    LTR CCGAAA 参与低温反应 Involved in low-temperature responsiveness
    MBS CAACTG 参与干旱诱导 Involved in drought-inducibility
    MBS І aaaAaaC(G/C)GTTA 参与类黄酮生物合成基因调控 Involved in flavonoid biosynthetic gene regulation
    GARE-motif TCTGTTG 赤霉素反应元件 Gibberellins-responsive element
    AE-box AGAAACTT 光响应模块的一部分 Part of a module for light response
    WUN-motif AAATTACT 创伤反应元件 Wound-responsive element
    P-box CCTTTTG 赤霉素反应元件 Gibberellin-responsive element
    TGA-box 生长素反应元件的一部分 Part of an auxin-responsive element
    ERE ATTTTAAA 乙烯反应元件 Ethylene-responsive element
    G-box CACGTC/TACGTG 光响应性和结合其他特定压力调节的元件
    Light responsiveness and combines with other regulatory elements under specific stress
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-05-25
  • 修回日期:  2020-07-01
  • 网络出版日期:  2021-01-29
  • 刊出日期:  2021-02-24

杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
    基金项目:  转基因生物新品种培育重大专项(2018ZX08020002)
    作者简介:

    王雪怡。主要研究方向:林木抗性育种研究。Email:1368736882@qq.com 地址:150040 黑龙江省哈尔滨市香坊区和兴路26号东北林业大学林学院

    通讯作者: 刘焕臻,讲师。主要研究方向:林木抗性育种研究。Email:zhenzhen_0522@163.com 地址:同上
  • 中图分类号: S722.3+6

摘要:   目的  探究小黑杨热激转录因子HSF在应答高温和高盐胁迫时发挥的关键作用。保守结构域和顺式作用元件预测等对杨树HSF转录因子家族基因进行生物信息学分析。本研究以小黑杨为材料,经过37 ℃高温胁迫半个月后观察其形态变化;将小黑杨在37 ℃下分别处理0、12、24、48 h,采用RT-qPCR对小黑杨组织中的PsnHSFs基因进行时空表达分析;将小黑杨于150 mmol/L NaCl胁迫分别处理0、24 h,通过RNA-seq分析PsnHSFs基因的相对表达量变化,并通过RT-qPCR进行验证。  结果  通过结构特征和系统发育比较将29个HSF转录因子家族基因分成A、B和C三个亚家族,各亚家族分别包含18、10和1个HSF基因;HSF编码的氨基酸序列长度介于209 ~ 595之间,均为亲水性蛋白;其N端具有高度保守的DBD结构域,由三个保守基序构成;HSF基因启动子序列中包含DRE core、ABRE和TC-rich等多种顺式作用元件。小黑杨经37 ℃高温处理后其株高仅为对照的76.51%,叶片呈卷曲状,叶表面粗糙,叶面积显著减小且苗干多侧枝柔软无韧性。RT-qPCR与RNA-seq结果表明,PsnHSFs被高温、高盐胁迫诱导表达。高温处理后其株高仅为对照的76.51%,叶片呈卷曲状,叶表面粗糙,叶面积显著减小且苗干多侧枝柔软无韧性。RT-qPCR与RNA-seq结果表明,PsnHSFs被高温、高盐胁迫诱导表达。家族基因以及揭示HSF参与木本植物胁迫应答的分子机制调控具有参考意义。

English Abstract

王雪怡, 顾咏梅, 张雪梅, 姜廷波, 刘焕臻. 杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
引用本文: 王雪怡, 顾咏梅, 张雪梅, 姜廷波, 刘焕臻. 杨树HSF家族基因生物信息学与胁迫应答表达分析[J]. 北京林业大学学报, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
Wang Xueyi, Gu Yongmei, Zhang Xuemei, Jiang Tingbo, Liu Huanzhen. Bioinformatics and stress response expression analysis of poplar HSF family genes[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
Citation: Wang Xueyi, Gu Yongmei, Zhang Xuemei, Jiang Tingbo, Liu Huanzhen. Bioinformatics and stress response expression analysis of poplar HSF family genes[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2021, 43(2): 34-45. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200159
  • 逆境胁迫严重影响植物的生长发育、作物产量和质量[1]。非生物胁迫因素即环境因素,包括寒冷、炎热、干旱、高盐、过量水、辐射、各种化学物质、氧化胁迫、风以及食物不足等[2]。其中,高温环境危害植物生长发育表现在许多方面,高温不仅破坏植物光合作用中的电子转运、抑制CO2的固定,还可引起植物活性氧(ROS)的过度积累,抑制D1蛋白(分子量为32 kD,由叶绿体psbA基因编码,维持PSII反应中心构象稳定、影响原初电荷分离与传递)从头合成,进而影响植物的光合作用[3-6]。全球气候变暖导致的高温天气使作物减产引起广泛关注,例如,持续高温可导致水稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)等大面积减产[7]。如何克服高温胁迫对植物生长发育和繁殖的不利影响成为一个重要的研究课题。

    地球上的植物大多都对高温环境具有一定的耐受性,植物体获得耐热性后能够通过诱导代谢和细胞调节对高温环境产生一定的适应性,从而有效防止细胞损伤和植物致死,这种机制称之为高温胁迫响应[8]。植物在响应高温胁迫的过程中会积累大量热激蛋白(heat shock proteins,HSPs),该蛋白主要作为分子伴侣阻止蛋白质聚集并促进热损伤蛋白质的重新折叠,从而达到有效的高温防御;而在高温胁迫响应过程中热激蛋白的表达主要受热应激转录因子(heat stress transcription factorsHSF)的调控[9]。热应激转录因子基因在不同物种中的分布存在较大差异,研究发现在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)、毛果杨(Popolus trichocarpa)、胡杨(Populus euphratica)中分别有21、13、29、31个HSF成员基因[10-11]。大量研究表明,植物中HSFs不仅在高温环境响应胁迫应答,在低温、干旱、盐碱、氧化胁迫等逆境响应中也发挥着重要作用[12]。例如,拟南芥中属于A亚家族的HSFA6b基因不仅参与高温胁迫响应,还作为ABA信号介导胁迫应答途径的正调控因子,显著提高植物的耐盐性和耐旱性[9]HSFA2作为防御反应的关键调控因子,通过转录激活HSP分子伴侣,从而响应不同的环境胁迫,包括极端温度(高温和低温)、过氧化氢、高强度光照等;最新研究还发现HSFA2可能在航天环境的生理适应中发挥重要作用[13]AtHSFA7b主要通过与顺式作用元件E-box-like基序结合调控其靶基因表达从而介导一系列生理变化,包括维持细胞离子稳态、降低失水率、减少活性氧积累以及调节渗透压等,最终提高植物耐盐性[14]。目前关于拟南芥的HSFs体系和调控机制研究较多,但有关杨树HSFs研究还有待进一步深入。

    本研究以毛果杨PtrHSFs基因和氨基酸序列为参照进行生物信息学分析,对杨树PtrHSFs进行分类,获取各基因蛋白的相关理化性质信息,剖析了PtrHSFs的结构和保守结构域及保守基序,找到存在于PtrHSFs基因上游启动子序列中的顺式作用元件。另外,本文以小黑杨为材料,分析了高温胁迫对小黑杨生长发育的影响,还通过RNA-seq分析小黑杨HSF家族基因在高盐胁迫下的响应作用,为揭示木本植物的胁迫应答分子机制奠定基础。

    • 试验材料为本实验室保存的小黑杨(Populus simonii × P. nigra)双单倍体无性系,将组培时间为一个月且长势一致的小黑杨组培苗移植到装有相同基质的塑料盆中进行土培,置于温室条件下(光照16 h/d,相对湿度约60%,温度(24 ± 1) ℃)培养15 d左右,将其分为2组,每组至少10株苗,将其中1组置于37 ℃光照培养箱,另外1组置于24 ℃光照培养箱(光照16 h/d,相对湿度60%)各培养15 d,观察小黑杨的生长状况,并测量其株高。另外将组培一个月的小黑杨组培苗洗净培养基后清水培养30 d左右,用150 mmol/L NaCl溶液处理,分析在盐胁迫下小黑杨PsnHSFs家族基因表达趋势。高温胁迫处理均包含3个生物学重复;高盐胁迫处理均包含4个生物学重复。

    • 根据PlantTFDB v3.0(http://planttfdb_v3.cbi.pku.edu.cn/family.php?fam=HSF)分别获取29个毛果杨PtrHSFs和拟南芥21个HSFs氨基酸保守序列,将50条氨基酸保守序列以Fasta的格式输入BioEdit软件,Threshhold设置为80%进行多序列比对。另外将50条氨基酸保守序列输入MEGA 7软件,采用Neighbor-Joinging的数据分析方法,Bootstrap参数设置为1 000构建系统发育进化树。根据PtrHSFs的氨基酸序列,利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)在线网站获取各基因蛋白理化性质相关信息。利用Conserved Domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 和Pfam(https://pfam.xfam.org/)对杨树PtrHSFs结构域进行预测,并采用MEME(http://meme-suite.org/)在线软件对各基因蛋白的保守基序进行预测分析。从Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/jbrowse/index.html)调取毛果杨中29个PtrHSFs基因上游2 000 bp的启动子序列,利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare)预测各基因启动子序列中的顺式作用元件。

    • 从Phytozome v3.1在线网站获得毛果杨29个PtrHSFs的CDS序列,并以此为参照设计荧光定量引物(表1)。为了检测小黑杨叶片PsnHSFs相对表达量变化,将小黑杨置于37 ℃光照培养箱处理0、12、24和48 h,以非高温胁迫(24 ℃)处理的小黑杨叶片为对照,用TaKaRa RNA提取试剂盒分别提取叶片RNA,并反转录成cDNA作为模板,利用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进行荧光定量PCR。反应体系为:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s(40个循环);95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。通过2−ΔΔCt[15]计算各个热激转录因子基因在小黑杨叶片中的相对表达量。

      表 1  小黑杨PsnHSFs转录因子基因定量引物

      Table 1.  Quantitative primers for PsnHSFs transcription factor genes of Populus simonii × P. nigra

      基因名称 Gene name基因编号 Gene ID正向引物(5′—3′) Forward primer (5′−3′)反向引物(3′—5′) Reverse primer (3′−5′)
      PsnHSF1 Potri.001G108100.1 CTACGATGGCGGCATCAGCTG CAGCTGATGCCGCCATCGTAG
      PsnHSF2 Potri.001G138900.1 GCTTAGGACTATCAGTCGGCG CCTCTTAAGCCTCTCTACCTC
      PsnHSF3 Potri.001G273700.1 CCCAACACCATCACCAGCACT GATTATCTTCTGAGAGTGCAG
      PsnHSF4 Potri.001G320900.1 CCTACTTTTGTTGAACACCTT TACTGTGATTTTCCACAAGAC
      PsnHSF5 Potri.002G048200.1 ATGAATCCATATCTAACAGTG GTATCATGTAAACCTTCCATC
      PsnHSF6 Potri.002G124800.1 CAGCTCAGCCACAAGTAGCCA GTGAATCACACCAGTTGTTGG
      PsnHSF7 Potri.003G095000.1 GCTTAGGATTATCAGTCGGCG CTTCCTCGAGCCCAAATTTCC
      PsnHSF8 Potri.004G042600.1 GCGAGCCCAGCACGTTTCCAG CTAGTTCCATTTTCTCTCTTC
      PsnHSF9 Potri.004G062300.1 GTATCTTTTGTGACCCGAGTG GAAGTCACCGTCTGATTATCC
      PsnHSF10 Potri.005G214800.1 GATCTAGTAGAGGTGGTGGTG CATACCCTTGCATTTCCAACG
      PsnHSF11 Potri.006G049200.1 GGACTAACAAGCAACAACCTA CTAGTAAGCTCAGTGCTCAAG
      PsnHSF12 Potri.006G115700.1 GGAGAGATTGGTTCATCAAGG GTGATGTTTCTCCAATCAGGC
      PsnHSF13 Potri.006G148200.1 ATGAATACAAGAGAAATGCAG CTTCAACTCATTGAGACTATC
      PsnHSF14 Potri.006G226800.1 GACATCTCTCACAGACCACAC CTAAGCCTTACAATCTCTGCC
      PsnHSF15 Potri.007G043800.1 GACAGCGGCTGCGTCTCCGAC GACGTTGACGTGGACCCCAGG
      PsnHSF16 Potri.008G157600.1 CATCTTCTCAAGAGTATTAGG CTTGCTTGTCTCGCCTTAATC
      PsnHSF17 Potri.009G068000.1 CAATATCCCAGCACCATCACC CTGAGAGGGCAGTTAGGATAT
      PsnHSF18 Potri.010G082000.1 CTCCTCAAACTCAGACTTCTC CTTCACTAGTTCCACCATTAG
      PsnHSF19 Potri.010G104300.1 CTCAGGGCACAGACAATCGAA CTCAACTTCCTTCCAGAGACC
      PsnHSF20 Potri.011G051600.1 GTGAGCCTAGTATGTTTCCAG CAGTTCAAGTTTCTCTCTTCG
      PsnHSF21 Potri.011G071700.1 CATACAGCAAACTATAGTGTC GTATAGATAACCAATTCTAGG
      PsnHSF22 Potri.012G138900.1 GCCATGGTGAAAACGTCGTCG CTCTTCATCTCCGTCAACTCC
      PsnHSF23 Potri.013G079800.1 CTGTTCATGGTAACCTACCAC TCTAACAAGTTCCTGCATGAG
      PsnHSF24 Potri.014G027100.1 CAGCTCAGCCACAAGTAGCTA GAGAGATGCTGGTTCTGCTTG
      PsnHSF25 Potri.014G141400.1 GTTCTCCAATTGCAAACCTGG CAACATGGCACACTTCTTCAC
      PsnHSF26 Potri.015G141100.1 GTGGCGACGGTGGCGCAAGTG CCGGCGAAGAACTCCTCGTCG
      PsnHSF27 Potri.016G056500.1 CATGGTCTAGCAAGCAACAAC GTAAGCTCAGTGCTCAAGACC
      PsnHSF28 Potri.017G059600.1 CTGCTTTTGTTGAACATCTTG AGAACTACAGTGATTTTCGAC
      PsnHSF29 Potri.T137400.1 CTGAAGAATATAGTTCGCAGG CATAATTATATCTTCATCATC
    • 将一个月大小的小黑杨组培苗洗净后置于玻璃杯中水培30 d左右,待小黑杨长出新的根和叶片时用150 mmol/L NaCl溶液胁迫处理24 h后取样,将处理0和24 h的小黑杨叶片置于液氮中速冻,一部分干冰保存送至金唯智公司利用Illumina HiSeq 2500进行RNA-seq测序。将测序数据进行质量评估[15],根据基因ID号将29个小黑杨PsnHSFs家族基因的FPKM值从RNA-seq文库中调取出来,根据Log Ratio值绘制高盐胁迫下小黑杨PsnHSFs家族基因表达量热谱图。另一部分用TaKaRa RNA提取试剂盒分别提取叶片RNA,并反转录成cDNA作为模板,利用Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System进行荧光定量PCR。分析各个热激转录因子基因在小黑杨叶片中的相对表达量变化。

    • 使用Excel 2010统计数据的平均值和标准误差。采用Excel 2010 Student’s T-Test进行差异显著性方差分析,在0.001、0.01和0.05水平下检验各组之间的差异显著性。

    • 为了探索杨树HSF家族基因在各亚家族中的分布,将29个杨树PtrHSFs和21个拟南芥HSFs氨基酸保守序列进行比对并构建系统进化树(图1),根据HR-A/B结构域中A与B之间的氨基酸残基数将HSF家族基因分成A、B、C三大类[16]。29个杨树PtrHSFs中18个基因属于class A,10个基因属于class B,1个基因属于class C(PtrHSF29)。另外,根据拟南芥HSF家族基因的分类,又将class A分为A1 ~ A9九个亚类,将class B分为B1 ~ B4四个亚类(表2)。根据ProtParam tool获得的PtrHSFs理化性质可知,29个PtrHSFs家族基因编码的氨基酸序列长度介于209 ~ 595之间,其中PtrHSF8最小,仅编码209个氨基酸,PtrHSF2最大,编码595个氨基酸,且这两个基因均属于class A1亚类。29个PtrHSFs基因在杨树染色体上呈现不均匀分布,染色体Chr01和Chr06上最多,均含有4个PtrHSFs基因,染色体Chr03、Chr05、Chr07、Chr08、Chr09、Chr12、Chr13、Chr15、Chr16、Chr17、scaffold 294上均只有一个PtrHSF基因,唯一一个属于class C的PtrHSF29位于scaffold 294上。PtrHSFs蛋白的分子量(molecular weight,MW)集中在24 028.4~65 369.3 Da之间,29个PtrHSFs蛋白的理论等电点(theoretical pI)各不相同,其中PtrHSF1、PtrHSF2、PtrHSF4等21个蛋白的pI值小于7,为酸性蛋白质;其余8个蛋白的pI值大于7,为碱性蛋白质,其中PtrHSF20的pI值最大,达到9.79。脂肪系数(aliphatic index,AI)是蛋白质脂肪侧链占蛋白质的相对含量,由蛋白质中Ala、Val、Ile和Leu的含量决定。杨树PtrHSFs蛋白脂肪系数位于59.58 ~ 80.66之间,说明PtrHSFs蛋白中脂肪族氨基酸含量相对较高。杨树PtrHSFs蛋白不稳定指数(instability index,II)差异较大,其中PtrHSF15和PtrHSF19的II值较低,稳定性较差。总平均亲水性(grand average of hydropathicity,GRAVY)是所有氨基酸亲水值的总和与氨基酸数量的比值,GRAVY大于0,为疏水性蛋白;GRAVY小于0,为亲水性蛋白。根据预测结果可知,杨树PtrHSFs蛋白均为亲水性蛋白,PtrHSF10的亲水性最好。

      图  1  杨树与拟南芥HSF家族基因系统进化树

      Figure 1.  Phylogenetic tree of HSF family in poplar and Arabidopsis thaliana

      表 2  杨树HSF转录因子基因理化性质

      Table 2.  Physical and chemical properties of HSF transcription factor genes in poplar

      基因名称
      Gene name
      基因编号
      Gene ID
      基因群
      Gene
      group
      氨基酸个数
      Amino acid
      number
      连锁群
      Linkage
      group
      蛋白分子质量
      Molecular mass
      of protein/Da
      等电点
      Isoelectric
      point (PI)
      脂肪指数
      Aliphatic
      index (AI)
      不稳定系数
      Instability
      index (II)
      总平均亲水性
      Grand average of
      hydropathicity
      (GRAVY)
      PtrHSF1 Potri.001G108100.1 B2b 343 Chr01 36 826.6 4.71 69.15 55.66 −0.559
      PtrHSF2 Potri.001G138900.1 A1d 595 Chr01 65 369.3 5.51 74.57 64.08 −0.532
      PtrHSF3 Potri.001G273700.1 B4d 270 Chr01 31 292.3 7.15 70.37 56.72 −0.610
      PtrHSF4 Potri.001G320900.1 A5b 490 Chr01 54 702.7 6.01 70.67 56.61 −0.770
      PtrHSF5 Potri.002G048200.1 A7b 359 Chr02 41 148.3 5.13 67.41 57.79 −0.808
      PtrHSF6 Potri.002G124800.1 B4a 364 Chr02 40 440.7 8.15 73.90 51.74 −0.468
      PtrHSF7 Potri.003G095000.1 A1a 507 Chr03 55 694.9 4.61 70.81 58.55 −0.601
      PtrHSF8 Potri.004G042600.1 A1 209 Chr04 24 028.4 9.50 70.53 57.40 −0.655
      PtrHSF9 Potri.004G062300.1 A4a 407 Chr04 46 642.1 4.91 62.04 57.47 −0.843
      PtrHSF10 Potri.005G214800.1 A7a 359 Chr05 40 692.4 5.37 61.42 66.48 −0.914
      PtrHSF11 Potri.006G049200.1 B3 226 Chr06 26 377.0 9.06 76.77 51.80 −0.753
      PtrHSF12 Potri.006G115700.1 A3 444 Chr06 49 881.0 4.86 66.94 61.80 −0.634
      PtrHSF13 Potri.006G148200.1 A9 430 Chr06 48 496.8 5.40 73.23 51.38 −0.626
      PtrHSF14 Potri.006G226800.1 A2 388 Chr06 43 856.9 4.70 73.30 56.80 −0.592
      PtrHSF15 Potri.007G043800.1 B1 285 Chr07 31 018.9 4.57 59.58 37.61 −0.853
      PtrHSF16 Potri.008G157600.1 A6b 348 Chr08 40 084.0 4.90 75.89 57.84 −0.692
      PtrHSF17 Potri.009G068000.1 B4b 272 Chr09 31 530.7 7.19 72.68 57.32 −0.586
      PtrHSF18 Potri.010G082000.1 A6a 358 Chr10 41 335.3 4.90 67.21 55.43 −0.788
      PtrHSF19 Potri.010G104300.1 A8b 392 Chr10 44 690.9 4.42 70.61 43.14 −0.705
      PtrHSF20 Potri.011G051600.1 A1 211 Chr11 24 383.6 9.79 63.84 53.41 −0.772
      PtrHSF21 Potri.011G071700.1 A4a 406 Chr11 46 266.6 5.02 66.28 54.95 −0.793
      PtrHSF22 Potri.012G138900.1 B2a 301 Chr12 33 366.2 4.77 67.94 50.83 −0.667
      PtrHSF23 Potri.013G079800.1 A1b 499 Chr13 55 091.5 5.62 65.03 57.66 −0.619
      PtrHSF24 Potri.014G027100.1 B4c 368 Chr14 41 038.2 8.17 68.10 52.12 −0.564
      PtrHSF25 Potri.014G141400.1 A4b 443 Chr14 50 781.7 6.17 65.15 62.50 −0.806
      PtrHSF26 Potri.015G141100.1 B2c 286 Chr15 31 751.8 4.86 80.66 50.80 −0.470
      PtrHSF27 Potri.016G056500.1 B3b 228 Chr16 26 486.0 7.30 71.84 55.59 −0.732
      PtrHSF28 Potri.017G059600.1 A5a 485 Chr17 54 386.4 5.84 69.01 57.90 −0.752
      PtrHSF29 Potri.T137400.1 C1 339 Scaffold-294 37 981.9 5.27 77.05 51.81 −0.409

      根据Pfam对杨树PtrHSF蛋白结构的分析可知,PtrHSF序列具有模块化的基本结构[17],如图2A所示,PtrHSF基本结构包括位于N端的DNA结合域(DNA binding domain, DBD)、寡聚化功能域(HR-A/B结构域)、核定位信号(nuclear localization signal,NLS)、激活基序(activator motifs,AHA)和核输出信号(nuclear export signal,NES)。不同亚家族的PtrHSF蛋白序列中各保守结构域的位置有所不同,其中HR-A/B结构域的长度变化明显,HR-A/B结构域中疏水性氨基酸残基的七肽模式形成与亮氨酸拉链蛋白相互作用的卷曲螺旋结构域[18],成为HSF家族基因分类的重要因素。为了进一步分析杨树PtrHSFs蛋白保守基序的分布,利用MEME对29条杨树PtrHSFs氨基酸序列进行预测,结果表明所有HSF蛋白在N端均含有一个高度保守的DBD结构域,且由3个保守基序构成(图2B)。另外,从PtrHSFs氨基酸全长序列中共检测出20个保守基序(图2C),介于11 ~ 50之间,每条蛋白序列包含4 ~ 10个基序(motif)。除了共同组成DBD结构域的motif1、motif2和motif4在所有蛋白序列中存在外,其他17个基序在PtrHSFs中分布不同。

      图  2  PtrHSFs结构域分析

      Figure 2.  PtrHSFs domain analysis

      从Phytozome在线网站调取29个PtrHSFs基因上游2 000 bp的启动子序列,并通过PlantCARE预测发现,在PtrHSFs基因启动子中除了一些核心启动子元件外,还包含多种多样的胁迫应答顺式作用元件(表3),涉及到光胁迫应答元件(Gap-box、Box4、AE-box)、干旱胁迫应答元件DRE core、ABA应答胁迫元件ABRE、茉莉酸甲酯应答元件TGACG-motif、水杨酸胁迫响应元件TCA-element、赤霉素应答元件GARE-motif以及防御和胁迫响应元件TC-rich等,说明PtrHSFs基因在植物应答各种胁迫过程中发挥重要作用。

      表 3  杨树HSF家族基因启动子顺式作用元件

      Table 3.  Cis-acting elements of HSF family gene promoter in poplar

      作用元件 Acting element序列 Sequence功能 Function
      Gap-box CAAATGAA(A/G)A 光响应元件的一部分 Part of light responsive element
      Box4 ATTAAT 与光相关的保守DNA模块的一部分 Part of a conserved DNA module involved in light
      DRE core GCCGAC 脱水反应元件 Dehydration responsive element
      MYC CATTTG 参与低温反应 Involved in chilling response
      MYB CAACCA MYB 结合位点 MYB binding site
      ARE AAACCA 无氧诱导所必需的 Essential for anaerobic induction
      ABRE ACGTG 参与脱落酸反应 Involved in abscisic acid responsiveness
      TGACG-motif TGACG 参与了MeJA反应 Involved in MeJA-responsiveness
      TC-rich repeats ATTCTCTAAC 参与防御和压力反应 Involved in defense and stress responsiveness
      TCA-element CCATCTTTTT 参与水杨酸反应 Involved in salicylic acid responsiveness
      LTR CCGAAA 参与低温反应 Involved in low-temperature responsiveness
      MBS CAACTG 参与干旱诱导 Involved in drought-inducibility
      MBS І aaaAaaC(G/C)GTTA 参与类黄酮生物合成基因调控 Involved in flavonoid biosynthetic gene regulation
      GARE-motif TCTGTTG 赤霉素反应元件 Gibberellins-responsive element
      AE-box AGAAACTT 光响应模块的一部分 Part of a module for light response
      WUN-motif AAATTACT 创伤反应元件 Wound-responsive element
      P-box CCTTTTG 赤霉素反应元件 Gibberellin-responsive element
      TGA-box 生长素反应元件的一部分 Part of an auxin-responsive element
      ERE ATTTTAAA 乙烯反应元件 Ethylene-responsive element
      G-box CACGTC/TACGTG 光响应性和结合其他特定压力调节的元件
      Light responsiveness and combines with other regulatory elements under specific stress
    • 将温室条件下长势一致的小黑杨分别置于24 ℃和37 ℃光照培养箱培养半个月后,如图3A所示,常温条件小黑杨(a)生长良好,叶片呈延展状态,苗干笔直无侧枝,株高平均达到46.53 cm。经过高温胁迫处理后的小黑杨(b、c、d)从苗干下部长出侧枝,苗干柔软不直立,且株高显著受高温影响,平均为35.60 cm,较对照降低了23.49%(图3B)。由此可见高温环境对小黑杨的生长发育具有显著影响。

      图  3  小黑杨高温胁迫生长状态

      Figure 3.  Growth state of P. simonii × P. nigra under high temperature stress

      本试验中分别比较了对照和高温胁迫条件下从形态学上端向下第3片到第11片小黑杨叶片,如图4A所示,对照条件下的叶面积(a)均大于高温处理后的小黑杨叶片,且经过高温处理后的叶片(b、c、d)向叶背方向扭曲,无法延展开来,叶形亦受高温影响变化显著。另外,如图4B所示,对照条件下的小黑杨叶片(a)润滑有光泽,胁迫后的叶片(b、c、d)上表皮和下表皮均表现粗糙无光泽。

      图  4  小黑杨高温胁迫叶片状态

      Figure 4.  Leaf state of P. simonii × P. nigra under high temperature stress

    • 为了探究小黑杨热激转录因子基因在高温胁迫下的作用,以毛果杨PtrHSFs序列为参照设计荧光定量引物(表1),定量PCR结果如图5所示,以0 h为对照,分别经过12、24和48 h高温处理后,除了PsnHSF1和PsnHSF29未检测出相对表达量以及PsnHSF9的相对表达量无明显变化外,PsnHSF2、PsnHSF3、PsnHSF6、PsnHSF7、PsnHSF8、PsnHSF10、PsnHSF11、PsnHSF16、PsnHSF17、PsnHSF18、PsnHSF19、PsnHSF20、PsnHSF21、PsnHSF22、PsnHSF23、PsnHSF24、PsnHSF25、PsnHSF27和PsnHSF28等19个基因显著上调表达,且表现为相同的表达趋势,在经过37 ℃高温处理24 h后其相对表达量达到最大,其中PsnHSF16和PsnHSF8表达量分别提高47.95和26.82倍。另外,PsnHSF4、PsnHSF5、PsnHSF12、PsnHSF13、PsnHSF14、PsnHSF15、PsnHSF26等7个基因显著下调表达,且具有相同的表达趋势,处理12 h后其相对表达量达到最大,其中PsnHSF5、PsnHSF14、PsnHSF13、PsnHSF26相对表达量分别上调46.09、45.37、22.25、16.69倍。综合表明,杨树PsnHSFs在应答高温胁迫过程中发挥重要的作用。

      图  5  小黑杨PsnHSFs转录因子基因高温胁迫下相对表达量

      Figure 5.  Relative expression level of PsnHSFs transcription factor genes in P. simonii × P. nigra under high temperature stress

    • 根据公式Log Ratio=Log2(FPKM 24 h/FPKM 0 h)计算小黑杨PsnHSFs转录因子基因的相对表达量,当Log Ratio > 0时,该基因上调表达;当Log Ratio < 0时,该基因下调表达。从RNA-seq数据中调取小黑杨PsnHSFs转录因子基因FPKM值,经计算发现除了PsnHSF8未检测出表达量变化以外其他PsnHSFs经过高盐胁迫处理后均发生差异表达变化(图6),PsnHSF1、PsnHSF2、PsnHSF4、PsnHSF7、PsnHSF9、PsnHSF10、PsnHSF11、PsnHSF14、PsnHSF15、PsnHSF16、PsnHSF17、PsnHSF18、PsnHSF19、PsnHSF20、PsnHSF23、PsnHSF25、PsnHSF27、PsnHSF28、PsnHSF29等19个PsnHSFs上调表达(65.5%),PsnHSF3、PsnHSF5、PsnHSF6、PsnHSF12、PsnHSF13、PsnHSF21、PsnHSF22、PsnHSF24、PsnHSF26等9个PsnHSFs下调表达(31.0%)。其中PsnHSF14、PsnHSF15、PsnHSF20、PsnHSF27显著上调表达,Log Ratio值均大于2,PsnHSF20经过盐胁迫处理后上调表达达到5.80倍;9个下调表达的基因中有5个Log Ratio值小于−1,其中PsnHSF24下调表达2.21倍。该结果表明,PsnHSFs转录因子基因参与杨树盐胁迫应答反应。将19个上调表达的PsnHSFs基因用于RT-qPCR定量分析,如图7所示,以0 h为对照,小黑杨经过150 mmol/L NaCl高盐胁迫处理24 h后,19个PsnHSFs基因均诱导上调表达,该结果与转录组数据分析结果一致。其中,PsnHSF20、PsnHSF29、PsnHSF16等基因显著上调表达。进一步表明,PsnHSFs转录因子基因在应答高盐胁迫反应过程中发挥重要作用。

      图  6  小黑杨PsnHSFs应答盐胁迫热谱图分析

      Figure 6.  Thermogram analysis of PsnHSFs genes responsing to salt stress of P. simonii × P. nigra

      图  7  小黑杨PsnHSFs基因应答盐胁迫定量分析

      Figure 7.  Quantitative analysis of PsnHSFs genes responsing to salt stress in P. simonii × P. nigra

    • 本研究的小黑杨是由以往研究生通过对二倍体小黑杨无性系(小叶杨与欧洲黑杨的杂交种)进行花药培养,获得单倍体小黑杨,在自然条件下,经过多次继代培养后,体细胞染色体数目加倍,形成纯合的二倍体,称之为双单倍体[19]。其具有长势优良、周期短、较强适应性和抗性的特点。同时,双单倍体植株的等位基因纯合,是研究遗传变异及基因组测序的理想材料[20],有利于筛选突变体和新的品种,选择优良纯合系后代且表现整齐一致,缩短育种年限[21-22]。另外,无性系小黑杨没有飞絮,不会污染环境[23]。因此,研究双单倍体无性系植株对推动林木遗传育种进程具有重大意义。

      热激转录因子HSFs在植物应答高温胁迫时发挥至关重要的作用,是信号转导链的末端组成部分,介导热胁迫响应基因和大量化学应激源的激活[24]。HSF蛋白包含3个保守结构域,即DBD、HR-A/HR-B和C端HR-C[25]。N端高度保守的DNA结合域特异性地识别和结合回文基序即热应激因子(heat stress elements,HSE),并与其他转录因子基因互作共同调控HSPs的转录活性[26]。依据HSF蛋白氨基酸保守序列从DBD到HR-A/HR-B的长度以及HR-A到HR-B的长度将HSFs划分为三个亚家族A、B、C[25]。本研究通过生物信息学分析表明杨树29个HSF基因有18个基因属于A类,10个基因属于B类,1个基因属于C类。29个PtrHSFs蛋白均为亲水性蛋白,且大多为酸性蛋白质,但在染色体上的分布、蛋白不稳定指数和等电点的差异较大。所有HSF蛋白在N端均含有一个高度保守的DBD结构域,且由3个保守基序构成。在HSFs基因上游的启动子序列中包含DRE core、ABRE、TGACG-motif、TCA-element、GARE-motif和TC-rich等多种胁迫应答顺式作用元件。

      随着全球温度持续升高,植物的生长周期、种子萌发、开花及某些物种的物候期等都受到影响[27]。例如,拟南芥在28 ℃下生长,其营养叶发育迅速、开花早、根系生长增加、抗病能力降低[28-29]。高温胁迫能诱导植物的热形态发生变化,具体表现为下胚轴伸长增加、叶柄低温生长、气孔密度和叶厚度降低[30],同时还会导致植物叶片发黄、卷曲粗糙且株高降低[31]。本文通过高温胁迫处理小黑杨发现其株高仅为对照的76.51%,叶面积显著减小、卷曲且叶面粗糙,苗干多侧枝且柔软无韧性,该结果与前人研究结果相似。另外根据小黑杨在高温环境下的表型变化探讨了HSF转录因子家族基因在小黑杨叶片组织中的相对表达量变化,结果表明小黑杨PsnHSF2、PsnHSF3、PsnHSF8、PsnHSF16等19个基因在37 ℃处理后显著上调表达且在24 h相对表达量达到最大;PsnHSF4、PsnHSF5、PsnHSF13、PsnHSF14等7个基因在高温处理后显著下调表达且在12 h相对表达量达到最大。其中,PsnHSF16、PsnHSF8、PsnHSF5、PsnHSF14、PsnHSF13均属于A类亚家族,PsnHSF16在拟南芥中的同源基因为HSFA6b,研究表明HSFA6b还参与调控ABA信号通路,在ABA介导的干旱、高盐和高温胁迫响应中起着正调控作用[9],由此可推测,小黑杨PsnHSF16在高温环境下显著上调表达可能通过参与ABA信号途径介导高温应激响应。PsnHSF14的同源基因HSFA2受高温诱导,在耐热细胞中起着决定性的作用,调控长时间高温胁迫和恢复期的HSPs的表达[32]。另外,PsnHSF8在拟南芥中的同源基因HSFA1与HSFA2是不同胁迫环境下调控过氧化物响应基因表达的关键基因[33]

      热激转录因子HSFs还参与植物高盐胁迫应答响应。在盐胁迫下,过表达白桦(Betula platyphllaHSFA4基因能通过提高保护酶(SOD、POD)的活性来提高活性氧清除能力、降低膜脂氧化程度,减少细胞损伤或死亡,进而提高白桦的耐盐能力[34]。在拟南芥中证实过表达HSFA4A基因能通过调节自身磷酸化水平来增强拟南芥的耐盐和抗氧化能力[35]。小麦HSFA2d基因和拟南芥HSFA2基因均为参与盐胁迫响应的正调控因子,从而提高植株的耐盐性[36]。本文探讨了HSF转录因子家族基因在小黑杨中的相对表达量变化,通过RNA-seq数据分析表明PsnHSF14、PsnHSF15、PsnHSF20、PsnHSF27等19个PsnHSFs基因经150 mmol/L NaCl胁迫诱导后上调表达,且经过RT-qPCR验证为结果一致;PsnHSF3、PsnHSF5、PsnHSF6、PsnHSF12等9个PsnHSFs在高盐胁迫诱导后下调表达。其中,PsnHSF14、PsnHSF20、PsnHSF27在高温和高盐胁迫下均显著上调表达,说明该基因在高温和高盐胁迫过程中均发挥重要作用。PsnHSF15和PsnHSF27均属于B亚家族,最新在大豆(Glycine max )中研究表明一些B类亚家族的HSFs基因可以通过激活类黄酮生物合成相关基因的表达提高植物的耐盐性[37]

      综上所述,高温环境对杨树的生长发育产生不利影响,而小黑杨PsnHSFs基因能够积极参与高温胁迫响应并发挥着至关重要的作用;同时,小黑杨PsnHSFs在高盐胁迫中也发挥着重要作用,但其在高盐胁迫应答过程中的分子机制需进一步试验验证。

参考文献 (37)

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