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大果紫檀心材色素纯化及成分研究

张卿硕 韦柳明 杨雨桐 孙静 符韵林

张卿硕, 韦柳明, 杨雨桐, 孙静, 符韵林. 大果紫檀心材色素纯化及成分研究[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
引用本文: 张卿硕, 韦柳明, 杨雨桐, 孙静, 符韵林. 大果紫檀心材色素纯化及成分研究[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
Zhang Qingshuo, Wei Liuming, Yang Yutong, Sun Jing, Fu Yunlin. Purification and composition of heartwood pigment of Pterocarpus macrocarpus[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
Citation: Zhang Qingshuo, Wei Liuming, Yang Yutong, Sun Jing, Fu Yunlin. Purification and composition of heartwood pigment of Pterocarpus macrocarpus[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225

大果紫檀心材色素纯化及成分研究

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
基金项目: 广西创新驱动发展专项资金项目(桂科AA17204087-14),国家林业局中南速生材繁育实验室项目(KF(2018)-02)
详细信息
    作者简介:

    张卿硕,主要研究方向:心材形成机理研究。Email:zhang_qing_shuo@163.com 地址:530000广西省南宁市西乡塘区广西大学林学院

    通讯作者:

    孙静,博士,副教授。主要研究方向:木材科学。Email:sunjing413@126.com 地址:同上

  • 中图分类号: S781.7

Purification and composition of heartwood pigment of Pterocarpus macrocarpus

  • 摘要:   目的  研究大果紫檀心材色素的纯化工艺及成分,为其心材形成机理提供理论基础。  方法  以大果紫檀心材为原料,使用7种溶剂抽提大果紫檀心材色素,测定波长并建立心材色素质量浓度的标准曲线。选用10种大孔树脂纯化心材色素, 分别测定吸附率、吸附量、解吸率和解吸量,确定吸附效果最佳的树脂。在DA-201树脂的动态吸附过程中,以色素质量浓度为指标探究不同因素的影响大小,确定最佳吸附条件。使用超高效液相色谱串联四极杆–静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术(UPLC-Q-EXCTIVE-MS)对纯化后的心材色素分离与鉴定。  结果  选用乙醇作为提取溶剂,提取液的色差值为55.15。将486 nm作为测定波长,建立了标准曲线。大孔树脂DA-201的吸附–解吸值最佳,其吸附量和吸附率分别是10.07 g/L和80.19%,解吸量和解吸率分别是7.06 g/L和70.07%。在DA-201大孔树脂的静态吸附过程中,最佳条件为pH值4和洗脱剂乙醇浓度100%。在动态吸附过程中,最佳吸附条件分别为吸附流速2.0 mL/min,上样液质量浓度2 g/L;最佳解吸条件分别为洗脱流速1 mL/min,洗脱剂用量100 mL。对纯化后的心材色素分析,从中分离鉴定出10种黄酮类和醇类化合物,分别为荭草苷、牡荆素、金雀异黄素、白藜芦醇、白杨素、黄豆黄素、异甘草素、诺卡酮、芒柄花黄素和酮洛芬。  结论  用DA-201型大孔吸附树脂纯化大果紫檀心材色素工艺稳定,获得了最佳吸附和解吸条件,同时确定了心材色素成分。
  • 图  1  大果紫檀心材色素全波长扫描图

    Figure  1.  Full wavelength scanning of the pigment of Pterocarpus macrocarpus

    图  2  大果紫檀心材色素质量浓度标准曲线

    Figure  2.  Standard curve of the pigment of Pterocarpus macrocarpus

    图  3  色素原液pH值对DA-201树脂吸附效果的影响

    Figure  3.  Effects of pH on the absorption rate of DA-201 macroporous resin

    图  4  乙醇体积分数对DA-201树脂解吸率的影

    Figure  4.  Effects of ethanol concentration on the desorption rate of DA-201 macroporous resin

    图  5  吸附流速对DA-201树脂吸附效果的影响

    吸光度比值为流出液的吸光度除以上样液的吸光度。Absorbance ratio is the absorbance of the effluent divided by the absorbance of the sample solution.

    Figure  5.  Effects of absorption velocity on the absorption of DA-201 macroporous resin

    图  6  上样液质量浓度对DA-201树脂吸附效果的影响

    Figure  6.  Effects of sample solution concentration on the absorption of DA-201 macroporous resin

    图  7  洗脱剂流速对DA-201树脂吸附效果的影响

    Figure  7.  Effects of elution velocity on the absorption of DA-201 macroporous resin

    图  8  洗脱剂用量对DA-201树脂解吸效果的影响

    Figure  8.  Effects of volume of eluent on the absorption of DA-201 macroporous resin

    图  9  大果紫檀心材色素基峰图

    Figure  9.  Positive base peak chart of the pigment of Pterocarpus macrocarpus

    图  10  大果紫檀心材色素成分二级质谱图

    Figure  10.  Secondary mass spectrogram of components in the pigment of Pterocarpus macrocarpus

    表  1  供试10种大孔吸附树脂的理化性质

    Table  1.   Physical and chemical characteristics of the 10 tested macro-porous adsorption resins

    树脂型号
    Resin No.
    极 性
    Polarity
    骨架
    Scaffold
    比表面积
    Specific surface area/(m2·g−1)
    平均孔径
    Mean pore size /nm
    粒径
    Particle size /mm
    外 观
    Appearance
    ADS-17 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 90 ~ 150 25 ~ 30 0.32 ~ 0.25 白色球状 White orb
    D101 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 500 ~ 550 90 ~ 100 1.18 ~ 1.24 白色球状 White orb
    D3520 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 480 ~ 520 85 ~ 90 2.10 ~ 2.15 白色球状 White orb
    HPD100 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 650 ~ 700 80 ~ 90 1.20 ~ 1.24 白色球状 White orb
    X-5 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 500 ~ 600 29 ~ 30 1.20 ~ 1.24 白色球状 White orb
    AB-8 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 450 ~ 500 130 ~ 140 0.73 ~ 0.77 白色球状 White orb
    DA-201 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 150 ~ 200 23 ~ 25 0.75 ~ 0.85 白色球状 White orb
    HPD722 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 485 ~ 530 13 ~ 14 0.30 ~ 1.25 白色球状 White orb
    HC-200 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 150 ~ 260 45 ~ 75 0.40 ~ 0.90 白色球状 White orb
    HPD400 中极性 Semi-polarity 苯乙烯型 Styrene type 550 ~ 600 90 ~ 100 0.30 ~ 1.25 白色球状 White orb
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    表  2  样品流动相梯度洗脱条件

    Table  2.   Gradient elution conditions of mobile phase for samples

    洗脱时间
    Elution time/
    min
    流速
    Flow velocity/
    (mL·min−1)
    流动相A
    Mobile
    phase A
    流动相B
    Mobile
    phase B
    0 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH
    2.0 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH
    20.0 0.3 10%CH2OH 90%CH3OH
    22.0 0.3 10%CH2OH 90%CH3OH
    22.1 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH
    26.0 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH
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    表  3  不同溶剂对大果紫檀木粉提取后色差值的对比

    Table  3.   Comparison of color chromatic aberration of Pterocarpus macrocarpus powder with different solvents

    溶剂
    Solvent
    石油醚
    Petroleum ether

    Benzene
    乙酸乙酯
    Ethyl acetate
    蒸馏水
    Distilled water
    正丁醇
    N-butanol
    甲醇
    Methanol
    乙醇
    Ethanol
    颜色
    Color
    无色
    Transparent color
    浅黄
    Buff
    棕色
    Suntan
    深棕
    dark brown
    粉红
    Pink

    Red

    red
    色差值
    Color chromatic aberration
    8.35 12.81 31.82 32.56 52.33 55.01 55.15
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    表  4  10种大孔吸附树脂对大果紫檀色素原液的静态吸附结果

    Table  4.   Static adsorption of pigment stock solution in Pterocarpus macrocarpus by ten types of macroporous resins

    型号
    Model No.
    吸附量
    Adsorption
    quantity/(g·L−1
    吸附率
    Adsorption
    rate/%
    解吸量
    Desorption
    quantity/(g·L−1
    解吸率
    Desorption
    rate/%
    ADS-17 8.80 70.07 5.77 65.52
    D101 8.04 64.05 5.65 70.26
    D3520 8.64 68.84 5.79 67.01
    HPD100 8.92 71.04 5.93 66.50
    X-5 7.90 62.90 4.90 62.00
    AB-8 7.86 62.54 5.15 65.56
    DA-201 10.07 80.19 7.06 70.07
    HPD722 7.56 60.17 5.55 73.47
    HC-200 8.36 66.56 5.34 63.85
    HPD400 8.04 64.02 5.44 67.61
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    表  5  大果紫檀心材色素中化学成分离子结构信息

    Table  5.   Characterization of chemical constituents in pigment from Pterocarpus macrocarpus heartwood

    序号
    No.
    保留时间
    Retention
    time/min
    分子式
    Formula
    实测分子量
    Experimental
    molecular mass
    理论分子量
    Theoretical
    molecular mass
    二级离子分子量
    Product ion
    molecular mass
    化学成分
    Component
    文献来源
    Reference
    1 4.714 C21H20O11 449.100 [M+H]+449.100 431.097
    353.065 60.081
    荭草苷
    Orientin
    Zhou et al.[16]
    2 5.071 C21H20O10 433.105 [M+H]+433.105 415.103
    367.082 283.060
    牡荆素
    Vitexin
    Pereira et al.[17]
    3 6.065 C15H10O5 271.060 [M+H]+271.052 253.162
    119.086
    金雀异黄素
    Genistein
    Angeloni et al.[18]
    4 6.387 C14H12O3 229.070 [M+H]+229.078 145.065
    119.049
    白藜芦醇
    Resveratrol
    Vlase et al.[19]
    5 6.514 C15H10O4 255.065 [M+H]+255.057 177.128
    159.083
    白杨黄素
    Chrysin
    李伟等[20]
    Li W et al.[20]
    6 6.825 C16H12O5 285.068 [M+H]+285.068 253.050
    137.023
    黄豆黄素
    Glycitein
    Wu et al.[21]
    7 7.770 C15H12O4 257.081 [M+H]+257.073 147.044
    137.023
    异甘草素
    Isoliquiritigenin
    Xie et al.[22]
    马若克[23]
    Ma R K[23]
    8 7.807 C15H22O 219.174 [M+H]+219.167 204.151
    163.112 135.117
    诺卡酮
    Nootkatone
    Xie et al.[24]
    9 7.864 C16H12O4 269.080 [M+H]+268.073 254.058
    237.054
    芒柄花黄素
    Taxifolin
    Wu et al.[25]
    10 9.947 C14H12O3 255.102 [M+H]+255.094 240.078
    105.070
    酮洛芬
    Ketoprofen
    李前荣等[26]
    Li Q R et al.[26]
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-07-22
  • 修回日期:  2020-08-18
  • 网络出版日期:  2020-10-16

大果紫檀心材色素纯化及成分研究

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
    基金项目:  广西创新驱动发展专项资金项目(桂科AA17204087-14),国家林业局中南速生材繁育实验室项目(KF(2018)-02)
    作者简介:

    张卿硕,主要研究方向:心材形成机理研究。Email:zhang_qing_shuo@163.com 地址:530000广西省南宁市西乡塘区广西大学林学院

    通讯作者: 孙静,博士,副教授。主要研究方向:木材科学。Email:sunjing413@126.com 地址:同上
  • 中图分类号: S781.7

摘要:   目的  研究大果紫檀心材色素的纯化工艺及成分,为其心材形成机理提供理论基础。  方法  以大果紫檀心材为原料,使用7种溶剂抽提大果紫檀心材色素,测定波长并建立心材色素质量浓度的标准曲线。选用10种大孔树脂纯化心材色素, 分别测定吸附率、吸附量、解吸率和解吸量,确定吸附效果最佳的树脂。在DA-201树脂的动态吸附过程中,以色素质量浓度为指标探究不同因素的影响大小,确定最佳吸附条件。使用超高效液相色谱串联四极杆–静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术(UPLC-Q-EXCTIVE-MS)对纯化后的心材色素分离与鉴定。  结果  选用乙醇作为提取溶剂,提取液的色差值为55.15。将486 nm作为测定波长,建立了标准曲线。大孔树脂DA-201的吸附–解吸值最佳,其吸附量和吸附率分别是10.07 g/L和80.19%,解吸量和解吸率分别是7.06 g/L和70.07%。在DA-201大孔树脂的静态吸附过程中,最佳条件为pH值4和洗脱剂乙醇浓度100%。在动态吸附过程中,最佳吸附条件分别为吸附流速2.0 mL/min,上样液质量浓度2 g/L;最佳解吸条件分别为洗脱流速1 mL/min,洗脱剂用量100 mL。对纯化后的心材色素分析,从中分离鉴定出10种黄酮类和醇类化合物,分别为荭草苷、牡荆素、金雀异黄素、白藜芦醇、白杨素、黄豆黄素、异甘草素、诺卡酮、芒柄花黄素和酮洛芬。  结论  用DA-201型大孔吸附树脂纯化大果紫檀心材色素工艺稳定,获得了最佳吸附和解吸条件,同时确定了心材色素成分。

English Abstract

张卿硕, 韦柳明, 杨雨桐, 孙静, 符韵林. 大果紫檀心材色素纯化及成分研究[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
引用本文: 张卿硕, 韦柳明, 杨雨桐, 孙静, 符韵林. 大果紫檀心材色素纯化及成分研究[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
Zhang Qingshuo, Wei Liuming, Yang Yutong, Sun Jing, Fu Yunlin. Purification and composition of heartwood pigment of Pterocarpus macrocarpus[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
Citation: Zhang Qingshuo, Wei Liuming, Yang Yutong, Sun Jing, Fu Yunlin. Purification and composition of heartwood pigment of Pterocarpus macrocarpus[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200225
  • 大果紫檀(Pterocarpus macrocarpus)隶属于蝶形花科(Papilionaceae)紫檀属(Pterocarpus)的一种半常绿高大乔木。国标GB/T18107−2017《红木》规定大果紫檀为29种红木之一, 俗称缅甸花梨,分布于缅甸、泰国、老挝、柬埔寨和越南等地区[1]。大果紫檀的成分主要有β-桉叶醇、桉油烯醇、高紫檀素、美迪紫檀素和龙涎酮等[2-3],并且具有一定的抗菌性。但是,具体哪些内含物影响心材颜色还未完全确定。

    随着大果紫檀心材颜色形成原因的研究增多,确定心材化学成分是必要环节,因此它的提取和精制方法逐渐受到了重视。大果紫檀心材内含物提取的方法较多,如不同有机溶剂提取法和萃取法[4]。朱续娜等[5]通过使用聚酰胺固相萃取法分离纯化出大果紫檀中的荧光组分。龙军等[6]采用超临界CO2技术对大果紫檀心材进行提取, 得到的内含物萃取率为4.26%。张鹏等[3]采用了不同溶剂对大果紫檀进行抽提,并结合色谱检测手段研究主要显色成分,初步确认内含物的主要官能团为酚羟基和共轭羰基。

    目前,大果紫檀心材的研究主要集中在提取工艺、化合物种类及其发色官能团,并未纯化心材色素和鉴定色素成分。故本研究针对性地探讨心材色素在不同溶剂中的提取效果和纯化工艺,而后分析一级和二级质谱图的裂解途径鉴定心材色素成分。本研究使用大孔树脂精制大果紫檀心材色素。它是近十余年发展起来的一类有机高聚物吸附剂, 其极性、比表面积、孔径和孔度大小等因素的选择范围较广,因此逐渐取代了活性白土、活性氧化铝等经典吸附剂,为黄酮类色素成分的富集和分离提供了技术支撑[7]。以苯乙烯为基础骨架的大孔树脂,其极性范围从非极至中极性,根据大孔树脂的吸附原理,满足了吸附黄酮类色素的极性范围[8]。不同树种心材中所含有的黄酮类色素成分和含量不同,因此不同型号的大孔树脂对其适用性有待进一步研究。因此,本研究以大果紫檀心材为原料,通过比较10种大孔树脂对心材色素的吸附率和解吸率,选出最佳工艺参数。使用超高效液相色谱串联四极杆−静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术(Q-EXACTIVE-MS)确定出大果紫檀心材中色素成分。通过鉴定出大果紫檀心材色素成分,为后续探究心边材的颜色过渡机制奠定理论基础。

    • 大果紫檀(Pterocarpus macrocarpus)于2018年6月采样于缅甸瓦城,树龄为200年。正己烷、正丁醇、乙酸乙酯、苯、石油醚、乙醇、甲醇,购自成都市科隆化学品有限公司。甲醇色谱纯,购自天津市大茂化学试剂厂。大孔吸附树脂 ADS-17、D101、D3520、HPD100、X-5、AB-8、DA-201、HPD722、HC-200、HPD400,购自和成新材料有限公司,其具体理化性质见表1

      表 1  供试10种大孔吸附树脂的理化性质

      Table 1.  Physical and chemical characteristics of the 10 tested macro-porous adsorption resins

      树脂型号
      Resin No.
      极 性
      Polarity
      骨架
      Scaffold
      比表面积
      Specific surface area/(m2·g−1)
      平均孔径
      Mean pore size /nm
      粒径
      Particle size /mm
      外 观
      Appearance
      ADS-17 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 90 ~ 150 25 ~ 30 0.32 ~ 0.25 白色球状 White orb
      D101 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 500 ~ 550 90 ~ 100 1.18 ~ 1.24 白色球状 White orb
      D3520 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 480 ~ 520 85 ~ 90 2.10 ~ 2.15 白色球状 White orb
      HPD100 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 650 ~ 700 80 ~ 90 1.20 ~ 1.24 白色球状 White orb
      X-5 非极性 Nonpolar 苯乙烯型 Styrene type 500 ~ 600 29 ~ 30 1.20 ~ 1.24 白色球状 White orb
      AB-8 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 450 ~ 500 130 ~ 140 0.73 ~ 0.77 白色球状 White orb
      DA-201 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 150 ~ 200 23 ~ 25 0.75 ~ 0.85 白色球状 White orb
      HPD722 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 485 ~ 530 13 ~ 14 0.30 ~ 1.25 白色球状 White orb
      HC-200 弱极性 Low-polarity 苯乙烯型 Styrene type 150 ~ 260 45 ~ 75 0.40 ~ 0.90 白色球状 White orb
      HPD400 中极性 Semi-polarity 苯乙烯型 Styrene type 550 ~ 600 90 ~ 100 0.30 ~ 1.25 白色球状 White orb
    • 称取7份0.5 g的 60目大果紫檀心材木粉, 分别放置于 7 个圆底烧瓶中,分别加入 20 mL的石油醚(沸程60 ~ 90 ℃)、无水乙醇、甲醇、苯、乙酸乙酯、正丁醇、蒸馏水。置于100 W 超声辅助浸提30 min,冷凝回流,将抽提液过滤后放入比色管中,使用ADCI系列全自动色差仪测定各个溶液的色差值∆E,方法参考文献[9],确定最适合的提取溶剂。

    • 将大果紫檀心材乙醇提取液,适当稀释后将色素溶液放置于石英比色皿中,采用赛默飞尔科技有限公司生产的Evolution300型紫外−可见光分光光度计测定。乙醇作为空白样,扫描大果紫檀色素溶液在 190 ~ 1 100 nm 波长下的吸光度。获取大果紫檀心材色素全波长扫描图,绘制曲线,确定色素的最佳吸收波长。

    • 大果紫檀心材色素提取液经过减压浓缩除去乙醇溶剂,得到色素浸膏。使用无水乙醇将大果紫檀心材色素浸膏溶解,分别配成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的大果紫檀心材色素标准液,测定溶液在最佳波长的吸光度值,绘制色素质量浓度为横坐标,吸光值为纵坐标的标准曲线。

    • 大果紫檀色素原液于486 nm波长下测其吸光值A0和体积V0,计算色素原液的质量浓度C0。分别量取经过预处理的ADS-17、D101、D3520、HPD100、X-5、AB-8、DA-201、HPD722、HC-200、HPD400这10种大孔树脂5 g放入带塞锥形瓶中,加入20 mL质量浓度为3.0 g/L的大果紫檀色素原液,在温室条件下恒温振荡(25 ℃,130 r/min)吸附24 h。待大孔树脂充分吸附后,对静态吸附后的色素溶液抽滤并测定其吸附后质量浓度C1和体积V1。将40 mL乙醇溶液加入滤出的吸附饱和的树脂中,在恒温摇床(25 ℃,130 r/min)中解吸24 h,大孔树脂被充分洗脱后,对洗脱后的色素溶液过滤处理并测出其洗脱后质量浓度C2和体积V2,分别计算吸附率、解吸率、吸附量和解吸量[10-11]

      $$ {Q_1} = \frac{{{C_0}{V_0} - {C_1}{V_1}}}{{{C_0}{V_0}}} \times {\rm{100\% }} $$ (1)

      式中:Q1为大孔树脂的吸附率(%);C0为大果紫檀心材色素质量浓度(g/L);V0为大果紫檀心材色素原液的体积(L);C1为大孔树脂吸附后色素滤液的质量浓度(g/L);V1为大孔树脂吸附后色素滤液的体积(L)。

      $$ {Q_2} = \frac{{{C_2}{V_2}}}{{{C_0}{V_0} - {C_1}{V_1}}} \times {\rm{100\%}} $$ (2)

      式中:Q2为大孔树脂的解吸率(%);C2为乙醇洗脱后色素滤液的质量浓度(g/L);V2为乙醇洗脱后色素滤液的体积(L)。

      $$ {M_1} = \frac{{{C_0}{V_0} - {C_1}{V_1}}}{m} $$ (3)

      式中:M1为大孔树脂的吸附量(g/L);m为大孔树脂的质量(g)。

      $$ {M_2} = \frac{{{C_2}{V_2}}}{m} $$ (4)

      式中:M2为吸附饱和后大孔树脂的解吸量(g/L)。

    • 在锥形瓶中加入DA-201大孔树脂5 g,经过24 h预处理后,分别加入pH值为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的大果紫檀心材色素溶液,分别测定其质量浓度C0和溶液体积V0。在恒温摇床(25 ℃,130 r/min)充分吸附后,对其过滤处理,测其吸附后的质量浓度C1和吸附后体积V1,用式(1)、(3)分别计算其吸附率和吸附量。

    • 按照上述静态吸附实验的条件,准确量取己吸附大果紫檀色素饱和的DA-201树脂5 g于带塞锥形瓶中,分别将20 mL的20%、40%、60%、80%、100%的乙醇水溶液加入锥形瓶中,经过2次静态解吸。在室温条件下恒温振荡(25 ℃,130 r/min)至色素充分洗脱,对其过滤处理,然后测定其质量浓度C2和解吸后体积V2,用式(2)、(4)计算其解吸率和解吸量。

    • 准确称量经24 h预处理过的DA-201大孔树脂装入层析柱,分别向装有大孔树脂的层析柱内加入吸附流速为1.0、2.0、3.0 mL/min的大果紫檀心材色素提取液,质量浓度为3.0 g/L,每5 mL收集一管流出液并测定吸光度,流出液的吸光度达到大果紫檀心材色素上样液吸光度的10%时,即泄露点已经出现。以流出液的体积作为横纵标,吸光度的比值(A/A0)为纵坐标,绘制泄露曲线,依据曲线确定动态吸附上样液最佳吸附流速。

    • 大果紫檀色素心材的上样液流速确定为2.0 mL/min,向装有大孔树脂的层析柱内分别加入1.0、2.0、3.0 g/L的大果紫檀色素上样液进行动态吸附,每5 mL收集1管流出液并测定吸光度,流出液的吸光值达到大果紫檀上样液吸光值10%时,即泄露点已经出现。以流出液的体积为横纵标,流出液和色素原液吸光值的比值(A/A0))做为纵坐标,绘制泄露曲线,确定大果紫檀心材色素上样液的最佳浓度。

    • 取定量预处理过的DA-201大孔树脂装柱,向层析柱内加入10 mL,pH值为4.0的大果紫檀色素溶液,质量浓度为2.0 g/L,待吸附饱和后加入用乙醇溶液,流速为1.0、2.0、3.0 mL/min进行洗脱,用收集器将流出液分段收集,测定其吸光值。

    • 准确量取经24小时预处理过的DA-201大孔树脂装入层析柱,向层析柱内加入10 ml,pH值为4.0的大果紫檀色素溶液,质量浓度为2.0 g/L,待大孔树脂吸附饱和之后用100%乙醇溶液在2.0 mL/min的流速下进行动态洗脱,用收集器将流出液分段收集,测定其吸光值。

    • 采用超高效液相色谱串联四极杆–静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术(UPLC-Q-EXCTIVE-MS)对大果紫檀心材色素成分进行分离鉴定。超高效液相色谱(UPLC)条件:色谱柱为ACQUITY UPLCBEHC18 色谱柱(50 mm × 2.1 mm,1.7 μm),柱温30 ℃;正离子(ESI +)模式;流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为甲醇。自动进样器温度4 ℃,进样体积1 μL。样品梯度洗脱程序见表2

      表 2  样品流动相梯度洗脱条件

      Table 2.  Gradient elution conditions of mobile phase for samples

      洗脱时间
      Elution time/
      min
      流速
      Flow velocity/
      (mL·min−1)
      流动相A
      Mobile
      phase A
      流动相B
      Mobile
      phase B
      0 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH
      2.0 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH
      20.0 0.3 10%CH2OH 90%CH3OH
      22.0 0.3 10%CH2OH 90%CH3OH
      22.1 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH
      26.0 0.3 90%CH2OH 10%CH3OH

      高分辨质谱(Q-EXACTIVE-MS)条件:加热型电喷雾(HESI)离子源,温度为300 ℃;传输毛细管温度320 ℃;鞘气206 kPa;辅助气流速69 kPa;正离子模式下喷雾电压为3.0 kV;扫描模式为Full MS 和Full MS /dd-MS2,质量范围50 ~ 300 amu,一级扫描和二级扫描分辨率分别为70 000、17 500。

    • 大果紫檀心材色素在石油醚溶剂的色差值为8.35,颜色较浅,说明它在石油醚中的溶解效果较差,而在苯溶液中的色差值为12.81,呈现为浅黄色,说明色素在苯的提取下有弱极性成分溶出(见表3)。在乙酸乙酯和蒸馏水中色差值分别为31.82和32.56,呈现棕色,乙酸乙酯和蒸馏水对色素的提取效果相近。正丁醇、甲醇、乙醇色差值超过50,呈现红色或粉红色,表明色素在醇类中溶解性较大。从颜色来看,乙醇色差值为55.15,呈红色,提取效果与正丁醇和甲醇相近。但甲醇具有毒性,其蒸气会影响人体的呼吸道和视网膜[12]。天然色素广泛应用于食品、化妆品、药物等各行业,综合考虑溶剂的安全性和经济性等因素,因此选择乙醇作为抽提溶剂。

      表 3  不同溶剂对大果紫檀木粉提取后色差值的对比

      Table 3.  Comparison of color chromatic aberration of Pterocarpus macrocarpus powder with different solvents

      溶剂
      Solvent
      石油醚
      Petroleum ether

      Benzene
      乙酸乙酯
      Ethyl acetate
      蒸馏水
      Distilled water
      正丁醇
      N-butanol
      甲醇
      Methanol
      乙醇
      Ethanol
      颜色
      Color
      无色
      Transparent color
      浅黄
      Buff
      棕色
      Suntan
      深棕
      dark brown
      粉红
      Pink

      Red

      red
      色差值
      Color chromatic aberration
      8.35 12.81 31.82 32.56 52.33 55.01 55.15
    • 对心材色素进行了190 ~ 1 100 nm全波长扫描,大果紫檀心材色素溶液有4个峰(图1)。紫外光区在190 ~ 360 nm区间有两个吸收峰和一个肩峰,波长分别为226、286、321 nm。可见光区在400 ~ 600 nm区间有一个峰,该峰的波长为486 nm。226 nm为苯环共轭烯键π电子与发色基团共轭,发生π→π*跃迁产生的吸收峰。286 nm为酮类化合物C=O的n→π*禁阻跃迁时出现峰值。321 nm可能为黄酮类化合物C环共轭双键被羟基取代,且与羰基相邻。486 nm为心材色素在可见光区显示的峰值。张鹏等[3]对大果紫檀心材的研究表明发色成分与黄酮的共轭羰基官能团有关。陈辉[13]分析了大果紫檀心材抽提物的成分,鉴定出紫檀素和龙涎酮,它们均为黄酮类化合物,含有苯环、酮羰基、环内双键和取代基。这与本研究测得光谱图的结果一致。大果紫檀心材色素中显色成分初步认定为黄酮类化合物,但黄酮类化合物有部分不显颜色,故没有采用总黄酮的测定方法进行含量计算。可见光区能直观反映色素的颜色,因此选用486 nm作为大果紫檀心材色素的测定波长。

      图  1  大果紫檀心材色素全波长扫描图

      Figure 1.  Full wavelength scanning of the pigment of Pterocarpus macrocarpus

    • 根据上述全波长扫描光谱选取486 nm绘制大果紫檀心材色素质量浓度标准曲线(图2)。以大果紫檀心材色素的质量浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,拟合标准曲线。色素标准浓度曲线的公式为:A = 0.4177C + 0.04175,相关系数R2 = 0.9997,在色素浓度为0.1 ~ 3.0 g/L范围内与吸光度显示了良好的线性关系。

      图  2  大果紫檀心材色素质量浓度标准曲线

      Figure 2.  Standard curve of the pigment of Pterocarpus macrocarpus

    • 从10种大孔树脂24 h的静态吸附效果观察(表4),大孔树脂DA-201的吸附率最高(80.19%),吸附量达到10.07 g/L。大孔树脂HPD722的解吸率最高(73.47%),解吸量达到5.55 g/L。大孔树脂DA-201的解吸率低于大孔树脂HPD722,但解吸量为7.06 g/L,明显高于大孔树脂HPD722。当树脂极性相近时,大粒径树脂的比表面积和平均孔径数较多,有助于提高吸附效率。在弱极性的树脂中,DA-201树脂孔径为23 ~ 25 nm,适合色素分子进入树脂内部;其粒径为0.75 ~ 0.85 nm,大于其他3种弱极性树脂,故吸附率和吸附量最高。弱极性树脂DA-201比其他树脂更适合大果紫檀心材色素的分离纯化,它可在极性溶剂中更容易吸附弱极性成分。大果紫檀心材中主要为黄酮类化合物,其酚羟基可作为供体吸附在大孔树脂上。另外,黄酮类化合物含有酚羟基、糖苷和非极性黄酮母核结构,总体显示为弱极性。因此大孔树脂DA-201更易在极性溶剂中吸附大果紫檀心材色素。段宙位等[14]研究表明:黄酮类化合物与大孔树脂之间以范德华力相结合,易被强极性的乙醇破环作用力。与本实验结果一致,故选择乙醇为洗脱剂。比较10种大孔树脂的吸附率和解吸率,DA-201的吸附性能优于其他型号大孔树脂,故选用DA-201进行吸附实验。

      表 4  10种大孔吸附树脂对大果紫檀色素原液的静态吸附结果

      Table 4.  Static adsorption of pigment stock solution in Pterocarpus macrocarpus by ten types of macroporous resins

      型号
      Model No.
      吸附量
      Adsorption
      quantity/(g·L−1
      吸附率
      Adsorption
      rate/%
      解吸量
      Desorption
      quantity/(g·L−1
      解吸率
      Desorption
      rate/%
      ADS-17 8.80 70.07 5.77 65.52
      D101 8.04 64.05 5.65 70.26
      D3520 8.64 68.84 5.79 67.01
      HPD100 8.92 71.04 5.93 66.50
      X-5 7.90 62.90 4.90 62.00
      AB-8 7.86 62.54 5.15 65.56
      DA-201 10.07 80.19 7.06 70.07
      HPD722 7.56 60.17 5.55 73.47
      HC-200 8.36 66.56 5.34 63.85
      HPD400 8.04 64.02 5.44 67.61
    • 大果紫檀色素原液pH值对大孔树脂的吸附和解吸效果有较大的影响。通过调节pH值可以提高色素的纯化效果。pH值为4.0时,大孔树脂DA-201吸附率达到最大值84.05%(图3)。其原因是大果紫檀中黄酮类化合物的酚羟基在酸性条件下能够稳定存在溶液中,能够形成范德华力吸附到大孔树脂中。碱性时,溶液中含有的氢氧根离子较多,使得黄酮类化合物开始部分解离,从而吸附率下降。因此大果紫檀色素溶液pH值确定为4。

      图  3  色素原液pH值对DA-201树脂吸附效果的影响

      Figure 3.  Effects of pH on the absorption rate of DA-201 macroporous resin

    • 在大果紫檀色素解吸过程中,吸附于大孔树脂上的色素应选取较强解吸力且易洗脱的溶剂。前期对不同极性的溶剂比较中表明乙醇的色素解吸量较大,故选择乙醇作为洗脱剂。大孔树脂充分吸附后,分别选用体积分数为20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液进行洗脱,计算解吸率。从图4可以看出:随着乙醇体积分数的增加,心材色素的解吸率逐渐提高,当乙醇的体积分数为100%时,解吸率达到最大值为71.05%。极性较大的乙醇能将大果紫檀色素洗脱下来,其中100%乙醇的解吸率最高,更易将色素解吸下来。因此,选用100%乙醇溶液对树脂进行解吸。

      图  4  乙醇体积分数对DA-201树脂解吸率的影

      Figure 4.  Effects of ethanol concentration on the desorption rate of DA-201 macroporous resin

    • 图5可观察到:大果紫檀心材色素上样液的动态吸附流速为3.0 mL/min时,在25 mL附近处泄漏点已经出现;流速为2.0 mL/min时,泄漏点出现在45 mL附近;流速为1.0 mL/min时,泄漏点出现在60 mL附近。最早和最晚的泄漏点出现时,流速分别为3.0和1.0 mL/min。吸附流速较高时,泄漏点较早出现;吸附流速较低时,泄漏点会一定程度后移。这可能是因为流速较慢时,色素中黄酮类化合物和大孔树脂之间能够形成分子间作用力,吸附效果较好。吸附流速过慢时,虽然树脂的吸附效果比较好,但是吸附时间过长会出现死吸附现象,使得大孔树脂的洗脱率变低,从而影响树脂再生。综合考虑,选定大果紫檀心材色素上样液的吸附流速为2.0 mL/min。

      图  5  吸附流速对DA-201树脂吸附效果的影响

      Figure 5.  Effects of absorption velocity on the absorption of DA-201 macroporous resin

    • 上样液质量浓度对大孔树脂动态吸附有一定的影响,1、2 g/L上样液的泄漏点分别出现在45和65 mL 附近,3 g/L时泄漏点出现在35 mL(图6)。因此,上样液质量浓度增加,泄漏点出现越早。考虑到上样液质量浓度过大时,树脂的吸附饱和点会过早出现,从而影响大孔树脂对色素的有效富集[15]。综合考虑,选择2 g/L上样液进行吸附实验较为适宜。

      图  6  上样液质量浓度对DA-201树脂吸附效果的影响

      Figure 6.  Effects of sample solution concentration on the absorption of DA-201 macroporous resin

    • 按照上述吸附条件,使大孔树脂充分吸附后用100%乙醇进行洗脱,观察解吸效果。从图7可以看出:当洗脱剂流速增加后,峰形逐渐变宽。而洗脱剂流速为1 mL/min时,不但吸收峰值最高并且峰宽较小,大果紫檀色素洗脱过程中能集中接收,减少洗脱剂的使用量,便于后期色素的再精制纯化。因此洗脱剂流速确定为1 mL/min。

      图  7  洗脱剂流速对DA-201树脂吸附效果的影响

      Figure 7.  Effects of elution velocity on the absorption of DA-201 macroporous resin

    • 从理论上说,洗脱剂的用量越大,色素洗脱的效果就会越好,但是洗脱剂用量过大,就会造成浪费并且回收困难。因此洗脱剂用量也是考察解吸效果的指标之一。洗脱剂用量的效果可见图8,吸光度值在20 mL 时开始增加,100 mL 后变化值较小,色素在20 ~ 100 mL 之间被集中洗脱出来。故洗脱剂乙醇的最适宜用量为100 mL。

      图  8  洗脱剂用量对DA-201树脂解吸效果的影响

      Figure 8.  Effects of volume of eluent on the absorption of DA-201 macroporous resin

    • 采用超高效液相色谱串联四极杆−静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术对大果紫檀心材色素成分分析(图9),从中分离鉴定出10种黄酮类和醇类化合物,分别为荭草苷、牡荆素、金雀异黄素、白藜芦醇、白杨素、黄豆黄素、异甘草素、诺卡酮、芒柄花黄素和酮洛芬。根据各组分的保留时间与质谱信息,通过与mzcloud比对二级质谱信息(图10),结合文献比照,推测各化合物可能的裂解途径(表5)。

      表 5  大果紫檀心材色素中化学成分离子结构信息

      Table 5.  Characterization of chemical constituents in pigment from Pterocarpus macrocarpus heartwood

      序号
      No.
      保留时间
      Retention
      time/min
      分子式
      Formula
      实测分子量
      Experimental
      molecular mass
      理论分子量
      Theoretical
      molecular mass
      二级离子分子量
      Product ion
      molecular mass
      化学成分
      Component
      文献来源
      Reference
      1 4.714 C21H20O11 449.100 [M+H]+449.100 431.097
      353.065 60.081
      荭草苷
      Orientin
      Zhou et al.[16]
      2 5.071 C21H20O10 433.105 [M+H]+433.105 415.103
      367.082 283.060
      牡荆素
      Vitexin
      Pereira et al.[17]
      3 6.065 C15H10O5 271.060 [M+H]+271.052 253.162
      119.086
      金雀异黄素
      Genistein
      Angeloni et al.[18]
      4 6.387 C14H12O3 229.070 [M+H]+229.078 145.065
      119.049
      白藜芦醇
      Resveratrol
      Vlase et al.[19]
      5 6.514 C15H10O4 255.065 [M+H]+255.057 177.128
      159.083
      白杨黄素
      Chrysin
      李伟等[20]
      Li W et al.[20]
      6 6.825 C16H12O5 285.068 [M+H]+285.068 253.050
      137.023
      黄豆黄素
      Glycitein
      Wu et al.[21]
      7 7.770 C15H12O4 257.081 [M+H]+257.073 147.044
      137.023
      异甘草素
      Isoliquiritigenin
      Xie et al.[22]
      马若克[23]
      Ma R K[23]
      8 7.807 C15H22O 219.174 [M+H]+219.167 204.151
      163.112 135.117
      诺卡酮
      Nootkatone
      Xie et al.[24]
      9 7.864 C16H12O4 269.080 [M+H]+268.073 254.058
      237.054
      芒柄花黄素
      Taxifolin
      Wu et al.[25]
      10 9.947 C14H12O3 255.102 [M+H]+255.094 240.078
      105.070
      酮洛芬
      Ketoprofen
      李前荣等[26]
      Li Q R et al.[26]

      图  9  大果紫檀心材色素基峰图

      Figure 9.  Positive base peak chart of the pigment of Pterocarpus macrocarpus

      图  10  大果紫檀心材色素成分二级质谱图

      Figure 10.  Secondary mass spectrogram of components in the pigment of Pterocarpus macrocarpus

      化合物1的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 449.100)依次脱去两分子H2O得到主要碎片离子C21H19O10m/z 431.097),再经过i裂解形成了碎片离子C19H13O7m/z 353.065)和C2H4O2m/z 60.081),结合文献报道[16],化合物1被鉴定为荭草苷。

      化合物2的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 433.105)脱去一分子H2O得到主要碎片离子C21H19O9m/z 415.103),再脱去一分子H2O生成碎片离子C21H17O8m/z 397.092),脱去一分子CH2O裂解成主要碎片离子C20H15O7m/z 367.082)。该碎片离子脱去一分子C4H4O2裂解成碎片离子C16H11O5m/z 283.060),结合文献报道[17], 化合物2被鉴定为杜荆素。

      化合物3的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 271.060)脱去一分子H2O得到主要碎片离子C15H9O4m/z 253.162),再经过RetroDiels-Alder(RDA)裂解获得碎片离子C8H7O1m/z 119.086),结合文献报道[18], 化合物3被鉴定为金雀异黄素。

      化合物4的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 229.070)发生键断裂失去一分子C4H4O2产生碎片离子C10H9O1m/z 145.065),该分子失去一分子C2H3生成碎片离子C8H7O1m/z 119.049),结合文献报道[19], 化合物4被鉴定为白藜芦醇。

      化合物5的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 255.065)发生键断裂失去一分子C6H5产生碎片离子C9H5O4m/z 177.128),再失去一分子H2O产生碎片离子C9H3O3m/z 159.083),结合文献报道[20], 化合物5被鉴定为白杨黄素。

      化合物6的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 285.068)脱去1个CH3O得到碎片离子C15H9O4m/z 253.050),在母核C环上的1位上发生C-C键断裂形成了碎片离子C7H5O3m/z 137.023),结合文献报道[21], 化合物6被鉴定为黄豆黄素。

      化合物7的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 257.081)经过RetroDiels-Alder(RDA)裂解获得碎片离子C9H6O2m/z 147.044)、C7H5O3m/z 137.023),结合文献报道[22-23], 化合物7被鉴定为异甘草素。

      化合物8的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 219.174)脱去1个CH3得到碎片离子C14H20O(m/z 204.151),进一步脱去1分子C3H5得碎片离子C11H15O(m/z 163.112),再脱去1分子CO得碎片离子C10H15m/z 135.117),结合文献报道[24], 化合物8被鉴定为诺卡酮。

      化合物9的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 269.080)依次失去1个CH3得到碎片离子C15H10O4(m/z 254.058),再失去一分子OH为碎片离子C15H9O3m/z 237.054),结合文献报道[25], 化合物9被鉴定为芒柄花黄素。

      化合物10的裂解途径为:该化合物准分子离子[M+H]+m/z 255.102)失去1个CH3得到碎片离子C15H12O3m/z 240.078),该碎片离子经过裂解得到碎片离子C7H5O1m/z 105.070),结合文献报道[26], 化合物10被鉴定为酮洛芬。

    • (1)通过不同溶剂抽提大果紫檀,心材色素易溶于醇类溶剂,其色差值最大为55.15。故选用乙醇作为大果紫檀的提取剂。对心材色素采用波长为190 ~ 1 100 nm的光区扫描,选用486 nm作为测定波长,建立了大果紫檀心材色素质量浓度的标准曲线。

      (2)在静态吸附−解吸过程探究10种大孔树脂对色素的吸附效果,得到DA-201大孔树脂的吸附−解吸值最佳。DA-201吸附量和吸附率分别是10.07 g/L和80.19%,解吸量和解吸率分别是7.06 g/L和70.07%。静态吸附pH为4和洗脱剂乙醇体积浓度100%时为最佳解吸条件。在动态吸附过程中,以色素质量浓度为指标,探究不同因素对树脂纯化的影响。从而确定最佳吸附条件:吸附流速是2.0 mL/min,上样液质量浓度为2 g/L;洗脱最佳条件:洗脱流速为1 mL/min,洗脱剂为100%乙醇100 mL。

      (3)对纯化的大果紫檀心材色素,采用超高效液相色谱串联四极杆−静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术进行成分分析,从中分离鉴定出10种黄酮类和醇类化合物,分别为荭草苷、牡荆素、金雀异黄素、白藜芦醇、白杨素、黄豆黄素、异甘草素、诺卡酮、芒柄花黄素、酮洛芬。

参考文献 (26)

目录

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