植物在生长发育过程中，由于其固着的生活方式，会遭遇不同的生物及非生物胁迫，严重影响了植物的生长发育，造成农林产品减产^[1]。目前，世界范围内农林业植物受到的主要非生物胁迫为盐渍化土壤。盐渍化土壤常常导致植物体内积累大量的盐分，盐分的积累能够改变植物细胞质膜脂质和蛋白组成，进而造成离子的不平衡和高渗胁迫，导致植物不能正常的生长和发育^[2]。因此，挖掘植物抗逆分子机制和开发抗逆新基因是培育农林作物新品种的关键。目前，对于抗逆分子机制的研究已经渗透到各个方面，而长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的研究则是其中的一个重要内容。已有研究表明，lncRNA在植物响应非生物胁迫方面发挥着至关重要的作用。

lncRNA是指长度超过200个核苷酸、无蛋白质编码能力或者有极低蛋白质编码能力的转录本^[3]。其主要由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录生成，广泛存在于动植物细胞中，是构成转录组的重要组成部分^[3-4]。lncRNA的研究相对较晚，且主要集中在动物和人类上，在植物方面的研究则较少。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，对于lncRNA的研究逐步深入，越来越多的研究证明了lncRNA在生物体的正常生命活动中扮演着重要的角色。lncRNA作为一种调控分子，能够从表观遗传学水平、转录水平以及转录后水平上调控基因的表达^[5-7]。

随着转录组测序等分子生物学技术的飞速发展，植物lncRNA的研究正在兴起。近几年，关于植物lncRNA响应非生物胁迫的研究取得了一定的进展，已有研究表明，lncRNA是植物胁迫反应中关键的调控因子之一^[8]。Liu等^[9]对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行干旱、寒冷、高盐或脱落酸等处理后发现，相比于对照，有1 832个lncRNA发生了差异表达，有的lncRNA甚至上调22倍左右，说明lncRNA可能是植物非生物胁迫响应中重要的调节因子。Qin等^[10]在拟南芥中鉴定了一个正向响应干旱和盐胁迫的lncRNA（drought induced RNA，DRIR），DRIR在非胁迫条件下表达水平较低，在干旱、盐胁迫及脱落酸（ABA）处理后表达水平显著上升。在拟南芥中过量表达DRIR提高了转基因植株的抗旱和耐盐能力。Li等^[11]研究发现了响应寒冷和/或干旱胁迫的318个木薯（Manihot esculenta）lncRNA，这些lncRNA通常能与邻近的基因共同表达。Karlik等^[12]发现盐胁迫下，大麦（Hordeum vulgare）lncRNA（AK370814）显著上调表达。上述研究表明，lncRNA在植物响应非生物胁迫过程中起作用。

目前，关于lncRNA的研究主要集中在拟南芥等草本植物中，在木本植物中的研究则鲜有报道。本研究拟对盐生木本植物刚毛柽柳lncRNA的耐盐功能进行研究，旨在通过测定盐胁迫条件下长链非编码RNA（salt induced RNA，SAIR6）的瞬时过表达及对照刚毛柽柳植株的耐盐相关生理生化指标，鉴定ThSAIR6是否具有耐盐功能，为丰富植物lncRNA的研究和深入挖掘木本植物lncRNA响应非生物胁迫的分子机制奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   植物材料

刚毛柽柳（Tamarix hispida）组培苗置于1/2 MS培养基中，放置在人工气候培养室中。培养条件为：温度（22 ± 2） ℃，相对湿度为65% ~ 75%，光照强度400 μmol/（m²·s），光周期16 h光照/8 h黑暗。原始接种组培苗为本实验室保存。

1.2   刚毛柽柳SAIR6长链非编码RNA的克隆

将4周苗龄的刚毛柽柳组培苗转移至含150 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基中，使其处于盐胁迫状态。胁迫0、6和24 h后，收集刚毛柽柳的叶组织。使用通用植物总RNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提取非胁迫（1/2 MS）及盐胁迫下不同时间段的刚毛柽柳叶组织的总RNA，使用反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）合成cDNA第1链，用作后续PCR反应的模板。

根据盐胁迫及非胁迫条件下刚毛柽柳的转录组测序结果，筛选出一条差异表达的lncRNA（lncRNA-224223.1），将其命名为ThSAIR6。根据ThSAIR6的序列设计同源融合引物ThSAIR6-F-infu 和ThSAIR6-R-infu，引物序列见表1，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化回收获得目的片段。

表  1  引物序列

Table  1.  Primer sequences

用途 Application	引物 Primer	引物序列(5′—3′) Primer sequence (5′−3′)
	q-ThSAIR6-F	GCCTGGTTGGTTTATCTG
	q-ThSAIR6-R	TCCCACTACCCTACCTTAT
实时荧光定量PCR Quantitative real-time PCR	Actin-F	AAACAATGGCTGATGCTG
	Actin-R	ACAATACCGTGCTCAATAGG
	β-tubulin-F	GGAAGCCATAGAAAGACC
	β-tubulin-R	CAACAAATGTGGGATGCT
基因克隆 Gene cloning	ThSAIR6-F-infu	GACTCTAGAGGATCCCCGAAAGATGTTGAGGCGGAC
	ThSAIR6-R-infu	GGAAATTCGAGCTCGGTACCCGTATCAGTACGGGTCCAATAC
载体验证 Vector verification	pROKⅡ-F	ATGTGATATCTCCACTGACGT
	pROKⅡ-R	ATCGCAAGACCGGCAACAGGA

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1.3   实时荧光定量PCR

以刚毛柽柳盐胁迫0、6和24 h的cDNA为模板，利用Primer premier 5.0（Premier Biosoft International）软件设计特异性引物q-ThSAIR6-F和q-ThSAIR6-R，引物序列见表1。同时将刚毛柽柳Actin（GenBank登陆号：FJ618517）和β-tubulin（GenBank登录号：FJ618519）作为内参基因，使用TransStart top Green qPCR SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）在Qtower³G（Analytikjena，German）仪器上进行qRT-PCR，用于研究刚毛柽柳SAIR6长链非编码RNA在野生型植株中的表达模式。上述试验设置3个生物学重复。反应体系为10 μL 2 × TransStart Top Green qPCR SuperMix，上下游引物各0.4 μL（20 μmol/L），2 μL模板（100 ng），7.2 μL RNase-free ddH₂O。反应程序为：预变性94 ℃ 30 s，变性94 ℃ 12 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，读板79 ℃ 1 s，45个循环。采用2^−∆∆Ct法对基因的表达进行相对定量分析^[13]。

1.4   刚毛柽柳pROKⅡ-ThSAIR6过表达载体的构建

使用SmaⅠ对pROKⅡ载体进行单酶切胶回收后，通过2 × Assembly Master Mix（Clone Smarter，America）将ThSAIR6基因和线性化的载体进行连接。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆为模板，以pROKⅡ-F和pROKⅡ-R为引物，进行菌液PCR检测。将检测正确的pROKⅡ-ThSAIR6质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞，保存菌种备用。

1.5   ThSAIR6瞬时过表达刚毛柽柳植株的获得及检测

利用改良的农杆菌介导的高效瞬时转化系统，方法参照Ji等^[14]，将pROKⅡ-ThSAIR6-EHA105和pROKⅡ-EHA105分别对4周苗龄的整株刚毛柽柳组培苗进行瞬时侵染，获得ThSAIR6瞬时过表达（OE）及对照（control）刚毛柽柳植株。为了检验ThSAIR6是否在瞬时转化的刚毛柽柳植株中过表达，将上述刚毛柽柳转入1/2 MS胁迫培养基中（含150 mmol/L NaCl）胁迫24 h。提取盐胁迫及正常条件下ThSAIR6瞬时过表达及对照刚毛柽柳植株的总RNA，并反转录为cDNA，进行qRT-PCR分析。为了检验ThSAIR6在瞬时转化的刚毛柽柳植株中持续表达情况，提取正常条件下12、24、48、72及96 h的ThSAIR6瞬时过表达及对照刚毛柽柳植株的总RNA，进行qRT-PCR分析。引物序列、反应体系及程序参见1.3。

1.6   耐盐相关生理生化指标的测定

将ThSAIR6瞬时过表达植株及对照刚毛柽柳植株分别移入含有150 mmol/L NaCl的1/2MS培养基中胁迫处理24 h，收集胁迫处理的瞬时过表达和对照刚毛柽柳植株叶组织。分别测定其电解质渗透率、失水率以及过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，方法参照王关林等^[15]。并进行了生理染色包括氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、二氨基联苯胺（DAB）及伊文思蓝（Evans blue）染色，方法参照Zhang等^[16]、Kim等^[17]，试验分别进行3次重复。

2.   结果与分析

2.1   刚毛柽柳SAIR6长链非编码RNA的克隆及表达载体构建

ThSAIR6长链非编码RNA序列长为759 bp（图1），通过PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示条带特异且大小与预期结果一致（图2B）。以pROKⅡ-F和pROKⅡ-R为引物，进行大肠杆菌菌液PCR检测，电泳检测结果正确（图2C），表明已成功将ThSAIR6基因构建到pROKⅡ载体上，载体构建示意图见图2A。提取检测结果正确的单克隆质粒进行测序，测序结果使用在线工具Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列比对。表明测序结果与ThSAIR6的cDNA序列一致。农杆菌菌液PCR结果用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2D。结果显示，pROKⅡ-ThSAIR6过表达载体已成功转化进入农杆菌中，可用于后续研究。

图  1  长链非编码RNA ThSAIR6序列

Figure  1.  ThSAIR6 sequence of long non-coding RNA

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图  2  ThSAIR6克隆及载体构建PCR检测结果

A. 植物过表达载体pROKⅡ-ThSAIR6构建图谱; B. ThSAIR6克隆结果; C. ThSAIR6 大肠杆菌菌液 PCR 结果，1为 阳性对照, 8为 阴性对照; D. ThSAIR6农杆菌菌液PCR结果; M为 Trans 2k DNA Marker。A, the map of plant overexpression vector pROKⅡ-ThSAIR6; B, the PCR of ThSAIR6; C, identification of recombinant plasmid ThSAIR6 by PCR, in picture C, 1 means positive control, 8 means negative control; D, Agrobacterium suspension containing recombinant plasmid ThSAIR6 by PCR; M, Trans 2k DNA Marker.

Figure  2.  PCR testing results of vector construction and ThSAIR6 cloning

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2.2   盐胁迫下刚毛柽柳SAIR6的表达分析

为了探究盐胁迫下ThSAIR6的表达情况，分别提取胁迫0、6和24 h刚毛柽柳叶组织的总RNA，进行qRT-PCR分析。结果显示，ThSAIR6在盐胁迫6和24 h均呈上调表达，其中胁迫24 h表达量最高（图3）。显著性分析表明，0和6 h ThSAIR6表达量差异不显著，而24 h与0、6 h的表达量差异显著（P < 0.05）。上述结果表明，ThSAIR6长链非编码RNA在刚毛柽柳叶组织中有表达且能响应盐胁迫。

图  3  盐胁迫下刚毛柽柳ThSAIR6的表达模式分析

Figure  3.  Analysis of expression pattern of ThSAIR6 in Tamarix hispida under salt stress

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2.3   盐胁迫下ThSAIR6在瞬时过表达植株中的表达分析

通过qRT-PCR对ThSAIR6过表达及对照刚毛柽柳植株中ThSAIR6的表达水平进行研究，将转化后24 h的对照刚毛柽柳植株SAIR6的表达量记作1，作为基准值来均一化ThSAIR6的表达。结果表明，在非胁迫条件下（1/2 MS培养基），ThSAIR6在瞬时过表达植株中的表达量明显高于对照刚毛柽柳植株（P < 0.05）；在盐胁迫条件下（含150 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基），ThSAIR6在过表达植株中的表达量同样明显高于对照植株（P < 0.05）（图4A）。通过qRT-PCR对ThSAIR6过表达及对照刚毛柽柳植株12、24、48、72及96 h的ThSAIR6表达水平进行研究，结果表明，转化后48 h时，ThSAIR6在瞬时过表达植株中的表达量最高（图4B）。说明ThSAIR6已经成功在瞬时转化的刚毛柽柳植株中过表达，瞬时转化的刚毛柽柳植株可用于后续的功能获得研究。

图  4  盐胁迫下ThSAIR6在瞬时过表达及对照刚毛柽柳植株中的表达情况

*P < 0.05；下同。*P < 0.05; The same below.

Figure  4.  Expression level of ThSAIR6 in transient overexpression (OE) and control of Tamarix hispida under salt stress

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2.4   瞬时过表达ThSAIR6刚毛柽柳植株细胞受损情况及失水率分析

分别取非胁迫及盐胁迫24 h的瞬时过表达ThSAIR6及对照刚毛柽柳植株（3个重复）进行电解质渗透率测定、伊文思蓝染色及失水率测定。电解质渗透率测定结果表明，在非胁迫条件下，过表达及对照植株的电解质渗透率均较低且基本相同，说明过表达ThSAIR6及对照植株的细胞受损程度均较低且基本一致；而盐胁迫条件下，过表达及对照植株的电解质渗透率均较高，但过表达植株的电解质渗透率明显低于对照植株，说明过表达及对照植株的细胞受损程度均较高且存在一定的差异，且过表达植株细胞的受损程度较对照植株低（图5A）。伊文思蓝染色结果表明，在盐胁迫下，过表达植株叶片上的蓝色明显浅于对照植株，说明过表达植株叶片细胞和对照植株叶片细胞的死亡数量存在一定的差异，且过表达植株叶片细胞的死亡数量较少。而非胁迫条件下对照及过表达植株叶片细胞死亡数量均较少且无明显差异（图5B）。上述结果表明，盐胁迫条件下，过表达ThSAIR6能够显著降低植株叶片细胞的死亡数量。

图  5  盐胁迫下对照及瞬时过表达植株电解质渗透率、失水率分析

Figure  5.  Electrolyte leakage and water loss rate analyses of control and overexpressing plants under salt stress

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失水率测定结果表明，0 ~ 1.5 h内对照和瞬时过表达刚毛柽柳植株失水率存在明显的差异，过表达植株的失水率明显低于对照植株。1.5 ~ 2.5 h对照植株的失水率达到100%，而瞬时过表达植株的失水率仍在逐渐增加（图5C）。结果说明，ThSAIR6在刚毛柽柳植株中过表达显著降低了植株的失水率，结合电解质渗透率及伊文思蓝染色结果，进一步显示出刚毛柽柳SAIR6长链非编码RNA对于提高植株抵抗盐胁迫的能力有一定的作用。

2.5   瞬时过表达ThSAIR6刚毛柽柳植株的ROS水平分析

分别取非胁迫及盐胁迫24 h的瞬时过表达ThSAIR6及对照刚毛柽柳植株（3个重复）进行POD活性测定和DAB染色，对瞬时过表达ThSAIR6及对照刚毛柽柳植株进行H₂O₂含量分析。POD测定结果表明，在非胁迫条件下（1/2 MS），对照及过表达植株的POD活性基本一致；在盐胁迫条件下，ThSAIR6过表达植株的POD活性明显高于对照植株（P < 0.05）（图6A）。DAB染色结果表明：在非胁迫条件下，对照及过表达植株叶片均呈现较浅的棕色且没有显著差异，说明对照及过表达植株叶片内H₂O₂的含量均较少且基本相同；在盐胁迫下，过表达植株叶片上的棕色明显浅于对照植株，说明过表达及对照植株叶片内H₂O₂的含量存在一定差异，且过表达植株叶片内H₂O₂的含量明显少于对照植株（图6B）。上述结果说明，盐胁迫下，过表达ThSAIR6能够显著降低刚毛柽柳植株体内的H₂O₂含量。

图  6  盐胁迫下对照及瞬时过表达植株ROS水平及POD、SOD活性分析

Figure  6.  Analysis of ROS accumulation and the activities of POD and SOD in OE and control plants under salt stress

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通过SOD活性测定和NBT染色，对瞬时过表达刚毛柽柳植株及对照植株进行${\rm{O}}_{\rm{2}}^{ {-}{\text{•}}}$含量分析。SOD活性测定结果，在非胁迫条件下，对照及过表达植株的SOD活性基本一致；在盐胁迫条件下，ThSAIR6的过表达植株的SOD活性明显高于对照植株（P < 0.05）（图6C）。NBT染色结果见图6D，在非胁迫条件下，对照及过表达的植株叶片均呈现较浅的蓝色且没有显著差异，说明对照及过表达植株叶片内${\rm{O}}_{\rm{2}}^{ {-}{\text{•}}}$的含量均较少且基本相同；在盐胁迫下，过表达植株叶片上的蓝色明显浅于对照植株，说明过表达及对照植株叶片内的${\rm{O}}_{\rm{2}}^{ {-}{\text{•}}}$含量存在一定的显著差异，且过表达植株叶片内${\rm{O}}_{\rm{2}}^{ {-}{\text{•}}}$的含量明显少于对照植株体内${\rm{O}}_{\rm{2}}^{ {-}{\text{•}}}$的含量。说明盐胁迫条件下，过表达ThSAIR6能够显著降低植株体内${\rm{O}}_{\rm{2}}^{ {-}{\text{•}}}$的含量。

上述结果表明，在刚毛柽柳中过表达ThSAIR6能够显著增强植株的POD及SOD活性，进而增强ROS清除能力，从而提高植株抵抗盐胁迫的能力。说明ThSAIR6在刚毛柽柳抵抗盐胁迫过程中起重要作用。

3.   讨　　论

本研究通过对ThSAIR6长链非编码RNA在盐胁迫下野生型刚毛柽柳中的表达模式分析，初步鉴定出ThSAIR6具有响应盐胁迫的能力。通过构建植物过表达载体（pROKⅡ-ThSAIR6），借助农杆菌介导的高效瞬时转化体系，获得了ThSAIR6瞬时过表达的刚毛柽柳植株，并通过qRT-PCR技术进行验证。在盐胁迫下，探究过表达ThSAIR6对刚毛柽柳植株的耐盐能力的影响。研究结果表明，在瞬时过表达植株中ThSAIR6的表达量较对照植株显著上升，说明瞬时过表达刚毛柽柳可用于后续的功能获得的研究。为了进一步探究刚毛柽柳ThSAIR6是否具有耐盐能力，对ThSAIR6瞬时过表达及对照植株的耐盐生理指标进行了测定。根据电解质渗透率、伊文思蓝染色及失水率的测定结果（图5），判断刚毛柽柳组织细胞的受损程度。ThSAIR6在刚毛柽柳中过表达能显著降低盐胁迫下的电解质渗透率及失水率，减少刚毛柽柳组织细胞受损和死亡，进而增加刚毛柽柳的耐盐性。根据POD、SOD活性测定及DAB、NBT染色结果，判断刚毛柽柳体内的ROS水平（图6）。在盐胁迫下，ThSAIR6过表达植株的POD、SOD活性明显高于对照植株。研究结果表明，盐胁迫下，刚毛柽柳ThSAIR6长链非编码RNA的过表达能显著提高POD和SOD的活性，从而增强刚毛柽柳的ROS清除能力，进而提高了刚毛柽柳植株的耐盐性。

关于植物长链非编码RNA的研究正在逐步深入。毋若楠等^[18]通过构建拟南芥lncRNA-AT5NC056820的过表达载体并稳定转化拟南芥，证明干旱胁迫下，lncRNA-AT5NC056820可提高拟南芥的抗旱性，表明其可能参与调控植物抗旱性的分子机制。Wu等^[19]研究发现lncRNA-BoNR8过表达显著降低了拟南芥种子萌发时期对高盐胁迫的抵抗能力，但对高浓度的ABA不敏感。上述研究表明，lncRNA在植物响应逆境胁迫过程中起重要作用。

Yan等^[20]研究发现，189个转录因子与无芒隐子草（Cleistogenes songorica）中的163个lncRNA相对应。MSTRG.43964.1和MSTRG.4400.2可能分别调控水胁迫及恢复过程中靶基因模拟物miRNA397和miRNA166的表达。Gai等^[21]发现了桑树（Morus multicaulis）的一种lncRNA并将其命名为MuLnc1。证明了MuLnc1与桑树响应逆境胁迫有关，其可能是桑树潜在的遗传改良靶基因。通过建立mul-miR3954-MuLnc1-siRNAs-mRNAs的网络模型，阐明了lncRNA和sRNAs与mRNA之间的相互作用。

在前期研究工作中，通过筛选刚毛柽柳耐盐相关lncRNA-miRNA互作网络构建及功能预测，并通过qRT-PCR分析发现ThNAC1转录因子可能为ThSAIR6调控的靶基因。卢惠君等^[22]研究发现，刚毛柽柳ThNAC24转录因子能响应盐、干旱胁迫，过表达ThNAC24植株通过增强POD、SOD活性，进而提高ROS清除能力，减少细胞受损情况，从而提高刚毛柽柳的耐盐及抗旱能力。He等^[23]研究发现，ThNAC7诱导与胁迫耐受性相关的基因表达，通过增加渗透势和增强ROS清除能力来提高刚毛柽柳对盐和渗透胁迫的耐受性。根据以上研究结果，我们推测ThSAIR6可能通过调节ThNAC1的表达来调控刚毛柽柳的耐盐能力。本研究证明了在刚毛柽柳植株中过表达ThSAIR6长链非编码RNA能够显著提高植株的耐盐性，结合植物长链非编码RNA的研究现状和本研究结果，可以进一步对lncRNA（ThSAIR6）的靶基因及靶基因的抗逆生理学途径进行更为系统深入的研究，为进一步阐明木本植物lncRNA抗逆分子调控机制奠定基础。

4.   结　　论

本研究从盐胁迫刚毛柽柳转录组数据中得到一条差异表达的ThSAIR6长链非编码RNA。ThSAIR6在刚毛柽柳叶组织中表达，且能够响应盐胁迫。ThSAIR6过表达能显著提高盐胁迫下刚毛柽柳植株中POD及SOD酶的活性，从而增强刚毛柽柳的ROS清除能力；同时显著降低盐胁迫下刚毛柽柳植株的电解质渗透率及失水率，从而有效减轻植物组织细胞的受损程度，减少死亡细胞数目。在刚毛柽柳植株中过表达ThSAIR6能显著提高植株的耐盐能力。