Colonization of Trichoderma hamatum and Bacillus subtilis in rhizosphere soil of walnut
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摘要:目的 植物病害生防菌在植物根际土壤中的定殖情况是影响其发挥生防作用的重要因素之一。近年来，由核桃炭疽病菌引起的核桃炭疽病对云南省核桃产业的发展产生了较为严重的危害，已成为该省核桃产业发展的重要制约因素。前期，通过对大理州漾濞县光明村核桃根际土壤生防菌的筛选工作，获得了具有重要生防潜力的钩状木霉YB-4-15和枯草芽孢杆菌yb33。为了推广上述生防菌株，需首先明确上述菌株在核桃根际土中的定殖情况。方法 本研究利用不同浓度钩状木霉孢子悬浮液对无菌的核桃根际土壤进行处理，采用定期测定根际土壤中上述生防菌的定殖量。结果 通过长达一个月的定殖试验，发现钩状木霉在土壤中定殖后的最大量为5 × 104 cfu/g，最小为2 × 104 cfu/g；同时，利用抗利福平枯草芽孢杆菌yb33-Rif在无菌土壤中定殖的最大量为1.08 × 108 cfu/g，最小为7.07 × 106 cfu/g，而在核桃根际土壤中的定殖能力明显低于无菌土，其最大量为7.53 × 106 cfu/g，最小为1.03 × 106 cfu/g。利用上述生防菌钩状木霉YB-4-15孢子和枯草芽孢杆菌yb33菌体浇灌在核桃、桂花、香樟以及石楠等不同根际土壤试验，发现二者在核桃根际土壤中定殖良好。结论 该研究为这两株生防菌的田间应用提供了理论基础。Abstract:Objective The colonization of plant disease biocontrol agents in plant rhizosphere soil is one of the important factors affecting its biocontrol effect. In recent years, walnut anthracnose has caused serious harm to the development of walnut industry in Yunnan Province of southwestern China, and it has posed a serious threat to the development of walnut industry in the growing areas. In the early stage, Trichoderma hamatum YB-4-15 and Bacillus subtilis yb33, which are important biocontrol agents, were obtained indoors by screening biocontrol of anthracnose on walnut in rhizosphere soil of Guangming Village, Yangbi County, Dali City. To better promote the above biocontrol agents, the colonization of the above strains in the rhizosphere of walnuts should be firstly considered.Method Trichoderma spore suspensions of different concentrations were applied to sterilized rhizosphere of walnuts.Result The colonization amount of the two biocontrol agents in rhizosphere soil was regularly measured, and it was found that after one month of mixing the biocontrol agents to the rhizosphere soil, the colonization amount of T. hamatum was 2 × 104 cfu/g at lowest level to 5 × 104 cfu/g at maximum level. At the same time, the rifampicin-resistant B. subtilis yb33-Rif was used to determine the colonization ability in sterilized soil and field soil, the colonization amount of tested bacteria ranged from 7.07 × 106 to 1.08 × 108 cfu/g, significantly lower in field soil than in sterilized soil, ranging from 1.03 × 106 cfu/g at lowest level to 7.53 × 106 cfu/g at maximum level. In addition, the two tested biocontrol agents were mixed in the rhizosphere soils of walnut, osmanthus, camphor and heather, and it was found that the two biocontrol agents were found to grow well in walnut rhizosphere soil.Conclusion The current study lays a solid base for future application of the two biocontrol agents in walnut fields.
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近些年来随着云南省大面积种植核桃（Juglans regia），核桃产业得到了快速发展，为增加人们收入、繁荣地方经济发挥了重要作用[1]。但是，核桃炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）在云南省各地发生越来越严重，已成为制约当地核桃产业发展的重要限制因子，在严重发病年份病株率高达90%，造成落叶现象严重。随着绿色食品理念不断深入人心，促使人们探寻一种对人类和环境无害并具有良好防治效果的新防治策略[2]。作者通过对核桃植株根际土壤微生物的筛选，获得了两株对核桃炭疽病菌具有良好抑菌效果的菌株，即钩状木霉（Trichoderma hamatum）YB-4-15[3]和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）yb33[4]。为了更好地推广上述生防菌株，更好地防治核桃炭疽病菌，从切断核桃炭疽病菌病害循环的某一环入手，这两种生防菌株在核桃根际土壤中能否定殖以及定殖情况如何将是影响它们生防作用的重要因子，为此，本文献开展了这两株生防菌在核桃根际土壤中定殖试验研究。
目前，对于植物病害生防菌的研究更多集中在菌株筛选[5]、鉴定及初期应用试验等方面[2]，而关于生防菌定殖方法的研究主要采用天然抗生素抗性标记、外源基因标记、DNA和RNA探针技术以及免疫学方法等[6-7]。有些学者研究了生防菌在植物（核桃、辣椒、西瓜）根际中的土壤定殖情况[8-10]。其中，DNA探针法具有较高灵敏度，不但可以检测活的微生物细胞，还可以检测死的微生物细胞[6]。应用免疫学方法可以较好地开展对于微生物与植物间互作的研究，以及用于检测土壤微生物定殖能力[7]。有关标记基因的种类主要有选择基因和报告基因[6]。尽管如此，在微生物分子生态学研究中，应用最多的标记基因主要为抗生素标记、生化显色标记基因、生物发光基因等[11]。研究细菌在植株体内的定殖，最常用的是单一抗生素标记法[12-13]。显然，上述不同标记各有优缺点，主要表现在经济性（时间及费用）、灵敏性（灵敏与迟钝）、操作步骤复杂性（简单与复杂）等方面。本研究采用经济、易操作的抗生素标记方法，对上述两株生防菌开展了核桃根际土壤中定殖的研究工作，以期明确二者在土壤中的适应性，为田间推广应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试菌株：生防菌株钩状木霉YB-4-15和枯草芽孢杆菌yb33为西南林业大学植物病理学实验室分离和筛选获得。
供试土壤：试验选取云南省大理州漾濞县光明村核桃树根际土壤和西南林业大学老校区校园（位于云南省昆明市盘龙区300号）内桂花（Osmamthus fragrans）、香樟（Cinnamomum camphora）、石楠（Photinia serratifolia）等植物的根际土壤作为对比研究对象。在各样地分别选取3个样点进行土壤样品采集，将在同一个样地多点采集的土壤混合、过筛。去除表层土，取深度为5 ~ 20 cm的根际土样，装袋做好标记，带回实验室自然晾干，于4 ℃冰箱保存备用。
供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和肉汤蛋白胨固体培养基（NA）、生防菌固体培养基（NYDA）及生防菌液体培养基（NYD）[14]。
1.2 钩状木霉在核桃根际土壤中的定殖力测定
将核桃根际土壤风干后经高温灭菌作为后续试验的无菌土。每份取200 g无菌土放入一次性育苗袋（直径9.5 cm × 高15 cm）中，然后向土壤中浇灌钩状木霉的孢子悬浮液20 mL（孢子数量：3.3 × 104个/μL），搅拌均匀，设置3次重复，置于室温条件下，此后每隔6 d进行定期取样。对于所取土样，采用土壤稀释法涂布平板（PDA培养基，稀释倍数为104），在光照培养箱中28 ℃恒温培养5 ~ 7 d后，记录不同培养基上的菌落数量。同样，选择未经灭菌的核桃根际土壤样品，每份取200 g样土放于一次性育苗袋中，其他步骤同上。
1.3 钩状木霉抗生素适宜含量的确定
首先，采用血球计数板法配制不同孢子含量的钩状木霉孢子悬浮液，取其100 μL均匀涂布到含有不同质量浓度（50、100、150、200、250、300 μg/mL）潮霉素B的PDA平板（9 cm）上，以不含潮霉素B的PDA平板作为对照，在28 ℃光照培养箱中培养4 d，确定钩状木霉对于抗生素耐受最高质量浓度。试验重复3次。
1.4 枯草芽孢杆菌yb33抗性标记菌株获取
将枯草芽孢杆菌yb33在NA培养基上划线活化，将单菌落转接至含有0.5 μg/mL质量浓度利福平的NYDA平板上30 ℃过夜培养，再用灭菌牙签挑单菌落接入含有0.5 μg/mL质量浓度利福平的5 mL的NYD液体培养基试管中，在温度30 ℃、转速150 r/min的黑暗条件下振荡培养过夜。其后，按照含0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、300 μg/mL不同质量浓度利福平的NYDA培养基中采取逐级提高质量浓度的方法诱导培养，获得用于后续抗利福平的标记菌株yb33-Rif。同时，将yb33-Rif菌株分别在不含利福平的NYD培养基和NYDA平板上交替培养2代，再回接到含利福平300 μg/mL的NYD培养基中进行检测，以证实菌株抗性的遗传稳定性[12]。
1.5 菌株yb33-Rif菌悬液制备及在土壤中定殖动态研究
将抗利福平标记菌株yb33-Rif接种在不含利福平的NYD培养基中，在温度30 ℃、转速150 r/min的黑暗条件下振荡培养48 h。采用血球计数板法测定细菌含量。向200 g无菌土中浇灌20 mL抗利福平标记菌株yb33-Rif搅拌均匀，设3次重复。置于室温条件下。此后，每周定期取样，采用土壤稀释法涂布在含利福平300 μg/mL的NYDA培养基上，在28 ℃的光照培养箱中恒温培养2 ~ 4 d后，记录不同培养基上的菌落数。同样，选择核桃根际土壤样土（未灭菌），每份取200 g样土放于一次性育苗袋中，其他步骤同上。
1.6 钩状木霉和菌株yb33-Rif在不同土壤中的定殖能力测定
取风干后并经高温灭菌的核桃、香樟、桂花、石楠的根际土壤，每份土取100 g于大塑料杯中，用20 mL孢子含量7.6 × 106个/μL的钩状木霉孢子悬浮液浇灌4种土壤并搅拌均匀。同样，选取上述4种植物根际土壤（未灭菌），每份土壤取200 g于大塑料杯中，用40 mL孢子含量为3 × 107个/μL的yb33-Rif菌悬液浇灌4种土壤并搅拌均匀。此后于第1、3、7天分别进行取样，测定定殖菌落数，统计方法同上。
1.7 数据分析
采用SPSS 25.0统计软件对获得的无菌土与样土之间的菌量数据进行独立性t检验，同时，以核桃根际土壤中菌量数据为对照，对比不同时间香樟、桂花、石楠根际土壤中菌量数据进行独立性t检验，明确上述不同处理之间的方差显著性。
2. 结果与分析
2.1 钩状木霉耐抗生素适宜含量的确定
采用血球计数板法计数配制孢子含量为3.3 × 104个/μL的钩状木霉孢子悬浮液。将100 μL孢子悬浮液均匀涂布到PDA平板以及含不同质量浓度潮霉素B的PDA平板上，在28 ℃光照培养箱中培养4 d，结果显示，在无潮霉素B的平板上长出木霉菌落，在含有50、100、150、200、250、300 μg/mL等不同处理质量浓度的含潮霉素B的平板上均未见分生孢子萌发和菌落形成。
2.2 钩状木霉在核桃根际土壤中的定殖情况
将钩状木霉孢子悬浮液浇灌到经灭菌的核桃根际土壤中进行定殖能力的测定，在定殖初期出现了较快的增长，从初始菌量2.67 × 104 cfu/g（6 d）增加到3.00 × 104 cfu/g（12 d），在18 d时回落到2.00 × 104 cfu/g含量，之后其含量一直处于不断增长的状态（图1）。该试验结果表明，钩状木霉可以较好地在不含有其他微生物的核桃根际土壤中成功定殖，具有较好的环境适应能力，并不断繁殖增长。同样，就核桃根际土壤（未经灭菌）而言，由于该菌受到核桃根际土壤微生物的影响，其在不同时间取样分析的土壤中的定殖菌落数量均低于无菌土。该菌定殖数量最小的时间出现在6 d，测定的木霉菌数量为0.67 × 104 cfu/g，定殖数量最大时间点出现在24 d，其木霉菌数量为3.33 × 104 cfu/g（图1）。统计结果发现，在6、12、18、24、30 d上述不同处理间莱文（Levene）方差等同性检验显著性数值分别为0.279、0.692、0.692、0.205、0.561，与显著水平0.05相比，两组数据的方差无显著差异，可以认为两个独立样本的方差一致，在满足方差齐性的条件下，进一步分析发现上述不同处理时间均值显著性数值（假定等方差）分别为0.219、0.279、0.643、0.643、0.003，上述结果表明自钩状木霉孢子浇灌到无菌土及样土等不同土壤中，前24 d不同处理之间菌量并不存在显著性差异，而在30 d无菌土和样土之间菌量存在着显著性差异。试验结果表明，钩状木霉菌在无菌土壤中具有较好的环境适应能力，而且呈现出随时间的增加菌体繁殖不断增加的趋势。在未经灭菌的核桃根际土壤中，钩状木霉在接种初期（6 d）由于受到土壤中微生物的影响，其菌体繁殖数量有所下降，但在适应环境后呈现出菌体繁殖数量不断增加的趋势，表现出较好的定殖能力。
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图 1 钩状木霉YB-4-15在核桃根际土壤（样土）及无菌土中的定殖情况不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。Different lowercase letters mean significant differences (P < 0.05).Figure 1. Colonization of Trichoderma hamatum YB-4-15 in rhizosphere soil (sample soil) and aseptic soil of walnut2.3 枯草芽孢杆菌抗利福平菌株筛选
试验结果表明，枯草芽孢杆菌yb33悬液在含有4、16、128、256、300 μg/mL等不同质量浓度利福平的NYDA平板上，均能生长（图2）。
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图 2 枯草芽孢杆菌在含不同浓度利福平的NYDA平板生长情况A. 不含利福平的NYDA平板；B ~ F. 分别为含4、16、128、256、300 μg/mL利福平的NYDA平板。A, NYDA plate without rifampicin; B−F, NYDA plate containing 4, 16, 128, 256, 300 μg/mL of rifampicin.Figure 2. Growth of Bacillus subtilis yb33 on NYDA medium containing various mass concentrations of rifampicin抗性菌株yb33-Rif在未经灭菌土、灭菌土中定殖试验研究结果表明，在无菌土中定殖菌体数量最多时为1.08 × 108 cfu/g（18 d），最少时为7.07 × 106 cfu/g（24 d）。而在未经灭菌的土壤中，菌株yb33-Rif定殖菌体数量最多时为7.53 × 106 cfu/g（6 d），最少时为1.03 × 106 cfu/g（24 d）（图3）。统计结果发现，在6、12、18、24、30 d上述不同处理间Levene方差等同性检验显著性数值分别为0.034、0.018、0.017、0.021、0.021，显然小于显著水平0.05，两组数据的方差具有较为显著差异，不同处理时间均值显著性数值（假定等方差）分别为0.341、0.362、0.273、0.283、0.218，上述结果表明自枯草芽孢杆菌浇灌到无菌土及样土等不同土壤中，不同处理之间菌量存在着显著性差异。结果表明，菌株yb33-Rif在无菌土中定殖菌体数量表现出先升高再降低并趋于稳定的趋势，而在未经灭菌的自然土壤中菌体定殖数量呈现出随时间推移而降低的趋势，在18 d后在土壤中的含菌量出现波动，与在无菌土壤中木霉菌数量相比，其在土壤中的定殖能力较弱。
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图 3 枯草芽孢杆菌利福平抗性菌株yb33-Rif在不同土壤中定殖情况A. 无菌土；B. 自然土；C. 菌量随时间变化情况。A, sterile soil; B, natural soil; C, changes of number of colony with time.Figure 3. Colonization of rifampicin-resistant strain Bacillus subtilis yb33-Rif in different soils2.4 钩状木霉与枯草芽孢杆菌在其他植物根际土壤中的定殖能力
将钩状木霉和yb33-Rif菌悬液浇灌在核桃、桂花、香樟及石楠根际土中，菌体数量在1 d（初期）均未出现明显的变化情况；但在3 d（中期）后核桃根际土中定殖的菌体数量均高于其他植物（图4）。统计结果发现，就钩状木霉菌悬液浇灌而言，以核桃作为对照，在第1 天桂花、香樟以及石楠等不同处理间Levene方差等同性检验显著性数值分别为0.116、0.492、0.492，第3天分别为0.219、0.422、0.670，第7天分别为0.047、0.275、0.145，仅有桂花与核桃之间在第7 天存在显著差异，其他两组数据的方差不具有显著差异。此外，就枯草芽孢杆菌浇灌而言，以核桃作为对照，在第1 天桂花、香樟以及石楠等不同处理间Levene方差等同性检验显著性数值分别为0.626、0.150、0.061，第3 天分别为0.862、0.583、0.133，第7 天分别为0.904、0.220、0.155，显然上述值均大于显著水平0.05，两组数据的方差不具有显著差异。因此，尽管两个供试菌株在桂花、香樟以及石楠等植物根际土壤中的定殖菌体数量在一定程度上低于核桃根际土壤，但上述菌株依然表现出较好的定殖能力。
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图 4 生防菌混合施用后在不同植物根际土壤中菌体数量随时间变化情况A. 钩状木霉YB-4-15；B. 枯草芽孢杆菌yb33-Rif。A, Trichoderma hamatum YB-4-15；B, Bacillus subtilis yb33-Rif.Figure 4. Changes in the amount of Trichoderma hamatum YB-4-15 and Bacillus subtilis yb33-Rif in different soils with time3. 结论与讨论
本研究通过对钩状木霉YB-4-15和枯草芽孢杆菌yb33在核桃根际土壤中的定殖能力测定，明确了这两个菌株在无菌土和样土中均具有较好的定殖能力。在长达一个月的定殖时间中，前者定殖最大量为5 × 104 cfu/g，最小为2 × 104 cfu/g；后者定殖最大量为1.08 × 108 cfu/g，最小为1.03 × 106 cfu/g。同时，选择香樟、石楠以及桂花等不同植物根际土壤开展上述菌株的定殖能力分析，结果表明上述菌株具有较好的定殖能力。
研究中发现，钩状木霉YB-4-15在施用30 d后出现菌落数量下降的趋势，可能与钩状木霉施入土壤后需要适应新的环境有关。同时，根据无菌土的试验结果钩状木霉出现短暂的菌落数量下降后，经过6 d时间，会产生进一步的增长态势，表明木霉菌已适应土壤环境。
土壤微生物是维持土壤生态及其质量的重要组成部分，其多样性水平能敏感地反映出土壤健康水平[15-17]。有较多研究发现，在人为控制条件下，应用生防菌往往可以取得较好的生防效果[18-19]。然而，在自然条件下，由于土壤中存在着大量各种微生物，特别是来自于土著微生物的竞争或其他环境因子的影响，外部添加生防菌的生长往往受到抑制，致使许多在室内试验中表现较好的生防菌，在田间试验却表现不理想等诸多问题[2]。生防菌作为外源微生物，将其大量引入土壤，最大的潜在影响则是生防菌对土壤小生境原有微生物的取代作用，从而使土壤原有稳定的生态平衡被打破，甚至产生系统多样性和功能等下降[20]。同时，钩状木霉YB-4-15和枯草芽孢杆菌yb33在核桃根际土壤中定殖后，尚缺乏对核桃炭疽病菌生长发育的抑制测定工作，尚不清楚该定殖情况是否满足未来生物防治炭疽病菌的需要，均有待进一步开展研究。本研究所选用的两株生防菌来自于核桃种植区域核桃根际土壤，因此，二者对当地核桃根际土壤具有较好的适应性，可通过驯化试验提高其生防效果。由于在室内生防菌的定殖环境与田间实际土壤、气候等环境条件均存在着一定的差异，上述菌株在田间的实际定殖能力有待于今后进一步明确。
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图 1 钩状木霉YB-4-15在核桃根际土壤（样土）及无菌土中的定殖情况
不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。Different lowercase letters mean significant differences (P < 0.05).
Figure 1. Colonization of Trichoderma hamatum YB-4-15 in rhizosphere soil (sample soil) and aseptic soil of walnut
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图 2 枯草芽孢杆菌在含不同浓度利福平的NYDA平板生长情况
A. 不含利福平的NYDA平板；B ~ F. 分别为含4、16、128、256、300 μg/mL利福平的NYDA平板。A, NYDA plate without rifampicin; B−F, NYDA plate containing 4, 16, 128, 256, 300 μg/mL of rifampicin.
Figure 2. Growth of Bacillus subtilis yb33 on NYDA medium containing various mass concentrations of rifampicin
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图 3 枯草芽孢杆菌利福平抗性菌株yb33-Rif在不同土壤中定殖情况
A. 无菌土；B. 自然土；C. 菌量随时间变化情况。A, sterile soil; B, natural soil; C, changes of number of colony with time.
Figure 3. Colonization of rifampicin-resistant strain Bacillus subtilis yb33-Rif in different soils
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