Expression patterns and salt tolerance analysis of BpPAT1 gene in Betula platyphylla
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摘要:目的 GRAS家族是植物特有的具有高度保守羧基末端的转录因子家族，已有研究表明GRAS转录因子是植物胁迫反应中关键的转录调节因子之一。本研究拟对白桦中GRAS转录因子基因BpPAT1基因是否具有耐盐能力进行分析，为阐明白桦GRAS转录因子响应盐胁迫的分子调控机制奠定基础，进一步丰富木本植物GRAS转录因子响应逆境胁迫分子机制的研究。方法 从盐胁迫白桦转录组数据中筛选并获得了1条GRAS转录因子基因，将其命名为BpPAT1。利用蛋白多序列比对及系统进化树来分析BpPAT1与其他GRAS家族蛋白的亲缘关系。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析盐胁迫及非胁迫条件下白桦根、茎和叶组织中BpPAT1的表达模式，初步鉴定其是否响应盐胁迫。为了进一步分析BpPAT1的抗逆功能，构建其植物过表达载体（pROKII-BpPAT1）与抑制表达载体（pFGC5941-BpPAT1），利用农杆菌介导的高效瞬时遗传转化体系，获得BpPAT1基因瞬时过表达、抑制表达及对照白桦植株。在盐胁迫下分别对BpPAT1瞬时表达及对照植株的耐盐相关生理指标进行测定，鉴定BpPAT1是否能调控白桦的耐盐能力。结果 多序列比对及系统进化树分析结果表明BpPAT1蛋白具有GRAS家族的序列特征，且与拟南芥中AtPAT1蛋白的亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明：在盐胁迫6 h后，BpPAT1在白桦植株中的表达量显著上升（P < 0.05），说明该基因能响应盐胁迫。抗逆生理指标的测定结果表明：在白桦中过表达BpPAT1能够使过氧化物酶（POD）及超氧化物歧化酶（SOD）活性显著增强（P < 0.05），同时增加了白桦组织中的脯氨酸含量，降低了电解质渗透率及丙二醛含量。结论 白桦BpPAT1基因能响应盐胁迫，过表达BpPAT1显著增加了白桦POD、SOD酶活性和脯氨酸含量，降低了电解质渗透率及丙二醛含量，进而提高了ROS清除能力，有效增强了白桦的耐盐能力。Abstract:Objective GRAS family is a plant-specific transcription factor family, characterized by a highly conserved carboxyl terminus domain. Previous studies have shown that GRAS transcription factor is one of the key transcriptional regulators in plant stress response. The purpose of this study is to analyze the salt tolerance of GRAS transcription factor gene BpPAT1 gene in Betula platyphylla, so as to lay a foundation for elucidating the molecular regulation mechanism of GRAS transcription factor in response to salt stress. Our work enriched the research on the molecular mechanism of the GRAS transcription factors of woody plant in response to stress.Method In this study, one GRAS transcription factor gene was screened from the transcriptome data of B. platyphylla under salt stress and named as BpPAT1. Multiple sequence alignment and phylogenetic tree were used to analyze the genetic relationship between BpPAT1 and other organism’s GRAS family genes. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) method was used to analyze the expression pattern of BpPAT1
in root, stem and leaf tissues of B. platyphylla under salt stress and normal condition, to identify whether it responded to salt stress or not. In order to further analyze the stress tolerance function of BpPAT1, plant overexpression vector (pROKII-BpPAT1) and inhibitory expression vector (pFGC5941-BpPAT1) were constructed. Transient overexpression and inhibitory expression of BpPAT1 gene and control B. platyphylla plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transient genetic transformation system. The physiological indexes related to salt tolerance were measured to identify whether the BpPAT1 was associated with salt tolerance in transient expression of BpPAT1 and control plants under salt stress. Result The results of multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that BpPAT1 protein had the sequence characteristics of GRAS family and was closely related to AtPAT1 protein in A. thaliana. The result level of qRT-PCR showed that the expression of BpPAT increased significantly in B. platyphylla plants after 6 hours of salt stress, indicating that BpPAT1could respond to salt stress signal. The measurement results of the physiological indexes of stress resistance showed that the overexpression of BpPAT1 in B. platyphylla could significantly increase the activity of peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD), increased the content of proline, and decreased electrolyte leakage and malondialdehyde (MDA) content. Conclusion The BpPAT1gene can respond to salt stress, overexpression of BpPAT1 significantly enhances POD, SOD enzyme activities and proline content, decreases electrolyte leakage and MDA content under salt stress, thus improves ROS scavenging ability and salt tolerance of B. platyphylla. -
Keywords:
- Betula platyphylla /
- GRAS transcription factor /
- BpPAT1 /
- gene expression /
- salt stress response
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黄土高原作为水资源短缺的典型区域，因地形破碎，黄土大面积覆盖，气候干燥，降雨分布不均，加之历史上毁林开荒等不合理的土地利用，导致水土流失严重[1]。1978年始，黄土高原逐步实行三北防护林、退耕还林还草等林业生态工程，对控制和减少水土流失起到了积极作用，但大规模植被建设和土地利用变化对生态水文造成了复杂影响。基于景观生态学等理念方法，探究植被格局变化下的流域水文过程逐渐成为广受关注的热点研究方向。大量研究表明，景观格局通过影响物质、能量循环进而对流域生态过程产生作用，量化景观的组成结构和空间配置特征，并探寻其与土壤侵蚀、径流形成等关键生态过程间的定量关系，对揭示生态脆弱区的形成演变机制和提出有效的保护对策等有重要意义[2−3]。
基流是径流的重要组成部分，是开展水资源评价的重要内容，也是维持流域生态健康的重要指标与保障[4]。为促进流域生态环境良性发展，进行的流域水资源开发利用、优化植被空间配置，必须以保证生态基流为前提[5]。然而，基流变化受流域气候、地质、自然地理和地表覆盖等条件和人类活动的综合影响[6]。
刘济等[7]研究了红壤丘陵区景观格局对水文过程的影响，发现径流总量和基流均受景观格局变化的显著影响。有学者研究发现[8]在Guadalentin河流域的各类土地利用面积大小与流域水文过程密切相关。Liu 等[9] 通过对比不同土地利用小流域，发现洪峰流量、洪水指数与景观破碎度呈正相关关系。雷泽鑫等[10]在探究黄土丘陵沟壑区三川河流域径流减少原因的过程中发现，景观格局变化的贡献率达到60%，其中林地减少与城市化为主要原因。还有研究[11]在综合分析土地利用方式、地形、土壤和景观格局指数关系基础上，建立了流域径流与景观格局指数间的关系。国内外目前关于径流对景观格局变化的响应已多有研究，但仍存在不少争议。有学者认为，高度碎片化景观格局通常会增加径流，而面积较大、聚集程度较高的景观格局则会减少径流[12−13]。但在某些区域，随着流域景观多样性、破碎度、形状复杂程度的提高，优势景观连通性下降，进而导致年径流总量减少、基流增加[6,14]。这些不同的认识，可能是由于研究尺度、地形地貌、植被覆盖等原因所致，因此十分必要在更多不同区域进行研究，以期获得更为统一、全面的结果。
晋西黄土区水土流失和景观破碎化严重[15]。现有研究主要集中在流域径流变化趋势和地表植被覆盖特征对径流的影响上，流域景观格局变化对径流总量与组分的影响研究还较少见。因此，选取该区典型流域，开展径流总量与基流对景观格局变化的响应研究，以期对黄土高原生态治理、水资源管理等提供理论参考和决策依据。
1. 研究区概况
选取山西吉县森林生态系统国家野外科学观测研究站内蔡家川小流域（110°39′45″ ~ 110°47′45″E，36°14′24″ ~ 36°18′23″N）作为研究区域（图1）。流域位于吕梁山南端，地表为沉积黄土覆盖，下层为第三纪红土，土层深厚。流域内土壤主要为褐土，呈微碱性，质地均匀，易形成水土流失。流域面积34.23 km2，海拔为898 ~ 1574 m，多年平均降水量575.9 mm，降雨时间主要集中于7—9月，年平均气温为10 ℃。流域主要乔木为刺槐（Robinia pseudoacacia）、油松（Pinus tabuliformis）、山杨（Populus davidiana）、辽东栎（Quercus wutaishanica）、侧柏（Platycladus orientalis）；灌木主要为胡枝子（Lespedeza bicolor）、黄刺玫（Rosa xanthina）；草本植物主要为白羊草（Bothriochloa ischaemum）、艾嵩（Artemisia argyi）；农作物为玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）；经济作物主要为苹果（Malus pumila）。
2. 研究方法
2.1 流域径流监测和基流分割
研究区蔡家川小流域主沟道（2号小流域）及其内部4个子流域内降雨集中在夏秋两季，在枯水季（11—次年4月）地表径流很小，经常发生断流现象。所以本试验选择雨季（5—10月）径流作为研究数据来近似反映全年地表水资源总量。5个小流域均配备自计水位计进行径流监测，每5 min测定一次水位，并定期进行水位校正。利用观测到的水位值和已标定的水位流量关系曲线，根据流速面积法计算流量及场降雨的流域径流数据，主沟道径流数据同样为实际观测数据。
径流组分的划分源于基流分割，即对流量过程线的分割[16]，是对径流总量中基流占比的量化。由于无法通过科学试验直接得到基流，因此基流分割的思路一般是在径流分割过程中，剔除地表径流部分，从而将剩余部分视为基流[17]。1990 年Nathan首次将数字滤波法引入水文研究，对基流进行分割，经过众多研究者改进，该方法逐渐趋于成熟，成为国际上应用最广的方法之一[18]。数字滤波法针对数字的低频信号和高频信号进行区分，以此为基础实现基流分割。本试验对径流组分的划分采用Chapman-Maxwell数字滤波法[18]。
Qbt=f1Qb(t−1)2−f1+(1−f1)Qt2−f1 (1) 式中：Qbt为t时段内流域基流深，Qt为实测t时段内流域总径流深，f1为退水常数，一般选取0.95。滤波次数根据流域历史径流资料决定，进行2次滤波。
根据径流总量、基流量计算基流指数（baseflow index，BFI）（式2），BFI代表流域基流量对同时间内径流总量的贡献情况[19]，以此评价不同流域的基流状况。
BFI=QbQ (2) 式中：Qb为流域基流深，Q为实测流域总径流深。
2.2 流域景观组成与景观格局解析
研究区高空间分辨率遥感影像采用Quick Bird数据（Quick Bird影像为空间分辨率2 m的多光谱波段，其中包括蓝色波段 （450 ~ 520 nm）、绿色波段 （520 ~ 600 nm） 、红色波段 （630 ~ 690 nm） 3个波段），采集时间为2019年。通过对影像进行辐射定标和大气校正等预处理，基于我国土地利用分类标准，将研究区土地利用分为农地（旱地）、果园、草地、灌木林地、乔木林地，以及其他（建设用地、裸地、水体、阴影），并开展野外调查对解译成果进行验证和修正。结合遥感解译结果和研究区历史资料查阅，统计获得5个二级小流域地形特征和土地利用方式面积占比（表1）。
表 1 流域基本特征和土地利用方式Table 1. Selected topographical characteristics and land use types in the studied catchment流域编号
No. of watershed面积/hm2
Area/ha高程
Elevation/m坡度
Slope/(°)形状系数
Shape factor各土地利用类型面积占比
Area percentage of each land use type/%农地（旱地）
Farmland (dry land)果园
Orchard灌木林地
Shrubland草地
Grassland乔木林地
Arbor forest land其他
Others1 0.71 1033 25.2 2.54 13.11 12.04 17.55 12.85 30.81 13.64 2 34.23 1074 21.6 6.14 5.59 4.87 13.16 5.11 65.29 5.98 3 1.93 1156 22.6 4.40 0.00 0.00 11.25 2.25 77.56 8.94 4 18.57 1186 22.3 2.72 2.04 2.04 11.09 4.68 72.46 7.69 5 2.63 1054 22.6 3.55 7.35 2.41 16.88 8.61 55.68 9.07 景观指数高度浓缩了景观格局信息，是反映其结构组成和空间配置等方面特征的简单定量指标[20]。基于土地利用分布计算景观格局指数，是景观空间格局分析的主要方式[14]。本文利用FRAGSTATS 4.1（Oregon State University，Corvallis，USA）计算流域景观格局指数，由于不同水平的景观格局指数与径流的关系不同，且斑块水平的一些景观指数对描述和理解景观中不同类型斑块的格局特征有重要作用，因此选择斑块和景观两种水平的景观格局指数，用于分析流域景观空间特征和探究其对径流的影响。为综合描述斑块的大小、形状以及在流域内的空间分布与组合规律，根据景观格局指数含义及其在已有研究中的应用情况，本文选择了常见且概括性较强的8个景观格局指数，用于描述流域内复杂的景观格局，包括斑块密度、景观形状指数、平均欧式距离、蔓延度指数、斑块凝聚度指数、香农多样性指数、聚集指数、边缘密度。各指数的具体含义见表2。
表 2 景观指数及其生态学意义Table 2. Landscape indices and their ecological significance景观指数
Landscape indices分析尺度
Analysis scale缩写
Abbreviation单位
Unit生态学意义
Ecological significance斑块密度
Patch density斑块/景观
Patch/landscapePD 个/km2
Number/km2景观破碎化程度
Degree of landscape fragmentation边缘密度
Edge density斑块/景观
Patch/landscapeED m/hm2
m/ha斑块受边界分割的程度
Extent to which patches are segmented by boundaries平均欧式距离
Mean euclidean nearest neighbor distance斑块/景观
Patch/landscapeENNMN m 斑块间的距离，体现了景观的空间格局
Distance between patches and spatial pattern of landscape景观形状指数
Landscape shape index斑块/景观
Patch/landscapeLSI 斑块形状的复杂程度，反映其变异性
Complexity of the patch shape蔓延度指数
Cotagion index景观
LandscapeCONTAG % 景观里不同斑块类型的延展趋势
Extension trend of different patch types in the landscape斑块凝聚度指数
Patch cohesion index斑块/景观
Patch/landscapeCOHESION % 景观中斑块间的连通性
Connectivity between patches in landscape聚集指数
Aggregation index斑块/景观
Patch/landscapeAI % 斑块的聚集程度
Aggregation degree of patches香农多样性指数
Shannon’s diversity index景观
LandscapeSHDI 景观中斑块的复杂程度
Complexity of patches in the landscape2.3 流域径流与景观组成和格局分析
以径流总量、不同土地利用方式面积占比分别作为响应变量、解释变量，采用偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）量化不同土地利用方式对径流总量的影响，分析径流总量与不同土地利用方式的响应关系。该方法相较于传统回归，在处理自变量间的多元共线性，以及样本数量少等问题上有一定优势。通过对数据信息的多次提取、分解，筛选出可用于解释因变量变化的因子，分析结果更加可靠[21]。利用皮尔逊相关分析，在流域景观水平上探究各土地利用方式面积占比与基流指数的关系，以及景观格局指数与径流组分的相关性，以此分析景观格局变化对径流组分的影响。
采用SPSS PRO软件完成PLSR和皮尔逊相关分析，综合评价不同景观格局对流域径流总量及其组分的影响。
3. 结果与分析
3.1 基流分割
5个小流域2016—2019年雨季（5—10月）平均总径流深分别为29.78、10.24、9.12、7.63、15.43 mm，采用数字滤波法进行基流分割，得到对应的平均基流深分别为4.89、1.24、1.96、1.64、0.61 mm（以2016年各小流域基流分割结果为例，结果见图2）。根据式2，计算出的雨季平均基流指数分别为0.16、0.12、 0.22、0.21、0.04。
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图 2 2016年各流域径流与基流动态曲线1，2，3，4，5分别代表图1标出的流域编号。1, 2, 3, 4, and 5 represent watershed No. in figure 1, respectively.Figure 2. Dynamic curves of runoff and base flow in the studied catchment in 20161号、5号小流域的总径流深较大，而2号、3号、4号小流域总径流深较为接近，且小于1号、5号小流域。基流指数的结果显示，3号和4号小流域的基流指数大于1号、2号、5号小流域。结果说明：以林地为主要景观的小流域所产生的径流总量较少，但基流占比较高。
3.2 景观组成与径流的关系
5个小流域间景观组成的差异主要为自然生态系统与受人为活动影响的生态系统的面积区别。本研究采用PLSR方法分析景观组成对径流总量的影响，该方法结合了主成分分析和多元线性回归的特征，可从最具解释性成分的单个解释变量的权重和回归系数来判定解释变量（土地利用方式）和响应函数（总径流量）之间的关系[22]。从而在不同景观格局中，确定哪种景观组成与径流总量的相互作用最强。在PLSR建模中，解释变量对因变量的重要性由VIP值反映， VIP值越大的解释变量，与因变量间相关性越强。
径流总量PLSR回归模型各参数如表3所示。随潜在因子的增加，对自变量进一步提取，预测误差进一步减小。1个组分分量可解释90.5%的径流变化，增加到3个组分时，解释程度增至99.7%。
表 3 径流变化方差表Table 3. Variance of runoff change组分分量
ComponentY变异解释程度
Degree of explanation for
Y variation/%Y累计变异解释程度
Cumulative explained
variability in Y/%R2 1 90.5 90.5 0.87 2 1.0 91.5 0.83 3 8.1 99.7 0.99 4 0.3 PLSR权重是定义分数的原始变量的线性组合，可用来描述预测因子和结果间的定量关系[22]。表4为径流PLSR模型各影响因素在第1、2、3成分的权重，第1成分的各土地利用方式权重接近；第2成分中农地（旱地）、果园、草地权重较大，占主导作用，其中农地（旱地）、果园权重占正侧主导，而草地权重占负侧主导；第3成分中农地（旱地）占负侧主导，而草地与乔木林地占正侧主导。除权重外，VIP值能更清晰、全面表达每种土地利用方式对径流总量的相对重要程度。乔木林地、灌木林地、草地的VIP值大于1，表明这3种土地利用方式对径流总量的影响程度大，而农地（旱地）、果园VIP值小于1，说明二者对径流总量的影响弱于乔木林地、灌木林地和草地。乔木林地的回归系数为−2.551且VIP值最大，可认为其对径流总量的削减作用最强，灌木林地、草地、果园回归系数为负，同样表明对径流总量具有削减作用，而农地（旱地）的回归系数为0.173，说明其促进流域产流。
表 4 不同土地利用方式对径流影响的VIP值与PLSR方程权重Table 4. VIP values and PLSR weights in different land use types土地利用方式
Land use type回归系数
Regression coefficient (β)重要性
Importance (VIP)权重 Weight W[1] W[2] W[3] 农地（旱地） Farmland 0.173 0.927 −0.422 0.974 −0.411 果园 Orchard −1.318 0.968 −0.461 0.429 0.110 灌木林地 Shrubland −0.385 1.003 −0.465 −0.284 0.013 草地 Grassland −0.110 1.016 −0.417 −0.984 0.788 乔木林地 Arbor forest land −2.551 1.079 0.468 0.093 0.454 注：粗体显示的数值的绝对值大于0.3，说明PLSR分量变化主要与相应的变量有关。Note: Absolute values shown in bold are greater than 0.3, indicating that the change of PLSR component is mainly related to the corresponding variable. 通过皮尔逊相关分析，发现不同土地利用方式与BFI相关性不显著，反映出土地利用方式对基流的影响较弱。
3.3 景观空间配置与径流的关系
本文共选取了8个指数，从流域景观的多样性、聚散性、连通性系统阐述了流域景观格局。在斑块水平上，不同土地利用方式的6个景观格局指数与径流总量的相关性如表5。其中，乔木林地的斑块密度与径流总量呈正相关，而斑块凝聚度指数、聚集指数与径流总量呈负相关，说明流域内乔木林地斑块间的分隔程度小、连通性强，对流域径流的滞缓作用越强。农地（旱地）、果园景观格局与径流总量间未见显著相关关系，可能是因为整体面积较小，且主要受人为规划影响，斑块形状及相互距离相似。灌木林地和草地的斑块密度、边缘密度与径流总量呈正相关，说明这两种土地利用方式对流域径流的影响主要取决于斑块间的破碎化程度。同时可以看出，斑块密度在决定景观格局对径流的影响方面具有明显作用[2]。
表 5 不同土地利用方式景观格局指数与径流总量的相关系数Table 5. Correlation coefficients between landscape pattern index of class metrics and total runoff of different land use types土地利用方式 Land use type PD ED LSI ENNMN COHESION AI 乔木林地 Arbor forest land 0.998** −0.673 −0.541 0. 848 −0.938* −0.984** 农地（旱地） Farmland (dry land) 0.691 0.860 −0.542 −0.848 0.635 0.817 灌木林地 Shrubbery woodland 0.973** 0.899* −0.550 −0.920* −0.836 −0.333 草地 Grassland 0.996* 0.982** −0.512 −0.937* 0.519 0.657 果园 Orchard 0.821 0.814 −0.551 −0.715 0.477 0.693 注：*为在0.05水平上相关性显著，**为在0.01水平上相关性显著。下同。Notes: * means significant correlation at 0.05 level, ** means significant correlation at 0.01 level. The same below. 在景观水平上（表6），斑块密度、边缘密度与径流总量呈正相关，二者反映了流域整体景观的破碎化程度及景观的空间异质性对径流总量的促进作用[23]，表明景观斑块间的隔离程度越大、破碎化程度越高、景观异质性增强，流域径流越易形成[24]。蔓延度指数与径流总量呈负相关，说明景观内优势斑块的连通性越好、流域产流能力降低。聚集指数、斑块凝聚度指数与径流总量存在显著负相关，说明景观内部不同斑块间的连通性越强、聚集程度越高，对流域径流的滞留作用越强[7,24−25] 。香农多样性指数反映景观中斑块的多样性，其与径流总量呈正相关，表明流域产流会随土地利用方式复杂化而增强。
表 6 径流总量、基流指数与景观格局指数相关性Table 6. Correlation coefficients between landscape pattern index and total runoff and BFI项目 Item PD LSI ENNMN CONTAG COHESION SHDI ED AI 径流总量 Total runoff 0.976** −0.469 −0.937* −0.987** −0.947* 0.963** 0.985** −0.999** 基流指数 Baseflow index −0.145 −0.087 0.381 0.321 −0.005 −0.393 −0.253 0.269 相较于径流总量，在斑块和景观两种水平下，景观格局与BFI的相关性不明显，说明连续降雨情况下，景观格局拦蓄径流的能力有限。
4. 讨 论
4.1 景观组成对径流组分影响分析
蔡家川小流域的5类主要土地利用方式中，农地（旱地）与乔木林地面积差别最大，均显著影响径流总量变化，且乔木林地占绝对优势。由此反映出，乔木林地能明显削减流域径流总量，而农地（旱地）面积的增加则会促进流域径流总量[26−27]，但二者均对基流影响较小。
这可能是由于林地的林冠层、枯落物层及土壤层，均会拦截和蓄积降水，增加了土壤蓄水能力[28]，从而整体影响流域水分循环、入渗、储蓄与产流过程[29]；农地（旱地）人为扰动较强，作物植株较小，地表也无枯落物覆盖，对地表径流的滞缓拦蓄能力较差，同等降雨条件下，更易产流。基流作为径流总量的组成，大部分由降雨入渗转化而来，因此入渗补给量是其重要影响因素[30]。林地土壤孔隙度、理化性质得到改良，入渗性能好[31]，可促进流域基流形成。人为耕作的扰动，则对土壤入渗、蓄存及其对地下水的补给量等造成了消极影响[32]，从而增加地表产流。
果园同样受人为活动扰动，在研究流域内其面积占比与农地（旱地）较为接近，其与流域径流总量间的回归系数为−1.318，表现出削减径流的作用，但其与BFI相关性较弱，说明对流域基流影响较小。这可能是由于研究流域内的果园多为水平阶整地，种植的苹果为落叶乔木，其林冠层可截留降雨，但现场调查显示林下未见草被和枯落物层，因此土壤储水能力不如林地。相关研究也证实，该区果园土壤理化性质和入渗性能优于农地、次于乔木林地[30,32]，因此也与林地一样，并不能影响基流形成。相较于农地（旱地），果园仍可滞缓地表径流。灌木林地、草地对径流的影响与果园类似，但重要程度不如乔木林地，这可能是由于两者没有和林地一样的茂密林冠层，截持降水的能力相对较弱，且土壤孔隙度等更小，因此影响较小。
4.2 景观空间配置对径流组分影响分析及流域景观格局优化建议
通过流域景观格局指数与径流总量的相关性分析，发现流域景观格局变化可显著影响径流。在景观水平上，破碎程度小、连通性强的景观格局对流域径流具有更强的削减作用。具体到各景观要素层面，不同景观要素的空间配置对径流的影响不同。在斑块水平上，空间分布紧密、具有高连通性的乔木林地对削减径流总量具有促进作用，减少灌木林地和草地的破碎化程度也会削减径流总量，3种景观要素的格局指数都反映出高连通性景观要素对径流形成的削减作用。农地、果园景观空间配置对径流总量影响很小，但二者所占面积比例对径流总量的影响不同，农地面积增加会促进流域产流，果园则相反。尽管景观空间配置对流域径流总量的影响较大，但对基流的影响很小，这可能是基流形成的迟滞性导致，基流是由降水入渗到包气带中，一部分以壤中流的方式运移入河道，另一部分通过补给至浅层地下水以出流方式补给至河道所形成[33]，因此在雨季，景观格局对基流的调控作用是有限的[7]，下垫面状况对基流的影响不易在短时间内得到体现。
随着对土地利用规划与生态效益研究的不断深入，从整体景观格局的角度优化用地结构是黄土高原水土保持新的方向[10]。本文综合分析了景观格局对总径流的影响，可以看出流域下垫面条件差异导致景观格局不同对晋西黄土区径流总量有显著影响，因此对流域整体植被规划时考虑景观格局是必要的，在注重不同植被搭配效果的同时，更要合理配置空间结构。景观斑块作为基本的景观组成单元，斑块镶嵌体空间格局直接影响了径流形成过程，其中保护、发展森林资源作为林业生态工程的出发点，优化林地景观格局，增加乔木林地优势斑块面积对流域径流管理是有积极效果的，同时要考虑包括灌木林地、草地等不同植被斑块的连通性及分布特征，晋西黄土区地形复杂破碎，进行植被恢复时，尽可能选择同种类型密集种植，减少植被差异造成的景观破碎化与空间异质性，才能拦截更多的降水资源，调蓄流域水资源量。此外在考虑兼顾生态效益与经济效益发展的基础上，在以粮食作物为主的经营策略中增加经济林种植占比，适当增加果园的面积，这样既有利于稳定流域径流，又可以提高经济价值。
5. 结 论
（1）晋西黄土区蔡家川流域不同土地利用方式间，乔木林地对径流总量的影响最大，能明显削减径流，农地（旱地）则促进径流形成，果园、灌木林地、草地整体对径流形成具有抑制作用，但影响相对较小，不同土地利用方式对基流的影响均较小。
（2）流域景观连通性、聚集程度与径流总量呈显著负相关，是径流形成的重要影响因素。其中，聚集指数、斑块凝聚度指数、蔓延度指数是径流总量的抑制性指标，斑块密度、边缘密度、香农多样性指数则对径流总量具有促进作用，其中，斑块密度是影响径流总量主要的景观格局指标。
（3）在雨季，流域景观格局对径流总量的影响高于基流，景观格局优化对流域水资源的调控作用于地表径流，对基流影响较弱。
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图 1 白桦BpPAT1蛋白的多序列比对分析(A)及系统进化树分析(B)
AtPAT1. 拟南芥(NP_001332482.1)；QsGRAS. 欧洲栓皮栎(XP_023916980.1)；MrGRAS. 杨梅(KAB1208676.1)；JrGRAS. 胡桃(XP_018849898.1)；VvGRAS. 葡萄(XP_002272334.1)；JcGRAS20. 麻风树(XP_012081428.1)；CfGRAS. 土瓶草(GAV74587.1)；DlGRAS54. 龙眼(AGE44291.1)；TcGRAS. 可可(EOX93442.1)。AtPAT1, Arabidopsis thaliana (NP_001332482.1); QsGRAS, Quercus suber (XP_023916980.1); MrGRAS, Morella rubra (KAB1208676.1); JrGRAS, Juglans regia (XP_018849898.1)；VvGRAS, Vitis vinifera (XP_002272334.1); JcGRAS20, Jatropha curcas (XP_012081428.1); CfGRAS, Cephalotus follicularis (GAV74587.1); DlGRAS54, Dimocarpus longan (AGE44291.1); TcGRAS, Theobroma cacao (EOX93442.1).
Figure 1. Multiple sequence alignment analysis of Betula platyphylla BpPAT1 protein (A) and phylogenetic tree analysis (B)
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图 2 盐胁迫条件下BpPAT1基因的表达模式
Figure 2. Expression pattern of BpPAT1 in B. platyphylla under salt stress
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图 3 盐胁迫下BpPAT1基因在瞬时表达白桦植株中的表达情况
A. 盐胁迫下不同转化时间对照植株及瞬时过表达植株BpPAT1基因的表达水平；B. 正常条件下与盐胁迫后对照植株及瞬时转化植株BpPAT1基因的表达水平；Control. 对照植株；OE. 瞬时过表达植株；IE. 瞬时抑制表达植株；*. 显著性差异(P < 0.05)。下同。A, expression levels of BpPAT1 gene in control plants and transient overexpressed plants at different transformation time under salt stress; B, expression level of BpPAT1 gene in control plants and transient transformed plants under normal conditions and salt stress. Control, control plant; OE, transient overexpression plant; IE, transient inhibitory expression plant. Asterisks indicate significant difference (P < 0.05). The same below.
Figure 3. Expression of BpPAT1 gene in transient expression plants of B. platyphylla under salt stress
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图 4 正常条件及盐胁迫后瞬时表达OE、IE及Control白桦植株中ROS水平(B、D)及POD(A)、SOD(C)活性分析
Figure 4. Analysis of ROS level (B, D) and activities of POD (A) and SOD (C) in OE, IE and control B. platyphylla plants under normal condition and salt stress
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图 5 正常条件及盐胁迫下OE、IE及Control白桦植株中电解质渗透率(A)及MDA含量(B)分析
Figure 5. Electrolyte leakage (A) and MDA content (B) analysis in OE, IE and control B. platyphylla plants under normal condition and salt stress
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图 6 正常条件及盐胁迫下OE、IE及Control白桦植株中脯氨酸含量分析
Figure 6. Proline content analysis in OE，IE and control B. platyphylla plants under normal condition and salt stress
表 1 引物序列
Table 1 Primers used in this study
用途 Application 引物名称 Primer name 引物序列(5′—3′) Primer sequence (5′−3′) 实时荧光定量 PCR Quantitative real-time PCR q-BpPAT1-F TACTGCTGCATTCTATCCAC q-BpPAT1-R ACTTACCAAGAAGCTCATG q-BpPAT1-OE-F CCCCACATCCGCATAACA q-BpPAT1-OE-R CCCAGGTCGAATCCCAAG q-BpPAT1-IE-F ACGAACGGTGTTGCACTT q-BpPAT1-IE-R GAGCCATAGGTATTGTCAGG Actin-F TGAGAAGAGCTATGAGTTGC Actin-R GTAGATCCACCACTAAGCAC Tubulin-F TCAACCGCCTTGTCTCTCAGG Tubulin-R TGGCTCGAATGCACTGTTGG 基因克隆 Gene cloning BpPAT1-F GCTCTAGAATGTCCAACGGATTGTACTATC BpPAT1-R GGGTACCTCACTTCCATGCACAAGCAG 载体构建 Vector verification pROKⅡ-F AGACGTTCCAACCACGTCTT pROKⅡ-R CCAGTGAATTCCCGATCTAG pFGC5941-cisF CGCTCGAGTATAAGAGCT pFGC5941-cisR ACCTTCCCACAATTCGTCGG pFGC5941-antiF GCATGCTATGCATTCAAT pFGC5941-antiR CGTGCACAACAGAATTGAAAGC pFGC5941-BpPAT1-cisF CCCATGGCAGCTATGCTACAATGATAG pFGC5941-BpPAT1-cisR TTGGCGCGCCTCCACATATAGAAGAGCCAT pFGC5941-BpPAT1-antiF CTCTAGACAGCTATGCTACAATGATAG pFGC5941-BpPAT1-antiR CGGATCCTCCACATATAGAAGAGCCAT 
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