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栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

郭婷 黄赛 安新民

郭婷, 黄赛, 安新民. 栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
引用本文: 郭婷, 黄赛, 安新民. 栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
Guo Ting, Huang Sai, An Xinmin. Cloning and expression of chalcone synthase gene from Koelreuteria paniculata Laxm[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
Citation: Guo Ting, Huang Sai, An Xinmin. Cloning and expression of chalcone synthase gene from Koelreuteria paniculata Laxm[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377

栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
基金项目: 国家自然科学基金项目(No. 31870652);2018年农业部华北都市农业重点实验室开放课题(kf2018012)
详细信息
    作者简介:

    郭婷。主要研究方向:林木基因组与分子育种。Email:guoting2020@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物学院

    通讯作者:

    安新民,教授。主要研究方向:林木基因组与分子育种。Email:anxinmin@bjfu.edu.cn 地址:同上

Cloning and expression of chalcone synthase gene from Koelreuteria paniculata Laxm

  • 摘要: 查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是苯丙烷途径的限速酶之一,在次生代谢物的合成中起着重要的作用。为筛选栾树类黄酮合成途径关键基因,我们以栾树叶片DNA和cDNA为模版,采用RT-PCR技术克隆获得两个CHS基因的全长DNA,命名为KpCHS1KpCHS2。其中KpCHS1序列全长为2 492 bp,ORF为1 173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质;KpCHS2序列全长为1 321 bp,ORF为1 182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质。进一步的序列比对和系统发育分析表明,KpCHS1和KpCHS2蛋白高度同源,具有四个CHS特异性保守基序和一个查尔酮合成酶活性位点。KpCHS1和KpCHS2属于少数的在系统进化树上分布在很远分支上的蛋白,推测这两个蛋白在氨基酸活性催化功能上可能存在较大差异。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,KpCHS1和KpCHS2在栾树根、茎、叶和种子中都普遍表达,其中,KpCHS2在种子中的表达量最高,KpCHS1在叶片中表达量高,而在根和茎中,两个基因的表达量相似且较低。表达模式分析显示,在栾树(WT)和锦叶栾(GL)叶片中,随着月份增加,KpCHS1的表达量呈现出下降的趋势,而KpCHS2表达量未表现出明显的规律。在7月份的叶片样本中,KpCHS1基因在锦叶栾中表达量显著高于栾树,且代谢组结果显示,山奈酚-7-O-葡萄糖苷、7-羟香豆素、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、以及类黄酮生物合成途径重要的中间产物山萘酚、柚皮苷等黄酮类物质在锦叶栾叶中含量显著升高,说明KpCHS1基因表达与栾树类黄酮合成高度相关。本研究通过对栾树CHS基因进行克隆与分析,期望为后续深入研究栾树类黄酮代谢途径其他相关基因、CHS基因家族以及锦叶栾呈色机制提供参考。
  • 图  1  KpCHS1KpCHS2基因组全长及CDS序列

    M: DL3 000的maker;1、2、3、4分别代表KpCHS1全长基因、KpCHS1 CDS序列、KpCHS2全长基因、KpCHS2 CDS序列。M: The maker of DL3 000; 1,2,3,4 represent KpCHS1 full-length gene, KpCHS1 CDs sequence, KpCHS2 full-length gene and KpCHS2 CDS sequence, respectively

    Figure  1.  Full length and CDS sequence of KpCHS1 and KpCHS2 genes

    图  2  KpCHS1KpCHS2基因结构

    Figure  2.  Gene structure of KpCHS1 and KpCHS2

    图  3  KpCHS1和KpCHS2蛋白二级结构分析

    Figure  3.  Secondary structure analysis of KpCHS1 and KpCHS2

    图  4  KpCHS1和KpCHS2蛋白预测的三级结构图

    a为KpCHS1蛋白,b为KpCHS2蛋白。a: KpCHS1 protein;b: KpCHS2 protein

    Figure  4.  The three-dimensional structures of the deduced KpCHS1 and KpCHS2

    图  5  KpCHS1和KpCHS2编码的氨基酸同源比对

    在所有序列中高度保守的残基以黑色背景表示,在序列中仅部分保守的残基以白色和灰色背景显示。蛋白活性位点、催化残基、CoA结合位点、其它高度保守的残基和不同的残基分别表示为◆、△、●、□和♡。红框为查尔酮合成酶活性位点(RLMMYQQGCFAGGTVLR)。Highly conserved residues in all the sequences are indicated in black background and only partially conserved residues in the CHS sequences are showed in black with gray background. The protein sequences of KpCHS has four CHS-specific conserved motifs (Marked Motif I, II, III and IV). Active site, catalytic residues, CoA-binding site, other highly conserved residues and different residues are indicated as ◆、△、●、□ and ♡, respectively. The red box is the active site of chalcone synthase (RLMMYQQGCFAGGTVLR).

    Figure  5.  Amino acid sequence alignment of KpCHS1 and KpCHS2

    图  6  KpCHS1、KpCHS2与其他物种CHS蛋白系统进化树分析

    Figure  6.  Phylogenetic trees of KpCHS1、KpCHS2 and CHSs in other plants

    图  7  栾树不同器官以及不同月份栾树和锦叶栾叶片中KpCHS1KpCHS2基因表达分析

    a:KpCHS1KpCHS2的组织特异性表达;b:KpCHS1在WT和GL的5月、7月、9月叶片中的表达量分析;c:KpCHS2在WT和GL的5月、7月、9月叶片中的表达量分析;WT为栾树;GL为锦叶栾。a: Tissue specific expression of KpCHS1 and KpCHS2; b: Expression of KpCHS1 in the leaves of WT and GL in May, July and September; c: expression of KpCHS2 in the leaves of WT and GL in May, July and September; WT: Koelreuteria paniculata; GL: Koelreuteria paniculata ‘Jinye’

    Figure  7.  Analysis of KpCHS1 and KpCHS2 expression in different organs and leaves of Koelreuteria paniculata and Koelreuteria paniculata ‘Jinye’ in different months

    图  8  差异的类黄酮物质热图

              WT为栾树,GL为锦叶栾。WT: Koelreuteria paniculata; GL: Koelreuteria paniculata ‘Jinye’

    Figure  8.  Heatmap of differential flavonoids

    表  1  基因克隆中使用引物列表

    Table  1.   List of primers in gene cloning

    引物名称 Primer name序列(5′-3′) Sequence (5′-3′)Tm值 Tm value用途 Usage
    CHS1-F ATGGTGACTGTCGAGGAAGTC 55.00 KpCHS1 基因扩增 KpCHS1 gene amplification
    CHS1-R CTAAGCAGAGGCAACAGAGTGG 55.00 KpCHS1 基因扩增 KpCHS1 gene amplification
    CHS2-F ATCTCACTCCTAAACCCCCTTC 56.00 KpCHS2 基因扩增 KpCHS2 gene amplification
    CHS2-R TTTAATAAAAGGAACAGTATCCAGA 56.00 KpCHS2 基因扩增 KpCHS2 gene amplification
    Actin-F AAATTAACGAGGACACCAATGC 58.00 qRT-PCR
    Actin-R GGGTATGGATATGGCGATCTTA 58.00 qRT-PCR
    Y-CHS1-F GTGTCGAAAAGCCCATGTATGA 58.99 qRT-PCR
    Y-CHS1-R TTGAAATCAGCCCAGGAACATC 58.91 qRT-PCR
    Y-CHS2-F AAGAACATCGAGAAAAGCTTGG 59.89 qRT-PCR
    Y-CHS2-R GCCCTGAGTTTCTCTTCTTTGA 60.00 qRT-PCR
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    表  2  CHS蛋白理化性质

    Table  2.   Physicochemical properties of CHS

    蛋白名称
    Protein name
    氨基酸数量
    Quantity of
    amino acids
    分子量(kD)
    MW
    等电点
    pI
    亲/疏水性
    Hydrophilicity/
    hydrophobicity
    跨膜区域
    Transmembrane
    region
    亚细胞定位预测
    Prediction of protein
    subcellular localization
    KpCHS139042.596.12疏水性hydrophobicity不具有no细胞质cytoplasm
    KpCHS239342.916.57疏水性hydrophobicity不具有no细胞质cytoplasm
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    北方梭囊孔菌漆酶基因DNA片段的克隆与序列分析 . 北京林业大学学报,
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-11-28
  • 修回日期:  2020-12-18
  • 网络出版日期:  2021-01-26

栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
    基金项目:  国家自然科学基金项目(No. 31870652);2018年农业部华北都市农业重点实验室开放课题(kf2018012)
    作者简介:

    郭婷。主要研究方向:林木基因组与分子育种。Email:guoting2020@bjfu.edu.cn 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物学院

    通讯作者: 安新民,教授。主要研究方向:林木基因组与分子育种。Email:anxinmin@bjfu.edu.cn 地址:同上

摘要: 查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是苯丙烷途径的限速酶之一,在次生代谢物的合成中起着重要的作用。为筛选栾树类黄酮合成途径关键基因,我们以栾树叶片DNA和cDNA为模版,采用RT-PCR技术克隆获得两个CHS基因的全长DNA,命名为KpCHS1KpCHS2。其中KpCHS1序列全长为2 492 bp,ORF为1 173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质;KpCHS2序列全长为1 321 bp,ORF为1 182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质。进一步的序列比对和系统发育分析表明,KpCHS1和KpCHS2蛋白高度同源,具有四个CHS特异性保守基序和一个查尔酮合成酶活性位点。KpCHS1和KpCHS2属于少数的在系统进化树上分布在很远分支上的蛋白,推测这两个蛋白在氨基酸活性催化功能上可能存在较大差异。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示,KpCHS1和KpCHS2在栾树根、茎、叶和种子中都普遍表达,其中,KpCHS2在种子中的表达量最高,KpCHS1在叶片中表达量高,而在根和茎中,两个基因的表达量相似且较低。表达模式分析显示,在栾树(WT)和锦叶栾(GL)叶片中,随着月份增加,KpCHS1的表达量呈现出下降的趋势,而KpCHS2表达量未表现出明显的规律。在7月份的叶片样本中,KpCHS1基因在锦叶栾中表达量显著高于栾树,且代谢组结果显示,山奈酚-7-O-葡萄糖苷、7-羟香豆素、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、以及类黄酮生物合成途径重要的中间产物山萘酚、柚皮苷等黄酮类物质在锦叶栾叶中含量显著升高,说明KpCHS1基因表达与栾树类黄酮合成高度相关。本研究通过对栾树CHS基因进行克隆与分析,期望为后续深入研究栾树类黄酮代谢途径其他相关基因、CHS基因家族以及锦叶栾呈色机制提供参考。

English Abstract

郭婷, 黄赛, 安新民. 栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
引用本文: 郭婷, 黄赛, 安新民. 栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析[J]. 北京林业大学学报. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
Guo Ting, Huang Sai, An Xinmin. Cloning and expression of chalcone synthase gene from Koelreuteria paniculata Laxm[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
Citation: Guo Ting, Huang Sai, An Xinmin. Cloning and expression of chalcone synthase gene from Koelreuteria paniculata Laxm[J]. Journal of Beijing Forestry University. doi: 10.12171/j.1000-1522.20200377
  • 栾树(Koelreuteria paniculata Laxm.)属于无患子科栾树属植物,是我国特有的乡土树种,具有适应性强、对自然灾害抗逆性强[1]等优点,作为行道树在我国广泛种植[1]。栾树具有生态保护[2]、城乡美化[3]的作用,由于富含黄酮类物质,使得其成为兼具药用价值[4]的优良树种。锦叶栾(Koelreuteria paniculata ‘Jinye’)是由普通栾树芽变选育而来的一种彩叶(金黄色)突变体[5],其生理学特征与普通栾树类似,但叶色发生明显变异。每年的5月,锦叶栾新生出金黄色叶片,嫩茎、嫩梢呈鲜艳的橙红色。但从7月至9月,锦叶栾的叶色发生复绿的现象,即由金黄转变成黄绿色。先前的研究表明[6],在其旺盛生长阶段(5—6月),锦叶栾叶片具有较高的类黄酮含量,且在5月底时达到峰值(36.72 mg·g−1),之后便一直呈现下降趋势,9月时含量已降至20 mg·g−1,锦叶栾叶片内总黄酮含量的季节性变化规律与其叶色变化规律一致。研究表明[7],高等植物叶色主要取决于叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮这几种色素的含量和比例,类黄酮含量的变化可能是锦叶栾叶色变异的原因之一。

    类黄酮(flavonoids)是一大类植物次生代谢物,包括7 000多种化合物[8],基本结构是C6-C3-C6。其在植物体内广泛分布于花、果、叶中,并表现出多样化的生物功能,如植物防御、抗氧化、参与信号传导、防护屏蔽紫外线以及作为结构支持等等[9, 10]。植物中类黄酮生物合成途径已经被科学家们研究的较为透彻[11-13]。查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮合成途径中的第一个限速酶,其催化一分子的4-香豆酰CoA和三分子丙二酰CoA合成查尔酮,再经查尔酮异构酶(CHI)快速的空间异构反应异化成无色的柚皮素,柚皮素作为主要的中间体物质进入下游三个类黄酮代谢阶段:花青素和原花青素的合成、黄酮和异黄酮的合成以及黄酮醇的合成[14]。因此,了解查尔酮合酶的功能基因及其调控机制对探索类黄酮和花色素的生物合成途径的遗传控制至关重要。CHS基因在类黄酮合成中的重要作用已经在多种植物中得到了验证[15-17],但迄今为止尚未见到成功克隆出栾树CHS基因。为了解CHS基因在栾树类黄酮生物合成中的作用,本研究利用生物信息学方法从栾树转录组中检索并克隆得到2个CHS基因,并对其蛋白质理化性质、进化关系、保守功能域以及表达模式进行了分析,为后续深入研究类黄酮代谢途径相关基因、CHS基因表达调控以及CHS基因家族进化提供科学依据。

    • 栾树与锦叶栾在山西省襄垣县栾树苗圃自然条件下生长。我们选取两个品种各三株长势一致的成年植株,收集种子,并于2018年5月12日、7月12日和9月12日在其分枝顶部同样位置采集叶片组织。同时取北京林业大学实验楼组培间内栾树组培苗的根与茎作为实验材料。各样品经液氮速冻后保存于−80 ℃冰箱中。

    • 利用植物总RNA提取试剂盒(OMEGA,美国)提取栾树根、茎、叶、种子和锦叶栾叶片的总RNA,进行RNA质量及浓度检测后,使用反转录试剂盒(Promega,美国)合成cDNA第一条链,−20 ℃保存备用。

    • 根据本课题组的栾树转录组数据,利用Primer3Plus在线网站设计克隆特异性引物(见表1)。以栾树和锦叶栾cDNA为模板,进行PCR扩增获得目的片段。利用DNA凝胶回收试剂盒(Biomega,中国)回收目的条带,将其与pGEM-T载体连接,转化至大肠杆菌top10感受态中,涂板过夜培养。挑单菌落进行PCR验证,将鉴定为阳性结果的单菌落加入到LB液体培养基中,放于37 ℃恒温摇床培养,将培养好的菌液送往睿博生物公司进行测序。

      表 1  基因克隆中使用引物列表

      Table 1.  List of primers in gene cloning

      引物名称 Primer name序列(5′-3′) Sequence (5′-3′)Tm值 Tm value用途 Usage
      CHS1-F ATGGTGACTGTCGAGGAAGTC 55.00 KpCHS1 基因扩增 KpCHS1 gene amplification
      CHS1-R CTAAGCAGAGGCAACAGAGTGG 55.00 KpCHS1 基因扩增 KpCHS1 gene amplification
      CHS2-F ATCTCACTCCTAAACCCCCTTC 56.00 KpCHS2 基因扩增 KpCHS2 gene amplification
      CHS2-R TTTAATAAAAGGAACAGTATCCAGA 56.00 KpCHS2 基因扩增 KpCHS2 gene amplification
      Actin-F AAATTAACGAGGACACCAATGC 58.00 qRT-PCR
      Actin-R GGGTATGGATATGGCGATCTTA 58.00 qRT-PCR
      Y-CHS1-F GTGTCGAAAAGCCCATGTATGA 58.99 qRT-PCR
      Y-CHS1-R TTGAAATCAGCCCAGGAACATC 58.91 qRT-PCR
      Y-CHS2-F AAGAACATCGAGAAAAGCTTGG 59.89 qRT-PCR
      Y-CHS2-R GCCCTGAGTTTCTCTTCTTTGA 60.00 qRT-PCR
    • 采用DNAMAN软件推导其氨基酸序列,并分析氨基酸组成成分和理化性质;利用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Blastp工具获得序列相似性较高的几个物种氨基酸序列;采用TMpred在线软件(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)分析蛋白质跨膜区域;利用PSORT在线软件(http://psort.hgc.jp/)预测蛋白质亚细胞定位;采用NCBI数据库中的CDD数据库对蛋白质的特异结构域进行分析;使用SOMPA在线网站(http://bip.weizmann.ac.il/bio-tools/faq.html)对KpCHS蛋白进行二级结构预测;通过使用Swiss-model和WebLab ViewerLite(http://www.accelrys.com)用于蛋白三级结构预测。采用PROSITE在线分析(https://prosite.expasy.org/)工具分析蛋白的活性位点,最后利用MEGA 7.0软件[18]进行系统进化树的构建。

    • 根据测序结果,设计实时荧光定量引物,以Actin作为内参基因,对其在栾树根、茎、叶、种子4个组织中的表达量进行分析。同时,以栾树与锦叶栾叶片cDNA为模版,检测CHS基因在两个品种不同月份的叶片中具体表达情况。利用GraphPad软件[19]进行显著性分析与柱状图的绘制。

    • 选取7月份的栾树、锦叶栾叶片经液氮研磨后分别称取100 mg,粉末转入1.5 mL EP管中,加入预冷的400 μL甲醇/水(3∶1),涡旋混合,于4 ℃下放置过夜,之后13000 rpm,4 ℃离心15 min,取上清经过0.22 μm滤膜过滤后,氮气吹干,−80 ℃保存待用,进行LC-MS质谱检测前,用异丙醇/甲醇/水(1∶1∶2 )50 μL复溶后,离心取上清进行检测。

    • 整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中,样品使用C18色谱柱进行分离。其中进样量3 μL,柱温45 ℃,流速0.35 mL/min;色谱流动相A:0.1%甲酸水溶液,B:乙腈与0.1%甲酸混合液;色谱梯度洗脱程序如下:0~0.5 min,98% A;0.5~15 min,98% ~ 2% A;15~17 min,2% A;17~20 min,2% ~ 98% A。样品经UPLC分离后用Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher)进行质谱分析。之后利用SIMCA-P软件对数据进行处理。进行可信度检验后,以FC(fold change)分析(FC > 2或FC < 0.5和P值 < 0.05作为筛选标准)和VIP(variable importance for the Projection)(VIP > 1和P值 < 0.1作为筛选标准)筛选出黄酮类差异代谢物。

    • 以栾树叶片的DNA和cDNA为模板,设计特异性引物,成功克隆出两个CHS基因,命名为KpCHS1KpCHS2(NCBI序号)(图1)。利用GSDS 2.0[20]在线分析工具对两个基因结构进行分析,得到基因外显子与内含子分布情况如图2所示,KpCHS1和KpCHS2都有两个外显子和一个内含子,KpCHS1外显子长度分别为178 bp和995 bp,内含子长度为1 319 bp;KpCHS2外显子长度分别为180 bp和1 002 bp,内含子长度为139 bp。利用DNAMAN软件对测序结果进行序列分析,结果显示KpCHS1基因包含完整的cDNA开放阅读框(ORF),ORF全长1 173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质,KpCHS2基因序列全长1 182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质。由表2可见,KpCHS1和KpCHS2都为疏水性蛋白,不具有跨膜区域。蛋白质亚细胞定位预测结果显示俩蛋白都定位在细胞质中。

      图  1  KpCHS1KpCHS2基因组全长及CDS序列

      Figure 1.  Full length and CDS sequence of KpCHS1 and KpCHS2 genes

      图  2  KpCHS1KpCHS2基因结构

      Figure 2.  Gene structure of KpCHS1 and KpCHS2

      表 2  CHS蛋白理化性质

      Table 2.  Physicochemical properties of CHS

      蛋白名称
      Protein name
      氨基酸数量
      Quantity of
      amino acids
      分子量(kD)
      MW
      等电点
      pI
      亲/疏水性
      Hydrophilicity/
      hydrophobicity
      跨膜区域
      Transmembrane
      region
      亚细胞定位预测
      Prediction of protein
      subcellular localization
      KpCHS139042.596.12疏水性hydrophobicity不具有no细胞质cytoplasm
      KpCHS239342.916.57疏水性hydrophobicity不具有no细胞质cytoplasm
    • 二级结构预测分析表明,KpCHS1由45.13%的α螺旋,15.13%的延伸链,7.18%的β转角和32.56%的无规则卷曲组成。KpCHS2由43.00%的α螺旋,16.03%的延伸链,6.87%的β转角和34.10%的无规则卷曲组成。α螺旋和无规则卷曲构成了二级结构主要部分的交错控制(图3)。通过Swiss-Modeling分析了基于同源性的KpCHS蛋白的3D结构建模,通过分析得到的模型,发现栾树CHS蛋白三级结构大部分由α螺旋和不规则卷曲组成,与草本植物异叶天南星[21]、木本植物血橙[22]等CHS蛋白结构相似度很高,从蛋白的水平上证明查尔酮合酶较为保守(图4)。

      图  3  KpCHS1和KpCHS2蛋白二级结构分析

      Figure 3.  Secondary structure analysis of KpCHS1 and KpCHS2

      图  4  KpCHS1和KpCHS2蛋白预测的三级结构图

      Figure 4.  The three-dimensional structures of the deduced KpCHS1 and KpCHS2

    • 将测序结果利用DNAMAN软件翻译获得CHS氨基酸序列,将KpCHS1和KpCHS2氨基酸序列进行blastp搜索,结果显示KpCHS1与鸡爪槭CHS(AWN08245.1)同源性最高,覆盖率达99%,匹配度达94.87%。KpCHS2与荔枝CHS(ADB44077.1)同源性最高,覆盖率达100%,匹配度达95.93%。从栾树中克隆获得的2个CHS几乎都具有CHS模型结构的所有主要特征,说明KpCHS1和KpCHS2属于查尔酮合成酶家族。它们在整个编码区具有高度相似性,有4个CHS特异性保守基序(标记为I、II、III和IV)和29个保守氨基酸残基,可分为4类[23]图5)。利用PROSITE在线网站分析栾树CHS蛋白功能位点,发现该蛋白具有一个查尔酮合成酶活性位点(RLMMYQQGCFAGGTVLR)。用MEGA7.0软件中自带的Cluster W进行蛋白序列多重比对后,用邻接法(Neighbor-joining)以1000个重复进行Bootstrap检验,绘制出包括KpCHS1和KpCHS2等17个CHS蛋白家族的进化树(图6)。根据系统进化树分析,KpCHS1与鸡爪槭(Acer palmatum, AWN08245.1)ApCHS、柠檬(Citrus limon, AXJ20608.1)ClCHS、柑橘(Citrus clementina, XP 006420608.1)CcCHS等关系较近聚为一类,而与KpCHS2在聚类分支上距离较远,说明两个基因在氨基酸活性催化功能上存在一定的差异性。

      图  5  KpCHS1和KpCHS2编码的氨基酸同源比对

      Figure 5.  Amino acid sequence alignment of KpCHS1 and KpCHS2

      图  6  KpCHS1、KpCHS2与其他物种CHS蛋白系统进化树分析

      Figure 6.  Phylogenetic trees of KpCHS1、KpCHS2 and CHSs in other plants

    • 我们根据测序结果设计荧光定量引物(表1),利用qRT-PCR检测了栾树中KpCHS1KpCHS2的组织特异性以及在不同品种时期的叶片中的表达模式。结果显示,虽然KpCHS1和KpCHS2在本研究的所有组织中都普遍表达,但他们的相对表达量却有所不同,与其他组织相比,KpCHS2在种子中的表达量最高,KpCHS1在叶片中表达量最高,而在根和茎中,两个基因的表达量相似且较低(图7a)。同时,我们利用荧光定量探究KpCHS1(图7b)和KpCHS2(图7c)在5、7、9三个月份的的栾树和锦叶栾叶片中的表达模式。结果显示,随着月份增加,KpCHS1的表达量呈现出下降的趋势,而KpCHS2表达未表现出明显的规律。除了7月份,KpCHS1基因在锦叶栾中表达量高于栾树,其余月份中,KpCHS1KpCHS2在栾树中的表达量都高于锦叶栾。

      图  7  栾树不同器官以及不同月份栾树和锦叶栾叶片中KpCHS1KpCHS2基因表达分析

      Figure 7.  Analysis of KpCHS1 and KpCHS2 expression in different organs and leaves of Koelreuteria paniculata and Koelreuteria paniculata ‘Jinye’ in different months

    • 查尔酮合酶是类黄酮代谢途径的第一个限速酶,它的表达会影响下游类黄酮和花色素苷的积累。为了探究栾树和锦叶栾叶片中的类黄酮物质积累情况,我们使用LC-MS技术分析了7月份锦叶栾和栾树叶片之间的代谢物水平,筛选出差异的类黄酮代谢物,并利用tbtools软件[24]进行热图的制作。如图8所示,可以看出山奈酚-7-O-葡萄糖苷、7-羟基香豆素、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、以及类黄酮生物合成中重要的中间产物山萘酚、柚皮苷等黄酮类物质在锦叶栾叶中含量显著升高。

      图  8  差异的类黄酮物质热图

      Figure 8.  Heatmap of differential flavonoids

    • 自1972年Kreuzaler[25]等在荷兰芹悬浮细胞中首次提取出查尔酮合酶,开启了科学家们对CHS基因的研究。这些年来,近百种植物的CHS家族基因被陆续报道[26-28]。研究表明,查尔酮合成酶基因保守性很强,编码区长约1 200 bp,编码约400个氨基酸,除了已发现的金鱼草的AMCHS含有两个内含子之外,其余CHS基因均只包括两个外显子和一个内含子,内含子长度从几十到几千碱基不等[29]。本研究克隆得到KpCHS1序列全长为2 492 bp,CDS区为1 173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质;KpCHS2序列全长为1 321 bp,CDS区为1 182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质。研究表明,种属间的CHS蛋白序列相似性在74% ~ 98%之间,大多数同科同属甚至同物种的CHS分布在很近的分支上,少数分布在较远的分支中。从系统进化树上来看,KpCHS1和KpCHS2分布较远,属于少数的分布在很远分支上的基因,推测这两个蛋白在氨基酸活性催化功能上可能存在较大的差异[30]

      利用qRT-PCR技术分析了KpCHS1和KpCHS2在栾树不同组织中的表达模式,同时结合代谢组数据,研究了栾树和锦叶栾不同时期叶片中的CHS基因表达情况。结果显示,KpCHS1和KpCHS2在栾树的多种植物器官中以不同水平积累(图4),但在叶片和种子中都呈高水平表达,推测可能与其含有丰富的黄酮类物质有关,先前研究结果显示栾树叶片、种子的粗提物中含有丰富的次生代谢产物,如没食子酸衍生物、氰基类化合物和类黄酮化合物等,具有潜在的药用和抗菌性能[31]。本项研究中,5月至9月,栾树与锦叶栾叶片中KpCHS1基因表达量整体呈下降趋势,与前人研究的锦叶栾叶片中类黄酮物质含量季节性下降趋势一致[6],同时,代谢组测定结果显示,相较于栾树,7月份的锦叶栾叶片中黄酮类物质含量发生显著性升高,与KpCHS1在锦叶栾中的高表达结果一致(见图7),说明KpCHS1基因与栾树类黄酮的生物合成高度相关。在高等植物中,CHS基因通常以3~12个成员的多基因家族形式存在[32],例如苹果有3个成员[33],桑树有5个[34]CHS基因的不同成员在表达模式、表达时间上不尽相同,在不同器官、不同品种方面也存在表达差异[35],与KpCHS2基因和KpCHS1基因在各种植物组织中不同的表达模式结果一致。

      CHS基因的表达受多种因素影响,光照[36]、环境胁迫[37]、生物胁迫如病原菌、虫害[38]以及某些中间产物都能影响CHS的生物活性。高光照强度[39]和UV-B辐射[40]在类黄酮生物合成的调控中也起着重要作用。一般植物例如丁香[41]和槐果[42]响应光照强度主要表现为在5月至10月间,类黄酮等物质在8月达到峰值然后逐渐下降。而大多数叶色突变体常伴随着叶绿体结构发育缺陷[43,44],则需要调整其生长发育以适应各种环境条件,包括光信号[45]、高温和遮荫能力[46]。Lubin Song等[47]通过对“黄金芽”突变体茶树进行中度遮阴处理模拟光照强度下降,研究发现在光照强度下降的条件下CHS基因表达与类黄酮物质含量显著降低。推测锦叶栾中类黄酮物质在5月到9月的下降趋势可能是由于对夏季高温强光的响应调节。虽然植物叶色突变体大多为单基因突变[22, 48],但往往会导致复杂的转录和代谢水平的变化,而植物次生代谢调控又是极其复杂的过程,对于栾树叶色突变体研究还需进一步的多代谢途径及多时间点的动态研究。本研究中,我们期望通过对栾树CHS基因进行克隆与分析,为进一步研究栾树类黄酮化合物的合成及其调控机制提供科学依据,为深入揭示锦叶栾叶片呈色机理提供理论参考。

参考文献 (48)

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