Phenotypic difference and comprehensive evaluation of Sophora japonica in Beijing urban area
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摘要:目的 为了准确掌握北京市区国槐资源表型性状的变异程度及表型多样性的主要来源，对其进行综合评价并定向筛选最优种质，为国槐良种选育提供理论支撑和选育材料。方法 本研究以135株胸径在20 ~ 30 cm、树龄在23年左右的国槐实生单株为材料，根据其叶部位特征、果实特征、冠幅特征等共26个表型性状，利用方差分析、多重比较和主成分分析等统计方法，分析表型性状的变异程度以及性状变异主要来源，量化评价定向筛选优良国槐单株。结果 国槐表型性状平均变异系数为25.08%，变异系数的变化幅度为7.01% ~ 264.44%，其中叶背绒毛、新枝皮孔数、叶片大小形状、叶色指标的变异系数较大，果实大小和千粒质量指标变异系数较小。由方差分析和多重比较可知，居群间的国槐除基部小叶长/宽、树冠圆满度、叶背绒毛性状外，其余表型性状均达到显著或极显著水平，表明国槐不同居群的表型性状存在广泛变异，且变异程度各不相同。主成分分析结果显示，前8个主成分代表了81.93%的国槐形态多样性，其中，叶片大小、叶片颜色、叶片形状、果实饱满是造成不同居群表型性状差异的主要因素。利用主成分综合评价得分来定向筛选国槐不同类型的观赏性性状，筛选出3类国槐优良种质各10份，最优种质来自朝阳区幸福大街和奥林西路2个居群。结论 北京市区国槐种质资源的表型性状变异丰富，变异程度较高，其中叶部位的变异是表型多样性的主要来源，且国槐叶片等营养性器官的变异程度大于果实等繁殖器官的变异程度，为国槐良种选育提供了丰富的资源和极大的空间。筛选出的3类各10份国槐最优种质，为国槐种质资源的进一步收集、保存和遗传改良提供了优良的繁殖材料。Abstract:Objective This paper aims to explore the degree of variation of phenotypic traits and main source of phenotypic diversity of Sophora japonica resources in Beijing urban area, comprehensively evaluate S. japonica and directly select the best germplasm, then provide theoretical support and breeding materials for the breeding of improved varieties of S. japonica.Method In this study, 135 seedlings of S. japonica with DBH of 20 − 30 cm and tree age of about 23 years old were used as materials. According to their 26 phenotypic traits such as leaf position characteristics, fruit characteristics and crown width characteristics, the variation degree of phenotypic traits and the main sources of trait variation were analyzed by statistical methods such as analysis of variance, multiple comparison and principal component analysis, and the excellent S. japonica individuals were selected by quantitative evaluation and orientation.Result The average coefficient of variation of the phenotypic traits of S. japonica was 25.08%, and the variation range of the coefficient of variation was 7.01% − 264.44%, among them, the variation coefficients of dorsal fluff, number of lenticels, leaf size and shape and leaf color were larger, and the variation coefficients of fruit size and thousand-grain mass were smaller. From the analysis of variance and multiple comparisons, it can be seen that, except for the basal leaf length to width, crown round rate, dorsal fluff, the other phenotypic traits of the S. japonica among populations reached significant or extremely significant levels, it showed that there were wide variations in phenotypic traits in different populations of S. japonicus, and the degree of variation was different. The results of principal component analysis showed that the first eight principal components represented 81.93% of the morphological diversity of S. japonica, among which, leaf size, leaf color, leaf shape and fruit fullness were the main factors causing differences in phenotypic traits among varied populations. Targeted screening of different types of ornamental traits of S. japonica by means of comprehensive evaluation of principal components, 10 excellent germplasms for each of 3 types of S. japonica were screened out, and the best germplasm came from 2 populations of Xingfu Street (XFDJ) and Aolin West Road (ALXL) in Chaoyang District of Beijing.Conclusion The phenotypic traits of S. japonica germplasm resources in Beijing urban area are rich in phenotypic variation, and the degree of variation is high. Among them, the variation of leaf positions is the main source of phenotypic diversity, in addition, the variation degree of leaf and other vegetative organs of S. japonicus is greater than that of fruit reproductive organs, which provides abundant resources and great space for the selection and breeding of S. japonica varieties. In each of the three categories, 10 optimal germplasms were selected, which provide excellent propagation materials for the further collection, preservation and genetic improvement of the germplasm resources of S. japonica.
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正常的花器分化发育与果实形成密切相关，围绕植物开花机理国内外均开展了广泛而深入的研究工作。目前，花器分化发育ABCDE模型和四因子模型被人们所熟知并广泛接受[1-3]。花器中的萼片、花瓣、雄蕊、心皮和胚珠由花器官特异性的MIKC型MADS转录因子四聚体复合物所决定，这些转录因子四聚体复合物与相邻的两个DNA顺式元件（CArG盒）相结合，使DNA顺式元件中间的DNA折叠成环[1]。2个A类蛋白APETALA1（AP1）与2个E类蛋白SEPALLATA（SEP）形成的四聚体复合物决定萼片发育；AP1、SEP、B类蛋白APETALA3（AP3）和PISTILLATA（PI）组成的四聚体复合物决定花瓣的发育；SEP、AP3、PI和C类蛋白AGAMOUS（AG）组成的四聚体复合物决定雄蕊的发育；2个SEP与2个AG蛋白组成的四聚体复合物决定心皮的发育；SEP、AG和D类蛋白SHATTERPROOF（SHP）和/或SEEDSTICK（STK）决定胚珠的发育[1]。可见，SEP可能是决定植物胚珠发育的一类重要蛋白。
榛子（Corylus spp.）是桦木科（Betulaceae）榛属（Corylus）植物，由于良好的环境适应性和较高的栽培效益，近年来，榛子成为东北退耕还林后广阔还林地的首选替代树种[4]。正常的胚珠充实是榛子种仁形成的前提与基础，胚珠充实不足可频繁导致瘪仁、空壳果实的形成[5]。清朝梁章钜撰的《巧对录》用“十榛九空”贴切的描述了榛子胚珠充实障碍的频繁程度；实际生产中，东北榛子产区仍采用传统的水选法来筛除空壳、瘪仁果实，通过水选的饱满果实俗称“水漏”。可见，榛子胚珠（种仁）充实障碍是一个历史久远且相当普遍的问题。目前SEP参与榛子胚珠发育的证据还不多。在此前的研究中，已经构建了榛子胚珠不同发育阶段的转录谱[6]；新近，利用PacBio单分子实时测序和Hi-C辅助组装策略，获得并发布了榛子高质量的基因组，并构建了平榛（Corylus heterophylla）基因组数据库HazelOmics，该数据库集成了组装基因组、基因编码序列、蛋白序列和各种注释信息[7]。这些研究为深入研究榛子SEP（ChSEP）基因的功能提供了良好的工作基础。本研究在此基础上，拟鉴定参与榛子胚珠发育的重要作用ChSEP基因，并制备ChSEP的多克隆抗体，开展正常发育与败育胚珠中ChSEP的免疫组织化学分析，以期为深入解析榛子胚珠发育机制提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
平欧杂交榛（C. heterophylla × C. avellana）植株种植于吉林省四平市伊通满族自治县榛园，品种为“达维”，树龄12年，株高3.0 ~ 3.5 m。榛子果实有胚珠2枚，未受精时，这2枚胚珠大小相同。受精以后，胚珠大小出现差异，在绝大多数情况下，仅大胚珠发育充实并形成单仁果实，而小胚珠发育停滞，成为败育胚珠。
1.2 研究方法
1.2.1 ChSEP基因家族鉴定及系统发育分析
在榛子基因组数据库HazelOmics（http://122.9.151.76/）中下载蛋白序列，构建本地BioEdit[8]数据库。另外，下载拟南芥（Arabidopsis thaliala）、葡萄（Vitis vinifera）与毛果杨（Populus trichocarpa）的SEP与AGL6（作为外群）蛋白序列。以收集的拟南芥、葡萄与毛果杨的蛋白序列作为查询序列，在自建BioEdit数据库中检索榛子的SEP与AGL6同源蛋白，选择BLASTP程序，参数为E < e−20。同时，使用关键词“SEPALLATA”及“AGL6”在HazelOmics数据库进行序列检索。将检索得到的序列汇总去冗余，于Pfam和CDD[9]在线数据库进行蛋白结构域验证，删除不含SRF-TF结构域和K-box结构域的序列。使用MEGA软件[10]Muscle程序对上述序列进行比对，并用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建进化树，主要参数设置如下：统计方法为最大似然法，重复次数为1 000次，替换类型为氨基酸，模型为泊松模型。
1.2.2 SEP蛋白特性分析与基因表达热图汇制
此前，以平欧杂交榛（C. heterophylla × C. avellana）‘达维’ 4个发育时期的胚珠为材料，建立了榛子胚珠的基因表达谱[6]，原始测序数据保存于SRA数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA591492）。这4个时期包括：胚珠形成期（Ov1），胚珠早期生长期（Ov2）、胚珠快速生长期（Ov3）和胚珠成熟期（Ov4）。使用EvolView[11]绘制ChSEP家族的基因表达热图，基因表达水平根据FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值确定。采用MEME软件[12]对ChSEP进行蛋白保守结构域预测，motif数量设置为15，长度设置为10 ~ 300 aa。
1.2.3 原核表达载体构建及诱导表达
构建目的基因和载体pMD18-T的重组质粒，进行ChSEP多克隆抗体的制备。以重组质粒为模板，对目的基因N端特异性片段进行PCR扩增，纯化PCR产物，再克隆至pGEX-4T-AB1载体（含His标签）。对克隆后的产物进行PCR检测和测序鉴定，提取阳性质粒并转化至Escherichia coli Rosetta菌株，使用氨苄青霉素选择培养基进行筛选及培养。检菌后，挑取单克隆阳性菌株于液体培养基中培养至菌液OD600达到0.6 ~ 1.0。实验组加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度为0.8 mmol/L，37 ℃摇床培养4 h；空白对照组加入等量无菌水。收集少量菌体进行菌落聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），检测目的蛋白是否表达。若目的蛋白表达，再将剩余全部菌液离心、收集菌体、重悬、超声波破碎至菌液清澈，离心分离上清和沉淀，通过SDS-PAGE判断蛋白的表达形式，用8 mol/L尿素溶解包涵体蛋白，用His标签蛋白纯化试剂盒（碧云天生物技术有限公司，上海）纯化后，SDS-PAGE鉴定蛋白浓度。
1.2.4 抗体制备和纯化及Western Blot检测
将纯化后的蛋白作为抗原分4次对2只实验级雄性日本大耳白兔进行酶联免疫吸附效价检测，免疫流程见表1。取免疫前兔的耳缘静脉血清作阴性对照，59 d后取等量兔的耳缘静脉抗血清为阳性实验组。在聚苯乙烯板中加入200 ng稀释后的抗原，37 ℃孵育6 h。弃孔内液体，加封闭液，37 ℃湿盒孵育6 h，弃反应液，洗涤液洗涤。将抗血清按不同梯度稀释（1∶1 000 ~ 1∶512 000）后加至反应孔，37 ℃水浴45 min，洗涤。加稀释后的二抗（1∶8 000）进行显色反应，酶标仪测定OD450吸光值并进行效价分析[13]。用pGEX-4T-AB1-ChSEP蛋白作抗原对抗血清亲和纯化后，得到浓缩后的抗体。抗体浓度用Nanodrop 2000/2000 C超微量分光光度计进行检测，纯度用SDS-PAGE进行检测。以ChSEP（N-64-216）蛋白作为抗原，取梯度为10 ng、5 ng、1 ng、500 pg的抗原进行SDS-PAGE分析，抗体（1∶1 000）稀释后进行Western Blot（WB）检测[14]，以确定抗体检测下限。
表 1 免疫流程Table 1. Immunization process过程
Process周期
Cycle剂量
Dose/mg弗氏佐剂
Freund’s adjuvant动物状态
Animal state第1次免疫 1st immunization 第1天 1st day 0.30 完全 Completely 良好 Good 第2 ~ 4免疫 2nd to 4th immunization 第12、26、40天 12th, 26th, 40th day 0.15 不完全 Incompletely 良好 Good 免疫动物采血
Blood collection from immunized animal第59天 59th day 采血正常
Blood collection is normal1.2.5 样品采集与免疫组织化学检测
在6月20日—7月20日取榛子完整果实，解剖获得受精后的发育胚珠与败育胚珠，并置于4%多聚甲醛溶液中固定。将胚珠取出，进行石蜡包埋。将包埋好的组织置于切片机上，切出厚度7 ~ 9 μm的切片，于36 ℃摊片机摊平，并于25 ℃电热板上烤干。选择包含完整组织的切片进行免疫组织化学染色，处理流程如下：二甲苯浸泡30 min脱蜡，体积分数为100%、95%、80%、70%的酒精梯度水化处理玻片，蒸馏水洗净；随后用柠檬酸缓冲液（pH = 6.0）浸泡材料，微波炉加热3 min，冷却后，蒸馏水冲洗；PBS缓冲液处理2次，每次5 min，滴加封闭液封闭，37 ℃恒温箱孵育30 min；吸水纸吸干封闭液，处理组与实验组均加制备获得的一抗（1∶100），40 ℃恒温箱保存过夜；将玻片取出，PBS处理，晾干后，实验组加辣根过氧化物酶标记二抗（1∶100），对照组加蒸馏水，37 ℃孵育30 min；PBS洗净，加DAB（3, 3-N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride）显色剂显色。
2. 结果与分析
2.1 ChSEP基因家族鉴定与进化分析
本研究共鉴定到3条榛子的ChSEP蛋白序列（Cor0142960.1、Cor0054610.1、Cor0008190.1），为了研究ChSEP家族成员之间的系统发育关系，与源自拟南芥、葡萄、毛果杨的17条蛋白序列及榛子的2条AGL6蛋白序列（Cor0152110.1、Cor0119400.1）进行序列比对后构建NJ树。全部22条蛋白序列聚类为2组，包括：AGL2-like和AGL6-like（图1）。其中，ChSEP蛋白序列Cor0054610.1与拟南芥的AtSEP1和AtSEP2聚在同一进化分枝中；ChSEP蛋白序列Cor0142960.1和拟南芥的AtSEP4聚在同一进化分枝中；ChSEP蛋白序列Cor0008190.1和拟南芥的AtSEP3聚在同一进化分枝中；AGL6蛋白序列Cor0152110.1、Cor0119400.1与AtAGL6及AtAGL13等聚在同一进化分枝中（图1）。鉴定到的ChSEP与拟南芥、葡萄、毛果杨的SEP序列的平均相似性分别为67.71%、78.72%、77.07%，其中榛子与葡萄的平均相似性最高。
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图 1 拟南芥、葡萄、毛果杨与榛子SEP蛋白的系统发育分析Figure 1. Phylogenetic analysis of A. thaliana, V. vinifera, P. persica and C. heterophylla SEP proteins2.2 SEP蛋白特性分析与胚珠发育过程中的基因表达变化
从序列相似性来看，Cor0054610.1与Cor0142960.1序列相似性较高，Cor0008190.1与上述2个ChSEP家族成员序列相似性相对较低（图2A）。保守结构域分析结果表明：鉴定到的3条榛子所有的ChSEP蛋白序列均含有SRF-TF与K-box结构域，具有SEP蛋白的典型特征，而且，在3条鉴定到的SEP蛋白中SRF-TF与K-box出现的位置相对接近，这表明SRF-TF与K-box结构域在不同的ChSEP蛋白中高度保守（图2B）。在榛子的胚珠形成期（Ov1）、胚珠早期生长期（Ov2）、胚珠快速生长期（Ov3）和胚珠成熟期（Ov4）进行了连续采样与RNA-seq分析，比较了3个ChSEP基因在4个发育时期基因表达丰度的变化（图2C）。其中，胚珠形成期（Ov1）时榛子还没有完成受精，胚珠早期生长期（Ov2）时榛子完成了受精，胚珠尺寸显著增加[6]。如果某个ChSEP基因参与胚珠发育调控，认为该基因表达丰度不应太低，而且在Ov2期的基因表达丰度可能会显著高于Ov1期。按以上标准进行筛选，认为Cor0054610.1和Cor0008190.1的FPKM值较高，而且Ov2期的基因表达丰度远高于Ov1期，推测这2个基因可能参与榛子胚珠发育调控。进一步考虑到K-box结构域是SEP的重要结构域，而Cor0008190.1的K-box结构域短于Cor0054610.1，关键结构域序列的缩短可能影响蛋白的调控功能，推测Cor0054610.1可能对胚珠发育调控起重要调控作用，但不排除Cor0008190.1及Cor0142960.1可能也具有调控胚珠发育的功能。
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图 2 ChSEP基因家族多重序列比对（A）、保守结构域分布（B）与基因表达模式分析（C）Figure 2. Multiple sequence alignment (A) and the conserve domain distribution (B) and gene expression model of ChSEP gene family (C)2.3 原核表达载体的构建及表达
选择Cor0054610.1（ChSEP）的N-64-216作为抗原的特异性片段，N-64-216区段涵盖K-box保守区，也包含抗原的特异性片段（图2B）。以测序正确的pMD18-T-ChSEP质粒为模板DNA，对目的片段进行PCR扩增，获得的PCR扩增产物长度为459 bp，符合预期（图3A）。将该PCR扩增产物克隆到pGEX-4T-AB1表达载体上，构建pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）重组载体，测序鉴定正确，重组载体构建成功。将阳性pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）重组质粒转化至E. coli Rosetta菌株中进行表达，重组蛋白融合了分子量约33 kDa的组氨酸标签。SDS-PAGE分析结果表明：实验组相比于对照组多1条分子量为45 kDa的特异性条带（图3B），和预期大小相符，表明ChSEP（N-64-216）在E. coli Rosetta菌株中获得成功表达。
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图 3 ChSEP（Cor0054610.1）PCR扩增结果与蛋白表达纯化检测A. PCR扩增结果：1. Marker；2. ChSEP（N-64-216）。B. 蛋白表达及可溶性检测：1. pGEX-4T-AB1空载诱导表达；2. 0.4 mg/mL BSA；3. Marker；4. 上清；5. 上清2；6. 包涵体2倍稀释（8 mol/L尿素溶解）；7. 包涵体10倍稀释（8 mol/L尿素溶解）。C. 纯化检测：1. Marker；2. 0.4 mg/mL 牛血清白蛋白； 3. 包涵体10倍稀释液（8 mol/L尿素溶解）；4. 包涵体5倍稀释液（8mol/L尿素溶解）。A, PCR amplification results: 1, marker; 2, ChSEP (N-64-216). B, protein expression and solubility detection: 1, pGEX-4T-AB1 empty-load-induced expression; 2, 0.4 mg/mL BSA; 3, marker; 4, supernatant; 5, supernatant 2; 6, two times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea); 7, ten times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea). C, purification detection:1, marker; 2, 0.4 mg/mL bovine serum albumin; 3, ten times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea); 4, five times dilution of inclusion bodies (dissolved in 8 mol/L urea).Figure 3. ChSEP (Cor0054610.1) PCR amplification results and detection of protein expression and purification2.4 抗原蛋白的可溶性检测及纯化
菌液经过超声波破碎离心后，分别取上清和沉淀进行ChSEP（N-64-216）抗原蛋白的可溶性检测。SDS-PAGE分析结果显示：在分子量45 kDa处，上清和上清2两条带不清晰，而沉淀中的包涵体经过8 mol/L尿素溶解后，2倍稀释和10倍稀释条件下条带都很清晰。可见，pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）蛋白在包涵体中进行了表达。由于pGEX-4T-AB1-ChSEP（N-64-216）蛋白具有组氨酸标签，所以选择组氨酸蛋白纯化试剂盒对抗原蛋白进行纯化。纯化前，ChSEP（N-64-216）蛋白非特异性条带较多，经过纯化后，非特异性条带基本消失，分子量45 kDa处的特异性条带清晰（图3B和C），包涵体蛋白质量浓度为5 mg/mL时，纯度达到免疫要求，可用于后续免疫实验。
2.5 多克隆抗体的制备及效价分析
2只日本雄性大耳兔注射纯化的ChSEP抗原后，获得ChSEP多克隆抗血清E18305和E18306。将多克隆抗血清按一定浓度梯度稀释后进行酶联免疫吸附检测（表2）。在不同稀释倍数下，抗血清均能与抗原蛋白进行特异性结合并出现显色反应，这表明抗血清均具有较好的免疫原性，根据（OD阳性–OD空白）/（OD阴性–OD空白） > 2.1标准，E18305和E18306抗血清效价均已达到1∶512 000。
表 2 ChSEP（Cor0054610.1）抗血清ELISA效价检测Table 2. ELISA titer detection of ChSEP (Cor0054610.1) antiserum分组 Group 稀释比例 Dilution ratio OD450 （OD阳性−OD空白）/（OD阴性−OD空白）
（ODpositive−ODblank）/（ODnegative−ODblank）E18305 E18306 E18305 E18306 阳性对照 Positive control 1∶1 000 1.365 0 1.448 3 103.48 882.00 1∶4 000 1.230 8 1.384 7 92.25 842.25 1∶8 000 1.082 8 1.247 0 81.43 756.19 1∶16 000 0.902 9 1.142 2 67.38 690.06 1∶32 000 0.720 9 0.968 1 53.16 581.88 1∶64 000 0.533 9 0.767 2 704.86 33.19 1∶128 000 0.352 3 0.548 4 445.43 23.24 1∶256 000 0.2338 0.369 2 276.14 15.10 1∶512000 0.152 3 0.237 2 159.71 9.09 阴性对照 Negative control 1∶1 000 0.053 3 0.038 7 1∶64 000 0.041 2 0.059 1 空白对照 Blank control 0.040 5 0.037 1 2.6 多克隆抗体的纯化及WB检测
亲和纯化用pGEX-4T-AB1-ChSEP蛋白质量浓度为4 mg/mL，与破菌纯化后质量浓度和纯度差异不大，可进行抗原亲和纯化。抗血清用pGEX-4T-AB1-ChSEP蛋白作抗原进行亲和纯化后，得到浓缩后的抗体。多克隆抗血清E18305质量浓度为2.05 mg/mL，E18306质量浓度为2.64 mg/mL，SDS-PAGE电泳后无杂带，纯度高。将抗体按1∶1 000稀释后，加到含10 ng、5 ng、1 ng、500 pg ChSEP抗原的泳道中，进行WB检测（图4）。结果显示：多克隆抗血清E18305和E18306抗体抗原条带分子量在45 kDa左右，与预期相符。多克隆抗血清E18305和E18306抗体经1∶1 000 稀释后，前者在1 ng ChSEP抗原泳道产生清晰条带，在500 pg ChSEP抗原泳道产生模糊条带，认为E18305的检测下限为1 ng ChSEP抗原；E18306抗体在1 ng ChSEP抗原泳道产生的条带较模糊，在5 ng ChSEP抗原泳道产生的条带粗且清晰，认为其检测下限为2 ng左右 ChSEP抗原。
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图 4 ChSEP E18305（A）和E18306（B）抗体的Western Blot检测泳道上方10 ng、5 ng、1 ng、500 pg分别表示该泳道中加有10 ng、5 ng、1 ng、500 pg ChSEP抗原。10 ng, 5 ng, 1 ng and 500 pg above the lane respectively indicate that 10 ng, 5 ng, 1 ng and 500 pg ChSEP antigen have been added to the lane.Figure 4. Western blot detection of ChSEP E18305 (A) and E18306 (B) antibody2.7 正常发育与败育胚珠的免疫组织化学分析
在本研究中，在二抗辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀，从而显示ChSEP在组织中的表达情况。此前，我们报道了正常发育与败育胚珠的受精过程[5]，认为榛子含2枚胚珠，多数情况下会形成单仁果实。2枚胚珠均会受精，并发育形成幼胚。但败育胚珠生长停滞，无法完成充实[5]。图A1与A2中同时含有败育胚珠与正常发育胚珠，败育胚珠（左）尺寸小，正常发育胚珠（右）尺寸明显较大。与对照A1相比较，A2中发育胚珠ChSEP主要分布于珠被，也分布于幼胚子叶，但子叶中的ChSEP浓度小于珠被（图5A1和A2，B1和B2）；败育胚珠ChSEP主要分布于珠被，珠被内的幼胚有少量ChSEP分布（图5A1和A2，C1和C2）。因此，正常发育胚珠与败育胚珠ChSEP分布特征差异不明显。
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图 5 榛子正常发育与败育胚珠的免疫组织化学分析A1与A2含正常发育与败育2个胚珠，A1为对照，一抗为清水，A2为处理，一抗为ChSEP抗体。B1与B2为正常发育胚珠，B1为对照，一抗为清水，B2为处理，一抗为ChSEP抗体。C1与C2为败育胚珠，C1为对照，一抗为清水，C2为处理，一抗为ChSEP抗体。ov. 败育胚珠；OV. 正常发育胚珠；Int. 珠被；F. 珠柄。A1 and A2 contain two ovules: normal development and abortive ovules. A1 is the control, the first antibody is distilled water, A2 is treatment, and the first antibody is ChSEP antibody; B1 and B2 are normal ovules, B1 is control, the first antibody is distilled water, B2 is treatment, and the first antibody is ChSEP antibody; C1 and C2 are aborted ovules, C1 is the control, the first antibody is distilled water, C2 is treatment, and the first antibody is ChSEP antibody. ov, abortive ovule; OV, normal development ovule. Int, integument; F, funicle.Figure 5. Immunohistochemical analysis of normal development and abortive ovules of hazelnut3. 讨 论
SEPALLATA是一类MADS转录因子，属同源异型蛋白亚家族，参与花发育过程的调节，决定花器与胚珠发育[15]。拟南芥基因组有4个SEP基因，包括：SEP1、SEP2、SEP3和SEP4[16-17]。在sep1 sep2 sep3三重突变体中，原本会发育为花瓣、雄蕊和心皮的原基结果发育成萼片状器官[16]。此外，在sep1 sep2 sep3三重突变体中，花器官生长受到干扰，花器官在第4个轮花中连续产生[16]。由于在单基因突变中很少观察到这种剧烈变异的表型，因此，一般认为SEP存在基因功能冗余[17-18]。本研究在榛子基因组中鉴定到3个ChSEP基因，所有的ChSEP蛋白序列均含有SRF-TF与K-box结构域，且SRF-TF与K-box出现的位置相对接近，认为这些ChSEP基因应当存在基因冗余。在转录水平上，这3个基因在榛子胚珠发育的不同时期均有表达，推测这些ChSEP基因均有可能参与了榛子胚珠的发育调控；其中，Cor0054610.1和Cor0008190.1的表达丰度相对较高，认为这2个基因可能在榛子胚珠发育中起到更重要的调控作用。进一步，在胚珠形成期（Ov1）、胚珠早期生长期（Ov2）、胚珠快速生长期（Ov3）和胚珠成熟期（Ov4）等4个发育期中，Cor0008190.1仅在Ov2期大量表达，表达量远高于其他3个时期，而Ov1、Ov3和Ov4等3个发育时期表达量相比无显著差异，认为该基因可能对受精后胚珠的早期生长有重要调控作用。Cor0054610.1在Ov1 vs Ov2、Ov1 vs Ov3、Ov1 vs Ov4、Ov2 vs Ov3、Ov2 vs Ov4这5种比较中均存在明显差异，推测Cor0054610.1可能广泛参与胚珠形成、早期生长、快速生长等生物学过程的调控。Cor0054610.1与拟南芥的SEP1与SEP2序列相似性高，成功制备了Cor0054610.1的多克隆抗体，开展了SEP的免疫组化定位分析，结果表明，ChSEP在胚珠的珠被及子叶等部位表达。因此，本研究在转录与蛋白水平上提供了ChSEP参与榛子胚珠发育调控的证据。
榛子是壳斗目（Fagales）植物，果实发育经历特殊的延迟受精过程[19-20]。在雌花开放时，榛子的子房还没有形成，需要等到花粉管进入柱头基部以后，子房原基才逐步发育，开始形成子房。随后，胚珠逐步发育，胚囊成熟，此时，在柱头基部长期驻留的花柱管恢复生长，进入胚囊完成受精作用。因此，榛子花粉管呈间歇性生长特征，受精时间耗时约2个月左右，远长于多数被子开花植物[19]。榛子含有2枚胚珠，可能存在3种情况。（1）1枚胚珠发育充实，1枚胚珠发生败育，形成单仁果实，在多数情况下榛子果实的确只含有1枚可食用的种子。（2）2枚胚珠同时发育充实，形成双仁果实，这种情况偶尔发生。（3）2枚胚珠均不发育充实，形成空壳果实[5]，果园中如果空壳果实大量形成，会导致严重的产量损失。单仁果实中存在1枚败育胚珠，而空壳果实中存在2枚败育胚珠，败育胚珠中均可观察到明显的胚结构，表明它们已经完成了受精，但营养物质运输受阻导致胚珠发育停滞[5, 21]。可见，胚珠败育在榛子果实生长过程中普遍发生。E 类SEP基因可与B、C和D类MADS-box基因进行协作并共同参与植物花果发育的调控[22]。在苹果（Malus pumila）中，SEP1/2的基因敲除导致花瓣变为萼片，果实尺寸变小[23]；枣（Ziziphus jujuba）和桃（Amygdalus persica）的基因组中各有3个SEP基因，实时荧光定量分析表明其在花和果实中表达[22, 24]。因此，目前SEP参与植物育性的证据多来自假果，如苹果、枣和桃等，其表达部位的证据一般来自实时定量分析或遗传转化后花果形态变化，少有SEP蛋白的免疫组织化学证据。榛子果实是真果，由子房发育而来。为确定ChSEP在胚珠败育过程中的调控作用，排除免疫组织化学分析中染色时间差异对研究结果的影响，特别选用同时含有败育胚珠（小胚珠）和正常发育胚珠（大胚珠）榛子幼果为材料，对比研究ChSEP分布特征的差异。结果表明，ChSEP在珠被中的表达量相对较高，而子叶表达量相对较低，认为ChSEP参与榛子珠被、子叶的发育调控，对榛子果实发育有重要影响，这与前人关于SEP基因参与植物花果发育调控的研究结果相一致。SEP参与番茄（Lycopersicon esculentum）育性的调控[25]。番茄的TM29与拟南芥的SEP1/2/3高度同源，在所有四轮花器官的原基中均有mRNA积累。通过共抑制或反义RNA干扰技术抑制了TM29的基因表达，转基因植株的内三轮花器官发生变化，且转基因番茄出现雄蕊和子房不育，还出现单性结实现象[25]。类似的，TM5 RNA表达受干扰后也会导致单性结实现象的发生[26]。综上，认为番茄SEP的直系同源基因通常都会限制单性结实果实的发育[25]。在本研究中，榛子发育胚珠与败育胚珠的ChSEP分布特征类似，意味着ChSEP似乎没有参与胚败育调控，这与番茄中SEP基因敲除导致单性结实（种子不可育）的结论并不一致，这应该与两者在果实结构及果实发育过程的差异有关。本研究完成了Cor0054610.1的抗体制备与免疫组织化学分析，另一个重要的SEP基因（Cor0008190.1）是否参与榛子胚败育调控还需进一步的研究。
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表 1 北京市区国槐居群的采样点地理信息
Table 1 Geographic information of sampling sites of Sophora japonica population in Beijing urban area
居群
Population采样地点
Sampling site生长方式
Growth mode个体数
Individual number经度
Latitude纬度
Longitude海拔
Altitude/mXFDJ 幸福大街 Xingfu Street 行道树 Street tree 21 116°25′21″E 39°53′26″N 40 BCXL 北辰路 Beichen Road 行道树 Street tree 17 116°22′50″E 40°00′21″N 40 ALXL 奥林西路 Aolin West Road 行道树 Street tree 28 116°22′38″E 40°00′14″N 50 YQL 月泉路 Yuequan Road 行道树 Street tree 20 116°20′10″E 40°00′49″N 50 ZGCGY 中关村森林公园 Zhongguancun Forest Park 片林 Fragment forest 33 116°16′21″E 40°03′23″N 40 ASGY 奥林匹克森林公园 Olympic Forest Park 群状散生 Clustered scattered tree 16 116°23′08″E 40°00′20″N 40 
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表 2 北京市区国槐表型性状的统计分析
Table 2 Statistical analysis of phenotypic traits of S. japonica in Beijing urban area
性状 Trait 极小值 Min. value 极大值 Max. value 极差 Range 均值 Mean SD 变异系数 Coefficient of variation/% CLL/cm 15.35 30.25 14.90 22.15 2.66 12.03 CLW/cm 6.40 14.75 8.35 10.12 1.80 17.78 CLL/CLW 1.53 3.05 1.52 2.23 0.31 13.73 TLL/mm 31.09 82.15 51.06 50.10 9.43 18.82 TLW/mm 15.03 35.73 20.70 24.04 4.08 16.95 TLL/TLW 1.37 3.04 1.67 2.10 0.29 13.74 MLL/mm 34.78 85.75 50.97 52.45 9.29 17.72 MLW/mm 15.38 30.75 15.37 22.41 3.25 14.51 MLL/MLW 1.62 3.54 1.92 2.35 0.33 14.13 BLL/mm 18.89 65.04 46.15 34.03 8.28 24.34 BLW/mm 11.04 29.10 18.06 17.98 3.61 20.10 BLL/BLW 1.36 2.74 1.38 1.89 0.26 13.80 L* 30.97 42.77 11.80 35.07 2.33 6.65 a* −13.50 −6.73 6.77 −9.89 1.42 14.40 b* 8.53 25.67 17.14 14.66 3.21 21.86 C 10.90 29.00 18.10 17.71 3.40 19.21 h 48.24 65.36 17.12 55.60 2.78 5.01 FL/mm 10.71 19.46 8.75 12.86 1.46 11.34 FW/mm 6.56 10.58 4.02 8.19 0.67 8.21 FL/FW 1.20 2.07 0.87 1.58 0.17 11.04 FTGM/g 190.00 523.33 333.33 338.25 66.11 19.54 LN 6.00 30.00 24.00 14.30 4.03 28.18 DF 0.00 1.00 1.00 0.13 0.33 264.44 CW/m 4.00 11.10 7.10 6.91 1.55 22.39 CRR 0.64 1.64 1.00 1.04 0.15 14.31 CR 0.60 0.85 0.25 0.74 0.06 7.92 均值 Mean 25.08 注：CLL. 复叶长；CLW. 复叶宽；TLL. 顶生小叶长；TLW. 顶生小叶宽；MLL. 中部小叶长；MLW. 中部小叶宽；BLL. 基部小叶长；BLW. 基部小叶宽；FL. 果实纵径；FW. 果实横径；FTGM. 千粒质量；LN. 新枝皮孔数；DF. 叶背绒毛；CW. 冠幅；CRR. 树冠圆满度；CR. 树冠率；C. 色度；h. 色相角；L*. a*. b*为叶色参数。下同。 Notes: CLL, compound leaf length; CLW, compound leaf width; TLL, top leaflet length; TLW, top leaflet width; MLL, middle leaflet length; MLW, middle leaflet width; BLL, basal leaflet length; BLW, basal leaflet width; FL, fruit longitudinal diameter; FW, fruit transverse diameter; FTGM, thousand-grain mass; LN, number of new branch lenticels; DF, dorsal leaf villi; CW, crown width; CRR, crown round rate; CR, crown ratio; C, chroma; h, hue angle. L*, a*, b* represent leaf color parameters. The same below.
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表 3 北京市区国槐表型性状的均值及多重比较
Table 3 Mean value and multiple comparison of phenotypic traits of S. japonica in Beijing urban area
性状 Trait 居群 Population XFDJ BCXL ALXL YQL ZGCGY ASGY CLL/cm 23.87 ± 2.52a 22.34 ± 1.77bc 23.44 ± 2.3ab 22.14 ± 2.61bc 20.03 ± 2.24d 21.83 ± 2.36c CLW/cm 11.91 ± 1.74a 10.48 ± 1.67bc 10.26 ± 1.44bc 9.64 ± 1.60c 8.69 ± 1.11d 10.66 ± 1.59b CLL/CLW 2.04 ± 0.34b 2.17 ± 0.3ab 2.30 ± 0.22a 2.34 ± 0.38a 2.32 ± 0.27a 2.06 ± 0.17b TLL/mm 59.04 ± 9.55a 53.48 ± 9.96b 50.20 ± 8.26bc 46.82 ± 8.23cd 44.17 ± 6.05d 50.91 ± 7.92bc TLW/mm 27.26 ± 3.87a 24.98 ± 4.15ab 24.76 ± 3.98b 21.12 ± 3.54c 22.20 ± 3.11c 24.97 ± 2.96ab TLL/TLW 2.19 ± 0.39ab 2.15 ± 0.33ab 2.04 ± 0.23ab 2.23 ± 0.22a 2.00 ± 0.25b 2.04 ± 0.26ab MLL/mm 59.71 ± 10.89a 55.31 ± 8.22ab 55.04 ± 8.70ab 51.40 ± 7.21b 45.20 ± 5.65c 51.61 ± 7.57b MLL/mm 24.47 ± 3.15a 22.80 ± 2.98ab 23.36 ± 3.91a 21.08 ± 2.75b 20.88 ± 2.64b 22.46 ± 2.12ab MLL/MLW 2.47 ± 0.47a 2.45 ± 0.35a 2.38 ± 0.27ab 2.45 ± 0.28a 2.18 ± 0.28b 2.29 ± 0.21ab BLL/mm 39.91 ± 10.33a 36.23 ± 8.24ab 34.48 ± 6.74b 35.24 ± 6.98ab 28.00 ± 5.31c 34.05 ± 7.62b BLW/mm 20.68 ± 4.36a 18.22 ± 2.9b 18.17 ± 3.66b 18.79 ± 3.43ab 15.69 ± 2.29c 17.61 ± 3.04bc BLL/BLW 1.94 ± 0.35ab 1.98 ± 0.29a 1.91 ± 0.21ab 1.88 ± 0.17ab 1.79 ± 0.21b 1.94 ± 0.32ab L* 33.58 ± 1.35c 35.03 ± 2.04b 37.53 ± 2.22a 33.55 ± 2.16c 35.14 ± 1.72b 34.50 ± 1.67bc a* −8.71 ± 1.13a −9.61 ± 1.17b −11.48 ± 1.13c −8.89 ± 1.18a −10.12 ± 0.82b −9.70 ± 1.11b b* 12.62 ± 2.2dc 14.17 ± 2.97bc 17.93 ± 3.16a 12.32 ± 2.83d 15.29 ± 1.84b 13.78 ± 2.36bcd C 15.35 ± 2.41c 17.14 ± 3.08b 21.31 ± 3.18a 15.21 ± 2.95c 18.35 ± 1.87b 16.86 ± 2.50bc h 55.18 ± 2.03bc 55.40 ± 2.97abc 57.06 ± 2.75a 53.71 ± 3.03c 56.35 ± 2.31ab 54.63 ± 2.54c FL/mm 14.43 ± 2.04a 12.83 ± 1.22bc 12.59 ± 1.04bc 12.36 ± 0.81c 12.17 ± 0.97c 13.36 ± 1.35b FW/mm 8.76 ± 0.89a 7.92 ± 0.70b 8.11 ± 0.61b 8.06 ± 0.36b 8.09 ± 0.45b 8.28 ± 0.77b FL/LW 1.65 ± 0.18a 1.63 ± 0.20a 1.56 ± 0.18ab 1.54 ± 0.09ab 1.51 ± 0.15c 1.63 ± 0.20a FTGM/g 379.34 ± 77.07a 290.92 ± 73.53c 327.83 ± 60.28bc 342.51 ± 61.75ab 323.52 ± 46.04bc 377.92 ± 46.69a LN 15.10 ± 5.34ab 16.65 ± 4.43a 15.75 ± 3.38ab 14.80 ± 2.89ab 11.15 ± 2.50c 14.06 ± 2.86b DF 0.10 ± 0.30a 0.06 ± 0.24a 0.18 ± 0.39a 0.20 ± 0.41a 0.12 ± 0.33a 0.06 ± 0.25a CW/m 8.27 ± 0.99b 9.05 ± 0.97a 6.97 ± 0.69d 5.45 ± 0.59e 5.43 ± 0.67e 7.65 ± 0.89c CRR 1.05 ± 0.23a 1.07 ± 0.13a 1.04 ± 0.12a 0.98 ± 0.08a 1.04 ± 0.13a 1.03 ± 0.17a CR 0.76 ± 0.05bc 0.78 ± 0.05ab 0.74 ± 0.03c 0.64 ± 0.03d 0.75 ± 0.03c 0.79 ± 0.02a 注：不同小写字母代表样本间具有显著性差异。Note: different lowercase letters represent significant differences between samples.
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表 4 北京市区不同居群国槐表型性状的变异系数
Table 4 Coefficient of variation of phenotypic traits of S. japonica in different populations in Beijing urban area
性状 Trait 居群 Population 均值 Mean XFDJ BCXL ALXL YQL ZGCGY ASGY CLL 10.56 7.92 9.81 11.79 11.18 10.81 10.35 CLW 14.61 15.94 14.04 16.60 12.77 14.92 14.81 CLL/CLW 16.67 13.82 9.57 16.24 11.64 8.25 12.70 TLL 16.18 18.62 16.45 17.58 13.70 15.56 16.35 TLW 14.20 16.61 16.07 16.76 14.01 11.85 14.92 TLL/TLW 17.81 15.35 11.27 9.87 12.50 12.75 13.26 MLL 18.24 14.86 15.81 14.03 12.50 14.67 15.02 MLL 12.87 13.07 16.74 13.05 12.64 9.44 12.97 MLL/MLW 19.03 14.29 11.34 11.43 12.84 9.17 13.02 BLL 25.88 22.74 19.55 19.81 18.96 22.38 21.55 BLW 21.08 15.92 20.14 18.25 14.60 17.26 17.88 BLL/BLW 18.04 14.65 10.99 9.04 11.73 16.49 13.49 L* 4.02 5.82 5.92 6.44 4.89 4.84 5.32 a* 12.97 12.17 9.84 13.27 8.10 11.44 11.30 b* 17.43 20.96 17.62 22.97 12.03 17.13 18.02 C 15.70 17.97 14.92 19.40 10.19 14.83 15.50 h 3.68 5.36 4.82 5.64 4.10 4.65 4.71 FL 14.14 9.51 8.26 6.55 7.97 10.10 9.42 FW 10.16 8.84 7.52 4.47 5.56 9.30 7.64 FL/FW 10.91 12.27 11.54 5.84 9.93 12.27 10.46 FTGM 20.32 25.27 18.39 18.03 14.23 12.35 18.10 LN 35.36 26.61 21.46 19.53 22.42 20.34 24.29 DF 300.00 400.00 216.67 205.00 275.00 416.67 302.22 CW 11.97 10.72 9.90 10.83 12.34 11.63 11.23 CRR 21.90 12.15 11.54 8.16 12.50 16.50 13.79 CR 6.58 6.41 4.05 4.69 4.00 2.53 4.71 均值 Mean 26.55 29.15 20.55 20.20 21.63 28.01 24.35
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表 5 北京市区国槐表型性状的主成分因子载荷矩阵
Table 5 Principal component factor loading matrix of phenotypic traits of S. japonica in Beijing urban area
性状 Trait 成分 Component 1 2 3 4 5 6 7 8 CLL 0.523 0.023 0.411 0.157 −0.072 −0.034 0.101 0.547 CLW 0.814 −0.103 0.380 0.132 0.128 −0.049 0.038 −0.143 CLL/CLW −0.585 0.134 −0.115 0.004 −0.228 0.003 0.049 0.661 TLL 0.706 −0.055 0.459 0.102 0.327 0.022 −0.029 0.047 TLW 0.825 0.000 −0.177 0.088 0.326 −0.031 0.029 −0.039 TLL/TLW −0.059 −0.085 0.852 0.029 0.028 0.070 −0.076 0.117 MLL 0.807 −0.025 0.471 0.058 0.058 −0.018 0.134 0.093 MLL 0.870 −0.020 −0.287 0.120 0.088 0.052 0.073 0.091 MLL/MLW 0.103 −0.008 0.888 −0.049 −0.044 −0.050 0.089 0.019 BLL 0.817 −0.064 0.383 0.117 −0.058 0.002 0.095 −0.070 BLW 0.867 −0.104 −0.106 0.068 −0.152 0.078 0.045 0.018 BLL/BLW 0.191 0.042 0.790 0.107 0.098 −0.088 0.089 −0.165 L* −0.032 0.934 0.015 −0.099 0.022 −0.007 0.018 0.027 a* 0.087 −0.899 0.032 0.054 0.022 0.064 −0.095 −0.106 b* −0.064 0.992 −0.021 −0.039 0.014 0.000 0.003 0.000 C −0.072 0.987 −0.022 −0.043 0.005 −0.014 0.024 0.025 h −0.002 0.826 −0.027 −0.006 0.109 0.092 −0.145 −0.169 FL 0.261 −0.094 0.069 0.907 0.132 −0.101 0.020 −0.018 FW 0.165 −0.032 −0.017 0.441 −0.033 0.844 −0.017 0.026 FL/FW 0.139 −0.070 0.078 0.579 0.169 −0.756 0.037 −0.040 FTGM 0.095 −0.113 0.028 0.871 −0.113 0.231 0.011 −0.041 LN 0.312 0.015 0.044 0.085 −0.151 −0.144 0.680 0.018 DF 0.051 0.017 −0.052 0.053 −0.319 −0.103 −0.731 0.083 CW 0.333 −0.001 0.199 0.069 0.612 −0.050 0.261 0.151 CRR 0.084 −0.110 −0.038 −0.204 0.375 0.085 −0.221 0.547 CR 0.051 0.131 −0.025 0.016 0.858 −0.092 0.014 −0.063 特征值 Eigenvalue 5.696 4.435 3.229 2.295 1.785 1.440 1.219 1.203 方差贡献率 Variation contribution rate/% 21.908 17.058 12.421 8.827 6.864 5.538 4.688 4.627 累积方差贡献率 Cumulative variation contribution rate/% 21.908 38.966 51.387 60.214 67.079 72.617 77.304 81.931
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表 6 北京市区国槐表型性状综合得分与排名
Table 6 Comprehensive score and ranking of phenotypic traits of S. japonica in Beijing urban area
排名 Ranking 叶特征与冠幅 Leaf trait and crown width 叶色 Leaf color 果实饱满度 Fruit plumpness 编号
Code居群
Population综合得分
Comprehensive score编号
Code居群
Population综合得分
Comprehensive score编号
Code居群
Population综合得分
Comprehensive score1 10 XFDJ 5.060 25 ALXL 6.535 8 XFDJ 4.435 2 14 ALXL 3.984 26 ALXL 6.172 9 XFDJ 3.326 3 8 XFDJ 3.619 19 ALXL 4.652 20 XFDJ 3.030 4 3 BCXL 3.091 18 ALXL 3.860 7 XFDJ 2.883 5 2 BCXL 3.050 28 ALXL 3.788 4 ASGY 2.191 6 9 BCXL 2.948 8 ALXL 3.526 10 XFDJ 2.037 7 20 XFDJ 2.631 5 BCXL 3.424 17 ALXL 2.003 8 18 XFDJ 2.619 24 ALXL 3.150 2 ASGY 1.908 9 3 ALXL 2.471 27 ALXL 3.111 7 ASGY 1.459 10 1 ASGY 2.164 16 ALXL 3.011 6 XFDJ 1.353
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