Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of hybrid sweetgum embryogenic callus
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摘要:目的 杂交枫香是我国重要的用材和观赏树种资源，但其遗传转化体系尚未建立。建立杂交枫香遗传转化体系为杂交枫香性状改良和基因功能研究提供了方法。方法 本研究基于杂交枫香高效的体细胞胚胎发生技术，用根癌农杆菌介导的遗传转化法对其胚性愈伤组织进行遗传转化，对潮霉素选择压、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、以及共培养温度等影响因素采用正交试验等设计进行了研究。结果 潮霉素对胚性愈伤组织的最小致死质量浓度为10 mg/L；获得最多Gus阳性斑点数的组合的菌液OD600为0.8，共培养时间为3 d，侵染时间为10 min，共培养温度为25 ℃；获得最多转基因阳性愈伤组织的组合的菌液OD600为0.2，共培养时间为2 d，侵染时间为10 min，共培养温度为23 ℃；且通过极差分析，最优处理组合的共培养时间为2 d，菌液OD600为0.2，侵染时间为20 min，共培养温度为23 ℃。结论 经分子鉴定，共获得210个转基因阳性愈伤组织，初步建立了农杆菌介导的杂交枫香遗传转化体系，为阔叶树种愈伤组织的遗传转化提供了更多的可行性依据。Abstract:Objective Hybrid sweetgum is an important timber and ornamental tree resources in China, but its genetic transformation system has not been established yet. Establishing genetic transformation system of hybrid sweetgum provides a useful approach for trait improvement and allows us to conduct a functional identification of gene in hybrid sweetgum.Method Based on the efficient somatic embryogenesis of hybrid sweetgum, the embryogenic calluses were transformed by Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation. Factors influencing transformation were studied by orthogonal experiment, including hygromycin selective pressure, concentration of Agrobacterium, infection time, co-culture time and co-culture temperature.Result Results showed that the minimum lethal concentration of hygromycin to embryogenic callus was 10 mg/L. The number of Gus positive spots was highest when bacterium solution (OD600) was 0.8, co-culture time was 3 d, infection time was 10 min, co-culture temperature was 25 ℃. The most transgenic positive resistant calluses were obtained when bacterium solution (OD600) was 0.2, co-culture time was 2 d, infection time was 10 min, co-culture temperature was 23 ℃. And the optimal treatment combination was 0.2 bacterium solution (OD600), 2 d co-culture time, 20 min infection time, 23 ℃ co-culture temperature.Conclusion A total of 210 positive transgenic callus were obtained by molecular identification. The genetic transformation system was established, which provides more feasible foundation for the transformation of broadleaf tree callus.
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枫香属（Liquidambar）植物为金缕梅科（Hamamelidaceae）的高大落叶乔木[1]，具有极高的观赏价值、使用价值和生态价值。常绿阔叶树种多数在秋季叶片变黄，逐渐凋落，而中国枫香（Liquidambar formosana）在秋季经历较大的昼夜温差后，叶片逐渐转变为红色，是优良的观赏树木[2]，唐朝诗人杜牧即有“停车坐爱枫林晚，霜叶红于二月花”的赞叹。同时，枫香树形优美，木材坚硬，作建筑用材有“梁阁千年枫”之说，是制造家具、胶合板和包装材料的理想用材[3]。此外，枫香树有较为突出的生态价值，其涵养水源能力强，落叶量大，能优化土壤结构，改善林地生境[4]。
迄今为止，国内外在枫香遗传转化研究方面取得了一定进展。早在20世纪90年代，Sullivan和Lagrimini[5]利用含有gus：nptII的农杆菌对北美枫香（Liquidambar styraciflua ）叶片进行侵染，侵染7 min，28 ℃共培养3 d，成功获得转基因植株；Dowda等[6]将烟草（Nicotiana tabacum）阴离子过氧化物酶基因转入北美枫香叶片中；Walsh等[7]使用基因枪成功将gus：nptII转入北美枫香体细胞胚胎愈伤团。国内，许林、刘冉冉、雷莎等[8-10]以枫香叶片为材料，开展RNAi、PaFT和TA29-Barnase等遗传转化试验，将叶片预培养3 d后，使用OD600为0.5的农杆菌菌液对其进行侵染，侵染10 min，25 ℃共培养4 d后进行筛选培养，初步获得21株阳性转化苗；乔桂荣等[11]使用OD600为0.5的农杆菌菌液对枫香叶片进行侵染，侵染8 ~ 10 min，25 ℃共培养3 d后进行筛选培养，成功抑制植株中LEAFY基因的表达，获得了不育植株。与基因枪法、PEG介导法、点击法相比，农杆菌介导法技术最成熟，机理最明确，且操作简便易行，转化率高，是天然的植物基因转化方法。
以中国枫香为父本，北美枫香为母本进行控制授粉所获得的杂交枫香（Liquidambar styraciflua × L. formosana）在生长性状方面表现出明显的杂种优势[12]，但国内尚未有其遗传转化方面的研究，对杂交枫香遗传改良工作造成了巨大障碍。本研究以杂交枫香的胚性愈伤组织为受体材料，利用Gus基因的瞬时表达和稳定表达，探索根癌农杆菌介导的遗传转化过程中的若干因素，以期为杂交枫香改良育种和基因功能研究打下基础。
1. 材料与方法
1.1 植物材料
以本实验室前期积累的杂交枫香胚性细胞系作为材料，选择增殖能力强，胚性较好的胚性细胞系54号，见图1。
1.2 载体及农杆菌菌株
本研究所用农杆菌工程菌株为EHA105，携带插入了Gus的载体PCAMBIA1300，具有潮霉素（Hygromycin，Hyg，V900932）抗性标记，由本课题组构建。
1.3 转化过程所需试剂和培养基
筛选抗生素潮霉素（Hyg）、诱导转化物乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS，D134406）购自Sigma公司，抑菌抗生素头孢霉素（Cefotaxime sodium salt，Cef，CC3251）购自北京酷来博科技有限公司。试验所用培养基见表1。
表 1 实验所用培养基Table 1. Culture medium used in this research培养基 Culture medium 成分 Component LB固体培养基
LB solid medium5 g/L酵母抽提物 + 10 g/L胰蛋白胨 + 10 g/L NaCl + 50 mg/L Kan + 15 g/L 琼脂粉
5 g/L yeast extract + 10 g/L tryptone + 10 g/L NaCl + 50 mg/L Kan + 15 g/L agar液体增殖培养基
Liquid propagation medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白，pH调至5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate, adjust pH to 5.6 −5.7固体增殖培养基
Solid propagation medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶，pH调至5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel, adjust pH to 5.6 − 5.7共培养培养基
Co-culture medium基本培养基 + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶 + 50 μmol/L AS，pH调至5.2
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel + 50 μmol/L AS, adjust pH to 5.2恢复培养基
Recovery medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶 + 300 mg/L Cef，pH调至5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel + 300 mg/L Cef, adjust pH to
5.6−5.7筛选培养基
Screening medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶 + 300 mg/L Cef + 10 mg/L Hyg，pH调至
5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel + 300 mg/L Cef + 10 mg/L Hyg, adjust pH to 5.6−5.71.4 潮霉素选择压的确定
制备含潮霉素的培养基，利用0、5、10、15、20 mg/L质量浓度的潮霉素分别处理胚性愈伤组织，每个质量浓度重复3次。每个皿均接种7块生长状态良好的愈伤组织，记录初始鲜质量。每隔7 d测量愈伤鲜质量，计算愈伤鲜质量增长率。在愈伤鲜质量增长率保持负值的处理中选取较低潮霉素浓度，该潮霉素质量浓度为愈伤组织潮霉素抗性临界值。
1.5 胚性愈伤组织的遗传转化
1.5.1 胚性愈伤组织悬浮培养
选取生长状况良好的胚性愈伤组织放入液体增殖培养基中，每1 g愈伤组织放入盛有30 mL液体培养基的100 mL三角瓶中，置于23 ℃，黑暗条件下摇床120 r/min振荡培养10 d后，除去褐化严重的大块组织，剩余用于遗传转化。
1.5.2 农杆菌工程菌的培养与活化
取−80 ℃冰箱保存的试验用EHA105农杆菌工程菌株，在含有50 mg/L卡那霉素（Kan）的LB固体培养基上划线，28 ℃恒温培养2 d后，将活化的农杆菌刮入液体共培养培养基，28 ℃摇床震荡培养，直至菌块全部溶解，菌液均匀一致。
1.5.3 试验设计
对侵染试验中的菌液浓度、侵染时间、共培养时间、共培养温度4个影响因素采用L9（34）正交试验设计。
1.5.3.1 遗传转化
将菌液分为3份，分别调节至所需浓度，每份菌液体积保持50 mL。每份菌液放入3 g胚性愈伤组织，按照试验设计进行侵染，其间摇动数次。倒掉菌液，使用抽滤装置吸干细胞团表面的菌液。然后用共培养培养基将滤纸润湿，将胚性细胞团转入滤纸上，分别在设定温度条件下暗培养。
1.5.3.2 筛选培养
愈伤组织共培养结束后，用加入300 mg/L头孢霉素（Cef）的无菌水冲洗3 ~ 4次，每次20 min，使用抽滤装置吸干细胞团表面的废液，将胚性愈伤组织转移至恢复培养基内培养7 d后，再转移至筛选培养基，全部培养过程均处于23 ℃黑暗条件。每3 ~ 4周更换1次筛选培养基，将筛选所得抗性愈伤转移至新的筛选培养基。
1.6 转化材料的检测
1.6.1 Gus阳性检测
Gus检测使用GUS染色试剂（DE0175，北京拜尔迪生物技术有限公司），方法参照试剂盒。在显微镜下观察并统计Gus阳性斑点数。
1.6.2 PCR阳性鉴定
①抗性愈伤DNA提取：按新型植物基因组DNA提取试剂盒（DP320-03，天根生化科技（北京）有限公司）操作，将收集好的DNA放于−20 ℃备用。
②PCR检测：所用试剂为2 × TSINGKE Master Mix（TSE003，北京擎科新业生物技术有限公司），PCR引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成。以Gus、hpt序列为模板设计引物：Gus-F：5′CAGTGAAGGGCGAACAGTTC3′，Gus-R：5′GCGAAATATTCCCGTGCACT3′，片段大小为557 bp；hpt-F：5′ACA CTACATGGCGTGATTTCAT3′，hpt-R：5′TCCACTATCGGCGAGTACTTCT3′，片段大小为453 bp。为排除农杆菌污染导致的假阳性，还需要对农杆菌毒性基因VirD2片段进行扩增，以VirD2为模板设计引物：VirD2-F：5′TTCGTCACGGCATAGTCCTG3′，VirD2-R：5′TTGCTCGGTACGGATGGAAG3′，片段大小为656 bp。以上述提取的DNA为模板进行PCR扩增，反应体系见表2。PCR程序为：94 ℃预变性4 min，进入循环扩增阶段：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次，最后在72 ℃保温5 min，结束反应，将PCR产物放于4 ℃保存。将PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中恒压140 V下进行电泳分离30 min，检查目的条带。
表 2 PCR反应体系Table 2. PCR reaction system成分 Component 体积 Volume/μL 2 × PCR master mix 10.0 ddH2O 5.2 ~ 7.2 上游引物 Forward primer 0.4 下游引物 Reverse primer 0.4 模板 DNA Template DNA 2.0 ~ 4.0 总体积 Total volume 20.0 将能扩增出Gus、htp基因片段，而未扩增出VirD2基因片段的抗性愈伤组织定义为转基因阳性愈伤组织。
1.7 数据统计
愈伤鲜质量增长率 = （愈伤鲜质量 − 初始鲜质量）/初始鲜质量；
Gus阳性斑点数（个/mg） = Gus阳性斑点总数/被检测组织鲜质量（mg）；
抗性愈伤数（个/g） = 抗性愈伤总数/被侵染愈伤质量（g）；
PCR转基因阳性愈伤数（个/g） = PCR转基因阳性愈伤总数/被侵染愈伤质量（g）；
使用SPSS对试验数据进行方差分析和多重比较。
2. 结果与分析
2.1 潮霉素选择压的确定
本研究的筛选标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因（hygromycin phosphortransferase，hpt），该基因所编码的酶能使潮霉素磷酸化而失活。成功转入该基因的细胞能够在含有一定潮霉素的培养基上生长，而未转入该基因的愈伤则会褐化死亡，从而筛选出转基因细胞。因此，在进行遗传转化之前，要确定抑制未成功转化细胞生长的潮霉素浓度。
如图2所示，在培养1周时，所有愈伤组织鲜质量均有所增加。在培养2周时，在不含潮霉素的培养基上，愈伤鲜质量增长率为20.25%，但在加入5 mg/L潮霉素的培养基上，愈伤鲜质量增长率先降低后升高，说明愈伤组织在14 d后适应了该潮霉素浓度。但在加入10、15、20 mg/L潮霉素的培养基上，愈伤鲜质量增长率在7 d后开始下降，之后保持负值，说明组织质量不断降低，部分组织开始褐化死亡。该结果表明，10 mg/L的潮霉素足够有效抑制愈伤组织的增长，因此，在后续的遗传转化试验中使用10 mg/L潮霉素作为愈伤组织增殖的选择压。
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图 2 愈伤鲜质量增长率随培养天数和潮霉素质量浓度的变化Figure 2. Variation of callus fresh mass proliferation rate with incubation days and hygromycin mass concentration2.2 转化材料的Gus阳性检测
在遗传转化过程中，共培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养温度是影响遗传转化效率的关键因素。本研究通过Gus基因表达检测转化效率，图3中的蓝点即为Gus的表达位点，这些位点在以后的筛选过程中有长成抗性愈伤的可能。
表 3 农杆菌介导转化试验设计及转化结果Table 3. Experimental design and results of Agrobacterium-mediated transformation编号
No.共培养时间
Co-culture
time/dOD600
侵染时间
Infection
time/min共培养温度
Co-culture
temperature/℃Gus阳性斑点数/(个· mg−1)
Gus positive spot/
(number· mg−1)抗性愈伤/(个·g−1)
Resistant callus/
(number·g−1)PCR阳性愈伤/(个·g−1)
PCR positive callus/
(number·g−1)1 2 0.2 10 23 0.57Bc 52 50 2 2 0.5 20 25 5.41Bbc 41 39 3 2 0.8 30 28 10.40Bbc 0 0 4 3 0.2 20 28 1.20Bc 40 32 5 3 0.5 30 23 13.07Bb 13 12 6 3 0.8 10 25 26.85Aa 0 0 7 4 0.2 30 25 7.54Bbcc 21 19 8 4 0.5 10 28 9.06Bbc 0 0 9 4 0.8 20 23 14.91Ab 44 28 注：同一列中不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)；同一列中不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。Notes：different capital letters in a column mean very significant difference at P < 0.01 level; different lowercase letters in a column mean significant differences at P < 0.05 level. The same below. ![]()
图 3 Gus在愈伤组织中7 d后的表达情况A、B. 菌液OD600 = 0.2时，Gus表达情况；C. 菌液OD600 = 0.5时，Gus表达情况；D. 菌液OD600 = 0.8时，Gus表达情况。A, B, concentration of bacterium OD600 = 0.2, the expression of Gus; C, concentration of bacterium OD600 = 0.5, the expression of Gus; D, concentration of bacterium OD600 = 0.8, the expression of Gus.Figure 3. Expression of Gus in callus after 7 d如表3所示，6号处理组产生的Gus阳性斑点数最多，平均每1 mg愈伤组织有26.85个Gus阳性斑点，其次是9号处理组；1号处理组产生的Gus阳性斑点数最少，每1 mg愈伤组织仅有0.57个。
通过对正交试验的结果进行方差分析（表4），发现菌液浓度对Gus阳性斑点数影响极显著，其次为共培养天数；侵染时间和共培养温度影响不显著。其中，随着菌液浓度的增加，Gus阳性斑点数逐步升高（图3）。通过极差分析（表5）显示，本试验最优组合为共培养时间为3 d，菌液OD600为0.8，侵染时间为10 min，共培养温度为25 ℃。
表 4 不同条件下Gus 阳性斑点数方差分析Table 4. Variance analysis of Gus positive spots under different conditions变异来源 Source of variation 自由度 df 均方 MS F值 F value 显著性 Sig. 共培养天数 Co-culture time 2 155.590 5.111 0.017* OD600 2 462.420 15.189 0.000** 侵染时间 Infection time 2 57.321 1.883 0.181 共培养温度 Co-culture temperature 2 92.635 3.043 0.073 误差 Error 18 30.444 总计 Total 26 注：**表示影响极显著(P < 0.01)，*表示影响显著(P < 0.05)。Notes: ** represents significant influence (P < 0.01); * represents very significant influence (P < 0.05). 表 5 不同条件下Gus阳性斑点数极差分析Table 5. Range analysis of Gus positive spots under different conditions指标
Index各因素不同条件下Gus阳性斑点数/(个·mg−1)
Gus positive spots detected at different gradients
of each factor/(number·mg−1)共培养时间
Co-culture timeOD600 侵染时间
Infection time共培养温度
Co-culture temperatureK1 5.46 3.10 12.16 9.52 K2 13.71 9.18 7.17 13.27 K3 10.50 17.39 10.34 6.89 R 8.25 14.29 4.99 6.38 注： 1表示各因素水平分别为共培养时间为2 d，菌液OD600为0.2，侵染时间为10 min，共培养温度为23 ℃；2表示各因素水平分别为共培养时间为3 d，菌液OD600为0.5，侵染时间为20 min，共培养温度为25 ℃；3表示各因素水平分别为共培养时间为4 d，菌液OD600为0.8，侵染时间为10 min，共培养温度为28 ℃。下同。 Notes: 1 means that the level of each factor is 2 d co-culture time, 0.2 bacterium solution (OD600), 10 min infection time, 23 ℃ co-culture temperature respectively; 2 means that the level of each factor is 3 d co-culture time, 0.5 bacterium solution (OD600), 20 min infection time, 25 ℃ co-culture temperature respectively; 3 means that the level of each factor is 4 d co-culture time, 0.8 bacterium solution (OD600), 30 min infection time, 28 ℃ co-culture temperature respectively. The same below. 2.3 稳定遗传转化效率
经过遗传转化的胚性愈伤组织，在恢复培养基上进行恢复培养7 d后，组织开始恢复生长，此时将其转移至筛选培养基上筛选30 ~ 45 d后，部分细胞因不具有潮霉素抗性而褐化死亡，部分抗性组织则可以继续生长（图4A）。待抗性细胞团生长至直径为3 mm左右时，转接至新的筛选培养基上（图4B）。
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图 4 抗性愈伤组织A. 抗性愈伤组织在筛选培养基上生长；B. 抗性愈伤的进一步筛选。A, antibiotic-resistant callus formed on selective medium; B, develepment of antibiotic-resistant cell lines for further selection.Figure 4. Antibiotic-resistant callus经过3次筛选后，分别在处理1、2、4、5、7、9中得到稳定转化，其中在菌液浓度为0.2、侵染时间为10 min、共培养温度为23 ℃、共培养时间为2 d时，得到的抗性愈伤最多，平均每克组织能得到52个独立的抗性愈伤组织（表3）。
2.4 抗性愈伤组织的PCR检测
经Hyg筛选得到的抗性细胞系，均成功检测出Gus基因片段（图5A）和hpt基因片段（图5B）。同时VirD2基因片段扩增结果显示，农杆菌菌液成功扩增出该基因片段（阳性对照），而其他抗性细胞系及未侵染组织均无该基因片段条带（图6）。因此排除了因农杆菌污染导致PCR结果阳性的可能，证明成功发生遗传转化。据统计，共获得210个转基因阳性愈伤组织（表3），且组织抗性基本稳定。
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图 5 Hyg抗性细胞系PCR检测A. Gus 453 bp；B. hpt 557 bp；M. Trans2K Plus DNA Marker；W. 野生型；1-10、2-12、418、5-7、7-11、9-20. 转基因愈伤组织；+. 质粒阳性对照。下同。W, wild type；1−10, 2−12, 4−18, 5−7, 7−11, 9−20, transformed cell lines; +, plasmid for positive control. The same below.Figure 5. PCR analysis of hygromycin-resistant embryogenic cell line![]()
图 6 Hyg抗性细胞系VirD2基因PCR检测Figure 6. PCR analysis of VirD2 gene about hygromycin-resistant embryogenic cell line极差分析（表6）表明，在本试验中，菌液OD600是影响阳性愈伤组织数量的主要因素，且最优组合为：共培养时间2 d，菌液OD600为0.2，侵染时间20 min，共培养温度23 ℃。
表 6 不同条件下阳性愈伤组织数极差分析Table 6. Range analysis of the number of positive calluses under different conditions指标
Index各因素不同梯度时阳性愈伤组织数(个·g−1)
Number of positive calluses detected at different
gradients of each factor/(number·g−1)共培养时间
Co-culture timeOD600 侵染时间
Infection time共培养温度
Co-culture temperatureK1 89 101 50 90 K2 44 51 99 58 K3 47 28 31 32 R 45 73 68 58 3. 讨 论
3.1 潮霉素选择压的确定
抗生素的选择与植物材料对抗生素的敏感性密切相关，在完成植物材料侵染以后，需要对转化材料进行筛选，此时转基因组织因获得抗性基因可以在含有抗生素的培养基上生长，但非转基因组织则褐化死亡。潮霉素是一种常用的选择抗生素，对未转化材料的影响效果显著[14]，不易产生假阳性组织。于波[15]等报道，金茶花（Camellia nitidissima ）愈伤组织增殖的潮霉素选择压是25 mg/L；在葡萄风信子（Muscari armeniacum）胚性愈伤组织中，90 mg/L的潮霉素是最有效选择压[16]。由此可见，不同的植物材料对潮霉素的敏感性差异较大。本研究发现，杂交枫香胚性愈伤组织对潮霉素较为敏感，10 mg/L的潮霉素培养14 d时，愈伤组织质量开始下降，说明其生长完全被抑制，可以作为枫香遗传转化筛选过程中的选择压。
3.2 遗传转化中外植体的选择
在遗传转化过程中，外植体的再生能力影响着遗传转化的效率。在以往关于阔叶树种转基因的研究中，多采用嫩芽、叶片、茎段作为转化外植体，很少使用愈伤组织进行遗传转化[17-18]。在杨树（Populus spp.）的遗传转化研究中发现，一般生根继代培养30 d左右的叶片最适合转化[19]，也有一些研究结果表明，与叶片相比，茎段对农杆菌更加敏感，其转化效率高于叶片[20]。无论是选用哪一种外植体，都必须依托完整的、高效的植物再生体系。以往的枫香遗传转化研究中，多采用叶片作为外植体，但是使用叶片进行遗传转化，转化效率低，且易产生嵌合体，而且器官发生培养程序复杂，培养周期长。本研究中，我们基于高效的杂交枫香体细胞胚胎发生体系，使用胚性愈伤组织进行遗传转化。一方面，愈伤组织分化程度低，可以减少嵌合体发生，是优良的受体材料；另一方面，体胚发生所需时间短，通过体细胞胚胎发生途径中获得的高密度、高质量的体胚苗，比器官发生效率更高，大大缩短育种周期，加速功能验证的进程。
3.3 侵染阶段对遗传转化的影响
农杆菌侵染是遗传转化过程中的重要环节，合适的菌液OD600和侵染时间是决定能否成功转化的关键因素[21-22]。菌液OD600过低，侵染时间过短，造成侵染不充分，从而降低转化效率；菌液OD600过高，侵染时间过长，则会导致侵染后抑菌困难，造成受体材料的死亡[23]。牛淑庆等[24]以苹果（Malus domestica）愈伤组织为受体材料进行遗传转化，研究所得最适转化条件为菌液OD600为0.8，侵染20 min，共培养3 d。在枫香叶片的遗传转化中，刘冉冉[9]、雷莎[10]均调整菌液OD600为0.5后进行侵染，侵染时间为8 ~ 10 min时，转化效果最好。本研究结果则表明，在菌液OD600为0.8，侵染时间为10 min时，得到的Gus阳性斑点数最多，但最终在菌液OD600为0.2，侵染10 min的条件下获得的阳性愈组织数量最多。该结果表明，菌液OD600对于瞬时转化效果影响极显著，但菌液OD600过高可能对植物材料造成伤害，不利于后续抗性愈伤组织的形成。
3.4 共培养阶段对转化的影响
早在1999年，郝贵霞等人[25-26]在关于毛白杨（Populus tomentosa）和荔枝（Litchi chinensis ）的遗传转化研究中就指出，共培养时间直接影响转化细胞的数量和目的基因的整合。农杆菌侵染植物材料后不能立即完成转化，需要在植物组织创伤处生存16 h才能诱发肿瘤，完成T-DNA的转移，这段时间又称为“细胞调节期”[27]。共培养时间过短使侵染不充分，而共培养时间过长则容易造成植物材料污染，大量研究表明，根癌农杆菌需要附着在受体材料表面2 ~ 4 d才能成功转入[28-29]。此外，共培养温度会影响农杆菌和植物材料的生长，从而间接影响转化效率[30-31]。农友业等[32]研究发现，当共培养的温度为22 ℃，时间为3 d时能够获得最高玉米（Zea mays）抗性愈伤数，且显著高于其他共培养时间。卓仁英等[33]在进行枫香叶片的遗传转化时，在共培养温度为28 ℃，共培养3 d时，成功将含有盐诱导表达启动子的基因转入枫香叶片中，获得了转基因植株。与此不同，在本研究中，我们发现共培养温度为23 ℃、共培养2 d时，能获得更多的抗性愈伤组织和转基因阳性愈伤组织。但由于材料和时间有限，本研究未对正交试验最佳处理组合进一步验证，后续可开展相关试验，以期获得更多的转化事件。
综上所述，影响转化的因素较多且不同植物材料所需转化条件差异较大，需进行不断探索。本研究首次使用杂交枫香胚性愈伤组织为受体材料对其遗传转化体系进行了初步探索，经分子鉴定共获得210个转基因阳性愈伤组织，为杂交枫香的遗传改良奠定了基础，为阔叶树种愈伤组织的遗传转化提供了更多的可行性依据。
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图 2 愈伤鲜质量增长率随培养天数和潮霉素质量浓度的变化
Figure 2. Variation of callus fresh mass proliferation rate with incubation days and hygromycin mass concentration
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图 3 Gus在愈伤组织中7 d后的表达情况
A、B. 菌液OD600 = 0.2时，Gus表达情况；C. 菌液OD600 = 0.5时，Gus表达情况；D. 菌液OD600 = 0.8时，Gus表达情况。A, B, concentration of bacterium OD600 = 0.2, the expression of Gus; C, concentration of bacterium OD600 = 0.5, the expression of Gus; D, concentration of bacterium OD600 = 0.8, the expression of Gus.
Figure 3. Expression of Gus in callus after 7 d
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图 4 抗性愈伤组织
A. 抗性愈伤组织在筛选培养基上生长；B. 抗性愈伤的进一步筛选。A, antibiotic-resistant callus formed on selective medium; B, develepment of antibiotic-resistant cell lines for further selection.
Figure 4. Antibiotic-resistant callus
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图 5 Hyg抗性细胞系PCR检测
A. Gus 453 bp；B. hpt 557 bp；M. Trans2K Plus DNA Marker；W. 野生型；1-10、2-12、418、5-7、7-11、9-20. 转基因愈伤组织；+. 质粒阳性对照。下同。W, wild type；1−10, 2−12, 4−18, 5−7, 7−11, 9−20, transformed cell lines; +, plasmid for positive control. The same below.
Figure 5. PCR analysis of hygromycin-resistant embryogenic cell line
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图 6 Hyg抗性细胞系VirD2基因PCR检测
Figure 6. PCR analysis of VirD2 gene about hygromycin-resistant embryogenic cell line
表 1 实验所用培养基
Table 1 Culture medium used in this research
培养基 Culture medium 成分 Component LB固体培养基
LB solid medium5 g/L酵母抽提物 + 10 g/L胰蛋白胨 + 10 g/L NaCl + 50 mg/L Kan + 15 g/L 琼脂粉
5 g/L yeast extract + 10 g/L tryptone + 10 g/L NaCl + 50 mg/L Kan + 15 g/L agar液体增殖培养基
Liquid propagation medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白，pH调至5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate, adjust pH to 5.6 −5.7固体增殖培养基
Solid propagation medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶，pH调至5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel, adjust pH to 5.6 − 5.7共培养培养基
Co-culture medium基本培养基 + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶 + 50 μmol/L AS，pH调至5.2
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel + 50 μmol/L AS, adjust pH to 5.2恢复培养基
Recovery medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶 + 300 mg/L Cef，pH调至5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel + 300 mg/L Cef, adjust pH to
5.6−5.7筛选培养基
Screening medium基本培养基[13] + 40 g/L蔗糖 + 1 g/L酶水解酪蛋白 + 3 g/L植物凝胶 + 300 mg/L Cef + 10 mg/L Hyg，pH调至
5.6 ~ 5.7
Basal medium[13] + 40 g/L sucrose + 1 g/L casein hydrolysate + 3 g/L phytagel + 300 mg/L Cef + 10 mg/L Hyg, adjust pH to 5.6−5.7
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表 2 PCR反应体系
Table 2 PCR reaction system
成分 Component 体积 Volume/μL 2 × PCR master mix 10.0 ddH2O 5.2 ~ 7.2 上游引物 Forward primer 0.4 下游引物 Reverse primer 0.4 模板 DNA Template DNA 2.0 ~ 4.0 总体积 Total volume 20.0
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表 3 农杆菌介导转化试验设计及转化结果
Table 3 Experimental design and results of Agrobacterium-mediated transformation
编号
No.共培养时间
Co-culture
time/dOD600
侵染时间
Infection
time/min共培养温度
Co-culture
temperature/℃Gus阳性斑点数/(个· mg−1)
Gus positive spot/
(number· mg−1)抗性愈伤/(个·g−1)
Resistant callus/
(number·g−1)PCR阳性愈伤/(个·g−1)
PCR positive callus/
(number·g−1)1 2 0.2 10 23 0.57Bc 52 50 2 2 0.5 20 25 5.41Bbc 41 39 3 2 0.8 30 28 10.40Bbc 0 0 4 3 0.2 20 28 1.20Bc 40 32 5 3 0.5 30 23 13.07Bb 13 12 6 3 0.8 10 25 26.85Aa 0 0 7 4 0.2 30 25 7.54Bbcc 21 19 8 4 0.5 10 28 9.06Bbc 0 0 9 4 0.8 20 23 14.91Ab 44 28 注：同一列中不同大写字母表示差异极显著(P < 0.01)；同一列中不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。Notes：different capital letters in a column mean very significant difference at P < 0.01 level; different lowercase letters in a column mean significant differences at P < 0.05 level. The same below.
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表 4 不同条件下Gus 阳性斑点数方差分析
Table 4 Variance analysis of Gus positive spots under different conditions
变异来源 Source of variation 自由度 df 均方 MS F值 F value 显著性 Sig. 共培养天数 Co-culture time 2 155.590 5.111 0.017* OD600 2 462.420 15.189 0.000** 侵染时间 Infection time 2 57.321 1.883 0.181 共培养温度 Co-culture temperature 2 92.635 3.043 0.073 误差 Error 18 30.444 总计 Total 26 注：**表示影响极显著(P < 0.01)，*表示影响显著(P < 0.05)。Notes: ** represents significant influence (P < 0.01); * represents very significant influence (P < 0.05).
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表 5 不同条件下Gus阳性斑点数极差分析
Table 5 Range analysis of Gus positive spots under different conditions
指标
Index各因素不同条件下Gus阳性斑点数/(个·mg−1)
Gus positive spots detected at different gradients
of each factor/(number·mg−1)共培养时间
Co-culture timeOD600 侵染时间
Infection time共培养温度
Co-culture temperatureK1 5.46 3.10 12.16 9.52 K2 13.71 9.18 7.17 13.27 K3 10.50 17.39 10.34 6.89 R 8.25 14.29 4.99 6.38 注： 1表示各因素水平分别为共培养时间为2 d，菌液OD600为0.2，侵染时间为10 min，共培养温度为23 ℃；2表示各因素水平分别为共培养时间为3 d，菌液OD600为0.5，侵染时间为20 min，共培养温度为25 ℃；3表示各因素水平分别为共培养时间为4 d，菌液OD600为0.8，侵染时间为10 min，共培养温度为28 ℃。下同。 Notes: 1 means that the level of each factor is 2 d co-culture time, 0.2 bacterium solution (OD600), 10 min infection time, 23 ℃ co-culture temperature respectively; 2 means that the level of each factor is 3 d co-culture time, 0.5 bacterium solution (OD600), 20 min infection time, 25 ℃ co-culture temperature respectively; 3 means that the level of each factor is 4 d co-culture time, 0.8 bacterium solution (OD600), 30 min infection time, 28 ℃ co-culture temperature respectively. The same below.
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表 6 不同条件下阳性愈伤组织数极差分析
Table 6 Range analysis of the number of positive calluses under different conditions
指标
Index各因素不同梯度时阳性愈伤组织数(个·g−1)
Number of positive calluses detected at different
gradients of each factor/(number·g−1)共培养时间
Co-culture timeOD600 侵染时间
Infection time共培养温度
Co-culture temperatureK1 89 101 50 90 K2 44 51 99 58 K3 47 28 31 32 R 45 73 68 58
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