Effects of green waste compost on soil organic carbon fractions
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摘要:目的 研究园林绿化废弃物堆肥对土壤有机碳组分影响，为精准提升土壤肥力质量提供一定理论基础。方法 以北京市副中心林地土壤为研究对象，设置4种施肥方案，即不施肥（NF）、氮磷钾单施（MF）、园林绿化废弃物堆肥单施（GF）、氮磷钾和园林绿化废弃物堆肥混施（MF+GF），每种施肥方案氮磷钾施入量均为N 10 g/kg、P2O5 1.5 g/kg、K2O 5 g/kg，分别在施肥后1、3、6、9、12个月采集土壤样品，进行土壤有机碳组分研究。结果 不同施肥方案下，土壤富里酸碳、胡敏素碳和球囊霉素碳含量均呈现先增高后降低的趋势，在施肥后1个月达到最高，分别为0.98、5.03 g/kg和215.48 mg/kg。施肥1年后，土壤富里酸碳、胡敏酸碳、可溶性碳、碳水化合物和球囊霉素碳含量均表现为在GF和MF+GF方案下最高，而土壤胡敏素碳含量则表现出在MF方案下最高。施肥对球囊霉素碳的敏感性显著高于其他有机碳组分，敏感性指数4.80% ~ 229.03%。MF方案对土壤有机碳组分最不敏感，GF方案显著提高了土壤胡敏酸碳，胡敏素碳和球囊霉素碳敏感系数，MF+GF方案提高了土壤可溶性碳，富里酸碳和碳水化合物敏感系数。土壤球囊霉素碳与全氮和有效磷含量线性相关系数最高，分别为0.703 8和0.867 6。土壤碳水化合物与硝态氮和速效钾线性相关性系数最高，分别为0.524 6和0.586 9。结论 不同施肥方案对土壤碳组分均有影响，球囊霉素是有机碳组分最敏感指标，且与土壤全氮、有效磷含量线性相关性较强，可作为苗木施肥管理过程中衡量土壤肥力的指标。Abstract:Objective This paper aims to study the effects of green waste compost on soil organic carbon fractions, which provide a theoretical basis for accurately improving the soil fertility quality.Method Taking Beijing sub-center forest soil as the research object, and the experiment consisted of four fertilization schedules, i.e. no fertilizer (NF), mineral NPK fertilizer (MF), green waste compost fertilizer (GF), mineral NPK fertilizer plus green waste compost fertilizer (MF+GF). The amount of N, P and K applied in each fertilization scheme was 10 N, 1.5 P2O5, 5 K2O g/kg. Soil samples were collected after fertilization 1, 3, 6, 9, and 12 months, respectively, to determine soil organic carbon fractions.Result Under different fertilization schemes, soil FAC, HMC and GRSPC content showed increasing first and then decreasing, and reached highest after fertilization 1 month, which were 0.98, 5.03 g/kg and 215.48 mg/kg. After fertilization 1 year, soil FAC, HAC, DOC, carbohydrates and GRSPC content showed highest under GF and MF+GF schemes. However, HMC content was the highest under MF scheme. The sensitivity of GRSPC was significantly higher than other organic carbon fractions under different fertilization schemes, which was 4.80%−229.03%. MF scheme was the least sensitive to soil organic carbon fractions. GF scheme significantly increased the sensitivity index of soil HAC, HMC and GRSPC, and MF+GF scheme increased the sensitivity index of soil DOC, FAC and carbohydrate. The relationship between soil GRSPC and TN, AP had highest linear correlation coefficients, which were 0.703 8 and 0.867 6, respectively. The relationship between soil carbohydrate and NO3-N, AK had highest linear correlation coefficients, which were 0.524 6 and 0.586 9.Conclusion Different fertilization schemes had impact on soil organic carbon fractions. GRSPC was the most sensitive index of organic carbon fractions, and had highest correlation with soil TN and AP, which could be used as an index to measure soil fertility during forestry fertilization management.
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松栎柱锈菌(Cronartium orientale)是导致樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)、兴凯湖松(Pinus takahasii)和马尾松(Pinus massoniana)等2针松瘤锈病的森林有害生物，是一种转主寄生菌，其春孢子阶段寄生在松树枝干部[1-2]。当松树被松栎柱锈菌侵染致病后，其病原菌就会长期寄生在松树枝干部，并且病部肿瘤会逐年增大，给林分健康和林木生长造成极大危害[3]。黄酮类化合物具有较高的生物活性，是一种强抗氧化剂，能有效清除自由基从而延缓衰老和阻止细胞衰老、癌变，对人类心脑血管疾病也有很好的治疗和预防效果，具有较高的医疗和保健作用[4-8]。已有较多研究成果表明松科植物树皮与松针中黄酮类化合物含量丰富，具有较好的开发利用潜力[9-10]。国内学者如李石清等对南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)枝叶总黄酮的研究、冯慧英等对巴山冷杉(Abies fargesii)总黄酮的研究、王飞等对青扦(Picea wilsonii)针叶总黄酮的研究等均表明其易提取且具有较强的抗氧化能力[11-13]。
担子菌门(Basidiomycota)的许多菌类代谢产物已经被开发利用，关于担子菌的研究已经成为当代生命科学、食品科学和医药领域的热点[14-15]。锈菌目(Uredinales)隶属于担子菌门，目前却尚未发现任何关于锈菌目真菌开发利用的研究，这也表明我们对于锈菌目真菌的潜在价值知之甚少。本研究选择了锈菌目中寄生在松科植物上的易于采集的松栎柱锈菌春孢子为研究对象，进行了松栎柱锈菌春孢子黄酮类化合物(以下简称CQF)的提取与体外抗氧化活性的研究，旨在为锈菌目菌物开发利用、森林有害生物开发利用和提升与拓宽森林有害生物防治理念提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1 研究材料与预处理
松栎柱锈菌春孢子于2015年5月中旬采自大兴安岭地区，过80目筛后于45℃烘干至恒质量，密封冷藏。所用试剂盒均购自南京建成生物研究所；芦丁标准品，购自上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯；KQ-600B型超声波仪，昆山市超声波仪器有限公司；分析天平(感应量0.0001g)；Gene Quant 1300型分光光度计，美国GE公司。
2.2 测定波长的选择与标准曲线的建立
精密称取芦丁标准品10.0mg，使用体积分数为75%的乙醇溶液配制成50mL 0.2mg/mL的标准溶液。取上述标准溶液稀释为质量浓度为0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20mg/mL的芦丁溶液，分别吸取5mL上述各质量浓度芦丁溶液，置于1，2，3，4，5，6，7，8，9号共9支25mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠(NaNO2)溶液1.0mL，摇匀后室温下静置6min，再分别加入10%硝酸铝(Al(NO3)3)溶液1.0mL，摇匀后室温下静置6min，再加入1mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液8mL，用75%乙醇溶液定容至25mL。显色15min后取5号容量瓶进行紫外全波长扫描，以确定吸收峰。用蒸馏水调零后在300~900nm范围内的扫描，截取其在400~650nm范围内的吸光度变化示意图，结果如图 1所示。可知经过本方法处理过的黄酮类化合物在500~520nm处出现了明显的吸收峰，因此判断本方法能够用于CQF的测定。为减小红移和蓝移对检测结果的影响，选择510nm作为测定波长。
不同质量浓度芦丁标准品溶液按照本方法操作后，在510nm处测定各质量浓度对应的吸光度A，以芦丁标准品质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图 2所示。标准曲线的回归方程为y=2.5617x-0.001，回归方程的相关系数R2=0.9995，说明该检测方法可行，所得回归方程能够用来测定CQF质量浓度。
2.3 单因素试验
设定松栎柱锈菌春孢子黄酮类化合物的初始提取条件为：提取温度A=40℃、料液比B=1:40、提取时间C=1h、乙醇体积分数D=50%(v/v)；每次试验所用春孢子粉200mg；超声频率40kHz，超声功率600W。将所得提取液5000r/min离心8min，吸取上层清液按照2.2的方法进行测定样品吸光值A。根据2.2中所得芦丁标准曲线：y=2.5617x-0.001推算CQF提取液中CQF的质量浓度，并通过式(1)计算CQF的得率。采用控制变量法依次考察该提取条件下上述4个单因子对CQF得率的影响。
T=NnVm×100% (1) 式中：T为CQF得率，%；N为根据标准曲线计算出的CQF的质量浓度，mg/mL；n为稀释倍数；V为提取液的体积，mL；m为供试春孢子质量，mg。
2.4 得率建模试验
在单因子考察试验基础上，根据中心组合实验(central composite design)原理使用软件Design-Expert 8.0.6对提取温度(A)，料液比(B)，提取时间(C)，乙醇体积分数(D)这4个因子较优的水平进行了CQF得率的响应面建模试验。完成建模试验后使用建模试验数据建立CQF得率关于以上4个影响因素的二次多项式回归方程数学模型，对所得模型及各个影响因子进行方差分析。通过软件Design-Expert 8.0.6与所得数学模型得出最优CQF提取条件，并验证优化结果。建模试验各因素水平与实际值对应关系见表 1。
表 1 建模试验因子水平表Table 1. Factors and levels of flavonoid extraction experiment水平
Level影响因子Influencing factor 温度Temperature(A)/℃ 料液比Solid-liquid ratio(B)/(g·mL-1) 时间Time(C)/min 乙醇体积分数
Ethanol contentration(D)/%-2 35 1:100 20 50 -1 45 1:120 30 60 0 55 1:140 40 70 1 65 1:160 50 80 2 75 1:180 60 90 2.5 CQF抗氧化能力测定
除CQF的还原力与DPPH·清除能力之外，清除超氧阴离子(O2-·)活性、清除羟基自由基(·OH)活性和总抗氧化活性均采用从南京建成生物研究所购买的对应的试剂盒测定，并严格按照试剂盒使用说明执行。本文所有CQF体外抗氧化活性测定实验均以抗坏血酸(Vc)做阳性对照，用以评价CQF的体外抗氧化活性。
2.5.1 CQF还原力测定
用体积分数为50%的乙醇溶液将在建模试验中所收集的CQF溶液稀释为原来质量浓度的0.2、0.4、0.6、0.8和1.0倍，分别向装有1.0mL各质量浓度CQF溶液的试管中加入0.2mol/L的pH 6.6的磷酸缓冲溶液2.5mL，快速混匀后加入质量分数1%的铁氰化钾溶液2.5mL并在50℃下水浴20min。迅速冷却反应液并加入质量分数10%的三氯乙酸溶液2.5mL，充分混匀，3000r/min离心10min后取上清液3mL，依次加入3mL蒸馏水和1.0mL的0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀后静置10min，于700nm波长下测定溶液吸光度。吸光度越大还原能力也越大，计算公式如(2)。
A700=A样品−A空白 (2) 2.5.2 DPPH·清除能力测定
用95%乙醇溶液配置DPPH·浓度为0.2mmol/L的乙醇溶液，置于冰箱中避光冷藏备用。测定方法：测定管用2mL DPPH·乙醇溶液中加入2mL各质量浓度的CQF样品溶液，CQF质量浓度设置梯度与2.5.1相同。对照管用95%乙醇代替DPPH·溶液；空白管用蒸馏水代替CQF溶液。混匀器混匀后避光反应30min。波长调至517nm处用0.5mL蒸馏水和2.5mL 95%的乙醇调零，然后测定反应液吸光值A，每个质量浓度设置3个平行实验，结果取平均值。DPPH·自由基的清除率通过公式(3)计算得出。
DPPH⋅清除率=A0−(A1−A2)A0×100% (3) 式中：A0为2mL DPPH·乙醇溶液+2mL超纯水的吸光值；A1为2mL DPPH·乙醇溶液+2mL样品溶液后的吸光值；A2为2mL样品溶液+2mL超纯水的吸光值。
3. 结果与分析
3.1 单因子试验
3.1.1 乙醇体积分数对CQF得率的影响
由图 3可知，在其他影响因子不变的条件下，乙醇体积分数在50%~90%范围内变化导致CQF的得率先逐渐增大，当乙醇体积分数增至70%的时候，得率最大，但是仍然不足0.5%。当乙醇体积分数超过70%以后，随着体积分数的增加导致CQF得率骤降并逐渐趋于稳定。黄酮类化合物难溶于水，易溶于有机溶剂，水和乙醇可以以任意比例互溶。在水中加入不同量的乙醇，溶液的极性也随之不同，因而对某种或某类物质的溶解能力也不相同。根据所得实验结果绘制的折线图可以看出乙醇体积分数为70%是较优水平。
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图 3 乙醇体积分数对黄酮类化合物(CQF)得率的影响Figure 3. Effects of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids3.1.2 料液比对CQF得率的影响
根据图 4可以看出在其他条件不变的情况下，随着料液比的减小，CQF得率在不断升高，并逐渐趋于平稳，在料液比达到1:140以后，CQF得率增长幅度变小，得率增幅减小，因此选择1:140为较优水平。这一结果与CQF在50%乙醇溶液中的溶解度相关，当料液比较大时，CQF只有少部分溶于了乙醇溶剂，此时的提取液处于一种近饱和状态；随着提取液的增多，也就是料液比减小，未溶出的CQF部分也逐渐溶出，导致CQF的得率上升。当料液比减小到一定程度时，能溶于50%乙醇溶液的部分溶解殆尽，所以这时的得率逐渐趋于稳定，靠近极值。
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图 4 料液比对CQF得率的影响Figure 4. Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids3.1.3 提取温度对CQF得率的影响图
在其他试验条件不变的条件下，考察了温度在15~75℃之间变化对CQF得率的影响，通过考察发现CQF得率先随着温度升高而增大，随着温度升高至65℃以后又逐渐降低。当提取液温度较低时，分子获得的能量相对较少，分子运动缓慢，有效提取CQF耗费的时间增长，这一点可以通过分子扩散现象很好地解释。但是，温度的变化同样会影响溶剂分子之间的作用力，从而影响溶剂溶解溶质的能力，导致CQF得率也随之发生变化。也就是说温度的变化同时影响着CQF分子运动速率与溶剂，因而CQF得率受此二者的交互作用影响，CQF得率随提取温度的变化如图 5所示。
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图 5 提取温度对CQF提取率的影响Figure 5. Effects of extraction temperature on extraction rate of flavonoids3.1.4 提取时间对CQF得率的影响
在其他试验因子不变的条件下，考察提取时间对CQF得率的影响，结果显示提取时间对CQF得率的影响微弱，时间在20~60min变化时，CQF得率的变化始终处在0.46%~0.468%之间。CQF分子溶解到提取液中需要一定的时间，所以在提取时间40min以内时，CQF得率随着时间增加而增高，随着提取时间的延长，CQF的得率反而逐渐开始降低。这或许是因为部分原生质体内的CQF分子进入了细胞壁，因为细胞壁本身就可以容纳黄酮类化合物，另一方面，松栎柱锈菌春孢子表面具有油球，对黄酮类化合物具有一定的溶解能力。除此之外，随着溶剂分子运动时间的增加，乙醇分子扩散增多引起溶剂中乙醇浓度降低，从而导致CQF提取率也降低。CQF得率随提取时间的变化如图 6所示。
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图 6 提取时间对CQF提取率的影响Figure 6. Effects of extraction time on extraction rate of flavonoids3.2 响应面法分析
3.2.1 建模试验设计及结果
使用软件Design-Expert 8.0.6对提取温度(A)，料液比(B)，提取时间(C)，乙醇体积分数(D)这4个因子的较优水平进行CQF得率的响应面建模试验。试验因子水平设计如表 1所示，中心组合实验设计与结果见表 2。
表 2 中心组合实验设计与结果Table 2. Design and results of central composite design试验号
Run No.温度
Temperature(A)/℃料液比
Solid-liquid ratio(B)/(g·mL-1)时间
Time(C)/min乙醇体积分数
Ethanol concentration(D)/%得率
Yield(T)/%1 0 -2 0 0 1.6329 2 1 -1 -1 1 1.0071 3 -1 1 1 1 0.9619 4 1 1 1 -1 1.4116 5 2 0 0 0 1.2952 6 0 0 0 0 1.1149 7 -1 1 1 -1 1.1555 8 0 0 0 0 1.1586 9 1 -1 1 1 1.1196 10 0 0 0 0 1.0930 11 1 1 -1 -1 1.3928 12 0 0 0 2 0.7542 13 0 0 0 0 1.1477 14 -1 -1 1 1 0.9697 15 1 -1 -1 -1 1.2507 16 -1 -1 -1 -1 1.1524 17 -1 -1 -1 1 0.8713 18 1 1 1 1 1.1805 19 -1 1 -1 1 0.9993 20 0 2 0 0 1.1453 21 -1 -1 1 -1 1.1055 22 0 0 -2 0 1.2133 23 1 -1 1 -1 1.3959 24 0 0 2 0 0.1969 25 1 1 -1 1 1.0555 26 0 0 0 -2 1.1040 27 0 0 0 0 1.1258 28 -2 0 0 0 1.3675 29 0 0 0 0 1.1477 30 -1 1 -1 -1 1.2304 3.2.2 数学模型的建立与分析
以CQF的得率为响应值，通过使用软件Design-Expert 8.0.6对得率T与4个影响因子回归拟合之后，得到CQF关于4个影响因子的数学模型方程：
T=1.13+0.051A−0.019B−0.071C−0.11D+1.171e−3AB+0.029AC−0.015AD−0.017BC−3.513e−3BD+0.016CD+0.059A2+0.073B2−0.098C2−0.042D2 对该数学模型进行方差分析(表 3)可知该模型回归显著(P＜0.05)，失拟项不显著(P=0.149)，说明未知因素对CQF得率影响较小，模型拟合效果良好。在我们设置的4因子水平梯度范围内，乙醇体积分数D对于CQF得率的影响显著(P＜0.05)，这与黄酮类化合物易溶于有机溶剂难溶于水的化学性质密不可分。由F值可得出各个影响因子对CQF得率的影响程度大小顺序为：乙醇体积分数(D)＞提取时间(C)＞提取温度(A)＞料液比(B)。
表 3 数学模型方差分析Table 3. Parameter estimate of regression model and variance analysis方差来源
Variance source平方和Sum
f squares自由度
df均方
Mean squareF值
F valueP值
P value显著性
Significance模型Model 1.150 14 0.082 7.469 0.043 1 显著Significant 温度Temperature(A) 0.062 1 0.062 1.520 0.237 1 料液比Solid-liquid ratio(B) 0.009 1 0.009 0.210 0.650 1 时间Time(C) 0.120 1 0.120 2.900 0.109 1 乙醇体积分数Ethanol concentration(D) 0.290 1 0.290 7.010 0.018 3 AB 0.000 1 0.000 0.001 0.981 9 AC 0.013 1 0.013 0.320 0.577 2 AD 0.004 1 0.004 0.093 0.765 2 BC 0.005 1 0.005 0.120 0.736 6 BD 0.000 1 0.000 0.005 0.945 7 CD 0.004 1 0.004 0.100 0.756 6 A2 0.095 1 0.095 2.300 0.149 8 B2 0.150 1 0.150 3.580 0.078 1 C2 0.260 1 0.260 6.380 0.023 3 D2 0.048 1 0.048 1.160 0.297 5 残差Residual 0.620 15 0.041 失拟项Lack of fit 0.610 10 0.061 0.017 0.149 不显著Not significant 纯误差Pure error 0.003 5 0.001 总误差Total error 1.770 29 3.2.3 交互项对CQF得率的影响
响应面是以响应值与影响响应值的因子构建起了空间三维图形，可以让我们更直观的判断出两两不同影响因子交互作用对响应值的影响趋势以及响应值的变化范围。响应面图中颜色的变化表示响应值(CQF得率)的变化，颜色变化快，响应值变化也快，一般较低的响应值使用蓝色表示，较高的响应值用红色表示，其他颜色均为中间过渡颜色。同时，在一定方向和范围内响应面3D图形中坡度越大表示响应值变化的越快，即对CQF得率的影响更为显著。这一点在等高线图形中也有很好的体现，当某条线段在垂直其中一条轴的方向上移动时，在一定范围内与它所相交的等高线越多，则说明在该范围内某一因子对响应值的影响越显著。等高线表示在此条线上所有试验方案都能够得到相同的响应值，即虽然等高线所对应的试验条件不同，但是能够产生相同的实验结果。4个影响因子的两两之间交互作用对CQF得率的影响示意图见图 7。
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图 7 各因素交互作用对CQF得率影响的响应面与等高线图Figure 7. Response surface and contour plots for the interaction effects of various factors on extraction rate of CQF3.2.4 最佳提取工艺及验证
根据在3.2.2中对模型进行的方差分析，已经得知我们拟合出的回归方程模型显著，失拟项不显著，说明该方程是适合用于CQF得率与提取工艺的数学模型，所以我们可以借助于该方程确定最佳的CQF提取工艺。经软件Design-Expert 8.0.6分析，得知模型预测的最佳提取工艺为：提取温度65℃，料液比1:120，提取时间38min，提取液乙醇体积分数60%。在此条件下有对该优化结果进行了3次验证实验，3次验证实验所得出的CQF得率为1.382%，实际得率与在该条件下模型所预测的得率1.416%相差2.46%，这表明我们优化出来的CQF提取条件真实可靠，能够应用于实践。
3.3 抗氧化活性分析
3.3.1 CQF的还原力测定
还原力是评价物质抗氧化能力的重要指标之一，其原理是具有较强还原力的物质将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+在酸性环境中能与FeCl3产生有颜色的普鲁士蓝。在该检测体系下物质的还原力越强，对应的吸光值也越大。根据图 8可以看出，CQF与Vc的还原力与质量浓度均呈现很好的线性关系，拟合度均超过0.998。在图示浓度范围内，CQF和Vc的质量浓度与还原力均表现出较好的量效关系，相同质量浓度条件下CQF的还原力更强，而且CQF质量浓度与还原力的线性方程斜率更大，量效关系更为明显。在图示范围内，不论是量效关系还是还原力，CQF都强于Vc，说明CQF具备很好的还原力。
3.3.2 CQF对DPPH·的清除能力
在图 9中，根据受试物质量浓度与DPPH·清除率的散点图，我们可以看出Vc对DPPH·的清除能力较CQF强，并迅速逼近清除率最大值。在散点图的基础上，可以得出CQF与Vc清除DPPH·的IC50分别为0.0492mg/mL和0.0335mg/mL，也就是说对CQF对DPPH·清除能力较Vc差。但是随着CQF质量浓度的逐步增大，CQF对DPPH·清除能力也逐步增强，量效关系越来越明显。对于该种人工合成自由基，CQF的反应不够灵敏。
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图 9 受试物清除DPPH·能力的比较Figure 9. Comparison of DPPH· radical scavenging capacity of CQF and Vc3.3.3 CQF总抗氧化能力
生物活性物质总抗氧化能力是指活性物质清除各种自由基的有效总和。虽然已有多种测定抗氧化活性的方法，但这些方法只是从某个角度来衡量天然抗氧化物的活性。事实上，抗氧化作用涉及到多种作用机制，它涉及一系列的问题，目前尚未形成标准方法[16]。本实验测定总抗氧化能力采用的南京建成生物研究所试剂盒原理为FRAP法，在该种检测方法下，由图 10可以看出CQF与Vc的总抗氧化能力相当。根据散点图经计算得知，CQF的半抑制率IC50为0.0303mg/mL，而Vc的半抑制率为0.0240mg/mL，可以看出Vc的总抗氧化能力较CQF强，但是CQF与Vc趋势线在0.0654mg/mL处相交。整体来看，两种物质达到最大清除率都不需要较大浓度，量效关系相近，其总抗氧化能力并不具有很大的差异。所以说，CQF的总抗氧化能力还是非常理想的。
3.3.4 CQF对·OH的清除能力
羟基自由基(·OH)属于一种强氧化剂(E0=2.80V，3.06V)，氧化能力远大于一般氧化剂，是机体中最活跃的一种活性氧分子，具有很强的破坏性。它几乎可以和活细胞中的任何生物分子发生反应而造成损伤，而且反应速度极快[17]。因此，清除机体内过多的·OH具有非常重要的生物学意义。通过与Vc的对比测试，我们可以看出Vc在质量浓度0.016 ~0.080mg/mL范围内呈现线性变化规律，但对·OH较强的清除能力远低于CQF。由图 11可以非常明显的看出Vc与CQF在·OH清除能力上的差距。虽然Vc具有很强的还原性，不仅能够直接清除·OH，还能够阻断Fenton反应，从而减少体系中的·OH，但是CQF对·OH的敏感程度与清除能力依然远胜Vc。经测定，CQF对·OH清除能力的IC50仅为0.0129mg/mL，因为Vc对·OH的清除能力远小于CQF，故未予测定与计算其对·OH的半抑制率。
3.3.5 CQF对O2-·的清除能力
超氧阴离子O2-·经过一系列反应可以生成其他氧自由基，是大多数氧自由基的母体，能够攻击细胞DNA，具有较强的毒性，所以清除生物机体内过多的O2-·具有重要意义。理论上来讲，CQF能够提供电子从而有效清除自由基，但本课题在测定CQF清除O2-·能力时却发现了截然相反的实验结果。由图 12可知，两种受试物对清除O2-·都具有一定的量效关系，但是测定结果不在同一象限内。这也就是说在该中检测体系下受试物CQF非但没有清除O2-·，反而促进了O2-·的产生。所使用试剂盒检测原理为模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，黄嘌呤在黄嘌呤酶的催化下转化为尿酸，在此过程中能够产生O2-·，然后通过衡量O2-·的量来推算加入反应体系的物质时清除还是产生O2-·。黄酮类化合物作为电子提供物质，不会产生O2-·，但是CQF提取液是未经过除杂的，一些会对该反应体系产生影响的物质可能一并被提取了，比如说嘌呤或黄嘌呤氧化酶以及一些自氧化物质，这些物质生成O2-·的能力远超黄酮类物质清除O2-·的能力，所以才产生了如图 12所示的测定结果[18-20]。这一问题没有得到有效解决，所以尚不清楚导致该检测结果的具体原因，需要在后续工作中进一步研究导致该结果的具体原因与解决方法。黄嘌呤酶氧化法目前是测定O2-·最完善最普遍的方法，但是这种方法应该对待测样品设置一定的要求或合适的处理条件以排除干扰因子，需要我们进一步完善这种测定方法。
4. 结论与讨论
从微生物孢子中提取黄酮类化合物的例子尚不多见，在此背景下，本研究采用控制变量法逐个考察了能够影响CQF得率的4个因子。然后使用软件Design-Expert 8.0.6设计了建模试验，完成建模试验之后利用可靠的CQF得率数学模型得到了适用的最优CQF提取条件：提取温度65℃，料液比1:120，提取时间38min，提取液乙醇体积分数60%，在该提取条件下CQF得率为1.382%。虽然松栎柱锈菌春孢子具有厚且坚硬的几丁质细胞壁，能够有效阻止细胞内含物的流失以抵抗不良环境因素，但是我们使用一般植物总黄酮提取的方法并辅以超声振荡也提取到了CQF，说明醇提取法同样能够用于其他孢子总黄酮的提取并且达到了预期的CQF得率。总黄酮得率既取决于提取方法，也取决于实验材料总黄酮含量。一般来说针叶树实验材料总黄酮得率高于菌物但不足5%。闫琳娜通过对落叶松(Larix gmelinii)松针黄酮的研究发现落叶松松针总黄酮含量较高且在不同提取条件下得率都能达到6%以上[21]；孙琼优化了在菌物中黄酮类化合物含量相对较高的杏鲍菇(Pleurotus eryngii)黄酮类化合物的提取条件，但是得率仍然不足3%[22]。同时我们也看到了黄嘌呤酶氧化法在实际应用中暴露出来的问题，没能有效测定出CQF清除O2-·的能力，需要进一步明确并排除干扰因子或者改进O2-·检测方法。
黄晓冬等对阔叶树种白桦(Betula platyphylla)活体寄生真菌桦褐孔菌(Inonotus obliquus)总黄酮的研究表明其具有较强的体内外抗氧化活性[23]，Boonsong等研究了5种食用菌总酚与类黄酮的提取与抗氧化活性，发现乙醇溶液更适合菌物总酚的提取，其提取物均表现出较强的抗氧化活性，然而很多的食用菌不是活体寄生或不含有黄酮类物质[24]。整体来看，对于针叶树总黄酮的研究成果与热情远胜担子菌，而活体寄生的担子菌总黄酮的研究很鲜见。本研究所选研究对象将针叶树与担子菌门菌物总黄酮的研究很好地有机结合，旨在为锈菌目菌物开发利用、森林有害生物开发利用和转变森林有害生物防治理念提供科学依据。迄今为止，人类对锈菌的认知还很不完善，尚未看到国内外任何关于锈菌开发利用的报道。本研究首次完成了CQF的提取与体外抗氧化活性测定工作，发现CQF具有很强的还原力，还原力较Vc强；其次CQF的总抗氧化能力和DPPH·清除能力与Vc相当；CQF对·OH具有非常好的清除作用，这一能力远胜Vc，与Treml等对黄酮类化合物清除·OH能力的研究现状综述相一致[26]。体外试验结果为体内试验提供了一定的科学依据，这表明CQF具有开发利用的潜在价值。
长久以来，人类对于有害生物的认识是不全面的，往往只是单纯的从治理的角度去对待，总是尝试使用各种各样的手段降低或控制有害生物的种群数量。森林有害生物确实为林业生产活动和森林健康产生了很多负面的影响，如果说发现并证实某种有害生物有其独特的利用价值，那么它的某种功能或价值就能在一定程度上抵偿它所造成的损失，从而引导我们转变传统的有害生物防治理念。
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图 1 不同施肥方案土壤腐殖质碳组分变化特征
NF表示不施肥，MF表示氮磷钾单施，GF表示园林绿化废弃物堆肥单施，MF+GF表示氮磷钾和园林绿化废弃物堆肥混施。不同小写字母表示施肥方案间差异显著，不同大写字母表示在不同采样时间下差异显著。下同。NF represents no fertilizer; MF represents NPK fertilizer; GF represents green waste compost fertilization; MF+GF represents NPK fertilizer and green waste compost fertilization. Values followed by different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level at different fertilization schedules, and different capital letters indicate significant difference at 0.05 level at different sampling time after fertilization. The same below.
Figure 1. Dynamic variation characteristics of soil humus fractions under different fertilization schedules
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图 2 不同施肥方案土壤非腐殖质碳组分变化特征
Figure 2. Dynamic variation characteristics of soil non-humus fractions under different fertilization schedules
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图 3 不同施肥方案土壤有机碳组分敏感系数
Figure 3. Sensitivity coefficient of soil organic carbon fractions under different fertilization schedules
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图 4 不同施肥方案下土壤pH，全氮，铵态氮，硝态氮，有效磷，速效钾与土壤有机碳组分相关关系
**表示在P < 0.01水平上极显著相关；*表示在P < 0.05水平上显著相关。** means significant correlation at P < 0.01 level; * means significant correlation at P < 0.05 level.
Figure 4. Relationship between soil pH, TN, NH4 +-N, NO3 −-N, AP, AK and soil organic carbon fractions under different fertilization schedules
表 1 不同施肥方案肥料种类和施肥量
Table 1 Fertilizer types and fertilizing amounts under different fertilization schedules
施肥方案
Fertilization schedule肥料种类 Fertilizer type 尿素
Urea/g过磷酸钙
Superphosphate/g氯化钾
Kalium chloratum/g园林绿化废弃物堆肥
Green waste compost fertilizer/kg不施肥 None fertilizer (NF) 0 0 0 0 化肥单施 Mineral fertilizer (MF) 22.0 12.5 7.8 0 园林绿化废弃物堆肥单施
Green waste compost fertilizer (GF)0 0 0 0.66 化肥园林绿化废弃物堆肥混施
Mineral fertilizer + green waste compost fertilizer (MF+GF)11.0 6.2 3.6 0.33 
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表 2 不同施肥方案土壤化学性质变化特征
Table 2 Dynamic variation characteristics of soil chemical properties under different fertilization schedules
化学性质
Chemical property方案
Schedule施肥后采样时间/月 Sampling time after fertilization/month 0 1 3 6 9 12 pH NF 8.17 ± 0.01Aa 8.14 ± 0.02Ba 8.14 ± 0.0Ba 8.15 ± 0.00Ba 8.13 ± 0.00Ca 8.11 ± 0.00Da MF 8.17 ± 0.01Aa 7.69 ± 0.03Cd 8.01 ± 0.01Bb 8.01 ± 0.00Bb 8.02 ± 0.01Bc 8.02 ± 0.01Bd GF 8.17 ± 0.01Aa 8.05 ± 0.03Db 8.12 ± 0.01Ba 8.13 ± 0.03Ba 8.10 ± 0.00Cb 8.06 ± 0.01Db MF+GF 8.17 ± 0.01Aa 7.91 ± 0.01Fc 8.12 ± 0.01Ca 8.14 ± 0.01Ba 8.09 ± 0.01Db 8.04 ± 0.00Ec 全氮
Total nitrogen
(TN)/(g·kg−1)NF 0.96 ± 0.02Ba 1.02 ± 0.00Ad 0.99 ± 0.07ABc 0.84 ± 0.01Cc 0.60 ± 0.01Db 0.63 ± 0.01Db MF 0.96 ± 0.02Ba 1.19 ± 0.06Ac 1.04 ± 0.06Bc 0.85 ± 0.01Cc 0.66 ± 0.03Db 0.68 ± 0.02Db GF 0.96 ± 0.02Da 1.48 ± 0.10Aa 1.47 ± 0.04Aa 1.48 ± 0.01Aa 1.24 ± 0.00Ba 1.09 ± 0.01Ca MF+GF 0.96 ± 0.02Ca 1.27 ± 0.07Ab 1.16 ± 0.09Bb 1.25 ± 0.01Ab 1.24 ± 0.01Aa 1.13 ± 0.02Ba 铵态氮
Ammonium nitrogen
(NH4 +-N)/(mg·kg−1)NF 6.38 ± 0.42Aa 4.15 ± 0.30Bd 2.38 ± 0.18Cc 2.54 ± 0.10Cc 2.43 ± 0.10Cd 2.31 ± 0.17Cd MF 6.38 ± 0.42Ba 16.76 ± 0.74Aa 6.66 ± 0.56Ba 5.53 ± 0.13Cb 4.26 ± 0.23Dc 3.00 ± 0.21Ec GF 6.38 ± 0.42Ba 5.00 ± 0.41Dc 4.98 ± 0.30Db 5.18 ± 0.13Cb 6.88 ± 0.14Ab 6.94 ± 0.17Ab MF+GF 6.38 ± 0.42Ca 7.45 ± 0.17Bb 4.89 ± 0.12Db 6.01 ± 0.29Ca 7.79 ± 0.15Aa 7.98 ± 0.06Aa 硝态氮
Nitrate nitrogen
(NO3 −-N)/(mg·kg−1)NF 0.49 ± 0.06Ca 0.77 ± 0.08Bd 0.76 ± 0.03Bc 0.74 ± 0.02Bc 0.96 ± 0.10Ac 0.99 ± 0.03Ac MF 0.49 ± 0.06Fa 34.17 ± 2.03Aa 5.82 ± 0.15Ba 4.97 ± 0.08Ca 4.16 ± 0.07Db 3.93 ± 0.16Eb GF 0.49 ± 0.06Fa 10.57 ± 0.44Ac 2.48 ± 0.20Eb 3.40 ± 0.05Db 4.19 ± 0.17Cb 4.55 ± 0.16Bb MF+GF 0.49 ± 0.06Fa 20.17 ± 1.22Ab 5.06 ± 0.36Ea 5.73 ± 0.25Da 6.23 ± 0.26Ca 6.87 ± 0.09Ba 有效磷
Available phosphorus
(AP)/(mg· kg−1)NF 20.56 ± 1.67Aa 20.93 ± 2.46Ad 21.80 ± 0.98Ad 16.98 ± 2.94Bc 9.22 ± 0.56Cc 9.58 ± 0.21Cc MF 20.56 ± 1.67Ca 38.42 ± 3.16Ac 39.77 ± 2.62Ac 24.49 ± 1.83Bb 16.98 ± 0.28Db 15.37 ± 0.40Db GF 20.56 ± 1.67Ca 53.93 ± 3.75Aa 51.72 ± 4.83Aa 34.50 ± 2.61Ba 32.13 ± 2.42Ba 27.77 ± 5.80Ba MF+GF 20.56 ± 1.67Ea 49.26 ± 3.95Ab 46.30 ± 1.86Bb 33.40 ± 2.41Ca 30.56 ± 2.69Ca 24.92 ± 1.73Da 速效钾
Available potassium
(AK)/(mg· kg−1)NF 97.22 ± 0.00Aa 94.44 ± 4.81Bd 95.00 ± 3.85Bd 88.35 ± 2.65Cd 80.51 ± 0.00Dd 75.00 ± 2.30Ed MF 97.22 ± 0.00Ea 199.00 ± 2.99Aa 148.78 ± 2.80Ba 128.11 ± 1.68Cc 104.76 ± 0.36Dc 96.93 ± 3.25Ec GF 97.22 ± 0.00Ea 120.56 ± 4.84Dc 123.56 ± 2.89Cc 131.57 ± 4.16Ab 134.57 ± 1.51Ab 128.26 ± 2.44Bb MF+GF 97.22 ± 0.00Ca 149.11 ± 3.08Ab 139.33 ± 1.39Bb 148.06 ± 2.65Aa 152.83 ± 1.92Aa 141.33 ± 1.10Ba
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