Cloning, subcellular localization and expression analysis of telomere genes CcTBP1 and CcPOT1 in ancient Cinnamomum camphora
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摘要:目的 端粒基因在植物组织衰老和分化过程中发挥着重要的调控作用。本研究通过对古樟端粒基因CcTBP1和CcPOT1进行克隆与生物信息学分析、亚细胞定位及在古樟及其复幼扦插苗中的表达水平检测，初步揭示端粒基因在古樟复幼扦插不定根发生过程中的功能，为探究古樟复幼的端粒调控机理奠定基础。方法 本研究以1200年树龄的古樟为研究材料，提取叶片RNA，利用PCR和同源克隆相结合的方法克隆端粒基因CcTBP1和CcPOT1，并对其序列进行生物信息学分析；通过构建过表达载体进行亚细胞定位分析；以及通过实时荧光定量（qRT-PCR）分析CcTBP1和CcPOT1在古樟及其复幼扦插苗不同组织和不定根发生过程中的表达模式。结果 （1）克隆获得2个端粒基因，分别命名为CcTBP1和CcPOT1。CcTBP1基因编码序列（CDS）长2163 bp，编码720个氨基酸；CcPOT1基因CDS序列长1407 bp，编码468个氨基酸。（2）序列相似性和系统进化树分析结果显示：CcTBP1蛋白与牛樟RWR76720.1序列相似性高达98%，二者亲缘关系最近；CcPOT1蛋白与牛樟RWR96964.1序列相似性高达99%，二者亲缘关系最近。（3）亚细胞定位分析结果显示：CcTBP1蛋白定位在细胞核中，CcPOT1蛋白定位在细胞质和细胞核中。（4）根茎叶qRT-PCR表达分析发现，CcTBP1基因在古樟根中的表达水平最高，CcPOT1基因在复幼扦插苗根中的表达水平最高。不定根发生过程中的表达分析发现：CcTBP1呈下调表达趋势，在古樟不定根中的表达量高于复幼扦插苗；CcPOT1基因呈上调表达趋势，在古樟不定根中的表达量低于复幼扦插苗。结论 古樟端粒基因CcTBP1和CcPOT1在古樟复幼不定根发生过程中具有重要的调控功能。Abstract:Objective Telomere genes play an important role in the process of plant tissue senescence and differentiation. In this study, the telomere genes CcTBP1 and CcPOT1 of ancient Cinnamomum camphora were cloned and analyzed by bioinformatics, subcellular localization and detection of their expression level in ancient C. camphora and its rejuvenating cuttings, to preliminarily reveal the function of telomere genes in the process of adventitious root formation of ancient C. camphora rejuvenating cuttings, and lay a foundation for exploring the telomere regulation mechanism of ancient C. camphora rejuvenating cuttings.Method In this study, leaf RNA was extracted from 1200 years old ancient C. camphora. The telomere genes CcTBP1 and CcPOT1 were cloned by PCR and homologous cloning, as well the bioinformatics analysis was conducted to their sequences. The over-expression vector was constructed for subcellular localization analysis. The CcTBP1 and CcPOT1 expression level of different tissues and adventitious root formation process was analyzed by qRT-PCR in ancient C. camphora and its rejuvenation cutting seedlings.Result (1) Two telomere genes were cloned, named CcTBP1 and CcPOT1, respectively. The CDS sequence of CcTBP1 gene was 2 163 bp and encoded 720 amino acids. The CDS sequence of CcPOT1 gene was 1 407 bp and encoded 468 amino acids. (2) The results of sequence similarity and phylogenetic tree analysis showed that the sequence similarity of CcTBP1 protein and Cinnamomum kanehirae RWR76720.1 was 98%, and their genetic relationship was the closest; the sequence similarity of CcPOT1 protein and Cinnamomum kanehirae RWR96964.1 was as high as 99%, and their genetic relationship was the closest. (3) Subcellular localization analysis showed that CcTBP1 protein was located in the nucleus, and CcPOT1 protein was located in the cytoplasm and nucleus. (4) The qRT-PCR expression analysis in root, stem and leaf showed that the expression level of CcTBP1 gene was highest in root of ancient C. camphora, the expression level of CcPOT1 gene was highest in root of rejuvenation cutting seedlings. Expression analysis showed CcTBP1 was down-regulated tendency during adventitious root formation process, and the expression level of ancient C. camphora was higher than rejuvenation cutting seedlings. And CcPOT1 gene was up-regulated tendency during adventitious root formation process, and the expression level of ancient C. camphora was lower than rejuvenation cutting seedlings.Conclusion The telomere genes CcTBP1 and CcPOT1 play an important regulation function in the adventitous root formation process of ancient C. camphora rejuvenation.
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端粒是线性真核生物染色体的末端区域，对基因组的稳定和染色体的完整至关重要[1]。端粒结构是由端粒DNA、组蛋白八聚体及与端粒DNA相结合的蛋白组成[2]。端粒具有阻止DNA损伤、染色体末端融合和退化的功能[3-4]。目前端粒生物学研究主要集中在动物及少数植物物种中，在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中研究较深入[5-6]。几乎所有高等植物的端粒都是由七核苷酸拟南芥端粒重复序列（TTTAGGG）n组成[7]。端粒除简单的核苷酸重复序列外，还包含特殊的非核小体蛋白。在基因层面上，众多的端粒及端粒酶相关的基因蛋白在植物DNA修复和细胞生长等进程中发挥着重要的端粒和非端粒功能[8]。
端粒结合蛋白（telomere binding proteins，TBPs）是可以和端粒双链dsDNA特异性结合的蛋白[9]，在水稻（Oryza sativa）中第一次鉴定得到（RTBP1）[10]。端粒结合蛋白1（TBP1）可以通过与端粒结合，阻碍端粒酶发挥调控端粒长度的功能。拟南芥端粒结合蛋白（AtTBP1）可以与植物端粒重复序列TTTAGGG特异性结合，研究显示其在基因组中以单拷贝形式存在，并在各个组织中均有表达，推测其可能在调控端粒功能过程中发挥重要作用[5]。水稻端粒结合蛋白（RTBP1）负调控端粒长度，敲除RTBP1后，水稻突变体的端粒长度明显长于野生型，但4代以后植株的生长发育受到严重干扰，细胞分裂后期染色体融合频率增加[11]。
端粒保护蛋白1（protection of telomeres 1，POT1）是Shelterin复合体中唯一能够特异性地与单链ssDNA直接连接的蛋白。研究发现POT1蛋白广泛存在于植物、动物和人类等真核生物细胞中，在细胞分裂和分化、染色体末端保护及端粒长度的调控方面起着重要的作用[1,12]。POT1蛋白第一次鉴定于人类（Homo sapiens）和裂殖酵母（Saccharomyces pombe）细胞中[13]。Tani和Murata [14]于2005年在拟南芥中鉴定到2个POT1蛋白，分别命名为AtPOT1-1、AtPOT1-2；Rossignol等[15]于2007年在拟南芥中鉴定到3个POT1蛋白，分别命名为AtPot1a、AtPot1b、AtPot1c，功能分析显示都参与了端粒调控。在侧柏（Platycladus orientalis）古树叶片中也克隆到了全长为1337 bp的PoPOT1基因，含有hPOT_OB1_like保守结构域，与RPA-2b-aaRSs-OBF-like super family有1个相同的结构域[16]。
香樟（Cinnamomum camphora）是我国长江流域及其以南地区重要的珍贵乡土树种，具有重要的材用、药用及观赏等生态和经济价值。古樟（古香樟）遍布江西全省各地，千年以上的古樟甚至成为多地的重要景观，更是研究香樟乃至当地自然地理变迁的宝贵种质资源[17]。由于生理年龄已经处于生长发育的衰老期，不少古樟已衰老甚至死亡，被列入《中国物种红色目录》[18]。复幼是组织器官成熟特征消失及幼态特征恢复的过程[19]。扦插作为复幼的一种重要方法，可以恢复林木母株幼龄生理年龄，重新获得组织分化能力，其中不定根形成是复幼的关键过程[20]。然而，高龄古树扦插存在生根难的瓶颈问题[21]。研究也发现，扦插和嫁接等复幼措施可以显著提高生根率，促进生根[22-23]。端粒是细胞分化和分裂的分子标记，端粒基因在调控植物发育过程中具有重要的功能[24]。古樟扦插不定根的形成是一个高度复杂和有序的生物学过程，但其不定根形成的扦插复幼机理尚不清楚，特别是与无性繁殖能力密切相关的端粒基因在古樟扦插不定根形成过程中的功能还没有相关报道。因此，本研究从古樟叶片中克隆2个端粒基因CcTBP1和CcPOT1，并对其理化性质、保守结构、系统进化、亚细胞定位以及在古樟扦插复幼前后过程中的表达水平进行了分析，旨在为深入了解古樟扦插复幼的端粒基因调控分子机理提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本研究选取江西省乐安县“中国第一古樟林”古樟群落中1株树龄为1200年的古樟，于2020年5月份采取当年生幼嫩叶片，液氮速冻后带回实验室−80 ℃保存。前期通过扦插获得了1200年古樟的2年生复幼苗，保存于南昌县黄马实验基地。本氏烟草种子保存于本实验室。
1.2 香樟CcTBP1和CcPOT1基因的克隆及生物信息学分析
香樟和牛樟（Cinnamomum kanehirae）在物种分类上属于同属物种，根据牛樟基因组的参考序列（assembly：GCA_003546025.1），在NCBI（National Center for Biotechnology Information）搜索POT1蛋白得到RWR96964.1序列；下载TBP1同源基因序列，并在牛樟基因组中进行比对，选择比对到含有TBP1保守结构域SANT/Myb的蛋白，得到RWR76720.1序列。根据牛樟基因组RWR96964.1和RWR76720.1蛋白相应基因的编码序列（CDS），设计从启动子到终止子包含CDS序列的引物（表1）。利用Trizol法提取古樟叶片RNA，反转录成cDNA，利用PrimeSTAR® HS（Premix）高保真酶扩增进行TA克隆测序。
表 1 基因克隆、定位及表达分析的引物序列Table 1. Primer sequences of gene cloning, localization and expression analysis引物名称
Primer name引物序列（5′—3′）
Primer sequence (5′−3′)用途
ApplicationTBP1-F ATGGTGTTTCAGAAGAAATTA 基因克隆
Gene cloningTBP1-R TTAGTGGACAAGGCAAGGAGG POT1-F ATGGAGAATATCATAGAAAAC POT1-R TCACCCAATTAGCTTGGTGCC CcTBP1-F CGGGGTACCATGGTGTTTCAGAAGAAA 亚细胞定位
Subcellular localizationCcTBP1-R TGCTCTAGAGTGGACAAGGCAAGGAGG CcPOT1-F CGGGGTACCATGGAGAATATCATAGAA CcPOT1-R TGCTCTAGACCCAATTAGCTTGGTGCC CcTBP1-F1 CCCATGATGGAAAAGTGGAGGA 基因表达分析
Gene expression analysisCcTBP1-R1 GATTTTGAGCGCTGCCATACAT CcPOT1-F1 AGGTTAATCTCTTGGCCGTTGT CcPOT1-R1 ACGACTTGACATGTGGTAGCTT PtActin-F CTCCATCATGAAATGCGATG 内参基因
Reference genePtActin-R TTGGGGCTAGTGCTGAGATT 注：下划线GGTACC、TCTAGA分别为Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点。Notes：underline GGTACC and TCTAGA indicate Kpn Ⅰ and Xba Ⅰ digestion sites, respectively. 使用NCBI网站里的ORF finder软件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）对克隆的序列预测开放阅读框（ORF）。使用ProtParam tool在线分析软件（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质的基本理化性质。利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）软件在线预测跨膜结构，通过SignalP-5.0Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）软件在线预测信号肽结构。利用NCBI在线软件Conserved Domain Search Service分析蛋白质的保守结构域。通过Plant-mPLoc Server（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）在线软件进行亚细胞定位预测。
利用NCBI的Protein BLAST在线比对TBP1和POT1蛋白序列，下载同源性较高的不同植物的TBP1和POT1同源性蛋白序列。利用ClustalX 2.1进行蛋白序列比对，输出结果导入到BioEdit 7.2.5软件做比对图。利用MEGA 7.0对香樟和牛樟及其他物种的TBP1和POT1蛋白家族进行系统进化分析，利用ClustalW程序比对蛋白序列，用邻位相连法（neighbor-joining，NJ）方法构建进化树，进行1 000 次Bootstrap统计学检验。
1.3 古樟CcTBP1和CcPOT1基因载体构建与亚细胞定位
根据克隆到的古樟基因cDNA序列，分别设计加KpnI/XbaI酶切位点的CcTBP1基因引物CcTBP1-F和CcTBP1-R，及加KpnI/XbaI酶切位点的CcPOT1基因引物CcPOT1-F和CcPOT1-R（表1）。使用酶切连接的方法构建带有绿色荧光蛋白标记（green fluorescent protein，GFP）的pCAMBIA1300-35S-GFP载体。电击法转化GV3101农杆菌，对用利福平（Rif）、庆大霉素（Gen）和卡那霉素（Kan）3种抗生素筛选过的农杆菌菌液进行PCR检测。采用浸染法，将带有目的基因的农杆菌菌液浸染到本式烟草叶片下表皮细胞中，暗培养3 h后继续培养2 d，取1 ~ 2 cm2叶片进行镜检，用激光共聚焦显微镜（Nikon C2-ER）观察并拍照。
1.4 实时荧光定量qRT-PCR分析
于5月份采集1200年古樟及其2年生复幼扦插苗当年生幼嫩的根茎叶，用蒸馏水冲洗干净后立即放入液氮冷冻，保存在−80 ℃备用，用于古樟端粒基因CcTBP1和CcPOT1的qRT-PCR表达分析。同时采集当年生幼嫩春梢扦插在“营养土 + 红心土 + 珍珠岩”基质中，采用全光照自动间歇喷雾装置进行管理。
分别在古樟及其复幼扦插苗不定根发生过程第0、25、45和75天取插穗基部及根部组织，选取生长一致的穗条，3个生物学重复。采取的样品用蒸馏水快速反复冲洗干净后，用滤纸吸干水分，立即放入液氮冷冻，然后储存在−80 ℃备用。
用Trizol法提取古樟保存样品组织的RNA，反转录成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Takara）试剂，在ABI 7500 Real-time PCR仪上分析CcTBP1和CcPOT1基因的实时荧光表达量，以毛白杨（Populus tomentosa）PtActin为内参基因，3个生物学重复。PCR反应体系为：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，左右引物（10 μmol/L）各1 μL，3 μL cDNA，5 μL ddH2O，共20 μL。扩增步骤为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保温。根据各个样本的Ct值，采用2−∆∆Ct法分析数据，用GraphPad Prism 5绘制柱形图。
2. 结果与分析
2.1 古樟CcTBP1和CcPOT1基因的克隆和序列分析
根据牛樟TBP1和POT1基因序列，提取古樟叶片RNA反转录成cDNA，利用同源克隆的方法进行克隆。古樟TBP1基因PCR反应在2 000 bp附近获得扩增条带，并测序得到CDS序列长2 163 bp（图1A），编码720个氨基酸。蛋白理化性质分析显示：TBP1蛋白质分子量为80.46 kDa，理论等电点为8.38，不存在信号肽和跨膜结构，亚细胞定位预测定位在细胞核中，命名为CcTBP1（表2）。古樟POT1基因在1 500 bp附近获得扩增条带，并测序得到CDS序列长1407 bp（图1B），编码468个氨基酸。蛋白理化性质分析显示：POT1蛋白质分子量为53.13 kDa，理论等电点为6.13，不存在信号肽和跨膜结构，亚细胞定位预测定位在叶绿体中，命名为CcPOT1（表2）。
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图 1 古樟端粒基因CcTBP1（A）和CcPOT1（B）CDS序列扩增电泳图Figure 1. Amplification electrophoresis map of CDS sequence of telomere genes CcTBP1 (A) and CcPOT1 (B) in ancient Cinnamomum camphora表 2 古樟CcTBP1和CcPOT1蛋白理化性质Table 2. Physicochemical properties of CcTBP1和CcPOT1 protein in ancient C. camphora蛋白名称
Protein name氨基酸数量
Quantity of amino acid分子量
Molecular mass/kDa等电点
Isoelectric point信号肽结构
Signal peptide structure跨膜结构
Transmembrane structure亚细胞定位预测
Subcellular localization predictionCcTBP1 720 80.46 8.38 不存在 Absent 不存在 Absent 细胞核 Nucleus CcPOT1 468 53.13 6.13 不存在 Absent 不存在 Absent 叶绿体 Chloroplast 利用NCBI在线软件分析蛋白质的保守结构域发现：香樟CcTBP1蛋白存在保守结构域SANT，SANT_TRF基序由51个氨基酸组成，属于端粒重复结合因子DNA结合域SANT/myb家族；CcPOT1蛋白存在2个保守结构域RPA_2b-aaRSs_OBF_like和Pot1C，含有2个OB基序hPOT1_OB1_like和hPOT1_OB2。
2.2 不同物种TBP1和POT1蛋白序列比对和系统进化树分析
为了比较古樟CcTBP1和CcPOT1蛋白与其他物种TBP1和POT1蛋白的亲缘关系，通过NCBI网站利用blastp工具将TBP1和POT1蛋白氨基酸序列与其他物种进行同源比对，分别下载同源性较高的11条TBP1及14条POT1蛋白序列。
其他物种11条TBP蛋白序列如下：RWR76720.1（牛樟Cinnamomum kanehirae）、XP_010262528.1（荷花Nelumbo nucifera）、XP_011042712.1（胡杨Populus euphratica）、XP_030929695.1（美洲栎Quercus lobata）、XP_024156560.1（月季Rosa chinensis）、NP_001281048.1（苹果Malus domestica）、XP_021653835.1（橡胶树Hevea brasiliensis）、XP_008222427.1（梅Prunus mume）、XP_015874014.1（枣Ziziphus jujuba）、AED91945.1（拟南芥Arabidopsis thaliana）和XP_010032390.1（巨桉Eucalyptus grandis）。序列比对结果（图2）显示：CcTBP1蛋白与牛樟RWR76720.1蛋白长度相同，编码720个氨基酸，但有13个氨基酸存在差异，序列相似性高达98%，与荷花的相似性次之（57%）。TBP1蛋白系统进化树分析结果（图3）显示，CcTBP1和牛樟RWR76720.1蛋白聚集在一个分支上，表明其亲缘关系很近。
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图 2 古樟CcTBP1与其他植物TBP1蛋白序列比对Figure 2. Sequence alignment of ancient C. camphora CcTBP1 and other plant TBP1 proteins![]()
图 3 古樟CcTBP1蛋白系统进化树分析Figure 3. Phylogenetic tree analysis of CcTBP1 of ancient C. camphora其他物种14条POT1蛋白序列如下：RWR96964.1（牛樟Cinnamomum kanehirae）、XP_034673997.1（葡萄Vitis riparia）、XP_023907832.1（栓皮栎Quercus suber）、XP_021658778.1（橡胶树Hevea brasiliensis）、XP_011039144.1（胡杨Populus euphratica）、XP_010034292.1（巨桉Eucalyptus grandis）、XP_015882717.1（枣Ziziphus jujuba）、ACJ49170.1（烟草Nicotiana tabacum）、XP_004233140.1（番茄Solanum lycopersicum）、XP_008240144.1（梅Prunus mume）、XP_025657159.1（花生Arachis hypogaea）、XP_024173014.1（月季Rosa chinensis）、XP_022571297.1（油菜Brassica napus）和OAP11105.1（拟南芥Arabidopsis thaliana）。序列比对结果（图4）显示：CcPOT1蛋白与牛樟RWR96964.1蛋白长度相同，编码468个氨基酸，仅有4个氨基酸存在差异，序列相似性高达99%，与葡萄的相似性次之（59%）。POT1蛋白的系统进化树分析结果（图5）显示：CcPOT1与牛樟RWR96964.1蛋白聚集在一个分支上，表明其亲缘关系很近。
2.3 古樟CcTBP1和CcPOT1蛋白亚细胞定位分析
Plant-mPLoc Server在线软件预测结果显示：CcTBP1蛋白定位于细胞核，CcPOT1蛋白定位于叶绿体。利用pCAMBIA1300-35S-CcTBP1-GFP和pCAMBIA1300-35S-CcPOT1-GFP过表达载体浸染烟草叶片，镜检亚细胞定位结果如图6所示。其中，阳性对照pCAMBIA1300-35S-GFP在烟草叶肉细胞的细胞质和细胞核都观察到绿色荧光；pCAMBIA1300-35S-CcTBP1-GFP只在细胞核中观察到荧光，表明古樟CcTBP1蛋白亚细胞定位在植物的细胞核中，与在线软件预测结果一致；pCAMBIA1300-35S-CcPOT1-GFP在细胞质和细胞核中都观察到绿色荧光，表明古樟CcPOT1蛋白亚细胞定位在植物的细胞质和细胞核中，与软件预测结果不一致，软件预测结果可能存在偏差。
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图 4 古樟CcPOT1蛋白与其他植物POT1蛋白比对Figure 4. Comparison of ancient C. camphora CcPOT1 protein and other plant POT1 protein![]()
图 5 古樟CcPOT1蛋白进化树分析Figure 5. Phylogenetic tree analysis of CcPOT1 of ancient C. camphora![]()
图 6 古樟CcTBP1和CcPOT1蛋白亚细胞定位Figure 6. Subcellular localization analysis of CcTBP1 and CcPOT1 protein of ancient C. camphora2.4 古樟及其复幼扦插苗端粒基因CcTBP1和CcPOT1的表达分析
本研究前期采集1200年古樟春梢进行扦插，获得了2年生复幼扦插苗，在2020年5月份选取1200年古樟及其复幼扦插苗的春梢进行扦插，连续观察古樟及其扦插复幼苗不定根发生的外部形态，古樟插穗从扦插到不定根形成需要约75 d，而复幼扦插苗需要约60 d。不定根发生进程经过愈伤组织形成期、不定根原基形成期及不定根形成期3个阶段。古樟出现愈伤组织大概在第35天左右，而其复幼扦插苗愈伤组织形成较早，大概第25天，提前10 d左右。如图7所示：古樟及其复幼扦插苗在愈伤组织形成和不定根萌发过程中存在较大差异。相对于母株古樟，复幼扦插苗的插穗愈伤组织诱导较快，基部增粗明显，乳白色根原基突起较多，不定根形成较早，根系数量较多。
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图 7 古樟及其复幼扦插苗不定根发生形态过程A1 ~ A4分别代表生长0、25、45和75 d的1200年古樟；B1 ~ B4分别代表生长0、25、45和75 d的复幼扦插苗。A1−A4 represent growing for 0, 25, 45 and 75 d of 1 200 years old C. camphora, respectively; B1−B4 indicate the growing for 0, 25, 45 and 75 d of rejuvenation cutting seedlings, respectively.Figure 7. Morphological process of adventitious root formation of ancient C. camphora and its rejuvenation cutting seedlings在5月份取古樟及其复幼扦插苗的根茎叶提取RNA，检测端粒基因CcTBP1和CcPOT1的表达水平，结果（图8）表明，CcTBP1基因在1200年古樟根中的表达水平最高，CcPOT1基因在复幼扦插苗根中的表达水平最高。CcTBP1基因在古樟根和叶中表达量显著高于复幼扦插苗，但在茎中没有显著差异；CcPOT1基因在古樟根中的表达量显著低于复幼扦插苗，但在茎和叶中没有显著差异（图8）。
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图 8 古樟及其复幼扦插苗不同组织CcTBP1和CcPOT1表达分析小写字母代表不同组织的基因表达差异显著性（P < 0.05）。下同。Lowercase letters represent significant differences in gene expression at different tissue (P < 0.05). The same below.Figure 8. Expression analysis of CcTBP1 and CcPOT1 in different tissues of ancient C. camphora and its rejuvenation cutting seedlings进一步取古樟及其扦插复幼苗当年生插穗进行扦插，分别取不定根发育0、25、45、75 d的4个发生阶段组织进行qRT-PCR表达分析，结果如图9所示：CcTBP1基因在不定根发生过程呈下调表达，在古樟不定根中的表达量始终高于复幼扦插苗；而CcPOT1基因呈上调表达，在古樟不定根中表达量始终低于复幼插穗扦插苗。综上，从基因表达层面上说明端粒基因CcPOT1和CcTBP1参与了古樟扦插复幼过程中不定根的发生。
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图 9 古樟和复幼扦插苗不定根发生过程中CcTBP1和CcPOT1表达分析Figure 9. Expression analysis of CcTBP1 and CcPOT1 in adventitious roots of ancient C. camphora and rejuvenation cutting seedlings3. 结论与讨论
扦插可以快速获得稳定遗传的无性系后代，被认为是保存古树种质资源的有效方法之一[20]。在林木中，不定根的形成是木本植物无性繁殖的关键，是限制优良种质资源快繁的重要因素[25-26]。不定根的形成是植物生长发育重要的过程，受众多基因调控，其中植物激素代谢通路途径相关基因在根原基的启动到不定根的形成都占有主导地位[27]。但不定根的形成是一个高度复杂和有序的生物学过程，受多基因在多个水平上互作共同调控[28]。无性繁殖容易受到树龄的影响，随着母株树龄的增加，不定根再生能力逐渐丧失[21,29]，因此，树龄引起的插穗生根困难严重阻碍了林木的无性繁殖进程[30]。通过扦插无性繁殖可以使古树重新获得繁殖能力，恢复幼龄生理年龄。端粒及端粒酶可以反映细胞的生理年龄和复制能力，是组织分化能力的重要生物标记之一[24]。在基因层面上，众多的端粒及端粒酶相关的基因在植物DNA修复和细胞生长等进程中发挥着重要的端粒和非端粒功能[8]。相比较于幼龄白栎（Quercus fabri）再生芽，老龄白栎再生芽具有更强的抗氧化系统及细胞生长和分裂转录活性水平，但DNA损伤和组织重塑发生频率较高[31]。在扁桃（Prunus dulcis）中，端粒长度和端粒酶逆转录酶（TERT）编码基因表达水平随着树龄的增加而降低[32]。在欧洲云杉（Picea abies）体细胞胚胎发生过程中，端粒长度存在显著的基因型变异[33]。因此，本研究从调控端粒及端粒酶的TBP1和POT1基因出发，比较古樟及扦插无性系后代的不定根分化能力，为端粒在古樟扦插不定根形成过程中的分子调控功能研究奠定理论基础。
端粒存在于线性真核生物染色体的末端，对保持基因组的完整性至关重要。端粒结合蛋白TBPs在染色体末端的保护和稳定中起着关键作用。端粒结合蛋白TBPs根据Myb结构域的位置可以分成3种不同类型：第1类蛋白是Myb结构域存在于N端，并在序列中间区域有一个组蛋白H15基序；第2类蛋白是Myb结构域存在于C端，并存在Myb扩增区域；第3类是Myb结构域存在C端，但不存在Myb扩增区域[34]。本研究克隆到的CcTBP1蛋白属于分类中的第2类蛋白，Myb结构域存在于C端，并存在54个氨基酸组成的Myb扩增区域。拟南芥AtTBP1和水稻RTBP1蛋白通过保守结构域分析发现也属于TBPs第2类蛋白[5,10]。拟南芥ATBP1与ATBP2通过蛋白质间的相互作用参与了叶片的衰老过程[35]。本研究克隆的古樟CcTBP1蛋白亚细胞定位结果定位于细胞核中，下一步对其蛋白间的相互作用进行分析。
在植物中，TBP1基因首次在水稻中克隆得到，命名为RTBP1，其cDNA全长2 031 bp，编码633个氨基酸，表达分析发现RTBP1基因在水稻根茎叶中高表达，但在胚芽鞘中表达量较低[10]。另外，拟南芥端粒结合蛋白基因（AtTBP1）在幼苗和成熟拟南芥的各个组织均表达，在根中的表达量最高[5]。本研究中，CcTBP1在根茎叶中都有表达，但在不定根中表达量最高，说明TBP1基因在植物根组织分化过程中可能发挥着重要调控功能。另外发现TBP1基因在调控端粒及衰老方面也发挥着重要的调控功能。通过凝胶迁移试验，在拟南芥中检测到2个端粒结合蛋白ATBP1和ATBP2，二者通过蛋白-蛋白互作形成复合物调控叶片衰老[35]。把水稻中的OsTRFL1（第2类TBP1蛋白）基因敲除后，突变体的端粒长度相对于野生型的5 ~ 12 kbp伸长到6 ~ 25 kbp，说明OsTRFL1负调控端粒长度；同时，该研究发现OsTRFL1基因表达水平的降低会导致水稻营养和生殖器官生长受阻[34]。综上说明，端粒结合蛋白基因TBP1的调控具有多向性，可能在生物发育的各个阶段发挥调控功能。
大多数端粒保护蛋白POT1是通过寡核苷酸/寡糖基序（OB）与单链ssDNA结合形成蛋白质-DNA复合物，具有保护染色体末端及调控端粒长度的功能[36-37]。POT1蛋白序列在不同物种间相似性很高，油松（Pinus tabuliformis）PtPOT1蛋白含有2个基序OB1和OB2，OB1由145个氨基酸组成，OB2由132个氨基酸组成[38]。本研究中克隆到的CcPOT1蛋白也包含2个OB基序（OB1和OB2），分别由135和49个氨基酸组成。另外发现绿色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus）OlPOT1、玉米（Zea mays）ZmPOT1b、芦笋（Asparagus officinalis）AoPOT1和绢毛葵（Helianthus argophyllus）HaPOT1能够通过2个OB折叠与单链ssDNA序列结合[39]。拟南芥POT1蛋白也有2个OB域，但在体外实验中发现不能与ssDNA结合[12]。油松中虽然存在2个OB1和OB2，但通过EMSA发现只有一个OB1与ssDNA结合。说明OB结构域可能是唯一的，一个OB1结构域就可以稳定结合ssDNA，确保端粒不被降解[38]。后期实验可以利用EMSA和凝胶电泳方法对古樟CcPOT1蛋白的OB1和OB2基序与ssDNA的结合性进行分析。
POT1是一种保守的端粒结合蛋白[40]。从11种植物中克隆到POT1基因，蛋白序列分析显示，对端粒DNA识别至关重要的残基在功能上是保守的[39]。在脊椎动物和裂殖酵母中，POT1基因的保守结构域与端粒末端的单链突起G-overhang结合[39]。大多数生物都只有一个POT1基因，如在小立碗藓（Physcomitrella patens）只存在一个单拷贝的POT1基因[41]。但拟南芥在POT1家族扩张过程中进化出POT1a、POT1b和POT1c 3个POT1基因，其中POT1c是拟南芥特有的一个新基因[40]。本研究中克隆到的CcPOT1基因也存在POT1c结构域，说明POT1基因在物种的长期进化中扩张出的POT1c位点可能存在于其他物种中。在人类和酵母中，POT1蛋白亚细胞定位于细胞核中，后在人类细胞质中也发现存在POT蛋白亚细胞定位GFP荧光信号[42-44]。拟南芥POT1A和POT1B蛋白亚细胞定位于细胞质和细胞核中[15]。本研究中，古樟CcPOT1定位于细胞质和细胞核中，与拟南芥研究结果一致，说明POT1蛋白亚细胞定位相对保守。
拟南芥POT1通过可变剪切产生2个AtPOT1-1和AtPOT1-2基因，在芽、花、叶、根、茎及悬浮培养组织中表达水平差异不显著。AtPOT1-1在花芽中的转录活性水平高于叶片和悬浮细胞，说明AtPOT1-1在分生组织中的表达量高于营养组织[14]。从油松针叶中克隆到Ptpot1基因，全长1449 bp，编码482个氨基酸，通过Southern杂交发现在油松中存在一个POT1基因。油松不同组织qRT-PCR分析显示：PtPOT1基因在所有组织中都有表达，但在根中表达量最高，而且在一年生针叶中的表达水平显著高于两年生针叶，说明生理年龄越小的组织POT1基因表达量越高[38]。本研究中发现CcPOT1基因在根茎叶组织中都有表达，在根中表达量最高，与油松结果一致。但随着根的分化，表达量升高，说明分化程度高的组织CcPOT1表达量高。在拟南芥中也发现POT1基因表达量与组织活性有关[14]，说明POT1基因表达与组织的分化有着直接或者间接的关系。
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图 1 古樟端粒基因CcTBP1（A）和CcPOT1（B）CDS序列扩增电泳图
Figure 1. Amplification electrophoresis map of CDS sequence of telomere genes CcTBP1 (A) and CcPOT1 (B) in ancient Cinnamomum camphora
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图 2 古樟CcTBP1与其他植物TBP1蛋白序列比对
Figure 2. Sequence alignment of ancient C. camphora CcTBP1 and other plant TBP1 proteins
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图 3 古樟CcTBP1蛋白系统进化树分析
Figure 3. Phylogenetic tree analysis of CcTBP1 of ancient C. camphora
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图 4 古樟CcPOT1蛋白与其他植物POT1蛋白比对
Figure 4. Comparison of ancient C. camphora CcPOT1 protein and other plant POT1 protein
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图 5 古樟CcPOT1蛋白进化树分析
Figure 5. Phylogenetic tree analysis of CcPOT1 of ancient C. camphora
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图 6 古樟CcTBP1和CcPOT1蛋白亚细胞定位
Figure 6. Subcellular localization analysis of CcTBP1 and CcPOT1 protein of ancient C. camphora
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图 7 古樟及其复幼扦插苗不定根发生形态过程
A1 ~ A4分别代表生长0、25、45和75 d的1200年古樟；B1 ~ B4分别代表生长0、25、45和75 d的复幼扦插苗。A1−A4 represent growing for 0, 25, 45 and 75 d of 1 200 years old C. camphora, respectively; B1−B4 indicate the growing for 0, 25, 45 and 75 d of rejuvenation cutting seedlings, respectively.
Figure 7. Morphological process of adventitious root formation of ancient C. camphora and its rejuvenation cutting seedlings
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图 8 古樟及其复幼扦插苗不同组织CcTBP1和CcPOT1表达分析
小写字母代表不同组织的基因表达差异显著性（P < 0.05）。下同。Lowercase letters represent significant differences in gene expression at different tissue (P < 0.05). The same below.
Figure 8. Expression analysis of CcTBP1 and CcPOT1 in different tissues of ancient C. camphora and its rejuvenation cutting seedlings
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图 9 古樟和复幼扦插苗不定根发生过程中CcTBP1和CcPOT1表达分析
Figure 9. Expression analysis of CcTBP1 and CcPOT1 in adventitious roots of ancient C. camphora and rejuvenation cutting seedlings
表 1 基因克隆、定位及表达分析的引物序列
Table 1 Primer sequences of gene cloning, localization and expression analysis
引物名称
Primer name引物序列（5′—3′）
Primer sequence (5′−3′)用途
ApplicationTBP1-F ATGGTGTTTCAGAAGAAATTA 基因克隆
Gene cloningTBP1-R TTAGTGGACAAGGCAAGGAGG POT1-F ATGGAGAATATCATAGAAAAC POT1-R TCACCCAATTAGCTTGGTGCC CcTBP1-F CGGGGTACCATGGTGTTTCAGAAGAAA 亚细胞定位
Subcellular localizationCcTBP1-R TGCTCTAGAGTGGACAAGGCAAGGAGG CcPOT1-F CGGGGTACCATGGAGAATATCATAGAA CcPOT1-R TGCTCTAGACCCAATTAGCTTGGTGCC CcTBP1-F1 CCCATGATGGAAAAGTGGAGGA 基因表达分析
Gene expression analysisCcTBP1-R1 GATTTTGAGCGCTGCCATACAT CcPOT1-F1 AGGTTAATCTCTTGGCCGTTGT CcPOT1-R1 ACGACTTGACATGTGGTAGCTT PtActin-F CTCCATCATGAAATGCGATG 内参基因
Reference genePtActin-R TTGGGGCTAGTGCTGAGATT 注：下划线GGTACC、TCTAGA分别为Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点。Notes：underline GGTACC and TCTAGA indicate Kpn Ⅰ and Xba Ⅰ digestion sites, respectively. 
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表 2 古樟CcTBP1和CcPOT1蛋白理化性质
Table 2 Physicochemical properties of CcTBP1和CcPOT1 protein in ancient C. camphora
蛋白名称
Protein name氨基酸数量
Quantity of amino acid分子量
Molecular mass/kDa等电点
Isoelectric point信号肽结构
Signal peptide structure跨膜结构
Transmembrane structure亚细胞定位预测
Subcellular localization predictionCcTBP1 720 80.46 8.38 不存在 Absent 不存在 Absent 细胞核 Nucleus CcPOT1 468 53.13 6.13 不存在 Absent 不存在 Absent 叶绿体 Chloroplast
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