Cloning and expression analysis of APN1 gene from Lymantria xylina
-
摘要:目的 氨肽酶N（APN）是昆虫中肠一类重要的Bt受体蛋白，Bt细菌产生的Cry毒素对昆虫的毒杀作用机理在学术界存在一定争议，但是普遍认为毒素与Bt受体蛋白的结合是产生毒力的必要环节。本研究通过基因克隆、生物信息学分析以及不同龄期组织中的表达对木毒蛾APN1基因进行研究，为后续研究APN基因家族、其他Bt受体蛋白及Cry毒素作用机制提供有益补充。方法 以木毒蛾中肠cDNA为模板，对木毒蛾APN1基因进行克隆并进行生物学分析，利用实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析该基因在木毒蛾发育阶段及不同组织中的表达模式。结果 克隆获得木毒蛾APN1
基因的全长DNA，命名为LxAPN1。LxAPN1序列全长为3 159 bp，ORF为3 054 bp，编码1 017个氨基酸，序列比对和进化树分析表明，LxAPN1与舞毒蛾的LdAPN1高度同源，在N-端都具有信号肽，都具有锌结合位点HEXXH（X18）E以及保守区域GAMENWG，在末端具有GPI结合位点；LxAPN1在木毒蛾卵期无表达，在所有幼虫阶段中均有表达，幼虫期过后LxAPN1表达量锐减；LxAPN1在肠道的表达量明显高于头部和表皮。 结论 LxAPN1在木毒蛾中肠被成功克隆，LxAPN1与LdAPN1高度同源，并且在进化树的分布上也极其相近，推测两者的APN1功能上近似；LxAPN1在木毒蛾2龄幼虫期表达量最高。并且在6龄幼虫肠道中表达量最高，肠道高表达与LxAPN1作为Bt受体在木毒蛾中肠发挥作用息息相关。Abstract:Objective Aminopeptidase N(APN) is a class of important kind of BT receptor protein in insect midgut. The mechanism of Cry toxin produced by Bt bacteria to kill insects has been controversial in the academic research, but it is generally believed that the binding of toxin and Bt receptor protein is the necessary link to its virulence. The APN1 gene of Lymantria xylina was studied by gene cloning, biological information analysis and expression patterns, with the purpose to provid a reference for the subsequent study of APN gene family, other Bt receptor proteins and the mechanism of Cry toxin.Method APN1 was cloned by cDNA from midgut of the moth as template in a PCR system. Biological analysis and real time quantitative PCR(qRT-PCR) were performed to analyze the expression pattern of LxAPN1gene in different ages and tissues of Lymantria xylina. Result The full-length DNA of APN1 gene was cloned from midgut of Lymantria xylina and named LxAPN1. The full-length sequence of LxAPN1 was 3 159 bp, ORF was 3 054 bp, encoding 1 017 amino acids. Sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that LxAPN1 and LdAPN1 were highly homologous, with signal peptide at N-terminal, zinc binding site HEXXH (X18) E and conserved region GAMENWG, and GPI binding site at the end. LxAPN1 was not expressed in egg stage, and expressed in 1−7 instar larvae, the expression of LxAPN1 decreased after larval stage; the expression of LxAPN1 in intestine was significantly higher than that in head and cuticle. ConclusionLxAPN 1 was successfully cloned in the midgut of Lymantria xylina. LxAPN1 and LdAPN1 are highly homologous, and the distribution of phylogenetic tree is also very similar, which not only indicates the similarity between Lymantria xylina and Lymantria dispar, but also the similarity of APN1 function between them; The expression of LxAPN1 was the highest in the second instar larvae of Lymantria xylina. And the expression was the highest in the gut from 6 instar larvae, as an Bt receptor in the intestinal of Lymantria xylina.-
Keywords:
- Lymantria xylina /
- Bt receptor /
- APN /
- cloning
-
木毒蛾（Lymantria xylina）为鳞翅目（Lepidoptera）、裳蛾科（Erebidae）、毒蛾亚科（Lymantriinae）、毒蛾属（Lymantria）昆虫[1-3]，是我国东南沿海木麻黄（Casuarina equisetifolia）防护林上的重要害虫，也称木麻黄毒蛾，和国际重要林业害虫舞毒蛾（Lymantria dispar）为同属近源种，又称黑角舞毒蛾，两者具有极为相似的生物学特性，木毒蛾很有可能成为类似舞毒蛾的国际性危险性害虫[4-5]。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）作为在国际上普遍使用的生物防治措施，Bt产生的Cry晶体蛋白对木毒蛾所属的鳞翅目害虫有着良好的防治效果[6-8]。
氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）是昆虫体内的一类重要Bt受体蛋白，是一类能从多肽N-端切除中性氨基酸的酶，属于肽链端解酶（exopeptidase）。APN位于昆虫中肠刷状缘膜（brush border membrane vesicle，BBMV）上，是鳞翅目昆虫BBMV上分布最为丰富的Bt受体蛋白，最多时可占据昆虫中肠蛋白总量的55%，主要在幼虫不同发育阶段的中肠体内表达[9-10]。APN属于金属蛋白酶/肽酶超家族（zinc-binding metalloprotease/ peptidase superfamily），APN的蛋白质分子量变化范围较大，蛋白大小可以从95到165 kDa不等[11-12]。
APN首次被分离及成功鉴定是在烟草天蛾（Manduca sexta）上。研究至今，已经有10余种昆虫的90多个APN基因的数据被上传到GenBank上[13]。Cry晶体蛋白能与APN受体蛋白结合也已经在多种昆虫中得到验证[14-16]。研究表明，Cry1A毒素结构中存在3个可与APN结合的位点，Cry1Ac与家蚕和舞毒蛾的APN均有两个结合位点[17]。在Cry1Ac毒素结构域II和III的交界处存在第3个结合位点，发现家蚕的APN1可以与这个结合位点相互作用[18]。
目前缺少关于木毒蛾Bt受体蛋白的研究，而Cry晶体蛋白与中肠受体蛋白的结合能力及结合位点被认为是对昆虫具有毒杀作用及害虫抗性产生的重要原因[19]。为了解APN1在木毒蛾中肠与Cry蛋白结合的作用机理，本研究从木毒蛾幼虫转录组中检索并克隆得到1个APN1基因，接着对其蛋白质理化性质，保守区域，进化关系及蛋白质三级结构进行分析，并对其不同龄期及组织的表达量进行分析。为后续深入研究APN类基因家族以及其他Cry毒素受体蛋白提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材 料
木毒蛾的幼虫采自福建省平潭综合区马腿村木麻黄纯林（119°42′50″E，25°32′11″N）。将采集好的幼虫带回实验室，放入培养皿中冰浴15 min，用0.7%NaCl溶液清洗从木毒蛾幼虫体内取出的肠道以及分离的头部和表皮组织，放入−80 ℃速冻备用。
1.2 基因克隆
1.2.1 RNA提取与cDNA的合成
利用Trizol法对木毒蛾卵、1 ~ 7龄幼虫、蛹、成虫、6龄幼虫的头部、肠道、表皮进行RNA提取，并对RNA进行质量检测及浓度的测定，使用逆转录试剂盒（Takara，日本）完成木毒蛾cDNA第一链的合成。−20 ℃保存备用。
1.2.2 LxAPN1基因的克隆
根据木毒蛾幼虫转录组数据，比对NR数据库，根据unigene注解，从中挑出APN1（Cluster-5176.22633）基因。并用Primer Premier 5进行LxAPN1引物的设计（表1），以木毒蛾幼虫中肠cDNA为模板，进行PCR扩增，反应程序为95 ℃预变性3 min，95 ℃预变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，72 ℃终延伸10 min。使用DNA纯化试剂盒（Omega，美国）纯化目标条带，将重组质粒pCE2-APN1转入到感受态DH5α，涂板培养12 h，随机选取8个单菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌液送至福州铂尚生物公司进行双向测通测序。
表 1 基因克隆中使用引物列表Table 1. List of primers in gene cloning引物名称 Primer name 序列(5′—3′) Sequence (5′−3′) 用途 Usage LxAPN1-F TTACAATAATCCAGTTGAGGGT LxAPN1 基因扩增 LxAPN1 gene amplification LxAPN1-R GAACATCAAACTAGATTTCTTAGTAATTGAT LxAPN1基因扩增 LxAPN1 gene amplification qAPN1-F CGTGATCCGTCCTCAAGATTAC qRT-PCR qAPN1-R TGGATGCGACGTAAAGTAAGG qRT-PCR qEF-1a-F CCGTGTTGAAACTGGTATCCT qRT-PCR qEF-1a-R TAGAGCTTCGTGGTGCATTT qRT-PCR qActin-F GGTAGATAAGGAGGCAAGGATTG qRT-PCR qActin-R ACCACAATGTACCCTGGTATTG qRT-PCR 1.2.3 生物信息学分析
使用DNAMAN9.0对LxAPN1氨基酸序列进行推导，从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Blastp中选取与LxAPN1序列相似的几种昆虫的APN氨基酸序列，使用DNAMAN对其APN1蛋白序列同源对比分析。使用MEGA[20]构建进化树。使用SignalP 5.1 Sever在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/instructions.php）对木毒蛾APN1蛋白进行蛋白信号肽的预测。使用SOMPA在线软件（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）对木毒蛾APN1进行蛋白二级结构预测。最后使用Swiss-Model Sever在线软件对木毒蛾APN1进行蛋白三级结构预测。
1.2.4 组织表达特异性分析
根据转录组设计LxAPN1实时荧光定量引物，采用两步法PCR扩增体系，对木毒蛾卵、1 ~ 7龄幼虫、蛹、成虫、以及6龄幼虫的肠道、头部、表皮进行qRT-PCR试验。试验结果采用2−ΔΔCT算法进行基因相对表达量计算，设计了β-actin和EF-1α，主要用于校正样品之间的差异以及消除机械损伤的影响。使用SPSS21.0中的单向ANOVA和Tukey的HSD确定了木毒蛾中LxAPN1基因表达的统计显著性（P < 0.05）。
2. 结果与分析
2.1 LxAPN1
基因的克隆 木毒蛾APN1的全长以木毒蛾4龄幼虫中肠为模板克隆获得，命名为LxAPN1。扩增产物的长度为3159 bp，经测序后通过DNAMAN对测序结果与原始序列进行比较，完全符合。木毒蛾中肠APN基因的扩增产物电泳图如图1所示。
![]()
图 1 LxAPN1基因全长 M. 1 kb marker；1代表LxAPN1基因全长。M, 1 kb marker; 1 represents LxAPN1 full-length gene.Figure 1. Full length of LxAPN1gene 2.2 LxAPN1
基因序列分析及比对分析 本试验成功克隆木毒蛾中肠Bt受体基因APN1，得到的全长为3 159 bp，GC含量为41.91%，其中A占28.77%，C占22.92%，G占18.99%，T占29.31%。开放阅读框ORF为3 054 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。可以编码1 017个氨基酸，理论分子量为119 kDa，等电点为4.79，信号肽的长度为17个氨基酸。根据转录组的注释，利用DNAMAN对比LxAPN1蛋白与舞毒蛾（Lymantria dispar, AAD31183.1）LdAPN1蛋白（图2），它们在多肽链N-端都具有信号肽，在多肽链中部具有锌结合位点HEXXH（X18）E，以及高度保守的GAMENWG基元。多肽链C-端含有末端信号肽，在C-端第22位氨基酸发现了一个糖基化磷脂酞肌醇锚着点（glycosyl-phosphatidylinositol-anchor，GPI-anchor），APN蛋白可以借助GPI固定在昆虫BBMV上，另外，它具有亲脂性和跨膜特性等特点。根据这些特点，可以断定LxAPN1为APN家族Class1类别的蛋白。
![]()
图 2 木毒蛾APN1编码区核苷酸序列及氨基酸序列高度保守的残基用深蓝色背景表示；部分保守的残基用白色和灰色背景显示。信号肽用黑色下划线标出；保守结构GAMENWG用红色空心方框标出；锌结合位点HEXXH(X)18E用绿色空心方框标出；GPI结合位点用黑实心三角标出；末端信号肽用红色下划线标出。Highly conserved residues are indicated in deep blue background and only partially conserved residues are indicated in white and gray background; black underline indicates the signal peptite; the gluzincin aminopeptidase GAMENWG is marked with a red hollow box; the characteristic zinc bingding/gluzincin motif HEXXH(X)18E is indicated with green hollow boxes. The GPI anchor point is showed as an black triangles. The C-terminal pro-peptide sequences are marked with a red underline.Figure 2. Nucleotide and amino acid sequences of LxAPN12.3 LxAPN1蛋白二级与三级结构分析
使用SOMPA在线软件分析了LxAPN1蛋白二级结构，α-螺旋占45.13%，β-转角占3.15%，延伸链占13.67%，无规则卷曲占38.05%。α-螺旋和无规则卷曲占据了LxAPN1蛋白主要部分（图3）。
![]()
图 3 木毒蛾APN1蛋白质二级结构预测蓝色代表α-螺旋；紫色代表无规则卷曲；红色代表延伸链；绿色代表β-转角；横坐标表示蛋白大小（kDa）。Blue represents α-helix; purple represents random coli; red represents extend strand; geen represents β-turn; abscissa indicates protein size（kDa）.Figure 3. Prediction of secondary structure of LxAPN1 protein通过Swiss-Model Sever数据库搜索，利用模板4wz9.1.A（APN）构建了木毒蛾幼虫中肠APN1的结构，在预测和修正后获得LxAPN1三级结构，发现LxAPN1蛋白三级结构主要由α-螺旋和不规则卷曲构成（图4），与二级结构蛋白预测吻合。
![]()
图 4 木毒蛾APN1蛋白三级结构预测Figure 4. Prediction of three-dimensional structure of LxAPN1 protein2.4 LxAPN1
系统进化树分析 Blastp搜索结果中，舞毒蛾LdAPN1与LxAPN1同源性最高，覆盖率100%，匹配度达到96.7%，并用MEGA软件绘制出20个APN家族的进化树（图5）。可以看出，LxAPN1与舞毒蛾LdAPN1最为接近，其次与烟芽夜蛾（Heliothis virescens, AAC46929.1）HvAPN、甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae, AHW57924.1）MbAPN1、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua, AAT99437.1）SeAPN关系较近，而跟赤拟谷盗（Tribolium castaneum, EEZ99297.2）TcAPN、黄粉虫（Tenebrio molitor, AAP94045.1）TmAPN、马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata, ADK11709.1）LdAPN、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae, ACJ10211.1）AgAPN关系较远，冈比亚按蚊属于双翅目，黄粉虫、赤拟谷盗与马铃薯甲虫属于鞘翅目，与木毒蛾所属的鳞翅目在氨基酸序列上存在较大差异。
![]()
图 5 木毒蛾APN1与其他昆虫APN蛋白系统进化树Figure 5. Neighbor-joining phylogenetic tree of LxAPN1 and APN in other insects2.5 LxAPN1
在不同龄期及组织中的表达分析 对不同龄期的LxAPN1
进行qRT-PCR分析，结果表明基因LxAPN1在木毒蛾幼虫期表达量均相对较高，其中，在2龄幼虫中的表达量达到顶峰，相对表达量为2.11，但在4龄幼虫中的表达量降到最低，相对表达量仅为0.20。幼虫期过后，基因LxAPN1的表达量大量减少，在成虫期达到最低值（图6a）。 ![]()
图 6 木毒蛾不同龄期及不同组织中LxAPN1基因的表达L1 ~ L7为1龄到7龄幼虫。小写字母表示差异显著(P < 0.05)。L1−L7 are the 1st to 7th instar larvae. Small letters mean the difference is significant (P < 0.05).Figure 6. Expression profiles of LxAPN1in different ages and tissues of Lymantria xylina 在木毒蛾6龄幼虫肠道、表皮、头部3个组织中，LxAPN1
在肠道的表达量最高，其次是表皮，最少的是头部，且肠道的表达量远远大于表皮和头部（图6b）。由于氨肽酶N蛋白的功能与作用可知，作为Bt受体蛋白，LxAPN1 主要存在于中肠中，在中肠发挥主要作用，只有少数存在于其他部位。 3. 讨 论
自1909年Bt被发现以来就广泛地用于防治昆虫[21]。Bt在生长阶段中随芽孢一同形成的晶体蛋白，在杀虫过程中发挥作用。晶体蛋白与中肠受体蛋白结合能力被认为是对昆虫具有毒杀作用及害虫抗性产生的重要原因[22]。所以，对昆虫中肠受体的基因及蛋白的研究具有重要意义。
木毒蛾可能的Bt受体蛋白LxAPN1编码1 017个氨基酸，蛋白质大小为119 kDa， 为锌金属肽酶M1（Zinc-metallopeptidases M1）家族的成员，在多肽链N-端，氨基酸可以被水解并依次释放出来。有着锌金属肽酶家族的共同特性：在多肽链C-端含有一个糖基化磷脂酞肌醇锚着点（glycosyl-phosphatidylinositol-anchor, GPI-anchor），能够使Bt受体蛋白借此锚定在昆虫BBMV上，并具有跨膜特性与亲脂性等特点，另外，在C-端还含有糖基化位点与苏氨酸富集区[23]；在多肽链N-端含有一个N-乙酞半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNac）结构，该结构的主要作用是能够被Cry类毒素识别，是Cry类毒素作用于昆虫的相关位点；在多肽链中部，含有锌结合位点HEXX（X18）E以及高度保守的GAMEN基元[24]。
经研究发现APN家族内每一类别的APN虽然存在着各种差别，但它们的氨基酸序列仍然具有较高的相似性，且都具有APN家族的共同特点[25]，但仍有昆虫APNs相似性不高，如飞扬阿夜蛾（Achaea janata）的APNs之间相似性就很低，只有不到40%[26]。本文采用PCR扩增技术克隆获得的木毒蛾的APN1基因，经测序与转录组的碱基序列进行比对，相似性为100%，而通过BLAST发现，木毒蛾APN1与舞毒蛾APN1氨基酸序列相似性高达96%。而与其他鳞翅目昆虫的APN1相似性大部分处于50% ~ 60%，再次证明了木毒蛾与舞毒蛾亲缘关系很近。LxAPN1与LdAPN1均属于APN家族Class1类，具有GAMENWG等APN 家族Class1类共有的位点，并且在GPI序列下游有一段区域具有一个由多个O-糖基化位点形成的茎环结构，该结构可以使细胞膜的表面酶活性提高，是APN1与Cry蛋白结合的重要原因[27]。
通过qRT-PCR分析了LxAPN1在木毒蛾不同龄期的表达量，卵期没有表达，蛹期、成虫期的表达量极少，在木毒蛾所有幼虫阶段均可以表达，但每个龄期表达量不一，LxAPN1在木毒蛾2龄幼虫体内表达量最高，在4龄时达到最低，可以推测在木毒蛾2龄幼虫期进行Bt防治可以达到良好的毒杀效果。同时，木毒蛾6龄幼虫3个组织头部、表皮、肠道LxAPN1的qRT-PCR试验发现，LxAPN1在肠道的表达量远远大于头部与表皮，由于APN1蛋白发挥作用的场所是在中肠，所以肠道表达量应远远高于其他组织。LxAPN1基因的时空表达模式与梨小食心虫GmolAPN3一致，幼虫期均有表达，且表达量在都在2龄幼虫期达到顶峰[28]。美国白蛾（Hyphantria cunea）[29]、棉铃虫[30]、大螟（Sesamia inferens）[31]、二点螟（Chilo infuscatellus）[32]等鳞翅目昆虫的APN基因在昆虫所有幼虫龄期均能表达，且肠道中的APN表达量远远大于其他组织，与LxAPN1
的表达模式相似。虽然APN蛋白主要作为Bt受体，但也具有消化功能，所以APN并不仅仅只在肠道组织中高度表达。研究发现，欧洲玉米螟APN8虽然在马氏管中与肠道组织均能表达，但是它们的表达量却基本相同[25]；木毒蛾的APN基因的表达量随着龄期的增加先增加后减少，达到5龄后又升高。这也进一步说明了APN的表达量不仅与APN的功能有关，还与昆虫本身的特性及所属种群相关。 本研究通过基因克隆、生物学信息分析以及不同龄期组织中的表达对LxAPN1基因进行研究，为进一步研究Bt受体蛋白功能分析提供科学依据，为深入揭示Cry毒素与昆虫中Bt受体的结合过程提供参考依据。
-
![]()
图 1 LxAPN1
基因全长 M. 1 kb marker；1代表LxAPN1基因全长。M, 1 kb marker; 1 represents LxAPN1 full-length gene.
Figure 1. Full length of LxAPN1
gene ![]()
图 2 木毒蛾APN1编码区核苷酸序列及氨基酸序列
高度保守的残基用深蓝色背景表示；部分保守的残基用白色和灰色背景显示。信号肽用黑色下划线标出；保守结构GAMENWG用红色空心方框标出；锌结合位点HEXXH(X)18E用绿色空心方框标出；GPI结合位点用黑实心三角标出；末端信号肽用红色下划线标出。Highly conserved residues are indicated in deep blue background and only partially conserved residues are indicated in white and gray background; black underline indicates the signal peptite; the gluzincin aminopeptidase GAMENWG is marked with a red hollow box; the characteristic zinc bingding/gluzincin motif HEXXH(X)18E is indicated with green hollow boxes. The GPI anchor point is showed as an black triangles. The C-terminal pro-peptide sequences are marked with a red underline.
Figure 2. Nucleotide and amino acid sequences of LxAPN1
![]()
图 3 木毒蛾APN1蛋白质二级结构预测
蓝色代表α-螺旋；紫色代表无规则卷曲；红色代表延伸链；绿色代表β-转角；横坐标表示蛋白大小（kDa）。Blue represents α-helix; purple represents random coli; red represents extend strand; geen represents β-turn; abscissa indicates protein size（kDa）.
Figure 3. Prediction of secondary structure of LxAPN1 protein
![]()
图 4 木毒蛾APN1蛋白三级结构预测
Figure 4. Prediction of three-dimensional structure of LxAPN1 protein
![]()
图 5 木毒蛾APN1与其他昆虫APN蛋白系统进化树
Figure 5. Neighbor-joining phylogenetic tree of LxAPN1 and APN in other insects
![]()
图 6 木毒蛾不同龄期及不同组织中LxAPN1基因的表达
L1 ~ L7为1龄到7龄幼虫。小写字母表示差异显著(P < 0.05)。L1−L7 are the 1st to 7th instar larvae. Small letters mean the difference is significant (P < 0.05).
Figure 6. Expression profiles of LxAPN1
in different ages and tissues of Lymantria xylina 表 1 基因克隆中使用引物列表
Table 1 List of primers in gene cloning
引物名称 Primer name 序列(5′—3′) Sequence (5′−3′) 用途 Usage LxAPN1-F TTACAATAATCCAGTTGAGGGT LxAPN1 基因扩增 LxAPN1 gene amplification LxAPN1-R GAACATCAAACTAGATTTCTTAGTAATTGAT LxAPN1基因扩增 LxAPN1 gene amplification qAPN1-F CGTGATCCGTCCTCAAGATTAC qRT-PCR qAPN1-R TGGATGCGACGTAAAGTAAGG qRT-PCR qEF-1a-F CCGTGTTGAAACTGGTATCCT qRT-PCR qEF-1a-R TAGAGCTTCGTGGTGCATTT qRT-PCR qActin-F GGTAGATAAGGAGGCAAGGATTG qRT-PCR qActin-R ACCACAATGTACCCTGGTATTG qRT-PCR 
下载: 导出CSV
-
[1] Fibiger M, Lafonatine J D. A review of the higher classification of the Noctuoidea (Lepidoptera) with special reference to the Holarctic fauna[J]. Experiana, 2005, 11: 7−92.
[2] Lafontaine J D, Fibiger M. Revised higher classification of the Noctuoidea (Lepidoptera)[J]. Canadian Entomologist, 2006, 138(5): 610−635. doi: 10.4039/n06-012
[3] Zahiri R, Kitching I J, Lafontaine J D, et al. A new molecular phylogeny offers hope for a stable family level classification of the Noctuoidea (Lepidoptera)[J]. Zoologica Scripta, 2011, 40(2): 158−173. doi: 10.1111/j.1463-6409.2010.00459.x
[4] Pogue M G, Schaefer P W. A review of selected species of Lymantria Hübner [1819] including three new species (Lepidoptera: Noctuidae: Lymantriinae) from subtropical and temperate regions of Asia, some potentially invasive to North America[M]. Washington D C: United States Department of Agriculture, Forest Health Technology Enterprise Team, 2007.
[5] Dewaard J R, Mitchell A, Keena M A, et al. Towards a global barcode library for Lymantria (lepidoptera: lymantriinae) tussock moths of biosecurity concern[J/OL]. PLoS One, 2010, 5(12): e14280[2010−12−09]. http://europepmc.org/backend/ptpmcrender.fcgi?accid=PMC3000334&blobtype=pdf.
[6] 周志强. 龙眼木毒蛾的发生规律及防治策略探究[J]. 现代农业, 2016(6):52−53. doi: 10.3969/j.issn.1008-0708.2016.06.035 Zhou Z Q. Research on the occurrence and control strategies of Lymantria xylina[J]. Modern Agriculture, 2016(6): 52−53. doi: 10.3969/j.issn.1008-0708.2016.06.035
[7] De B H, F Lemille. Presence of flagellar antigenic subfactors in serotype 3 of Bacillus thuringiensis[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 1970, 15(1): 139. doi: 10.1016/0022-2011(70)90113-8
[8] Goldberg L J, Margalit J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal activity against Anopheles sergentii, Uranotaenia unguiculata, Culex univittatus, Aedes aegypti and Culex pipiens[J]. Mosquito News, 1977, 37(3): 355−358.
[9] Knight P J K, Crickmore N, Ellar D J. The receptor for Bacillus thuringiensis CrylA(c) delta-endotoxin in the brush border membrane of the lepidopteran Manduca sexta is aminopeptidase N[J]. Molecular Microbiology, 1994, 11(3): 429−436. doi: 10.1111/j.1365-2958.1994.tb00324.x
[10] Pigott C R, Ellar D J. Role of receptor in Bacillus thuringiensis crystal toxin activity[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2007, 71: 255−281. doi: 10.1128/MMBR.00034-06
[11] Wang G, Kongming W. Gene cloning and expression of cadherin in midgut of Helicoverpa armigera and its Cry1A binding region[J]. Science in China, 2005, 48(4): 346−356. doi: 10.1360/03yc0273
[12] Bravo A, Gill S S, Soberón M. Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control[J]. Toxicon, 2007, 49(4): 423−435. doi: 10.1016/j.toxicon.2006.11.022
[13] 马文静, 韩兰芝, 尹新明, 等. 鳞翅目昆虫氨肽酶N与Bt毒素的结合及其与Bt抗性的关系[J]. 环境昆虫学报, 2011, 33(3):147−153. Ma W J, Han L Z, Yi X M, et al. Binding of Bt Cry toxins to lepidopteran midgut aminopeptidase N and the relationship between their interactions with Bt resistance[J]. Journal of Environmental Entomology, 2011, 33(3): 147−153.
[14] Jenkins J L, Dean D H. Binding specificity of Bacillus thuringiensis Cry1Aa for purified, native Bombyx mori aminopeptidase N and cadherin-like receptors[J]. BMC Biochemistry, 2001, 2(1): 1−8. doi: 10.1186/1471-2091-2-1
[15] Mi K L, Dean D H. Inconsistencies in determining Bacillus thuringiensis, toxin binding sites relationship by comparing competition assays with Ligand Blotting[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996, 220(3): 575−580. doi: 10.1006/bbrc.1996.0445
[16] Lorence A, Darszon A, Bravo A. Aminopeptidase dependent pore formation of Bacillus thuringiensis CrylAc toxin on Trichoplusia nimembranes[J]. FEBS Letters, 1997, 414(2): 303−307. doi: 10.1016/S0014-5793(97)01014-4
[17] Jenkins J L, Lee M K, Valaitis A P, et al. Bivalent sequential binding model of a Bacillus thuringiensis toxin to gypsy moth aminopeptidase N receptor[J]. Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(19): 23−31.
[18] Yaoi K, Nakanishi K, Kadotani T, et al. cDNA cloning and expression of Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin binding 120 kDa aminopeptidase N from Bombyx mori[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression, 1999, 1444(1): 131−137. doi: 10.1016/S0167-4781(98)00250-4
[19] Ferre J, VanRie J. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis[J]. Annual Review Entomology, 2002, 47: 501−533. doi: 10.1146/annurev.ento.47.091201.145234
[20] Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis software for microcomputers[J]. Bioinformatics, 1994, 10(2): 189−191. doi: 10.1093/bioinformatics/10.2.189
[21] 喻子牛. 苏云金杆菌[M]. 北京: 科学出版社, 1990: 20−21. Yu Z N. Bacillus thuringiensis[M]. Beijing: Science Press, 1990: 20−21.
[22] Schnepf E, Crickmore N, Van R J, et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1998, 62(3): 775−806. doi: 10.1128/MMBR.62.3.775-806.1998
[23] Cristofoletti P T, Terra W R. The role of amino acid residues in the active site of a midgut microvillar aminopeptidase from the beetle Tenebrio molitor[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1479(1): 185−195.
[24] Zhu Y C, Kramer K J, Oppert B, et al. cDNAs of aminopeptidase-like protein genes from Plodia interpunctella strains with different susceptibilities to Bacillus thuringiensis toxins[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2000, 30(3): 215−224. doi: 10.1016/S0965-1748(99)00118-6
[25] Crave C M, Bel Y, Lee S, et al. Study of aminopeptidase N gene family in the Lepidopterans Ostrinia nubilalis and Bombyx mori: Sequences, mapping and expression[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2010, 40: 506−515. doi: 10.1016/j.ibmb.2010.04.010
[26] Chauhan V K, Dhania N K, Lokya V, et al. Midgut aminopeptidase N expression profile in castor semilooper (Achaea janata) during sublethal Cry toxin exposure[J]. Journal of Biosciences, 2021, 46(1): 209−213.
[27] Knight P J K, Carroll J, Ellar D J. Analysis of glycan structures on the 120 kDa aminopeptidase N of Manduca sexta and their interactions with Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2004, 34(1): 101−112. doi: 10.1016/j.ibmb.2003.09.007
[28] 展恩玲. 梨小食心虫中肠氨肽酶N3(GmolAPN3)基因的克隆、表达及功能分析[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2018. Zhan E L. Gene cloning, expression and functional analysis of aminopeptidase N3(GmolAPN3) from midgut of the oriental fruit moth, Grapholitha molesta[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2018.
[29] Zhang Y, Dan Z, Yan X, et al. Identification and characterization of Hyphantria cunea aminopeptidase N as a binding protein of Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(12): 2575. doi: 10.3390/ijms18122575
[30] 牛琳琳, ZAW Lin Naing, 张彩虹, 等. 棉铃虫APN基因家族系统进化与功能分析[J]. 中国生物防治学报, 2021, 37(1):91−101. Niu L L, Zaw L N, Zhang C H, et al. Phylogenetic evolution and function of APN gene family in Helicoverpa armigera[J]. Chinese Journal of Biological Control, 2021, 37(1): 91−101.
[31] 王兴云, 马文静, 韩兰芝, 等. 大螟中肠氨肽酶N基因的克隆及表达谱分析[J]. 昆虫学报, 2012, 55(9):1022−1030. Wang X Y, Ma W J, Han Z L, et al. Cloning and expression profiling of aminopeptidase N encoding gene in larval midgut of Sesamia inferens[J]. Acta Entomologica Sinica, 2012, 55(9): 1022−1030.
[32] Wang J D, Zhang J S, Guo Y F, et al. Molecular cloning, characterization, and expression profiling analysis of Cry toxin receptor genes from sugarcane shoot borer Chilo infuscatellus (Snellen)[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2019, 157: 186−195. doi: 10.1016/j.pestbp.2019.03.023
-
期刊类型引用(4)
1. 李桂，曹文华，马建业，马波，王阳修，王秋月. 小麦秸秆覆盖量对坡面流水动力学特性影响. 农业工程学报. 2023(01): 108-116 . 
百度学术
2. 安妙颖，韩玉国，王金满，徐磊，王秀茹，庞丹波. 黄土丘陵区坡面薄层水流动力学特性及其对土壤侵蚀的影响. 中国农业大学学报. 2020(02): 142-150 . 百度学术
3. 李志刚，梁心蓝，黄洪粮，李和谋，赵小东. 坡耕地地表起伏对坡面漫流的影响. 水土保持学报. 2020(02): 71-77+85 . 百度学术
4. 杨坪坪，李瑞，盘礼东，王云琦，黄凯，张琳卿. 地表粗糙度及植被盖度对坡面流曼宁阻力系数的影响. 农业工程学报. 2020(06): 106-114 . 百度学术
其他类型引用(27)
计量
- 文章访问数: 909
- HTML全文浏览量: 366
- PDF下载量: 58
- 被引次数: 31
