Prokaryotic expression, polyclonal antibody preparation and expression pattern analysis of venom-allergen proteins from Bursaphelenchus xylophilus
-
摘要:目的 类毒素过敏原蛋白（VAPs）是松材线虫侵染松树过程中分泌的一类蛋白。此类蛋白可通过抑制松树的防卫反应，从而利于松材线虫在松树内的定殖与扩散。本研究对4种类毒素过敏原蛋白进行原核表达、多抗制备和基因的表达模式分析，明确松材线虫Bx-VAPs蛋白的结构与功能，为阐明该类蛋白在松材线虫与寄主松树互作中的作用机理提供基础支撑。方法 本研究利用聚合酶链式反应（PCR）扩增松材线虫4个Bx-VAPs基因，通过实时荧光定量（RT-qPCR）方法检测不同龄期松材线虫4个Bx-VAPs基因的表达量。同时，将扩增的4个基因全长产物分别转化至pET32b原核表达载体，构建重组质粒pET-32b-VAPs，经鉴定正确后的重组质粒转化至大肠杆菌BL21DE3进行诱导表达。利用纯化的Bx-VAPs蛋白分别免疫Balb/c鼠，4次免疫后获得多克隆抗体；采用间接酶联免疫吸附法ELISA测定抗体血清效价；利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法（Western-blot）进行蛋白鉴定。最后，应用生物信息学方法分析这四个蛋白的理化性质、二级结构和表面特性，预测B细胞抗原表位。结果 松材线虫4个Bx-VAPs基因在不同龄期的表达量存在显著差异，其中Bx-VAP1和Bx-VAP2基因在成虫期表达量较高，Bx-VAP3和Bx-VAP4基因在繁殖型L3时期表达量较高。构建获得的重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白分子量介于21 ~ 31 kDa之间，纯化后的多克隆抗体anti-VAP1、anti-VAP2和anti-VAP3均对松材线虫蛋白液具有较高的特异性，但anti-VAP4抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应。4个Bx-VAP蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主，存在信号肽，具有SCP结构域，无跨膜结构域，Bx-VAP1潜在的优势B细胞抗原表位较多。结论 重组质粒pET-32b-VAPn诱导表达的蛋白大小与预测的蛋白大小一致，均为包涵体表达，制备的多克隆抗体anti-VAP1、anti-VAP2和anti-VAP3效价高，特异性良好，Bx-VAP1具有潜在的B细胞抗原表位优势，为进一步研究松材线虫VAPs蛋白的功能及其相关致病机制研究提供了实验材料和基础。Abstract:Objective Venom-allergen proteins (VAPs) are proteins secreted by pine wood nematode during the process of infesting pine trees. Such proteins may inhibit the defense response of pine trees, thereby facilitating the colonization and spread of pine wood nematodes in pine trees. In this study, the prokaryotic expression, polyclonal antibody preparation and expression pattern analysis of four VAPs were conducted to clarify the structures and functions of the VAPs of Bursaphelenchus xylophilus (Bx-VAPs), in order to provide basic support for elucidating the mechanism of this kind of protein in the interaction between pine wood nematode and the host pine.Method Polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the fourBx-VAPs genes, and the expression levels of the four Bx-VAPs genes were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) method. At the same time, the amplified full-length products of the four genes were cloned into the pET32b prokaryotic expression vector separately, and the recombinant plasmid pET-32b-VAPS were constructed. After the identification, the correct recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli BL21DE3 for induced expression. The purified Bx-VAPs were used to immunize Balb/c mice respectively, and polyclonal antibodies were obtained after four immunizations; the antibody serum titer was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); the proteins were identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western-blot (WB). Finally, bioinformatics methods were used to analyze and predict the physical and chemical properties, secondary structure, surface properties and B cell epitopes of the proteins encoded by these four genes.Result There were significant differences in the expression levels of the four Bx-VAPs genes of B. xylophilus during different developmental stages. Among them, the Bx-VAP1 and Bx-VAP2 genes were expressed in high level in the adult stage, and the Bx-VAP3 and Bx-VAP4 genes were expressed in high level in propagative third-larval instar (L3). The constructed recombinant plasmid pET-32b-VAPn induced and expressed the proteins with a molecular weight between 21 kDa and 31 kDa. The three purified polyclonal antibodies anti-VAP1, anti-VAP2 and anti-VAP3 all had higher effect on the B. xylophilus protein solution specificity, but the anti-VAP4 antibody failed to react with the protein solution of B. xylophilus. The secondary structures of the four Bx-VAPs were dominated by alph-helix and random coils, all had signal peptides, SCP domains, and no transmembrane domains. Bx-VAP1 had many potential dominant B cell epitopes.Conclusion The protein size induced by recombinant plasmid pET-32b-VAPn is consistent with the predicted protein size. All are expression of inclusion bodies, the prepared polyclonal anti-VAP1, anti-VAP2 and anti-VAP3 have high titer and good specificity. Bx-VAP1 has potential B cell epitope advantages. This study provides experimental materials and basis for further research on the function of B. xylophilus VAPs protein and related pathogenic mechanisms.
-
朝鲜崖柏（Thuja koraiensis）为柏科（Cupressaceae）崖柏属（Thuja）的常绿乔木，又名长白侧柏、朝鲜柏，为中国二级重点保护植物，是集园林绿化、材用、芳香和经济价值于一身的珍贵植物资源，是具有广阔开发利用前景的珍贵树种[1]。目前中国学者对朝鲜崖柏的研究主要集中在繁育技术[2-4]、种子性状[5-6]、生境调查和生长规律[7-9]、精油提取及成分分析[10-12]等方面，对朝鲜崖柏精油提取的最佳工艺及抑菌活性还未有学者研究。国外学者对朝鲜崖柏的研究多为群落结构分布特征[13]、离体培养及冻存技术[14]、精油抗菌抗病毒[15]等方面，对朝鲜崖柏精油提取的最佳工艺以及化学成分分析还未见报道。
植物精油是通过不同方法从植物体内萃取出的芳香物质，一般在植物体的不同部位、不同器官中存在。研究发现影响精油在植物体内含量分布的原因除了植物种类不同外，也随着部位、贮藏条件和地理位置等因素的改变而发生变化[16-17]。精油提取的方法很多，目前主要有溶剂萃取法、超声波辅助萃取法、超临界萃取法和水蒸气蒸馏法等[18-22]。20世纪60年代，气相色谱法（gas chromatography，GC）逐渐发展起来[23]，而如今分析植物精油成分的方法主要为气相色谱–质谱联用仪（gas chromatography/mass spectrometry，GC-MS）[24-25]。王雪薇等[24]选择水蒸气蒸馏法对红松（Pinus koraiensis）不同部位精油进行提取，并用GC-MS对成分进行检验，结果表明同株红松中松针、松壳和松塔的成分差异显著且松针的抑菌最好。胡文杰等[25]采用GC-MS技术对3种樟树（Cinnamomum camphora）叶片的精油成分种类进行鉴定，结果表明不同化学型间叶片精油成分种类、主成分和相对含量存在较大差异。陈韵如等[26]和王凤等[27]的研究表明：植物精油对日常生活中所产生的致病性细菌具有有效的抑制作用，还能够杀灭或清除皮肤上的细菌，净化空气。陈可欣等[28]表明香樟（Cinnamomum camphora）精油对灰绿曲霉（Aspergullus glaucus）最小抑菌浓度为0.001 μg/L。钱卫东等[29]通过研究丁香（Syringa oblate）精油中主要成分丁香酚的抑菌作用，表明丁香酚可以通过改变大肠杆菌（Escherichia coli）的菌体结构对其产生抑制作用，对抑制大肠杆菌生长有良好的效果。Selivanova等[30]表明超临界提取法提取出的欧洲赤松（Pinus sylvestris）精油对大肠杆菌有抑菌作用。
本研究以朝鲜崖柏枝叶为材料，采用单因素试验、正交试验和响应面优化法对水蒸气蒸馏法提取朝鲜崖柏枝叶精油进行工艺优化，采取GC-MS技术对其化学成分进行分析，用滤纸片抑菌法检测其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性，并确定其最低抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），以期为朝鲜崖柏精油的开发提供数据支持。
1. 材料与方法
1.1 材 料
朝鲜崖柏采自吉林省长白县十五道沟，选取成熟的朝鲜崖柏的绿色枝叶为原料。无水硫酸钠、氯化钠、正己烷和无水乙醇均为分析纯，购于天津市致远化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨和琼脂粉等试剂购于北京奥博星生物技术有限公司；抗生素溶液，1%青霉素钠溶液购于华北制药股份有限公司（稀释剂为蒸馏水）。抑菌试验所用菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄葡萄球菌。以上菌种保存于吉林市北华大学微生物实验室内，购于上海鲁微科技有限公司。抑菌试验所用培养基分别为营养肉汤琼脂培养基（NA）和营养肉汤培养基（NB）。
1.2 研究方法
1.2.1 朝鲜崖柏枝叶的精油提取工艺
分别称取100 g朝鲜崖柏枝叶粉碎样品，放入圆底烧瓶中，加入2.0% NaCl溶液700 mL，然后使用电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）进行电加热蒸馏[31]。溶液沸腾后直至精油增长极其缓慢或不再增长时，停止加热并静置一段时间，待上层精油澄清后进行读数，收集上层精油，使用无水硫酸钠吸收多余水分，于4 ℃冰箱保存。考察NaCl质量分数、蒸馏时间、液料比和材料保存条件（保存条件分别为新鲜枝叶、室温阴干枝叶、−20 ℃冰箱保存的枝叶和−80 ℃冰箱保存的枝叶） 4个因素对朝鲜崖柏枝叶的精油提取率的影响。选择蒸馏时间（A）、液料比（B）和NaCl质量分数（C）为试验因素，具体水平见表1，以朝鲜崖柏枝叶精油的提取率为指标，设计L9（33）正交试验和响应面分析，对朝鲜崖柏枝叶的精油提取工艺进行优化。所有试验重复3次，结果取均值。
表 1 试验因素水平表Table 1. Levels of test factors水平
Level蒸馏时间
Distillation time
(A)/h液料比
Liquid-solid ratio
(B)/(mL·g−1)NaCl质量分数
Mass fraction of NaCl
(C)/%−1 1.0 6.0 1.0 0 2.0 7.0 2.0 1 3.0 8.0 4.0 1.2.2 朝鲜崖柏枝叶精油的化学成分分析
采用GC-MS（Agilent7890A-5975CAgilent公司）对朝鲜崖柏枝叶的精油进行化学成分分析，与色谱柱连接的柱子为DB-17MS毛细管柱（30.00 m × 0.25 mm × 0.25 μm），升温程序为：在初始温度50 ℃下保持5 min，之后以3.5 ℃/min的升温速度升到220 ℃保持5 min，再以5 ℃/min的升温速度升到240 ℃保持5 min；进样口的温度为260 ℃，进样量1.0 μL，分流比为20∶1，载气为流速1.2 mL/min的氦气。质谱条件为EI离子源，轰击电压70 eV，离子源温度230 ℃，相对分子质量扫描范围为15 ~ 500。之后将GC-MS分离出的组分进行定性定量分析，与NIST数据库、文献检索和人工解析进行联合分析鉴定，确认各成分，并采用峰面积归一法计算出各成分的相对百分质量。
1.2.3 朝鲜崖柏枝叶精油的抑菌试验
利用NA培养基，斜面活化3种供试细菌菌株，放入37 ℃恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司新苗SPX-25085-Ⅱ）中活化培养至光密度值（optical density，OD）达到0.8 h，此时菌的生殖活力达最旺盛时期。用接种环取一环菌种放入液体培养基中，使用振荡培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司HDL-HZ Q-F160）摇床培养至对数生长期后，制成约为1.0 × 107 cfu/mL的供试菌液，放入4 ℃冰箱冷藏备用。
（1）抑菌效果的测定
采用滤纸片法测定抑菌效果。取待测菌悬液200 μL，进行涂布，把精油浸润的滤纸片贴在均匀涂抹细菌的固体培养基上，空白对照为无菌水和正己烷溶液浸润的滤纸片，用1%青霉素浸泡的滤纸片作为细菌抑菌对照。将平板放置于37 ℃的恒温培养箱中培养至细菌生长最旺盛时期，测量抑菌圈的直径。
（2）MIC的测定
设置10个精油的质量浓度梯度，分为0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.005、2.5 × 10−3、1.25 × 10−3、0.625 × 10−3、0.312 × 10−3 μg/L。取10 μL测试细菌的菌悬液加入到1 mL含精油的液体培养基中充分混匀，将含有不同浓度精油的菌悬液置于37 ℃的培养箱中培养24 h，每个浓度设置3个重复。培养结束后，对每个精油浓度梯度的菌悬液试管，以及正己烷、无菌水的对照管进行营养平板的涂抹培养计数。滴加200 μL待试样品于固体培养基上涂抹均匀，置于37 ℃的培养箱中培养24 h，每个浓度梯度重复3次。通过观察营养平板上菌落数来确定MIC。
2. 结果与分析
2.1 朝鲜崖柏枝叶精油提取的工艺优化
2.1.1 单因素试验结果分析
2.1.1.1 液料比对精油提取率的影响
液料比对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响见图1。随着液料比的增加，朝鲜崖柏枝叶的精油提取率呈现先缓慢增加，而后逐渐降低的趋势。当液料比为7.0 mL/g时，朝鲜崖柏枝叶的精油提取率最高，可达37.0 mL/kg。精油在低液料比时提取率较低的原因可能为部分提取材料未能很好散开，从而导致精油提取率较小；而液料比过高时，大量精油溶解在水中，进而使得精油提取率逐渐减少[32]。由以上结果可知，朝鲜崖柏枝叶提取工艺中，当蒸馏时间3.0 h和NaCl质量分数2.0%时，最佳液料比为7.0 mL/g。
![]()
图 1 液料比对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响Figure 1. Effects of liquid-solid ratio on the extraction rate of essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves2.1.1.2 NaCl质量分数对精油提取率的影响
NaCl质量分数对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响见图2。NaCl质量分数对朝鲜崖柏枝叶的精油提取率的影响呈先上升后降低趋势。在NaCl质量分数为2.0%时，朝鲜崖柏枝叶的精油提取率为37.0 mL/kg。朝鲜崖柏枝叶的精油提取率随NaCl质量分数变化是由于NaCl使精油在水中溶解度降低，使精油被蒸出，从而明显提高了提取率[33]；但当溶液中NaCl质量过高时会导致提取液中可溶性物质增加，从而使其沸点升高，进而降低了其提取率[34]。分析可得，当蒸馏时间3.0 h和液料比7.0 mL/g时，最佳NaCl质量分数为2.0%。
![]()
图 2 NaCl质量分数对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响Figure 2. Effects of NaCl mass fraction on extraction rate of essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves2.1.1.3 蒸馏时间对精油提取率的影响
蒸馏时间对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响见图3。在1.0 ~ 5.0 h蒸馏时间内，朝鲜崖柏枝叶的精油提取率随蒸馏时间的延长呈增加趋势，但在2.0 h以前增长迅速，其后趋于平缓；在提取时间超过5.0 h后，精油提取率基本不变，精油提取率最高可达到39.0 mL/kg。理论提取终点是精油总量不再随时间延长而增加的时刻，但在工业生产中，为节约能源会缩短提取时间[11]。朝鲜崖柏枝叶2.0 h以后的提取率略有增加，但变化不明显，5.0 h提取率最高，之后增长趋于平稳，因差异较少同时为节约能源消耗，建议蒸馏时间采用2.0 h。当液料比7.0 mL/g和NaCl质量分数2.0%时，最佳蒸馏时间为2.0 h。
![]()
图 3 蒸馏时间对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响Figure 3. Effects of distillation time on extraction rate of essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves2.1.1.4 保存条件对精油提取率的影响
保存条件对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响见图4。当液料比7.0 mL/g、NaCl质量分数2.0%、蒸馏时间3.0 h时，新鲜朝鲜崖柏枝叶的精油提取率为39.0 mL/kg、干叶的为25.7 mL/kg，−20 ℃冰箱保存枝叶的为23.0 mL/kg，−80 ℃冰箱保存枝叶的为32.0 mL/kg。由此可知，新鲜朝鲜崖柏枝叶的提取率最高，−80 ℃冰箱保存的枝叶次之，−20 ℃冰箱保存的枝叶提取率最低。所以当取回材料后无法立刻提取精油时，推荐使用−80 ℃冰箱保存，能有效防止精油流失，从而达到节约资源的目的。
![]()
图 4 保存条件对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响Figure 4. Effects of preservation conditions on extraction rate of the essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves2.1.2 正交试验结果分析
由正交试验结果和极差分析（表2）可知3个因素均为K2值最大，所以最佳工艺为蒸馏时间2.0 h、液料比7.0 mL/g、NaCl质量分数2.0%。由极差值可知，影响朝鲜崖柏枝叶精油提取率的各因素的主次顺序为：A = B > C。
表 2 朝鲜崖柏枝叶精油提取工艺正交试验结果Table 2. Orthogonal experiment results of extraction technology of the essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves试验序号
Experiment No.因素 Factor 提取率
Extraction rate/%A B C 1 −1 −1 −1 3.0 2 −1 0 0 3.6 3 −1 1 1 2.3 4 0 −1 0 3.8 5 0 0 1 3.8 6 0 1 −1 3.4 7 1 −1 1 3.1 8 1 0 −1 3.9 9 1 1 0 3.5 K1 2.967 3.567 3.433 K2 3.667 3.767 3.633 K3 3.500 3.067 3.067 极差 Range 0.700 0.700 0.566 由表3可知3个因素的P值均小于0.05。这说明3个因素对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响均显著。因蒸馏时间A的P值最小，所以蒸馏时间对朝鲜崖柏枝叶精油的提取率影响最显著。
表 3 朝鲜崖柏枝叶精油的正交试验方差分析Table 3. Analysis of variance in orthogonal test of the essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves因素
Factor平方和
Sum of
square自由度
Degree of
freedom均方
Mean
squareF P A 0.802 2 0.401 51.571 0.019 B 0.762 2 0.381 49.000 0.020 C 0.496 2 0.248 31.857 0.030 误差 Error 0.016 2 0.008 2.1.3 响应面优化结果分析
以精油提取率（Y）为响应值，蒸馏时间、液料比、NaCl质量分数为响应因素，响应面试验设计和结果见表4。根据表4数据，利用Design-Expert软件对试验结果进行分析，得到朝鲜崖柏枝叶精油提取率与蒸馏时间、液料比、NaCl质量分数的回归方程：
表 4 响应面试验设计和结果Table 4. Design and results of response surface test试验序号
Experiment No.因素 Factor 提取率
Extraction rate (Y)/%A B C 1 1 0 1 3.9 2 1 0 −1 3.8 3 −1 0 1 3.3 4 0 −1 1 3.3 5 0 1 1 3.1 6 0 −1 −1 3.2 7 0 0 0 4.1 8 −1 −1 0 3.0 9 0 0 0 4.0 10 −1 1 0 2.4 11 0 0 0 4.1 12 0 1 −1 3.0 13 0 0 0 4.2 14 1 1 0 3.6 15 −1 0 −1 2.8 16 1 −1 0 3.8 17 0 0 0 4.3 Y=−27.49778+1.19667A+0.0833B+1.02222C+1.0×10−3AB−0.066667AC−1.38778×10−18BC−0.32A2−6.2×10−5B2−0.16444C2 (1) 由表5的方差分析表明：蒸馏时间（P < 0.000 1）对朝鲜崖柏枝叶精油的提取率有极显著影响，液料比和NaCl质量分数对精油提取率具有显著影响，其影响大小为A > B > C，即蒸馏时间 > 液料比 > NaCl质量分数。由表5可知，此模型极显著有效（P < 0.000 1），失拟项不显著（P = 0.334 8 > 0.05），决定系数R2 = 0.977 5，说明拟合良好，试验误差小。调整系数R2 adj = 0.948 5，表明该模型能够解释94.85%响应值的变化。所以，该模型能对朝鲜崖柏枝叶精油的提取工艺进行优化。
表 5 响应面试验方差分析Table 5. ANOVA for response surface项目 Item 平方和 Sum of square 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F P 模型 Model 4.860 9 0.540 33.74 < 0.000 1 A 1.620 1 1.620 101.25 < 0.000 1 B 0.180 1 0.180 11.25 0.012 2 C 0.080 1 0.080 5.00 0.040 4 AB 0.040 1 0.040 2.50 0.157 9 AC 0.040 1 0.040 2.50 0.157 9 BC 0.000 1 0.000 0.00 1.000 0 A2 0.430 1 0.430 26.95 0.001 3 B2 1.620 1 1.620 101.16 < 0.000 1 C2 0.580 1 0.580 36.03 0.000 5 残差 Residual 0.110 1 0.016 1.54 0.334 8 失拟误差 Lack of fit error 0.060 1 0.020 纯误差 Pure error 0.052 4 0.013 总误差 Total error 4.970 16 各因素对响应值的影响和交互作用大小都能够通过观察响应面和等高线图反映出来。由图5 ~ 7可以看出，等高线呈椭圆形且响应面曲线较陡，因此3个因素之间的交互作用对朝鲜崖柏枝叶精油的提取率均有显著影响。
![]()
图 5 蒸馏时间与液料比对精油提取率影响的等高线图与响应面Figure 5. Contour plot and response surface of effect of distillation time and liquid-solid ratio on essential oil yield![]()
图 7 液料比与NaCl质量分数对精油提取率影响的等高线图与响应面Figure 7. Concontour plot and response surface of the effect of liquid-solid ratio and NaCl mass fraction on essential oil yield![]()
图 6 蒸馏时间与NaCl质量分数对精油提取率影响的等高线图与响应面Figure 6. Contour plot and response surface of the effect of distillation time and NaCl mass fraction on essential oil yield2.1.4 最佳工艺条件验证
对回归方程（1）进行最优解分析，能够确定朝鲜崖柏枝叶精油的最佳提取工艺。通过响应面分析得出水蒸气蒸馏法提取朝鲜崖柏枝叶精油的最佳工艺为：液料比6.9 mL/g、蒸馏时间2.7 h、NaCl质量分数为2.6%，在此条件下的提取率为4.3%。经过3次平行试验，得到朝鲜崖柏枝叶精油提取率的均值为4.4%。基本等同于预测值4.3%，两者拟合良好，说明此提取工艺参数可靠且有应用价值。
2.2 朝鲜崖柏枝叶精油化学成分分析
朝鲜崖柏枝叶精油的离子流色谱图见图8，共得到57个峰值，现检出48种化合物，占所提取精油总量的93.79%。各成分及其质量分数见表6。烯类物质17种，醇类物质15种，酯类物质6种，酮类物质5种，酚类等物质5种，分别占总含量的26.79%、25.40%、28.47%、11.84%和1.11%。乙酸香芹酯为含量最高的化合物，占总含量的22.43%。与倪妍妍等[10]、戚继忠等[11]和杨智蕴等[12]的研究结果不同，倪妍妍等共鉴定出48种化合物，其中（8β,13β）-13-methyl-17-norkaur-15-ene含量最高，高达30.79%；戚继忠等共检测出49种有效化合物，但本文中检测出含量较高的乙酸龙脑酯等有效成分并未报道；杨智蕴等[12]共检测出33种化合物，其中含量最高的为β-侧柏酮，高达11.73%。经检测朝鲜崖柏枝叶的精油中还有较多有效成分，如柠檬烯对常见致腐菌有抑制作用[24]，水芹烯具有抗氧化、抗炎、抗增殖作用[35]，乙酸龙脑酯有治疗腹泻、镇痛等功效，香茅醇具有抗菌和提高皮肤免疫力的作用，松油醇大量应用于调配香精，也可作为溶剂和消毒剂等[31, 36]。
![]()
图 8 朝鲜崖柏枝叶精油的离子流色谱图Figure 8. Ion flow chromatography of the essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves表 6 朝鲜崖柏枝叶精油的成分分析鉴定结果Table 6. Compound analysis and identification of the essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves峰号 Peak No. 化合物名称 Compound name 分子式 Formula 分子量 Molecular mass 质量分数 Mass fraction/% 1 葑烯 Feoehene C10H16 136 0.07 2 α-侧柏烯 α-thujene C10H16 136 0.59 3 马鞭草烯酮 Trimethylbicyclo C10H14O 150 1.80 4 β-水芹烯 β-phellandrene C10H16 136 11.62 5 莰烯 Camphene C10H16 136 1.84 6 β-蒎烯 β-phellandrene C10H16 136 0.08 7 月桂烯 Myrcene C10H16 136 2.82 8 α-水芹烯 α-phellandrene C10H16 136 0.09 9 松油烯 Terpinene C10H16 136 1.00 10 d-柠檬烯 d-limonene C10H16 136 2.13 11 萜品烯Terpinene C10H16 136 1.41 12 降樟脑 Norcamphor C7H10O 110 14.27 13 山梨酸乙酯 2,4-hexadienoic acid C8H12O2 140 0.14 14 芳樟醇 Linalool C10H18O 154 0.35 15 α-侧柏酮 α-bicyclo C10H16O 152 1.05 16 小茴香酮 Fenehone C10H18O 154 0.07 17 侧柏酮 Thujone C10H16O 152 8.86 18 2-环己烯-1-醇 2-cyclohexen-1-ol C9H16O 140 0.26 19 双环[3.1.0]-3-己醇 Bicyclo[3.1.0]hexan-3-ol C6H10O 98 0.46 20 樟脑 Camphor C10H16O 152 0.20 21 双环[2.2.1]-2-庚醇 Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol C7H12O 112 0.28 22 冰片 Borneol C10H18O 154 0.22 23 1-羟基-3-环己烯 3-cyclohexen-1-ol C6H10O 98 2.14 24 α-松油醇 α-terpineol C10H18O 154 0.39 25 2-环己烯-1-醇 2-cyclohexen-1-ol C6H10O 98 0.08 26 双环[2.2.1]-2-庚醇 Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol C7H12O 112 0.19 27 香茅醇 Citronellol C10H20O 156 0.22 28 香茅酸 Citronellic acid C10H18O2 170 0.32 29 乙酸龙脑酯 Bornyl acetate C12H20O2 196 7.58 30 乙酸香芹酯 Carvyl acetate C12H18O2 194 20.43 31 乙酸萜品酯 Terpinyl acetate C12H20O2 196 0.10 32 乙酸松油酯 3-cyclohexene-1-methanol C12H20O2 196 0.06 33 β-榄香烯 β-cyclohexane C15H24 204 0.43 34 石竹烯 Caryophyllene C15H24 204 0.07 35 肉桂酸乙酯 2-propenoic acid C11H12O2 176 0.16 36 β-番茄红素 β-copaene C15H24 204 0.35 37 α-摩勒烯 α-muurolene C15H24 204 0.18 38 环己醇 Cyclohexanol C6H12O 244 5.76 39 α-毕橙茄醇 α-cadinol C15H24 204 0.25 40 2-萘酚 2-hydroxy naphthalene C15H18O 214 0.12 41 异前列腺素 8-epi-prostaglandin F2α C20H34O5 354 0.10 42 γ-桉叶醇 γ-naphthalenemethanol C15H26O 222 1.36 43 β-桉叶醇 β-naphthalenemethanol C15H26O 222 1.08 44 芮木泪柏烯 Phenanthrene C20H32 272 2.35 45 蛇麻烯 Humulene C15H24 204 0.08 46 γ-摩勒烯 γ-muurolene C15H24 204 0.07 47 2-异丙基-5-甲基-3-环己烯-1-酮
2-isopropyl-5-methyl-3-cyclohexen-1-oneC10H16O 152 0.06 48 τ-松油醇 τ-terpineol C15H26O 222 0.25 2.3 朝鲜崖柏枝叶精油的抑菌性研究
2.3.1 朝鲜崖柏枝叶精油的抑菌圈测定结果分析
由抑菌圈试验结果（图9）可见：朝鲜崖柏枝叶精油对金黄葡萄球菌抑菌圈直径为13.28 mm，枯草芽孢杆菌抑菌圈直径为12.04 mm，大肠杆菌抑菌圈直径为12.94 mm。朝鲜崖柏枝叶精油对这3个菌种均有抑菌作用，均表现为中度敏感。其中朝鲜崖柏枝叶精油对金黄葡萄球菌抑菌效果最好，对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最差。
![]()
图 9 朝鲜崖柏枝叶精油对不同菌种的抑菌圈图片1. 朝鲜崖柏枝叶精油；2. 1%青霉素；3. 无菌生理盐水；4. 正己烷。1, essential oil from the branches and leaves of Thuja koraiensis; 2, 1% penicillin; 3, sterile saline; 4, n-hexane.Figure 9. Inhibitory zone of the essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves to different strains2.3.2 朝鲜崖柏枝叶精油MIC测定结果分析
朝鲜崖柏枝叶精油的MIC测定结果（表7）表明朝鲜崖柏枝叶精油有较显著的抑菌作用。本试验中，朝鲜崖柏枝叶精油对金黄葡萄球菌的MIC值为0.005 μg/L，对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的MIC值均为0.010 μg/L。这表明3个菌种中朝鲜崖柏枝叶精油对金黄葡萄球菌的抑菌效果最好，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌略差。该结果与2.3.1抑菌圈的测定结果具有一致性。
表 7 朝鲜崖柏枝叶精油的最低抑菌质量浓度Table 7. Minimum inhibitory concentration of the essential oil from Thuja koraiensis branches and leaves菌种 Strain 菌种类型 Strain type 最低抑菌质量浓度 Minimum inhibitory concentration/(μg·L−1) 金黄葡萄球菌 Staphylococcus aureus G+ 0.005 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis G+ 0.010 大肠杆菌 Escherichia coli G− 0.010 3. 结 论
（1）水蒸气蒸馏法提取朝鲜崖柏枝叶精油的最佳工艺。正交试验表明：3个因素对朝鲜崖柏枝叶精油提取率的影响均为显著，且蒸馏时间对朝鲜崖柏枝叶的精油提取率影响最大，其次分别为液料比和NaCl质量分数。正交试验得出的最佳工艺条件为蒸馏时间2.0 h、液料比7.0 mL/g、NaCl质量分数2.0%，经验证在此条件下精油提取率为4.2%。响应面优化法得出的最佳工艺条件为液料比6.9 mL/g、蒸馏时间2.7 h、NaCl质量分数2.6%，在此条件下的精油提取率为4.3%，实际值为4.4%，两者拟合良好，说明响应面优化法得到的朝鲜崖柏枝叶精油提取工艺参数可靠且有应用价值。
（2）朝鲜崖柏枝叶精油的化学成分分析。共检出48种化合物，占所提取精油总量的93.79%。烯类物质17种，醇类物质15种，酯类物质6种，酮类物质5种，酚类等物质5种，分别占总质量的26.79%、25.40%、28.47%、11.84%和1.11%。其中乙酸香芹酯含量最高，占总含量的22.43%，目前已被应用于各类香精的配方中。
（3）抑菌试验表明：朝鲜崖柏枝叶精油对3个菌种均有抑菌作用，其中对金黄葡萄球菌的抑菌圈直径为13.28 mm，枯草芽孢杆菌的为12.04 mm，大肠杆菌的为12.94 mm，均表现为中度敏感。朝鲜崖柏枝叶精油对金黄葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC值为0.005 μg/L；对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果次之，MIC值均为0.010 μg/L。
-
![]()
图 1 Bx-VAPs基因PCR扩增的电泳图
Figure 1. Electrophoresis map of PCR amplification of Bx-VAPs gene
![]()
图 2 不同发育阶段松材线虫Bx-VAPs的相对表达量
E代表卵，L2 ~ L4 代表繁殖型2 ~ 4龄幼虫，A代表成虫。不同小写字母表示不同发育阶段基因表达量差异显著性(P < 0.05)。下同。E indicates egg stage, L2 − L4 indicate propagative 2nd to 4th instar larvae, A indicates adult. Different lowercase letters indicate significant differences in gene expression at different developmental stages (P < 0.05). The same below.
Figure 2. Relative expression level of Bx-VAPs in B. ylophilus at various developmental stages
![]()
图 3 重组蛋白在大肠杆菌BL21DE3中表达的SDS-PAGE分析
1. 无IPTG诱导的BL21DE3-BxVAPn全菌；2. IPTG诱导的BL21DE3-BxVAPn 全菌；3. 上清液；4. 包涵体；5. 纯化的BxVAPn蛋白；6. 低分子量蛋白标记。1, BL21DE3–BxVAP1 without IPTG; 2, BL21DE3- BxVAP1 induced with IPTG; 3, supernatant; 4, inclusion body; 5, purified BXVAP1 protein; 6, low molecular mass protein marker.
Figure 3. SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant protein in E. coli BL21DE3
![]()
图 5 Western blot验证抗体的特异性
M. 低分子量蛋白质标记物；Bx. 松材线虫蛋白液。M, low molecular mass protein marker; Bx, protein solution of B. xylophilus.
Figure 5. Western blot verifying antibody specificity
![]()
图 6 Bx-VAPs蛋白生物信息学分析
A. Bx-VAPs的氨基酸序列；B. Bx-VAPs蛋白的亲水/疏水性；C. Bx-VAPs蛋白系统发育树。A, amino acid sequence of Bx-VAPs; B, predicted hydrophilicity/ hydrophobicity of Bx-VAPs; C, phylogenetic tree analysis of Bx-VAPs protein.
Figure 6. Bioinformatics information analysis of the Bx-VAPs protein
![]()
图 8 Bx-VAPs的三级结构（A）和二级结构（B）预测图
h代表α-螺旋，c代表无规则卷曲，e代表延伸链，t代表β转角。h represents α-helix, c represents random coil, e represents extended strand, and t represents β turn.
Figure 8. Secondary structure (B) and tertiary structure (A) prediction diagram of Bx-VAPs
![]()
图 9 Bx-VAPs蛋白的B细胞抗原表位预测
A. Bx-VAP1蛋白的B细胞表位预测；B. Bx-VAP2蛋白的B细胞表位预测；C. Bx-VAP3蛋白的B细胞表位预测；D. Bx-VAP4蛋白的细胞表位预测。A, B cell epitope prediction of Bx-VAP1 protein; B, B cell epitope prediction of Bx-VAP2 protein; C, B cell epitope prediction of Bx-VAP3 protein; D, B cell epitope prediction of Bx-VAP4 protein.
Figure 9. B cell antigenic epitope prediction of Bx-VAPs protein
表 1 引物信息
Table 1 Primer information
引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence引物用途
Primer usageBx-VAP1-F ATGTTCGGTCTACTGTTAGT 全长克隆
Full-length gene cloneBx-VAP1-R TCAGGCGCTACACAGACTGT Bx-VAP2-F ATGGTTCGAGTATTAGTTCT Bx-VAP2-R TCAGGCACTGCACAAACTGT Bx-VAP3-F ATGTTCCGAGTTCTCCTGAC Bx-VAP3-R CTATTCGGCACTGCAGAGTG Bx-VAP4-F ATGATAACTAAATTCCTGTG Bx-VAP4-R TTAAGCGACGCACAATCCCT EX-VAP1-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCGACAGGTTCAGCAACAGCCAA 添加双酶切位点
Addition of double cleavage sitesEX-VAP1-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGCGCTACACAGACTGT EX-VAP2-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCACCAAATTCAGCGAAAGCCAA EX-VAP2-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGCGCTACACAGACTGT EX-VAP3-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCGCCAGGTTAAGCGACGATGAG EX-VAP3-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTATTCGGCACTGCAGAGTG EX-VAP4-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCGAAAAGTTGAATAGCGCTGAG EX-VAP4-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGCGACGCACAATCCCT RT-VAP1-F AATGTGATGGAGGCTGAC 实时荧光定量PCR
Real-time quantitative polymerase chain reactionRT-VAP1-R GCTACACAGACTGTCACT RT-VAP2-F GCTGTGCCATTCAGAACT RT-VAP2-R GCTCCCATCATGTTTCCA RT-VAP3-F TTGGACCTTCACCGTCTG RT-VAP3-R CTTCTTCTTCCTCGCACTG RT-VAP4-F CTCCGACCTGGAAGACAA RT-VAP4-R CGCTCTCATGGCAATGTT β-actin -F TCCGTACCCTGAAGTTGGCTAACC β-actin -R AAGTGGAGACGAGGGAATGGAACC 
下载: 导出CSV
表 2 松材线虫的Bx-VAPs蛋白序列及理化性质
Table 2 Protein sequence and physicochemical properties of Bx-VAPs in B. xylophilus
蛋白名称
Protein name基因库登录号
GenBank ID氨基酸数
Number of
amino acid分子量
Molecular
mass/Da理论等电点
Theoretical pI信号肽的位置
Signal peptide
location/aa跨膜结构域
Transmembrane
domain磷酸化位点数量
Number of phosphorylation site丝氨酸
Serine苏氨酸
Threonine络氨酸
ComplexinBx-VAP1 ADG86237.1 204 22 434.86 4.93 17 ~ 18 无 No 12 17 4 Bx-VAP2 ADG86238.1 206 22 418.83 4.68 17 ~ 18 无 No 15 15 4 Bx-VAP3 ADG86239.1 202 22 446.27 4.31 18 ~ 19 无 No 16 11 8 Bx-VAP4 CAD5147609.1 201 22 038.58 5.19 17 ~ 18 无 No 14 17 7
下载: 导出CSV
-
[1] Cantacessi C, Gasser R B. SCP/TAPS proteins in helminths: where to from now [J]? Molecular & Cellular Probes, 2012, 26(1): 54−59.
[2] Jasmer D P, Goverse A, Smant G. Parasitic nematodeinteractions with mammals and plants[J]. Annual Review of Phytopathology, 2003, 41(1): 245−270. doi: 10.1146/annurev.phyto.41.052102.104023
[3] Wilbers R H P, Schneiter R, Holterman M H M, et al. Secreted venom allergen-like proteins of helminths: conserved modulators of host responses in animals and plants [J/OL]. PLoS Pathogens, 2018, 14(10): e1007300 [2021−03−15]. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1007300.
[4] Ding X, Shields J, Allen R, et al. Molecular cloning and characterisation of a venom allergen AG5-like cDNA from Meloidogyne incognita[J]. International Journal for Parasitology, 2000, 30(1): 77−81. doi: 10.1016/S0020-7519(99)00165-4
[5] Wang X, Li H, Hu Y, et al. Molecular cloning and analysis of a new venom allergen-like protein gene from the root-knot nematode Meloidogyne incognita[J]. Experimental Parasitology, 2007, 117(2): 133−140. doi: 10.1016/j.exppara.2007.03.017
[6] Gao B, Allen R, Maier T, et al. Molecular characterisation and expression of two venom allergen-like protein genes in Heterodera glycines[J]. International Journal for Parasitology, 2002, 31(14): 1617−1625.
[7] 王秉宇, 彭德良, 黄文坤, 等. 马铃薯腐烂茎线虫类毒液过敏原蛋白基因cDNA全长的克隆与序列分析[J]. 华中农业大学学报, 2011, 30(2):182−186. Wang B Y, Peng D L, Huang W K, et al. Cloning and sequence analysis of a venom allergen-like proteins gene from Ditylenchus destructoron potato in China[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2011, 30(2): 182−186.
[8] Lin S, Jian H, Zhao H, et al. Cloning and characterization of a venom allergen-like protein gene cluster from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus[J]. Experimental Parasitology, 2011, 127(2): 440−447. doi: 10.1016/j.exppara.2010.10.013
[9] Lozano-Torres J L, Wilbers R H P, Gawronski P, et al. Dual disease resistance mediated by the immune receptor Cf-2 in tomato requires a common virulence target of a fungus and a nematode[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(25): 10119−10124. doi: 10.1073/pnas.1202867109
[10] Luo S J, Liu S M, Kong L G, et al. Two venom allergen-like proteins, HaVAP1 and HaVAP2, are involved in the parasitism of Heterodera avenae[J]. Molecular Plant Pathology, 2019, 20(4): 471−484. doi: 10.1111/mpp.12768
[11] Li J Y, Xu C L, Yang S H, et al. A venom allergen-like protein, RsVAP, the first discovered effector protein of Radopholus similis that inhibits plant defense and facilitates parasitism[J/OL]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22: 4782 [2021−03−15]. https://doi.org/10.3390/ijms22094782.
[12] Franchini G, Porfido J, Shimabukuro M, et al. The unusual lipid binding proteins of parasitic helminths and their potential roles in parasitism and as therapeutic targets[J]. Prostaglandins Leukotrienes & Essential Fatty Acids, 2015, 93: 31−36.
[13] Duarte A, Curtis R, Maleita C, et al. Characterization of the venom allergen—like protein (VAP-1) and the fatty acid and retinol binding protein (far-1) genes in Meloidogyne hispanica[J]. European Journal of Plant Pathology, 2014, 139(4): 825−836. doi: 10.1007/s10658-014-0436-3
[14] Kang J S, Koh Y H, Moon Y S, et al. Molecular properties of a venom allergen-like protein suggest a parasitic function in the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus[J]. International Journal for Parasitology, 2012, 42(1): 63−70. doi: 10.1016/j.ijpara.2011.10.006
[15] Somvanshi V S, Phani V, Banakar P, et al. Transcriptomic changes in the pre-parasitic juveniles of Meloidogyne incognita induced by silencing of effectors Mi-msp-1 and Mi-msp-20[J]. 3 Biotech, 2020, 10: 360. doi: 10.1007/s13205-020-02353-8
[16] Nickle W R, Golden A M, Mamiya Y, et al. On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer 1934) Nickle 1970[J]. Journal of Nematology, 1981, 13(3): 385.
[17] 理永霞, 张星耀. 我国中温带面临的松材线虫入侵扩张高风险[J]. 温带林业研究, 2018, 1(1):3−6. doi: 10.3969/j.issn.2096-4900.2018.01.002 Li Y X, Zhang X Y. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in middle temperate zone of China[J]. Journal of Temperate Forestry Research, 2018, 1(1): 3−6. doi: 10.3969/j.issn.2096-4900.2018.01.002
[18] 叶建仁. 松材线虫病在中国的流行现状, 防治技术与对策分析[J]. 林业科学, 2019, 55(9):1−10. Ye J R. Epidemic status of pine wilt disease in China and its prevention and control techniques and counter measures[J]. Scientia Silvae Sinicae, 2019, 55(9): 1−10.
[19] Yan X, Cheng X Y, Wang Y S, et al. Comparative transcriptomics of two pathogenic pinewood nematodes yields insights into parasitic adaptation to life on pine hosts[J]. Gene, 2012, 505(1): 81−90. doi: 10.1016/j.gene.2012.05.041
[20] 林世锋, 简恒, 赵海娟, 等. 松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 植物病理学报, 2013, 43(2):128−135. doi: 10.3969/j.issn.0412-0914.2013.02.003 Lin S F, Jian H, Zhao H J, et al. Prokaryotic expression of venom allergen-like protein of Bursaphelenchus xylophilus and preparation of its polyclonal antibody[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2013, 43(2): 128−135. doi: 10.3969/j.issn.0412-0914.2013.02.003
[21] 王颖.松材线虫Bx-VAP-1基因在昆虫细胞中的表达及功能分析[D].哈尔滨: 东北林业大学, 2014. Wang Y. Functional analysis of venom allergen-like protein gene from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus using insect cell expression system [D]. Harbin: Northeast Forestry University, 2014.
[22] Li Y X, Wang Y, Liu Z Y, et al. Functional analysis of the venom allergen-like protein gene from pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus using a baculovirus expression system[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2016, 93: 58−66. doi: 10.1016/j.pmpp.2015.12.006
[23] Schatz G, Dobberstein B. Common principles of protein translocation across membranes[J]. Science, 1996, 271: 1519−1526. doi: 10.1126/science.271.5255.1519
[24] Rose J K, Shaferman A. Conditional expression of vesicular stomatitis virus glycoprotein gene in Escherichia coli[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1981, 78(11): 6670−6674. doi: 10.1073/pnas.78.11.6670
-
期刊类型引用(3)
1. 李潇，王汉时，王宏星，蒋路平，庞忠义，彭彦辉，赵曦阳. 灌溉和施肥对‘新林1号’杨生长和光合生理特性的影响. 植物研究. 2025(01): 77-87 . 
百度学术
2. 张聪，贾炜玮，郭昊天，范迎新. 不同施肥措施的人工落叶松生长差异性. 东北林业大学学报. 2024(11): 1-9 . 百度学术
3. 王亚飞，贺曰林，杨红青，祝维，贾黎明，席本野. 灌溉施肥对杨树人工林林木及地力效应研究进展. 世界林业研究. 2023(05): 63-69 . 百度学术
其他类型引用(0)
计量
- 文章访问数: 908
- HTML全文浏览量: 314
- PDF下载量: 82
- 被引次数: 3
