Selection and validation of appropriate reference genes and expression analysis of jasmonic acid-related genes responding to Marssonina rosae in Rosa species and cultivars
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摘要:目的 为研究蔷薇属植物响应黑斑病侵染的稳定表达的最适内参基因，解析茉莉酸在蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染过程中的作用。方法 以黑斑病病原菌蔷薇盘二孢侵染的6个蔷薇属种/品种不同时间的离体叶片为材料，利用qRT-PCR技术及geNorm、NormFinder、BestKeeper软件对9个候选内参基因（ACT、GAPDH、PP2A、Rcl2、SAND、TIP、TUA、TUB、UBC）的表达量进行测定和分析，利用筛选出的内参基因，对蔷薇属植物茉莉酸（JA）抗病途径相关基因（COI1、OPR3、MYC2、JAR1）的表达水平进行定量分析。结果 （1）UBC可作为6种蔷薇属植物共同适用的内参基因，可用于后续分析JA抗病途径相关基因的表达水平。（2）内源JA含量在6种蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的过程中存在差异。在黑斑病高抗植物受侵染0 ~ 4 d间JA含量下调，4 ~ 8 d间上调。在黑斑病易感植物受侵染0 ~ 8 d间，内源JA含量呈下调趋势。（3）JA合成相关基因OPR3及JAR1表达量在受侵染初期表达量趋势存在差异。在除荷花蔷薇外的其余5种植物中，OPR3在侵染初期（0 ~ 0.5 d）表达下调，JAR1在侵染初期表达上调。OPR3和JAR1在侵染后期均表达上调，黑斑病易感材料的上调程度高于高抗材料。（4）JA信号传导相关基因COI1及MYC2在受侵染初期表达量趋势同样存在差异。COI1在黑斑病高抗材料受侵染初期上调表达，在黑斑病易感材料下调表达，MYC2在6种植物受侵染0 ~ 2 d中均下调表达。COI1及MYC2表达量在受侵染2 d后均上调表达，且在黑斑病易感植物中的上调程度大于黑斑病高抗材料。结论 与JA信号传导相关的MYC2、COI1在蔷薇属植物抵御黑斑病病菌入侵过程中发挥负调控作用，且由JA通路介导的抵御死体营养型病原菌的侵染在后期发挥了作用。Abstract:Objective This paper aims to select the appropriate reference gene and analyze the role of jasmonic acid in Rosa species and cultivars responding to Marssonina rosae.Method R. multiflora f. carnea, R. xanthina f. spontanea, R. glauca, R. rugosa, R. hybrida ‘Porcelina’ and R12-26 (hybrid of R. rugosa and R. hybrida ‘Porcelina’) were used as materials, qRT-PCR technology, geNorm, NormFinder, BestKeeper were used to evaluate the expression stability of nine candidate reference genes (ACT, GAPDH, PP2A, RCl2, SAND, TIP, TUA, TUB and UBC). The expression levels of jasmonic acid resistance pathway relatedgenes (COI1, OPR3, MYC2 and JAR1) in six Rosa species and cultivars were quantitatively analyzed.Result (1) UBC was the common reference gene of six Rosa species and cultivars responding to M. rosae, and can be used for analyzing the related gene expression levels to JA resistance pathway. (2) There were differences in JA content among the six plants responding to M. rosae. In disease-resistant plants, JA concentration decreased at 0−4 d and increased at 4−8 d. In disease-susceptible plants, JA concentration decreased at 0−8 d and increased significantly at 8−10 d. (3) The expression levels of JA synthesis-related genes OPR3 and JAR1 were different at the early stage of infection. The expression level of OPR3 was down-regulated and JAR1 up-regulated in five plants except for R. multiflora f. carnea. OPR3 and JAR1 were all up-regulated in the late stage of infection, however the up-regulation degree in black-spot susceptible species was significantly higher than that of resistant species. (4) There were also differences in the expression levels of JA signaling related genes COI1 and MYC2 at the early stage of infection. The expression of COI1 was up-regulated in disease-resistant plants and down-regulated in disease-susceptible plants at the early stage of infection, MYC2 was down-regulated in 6 plants infected 0−2 d. COI1 and MYC2 were up-regulated after 2 d of infection, and the up-regulation degree in black-spot susceptible species was significantly higher than that of resistant species.Conclusion MYC2 and COI1, which are related to JA signaling, play a negative regulatory role in the resistance of Rosa plants to the invasion of black spot pathogens, and the JA pathway mediated resistance to the invasion of dead vegetative pathogens plays a role in the later stage of infection.
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Keywords:
- Rosa /
- Marssonina rosae /
- reference gene selection /
- jasmonic acid /
- expression analysis
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现代月季（Rosa hybrida）因其极高的观赏价值，广泛应用于城市园林建设、切花和盆花生产。然而，由于早期育种过程中异味蔷薇（R. foetida）的引入，现代月季群体普遍极易受到蔷薇盘二孢（Marssonina rosae）入侵而引发黑斑病病害[1-2]，造成植株叶表生黑斑、叶片发黄脱落，甚至整株死亡，严重影响月季的观赏价值和经济价值。目前，月季黑斑病的防治手段主要依赖于化学药剂喷施，这不仅会使病菌产生抗药性，而且对环境造成不利影响。因此，选育黑斑病抗性强的月季品种是防治黑斑病的有效措施。
在“病原菌−寄主”双向互作机制的长期进化过程中，寄主植物慢慢形成了一系列复杂而有效的自我保护机制，在受到病原菌侵染后常发生过敏性反应（hypersensitive response，HR），如植物激素水杨酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）等的积累[3]。HR发生会使整个组织或植株都具有抗性，即系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[4]。JA是诱导植物SAR的重要信号物质[5]，外源施用JA或Me-JA，能够诱导植物防卫基因表达，增强植物防御酶的活性，对植物抗病具有不可忽视的作用[6]。傅竞也[7]发现在敲除抗病基因ZmEREB92的玉米（Zea mays）株系中，外源施加JA后能恢复其对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）的抗病性。刘瑞峰等[8-9]推测JA参与了月季对黑斑病的响应，此后发现黑斑病菌对月季的JA合成及信号诱导具有抑制作用。包颖等[10]发现外施JA可诱导RcMYB102的表达，进而缓解盐胁迫对‘月月粉’（R. chinensis ‘Old Blush’）的伤害。以上研究均表明，JA在植物抵御胁迫时发挥着重要作用。
OPR3和JAR1分别是编码JA及其衍生物合成的标志基因[11-12]，COI1是JA信号转导中的受体[13]，MYC2是JA信号转导中重要转录因子[14]。JA是植物中重要的信号分子，能够调控植物自身的生长发育以及代谢物质的合成。苗琪等[15]发现植物可通过COI1介导JA信号调控植物生长发育以及代谢产物合成。季彤彤[16]发现JA通过MYC2结合活性氧相关基因CAT2启动子并抑制其表达来提高叶片中H2O2的积累，从而促进拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片的衰老。此外，JA还可协同SA共同调控植物的抗病反应。当亚麻锈病抗病品种被兼性营养型致病菌（Fusarium oxysporum）侵染时，寄主体内发生JA合成和JA合成抑制的制衡，以使JA在不同阶段的含量处于一种相对稳定的状态[17-18]。Ding等[19]通过小麦（Triticum aestivum）头枯病致病菌兼性营养型病原菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）侵染植物材料，发现SA合成缺陷植物中JA合成显著上升，表明SA和JA信号通路间具有拮抗作用，从而共同影响着植物的抗性。
荧光定量PCR（qRT-PCR）因其反应快、准确性高以及特异性强等特点，被广泛应用于基因表达分析中。但qRT-PCR的精确性受多种客观因素的影响，为保证其精确度，内参基因的选择显得尤为重要[20]。内参基因又称为传统管家基因，泛指能够维持细胞结构和基本功能的相关基因[21]。常用的内参基因有肌动蛋白基因（ACT）、β微管蛋白基因（TUB）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）等[22]。随着分子生物学研究的发展，人们发现传统管家基因并非总是稳定表达的，它受植物本身及实验条件的影响[23]。Czechowski等[24]通过研究拟南芥的全基因组数据，发现PP2A、SAND、TIP和UBC的表达稳定性高度优于传统管家基因。Kile等[25]以月季不同组织及经机械胁迫和热胁迫处理的叶片为材料筛选出PP2A、SAND和UBC为适用的内参基因。Meng等[26]以月季‘萨曼莎’（R. hybrida ‘Samantha’）为材料，筛选出适合月季切花采后研究的合适内参基因。为能够对基因表达模式进行准确分析，针对特定实验条件和不同实验目的筛选最佳内参基因是极其关键且重要的一步，目前并未有针对月季黑斑病研究的内参基因的筛选工作。
为了解析JA在蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染过程中的作用，本研究以6种黑斑病抗性不同的蔷薇属植物为材料，筛选响应蔷薇盘二孢侵染的最适内参基因，并在此基础上对JA合成及信号传导相关基因（COI1、OPR3、MYC2、JAR1）进行表达分析，以期为研究月季黑斑病广谱抗病性提供依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
供实验植物包括荷花蔷薇（R. multiflora f. carnea）、单瓣黄刺玫（R. xanthina f. spontanea）、玫瑰（R. rugosa）、红叶蔷薇（R. glauca）、‘波塞尼娜’（R. hybrida ‘Porcelina’）以及‘波塞尼娜’与玫瑰‘大红紫枝’（R. rugosa ‘Dahong Zizhi’）的杂交后代R12-26。根据前期的研究，6种蔷薇属植物抗黑斑病的能力排序为：荷花蔷薇 > 单瓣黄刺玫 > 玫瑰 > R12-26 > 红叶蔷薇 > ‘波塞尼娜’[27]。这些材料保存于北京林业大学小汤山花卉种质资源与育种圃内。2019年夏季扦插繁殖，当年上盆后选取3 ~ 5株生长健壮、长势一致的植株，修剪至同一高度，于温室中栽培30 ~ 40 d后，选新生枝条第3 ~ 4片复叶进行离体叶片侵染。
1.2 离体叶片侵染
蔷薇盘二孢病原菌悬浮液制备和离体叶片侵染参考Xu等[28]的方法。每种材料设置30个培养皿，每皿3 ~ 5片叶子，置于铺有双层湿润试纸的培养皿中，其中27个培养皿用于侵染实验，其余3皿喷施蒸馏水作为对照，统一置于25 ℃恒温人工气候箱中培养，光照条件为16 h（白天）/8 h（晚上），光照强度为300 μmol/（m2·s），空气湿度为60%。分别于侵染0 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d时取样，每组取叶片3枚以上，置于锡纸袋内，于–80 ℃保存备用。
1.3 RNA提取及cDNA获得
分别取各植物不同时期样品各0.1 g，迅速置于液氮中，研成粉末，参照植物总RNA提取试剂盒（Omega Plant RNA Kit）操作说明提取总RNA。利用超微量核酸测定仪测定RNA样品的浓度、A260/A280和A260/A230值，分析纯度。每个样品分别取1 μg总RNA为模板，参照PrimeScript RT reagent Kit和gDNA Eraser的反转录操作说明，反转录合成cDNA第一链，于−20 ℃保存。
1.4 候选内参基因和JA相关基因选择及引物设计
以月季[25-26]、葡萄（Vitis vinifera）[29-30]、苹果（Malus pumila）[31]等植物在胁迫条件下筛选并已被验证的ACT、GAPDH、PP2A、Rcl2、SAND、TIP、TUA、TUB、UBC等9个内参基因作为候选内参基因（表1）。利用筛选出的内参基因，对响应病原菌侵袭的JA合成相关基因OPR3、JAR1以及信号传导相关基因COI1、MYC2[8,12,32]进行表达分析（表1）。引物设计使用Primer5.0软件，引物合成由睿博兴科（北京）公司完成。
表 1 基因引物基本信息Table 1. Basic information of gene primers基因
Gene引物序列（5′—3′）
Primer sequence (5′-3′)退火温度
Annealing temperature (Tm)/℃扩增效率
Amplification efficiency (E)/%r ACT F: TCAAGGATTGGTGGACTTCAGT
R: ACCAGAGAACAAGAATGCAAGC55 96.0 0.970 GAPDH F: TATGACCAGATCAAGGCTGCT
R: ACCAATGAAGTCGGTTGACAC55 102.5 0.999 PP2A F: TGTCACTGCATCAAAGGACAG
R: GACGAATTGTCTTCTCCACCA55 102.0 0.982 Rcl2 F: ATGGGAAATGCCCTACCT
R: CACTTGTCCGACTGTTGC55 95.7 0.969 SAND F: BGTGTTGAGGAGTTGCCTCTTG
R: AACCTGTCGGGAGAATCTGTT55 98.5 0.989 TIP F: GAATCCACGGCTGGGAAA
R: CAGTTCGTGGGTGGAGGAGTT55 104.2 0.998 TUA F: CATTGAGCGTCCCACCTA
R: CACATCCACATTCAGAGCC55 103.2 0.987 TUB F: GTACATGGCCTGCTGTTTGAT
R: ATGGTACGCTTGGTCTTGATG55 96.1 0.972 UBC F: GCCAGAGATTGCCCATATGTA
R: TCACAGAGTCCTAGCAGCACA55 103.5 0.996 COI1 F: AATGAGGGGCTGTTGCTTCA
R: GATCCCCTGTACCCTTGCAC56 102.2 0.984 MYC2 F: CGGCAGCAGCGTCAAGAAT
R: GAGGTCGGAGTGGTGGGAAT57 101.0 0.957 OPR3 F: CATCAGCGAAGGCACTTTGG
R: GGCGTCGACTACCTTCTTCC55 103.6 0.951 JAR1 F: TTGGGTGCTACTTCTTTCTCAG
R: AATTGGAGGAAGGAGGGTG57 104.4 0.952 1.5 内参基因引物特异性检测与qRT-PCR分析
将每个样品的cDNA分别按101、102、103、104、105倍稀释以用作标准品，并对各内参基因进行qRT-PCR扩增，通过荧光定量PCR仪自动获得内参基因扩增效率（E）、相关系数（r）及熔解温度等系列参数。qRT-PCR采用SYBR Premix Ex Taq试剂，反应体系15 μL，具体为：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 7.5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 5.5 μL，每个样品3次技术重复。反应程序为：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性，从65 ℃缓慢升温至95 ℃，并采集荧光信号。
1.6 数据分析及内参基因稳定性评价
qRT-PCR扩增完成后，参照魏洁书和杨锦芬[33]的方法，根据基因表达丰度的Ct值，计算内参基因以及JA相关基因的表达量，并利用SPSS软件对基因表达量进行均值计算以及误差分析。参照geNorm、NormFinder和BestKeeper软件使用说明，分析各内参基因在蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染过程中的表达稳定性。其中，geNorm软件根据计算出的各候选内参基因的表达稳定度（average expression stability values，M）进行排序，M值越小，表达越稳定，反之则越不稳定，一般认为M ≤ 1.5的基因适合作为内参基因。通过对内参基因标准化因子的配对差异分析（Vn/Vn + 1），确定最佳内参基因的数量，当Vn/Vn + 1值 < 0.15时，表示n个基因可以作为qRT-PCR分析的内参基因，反之，则n + 1个基因的组合可以作为qRT-PCR分析的最佳内参基因组合[34]。NormFinder软件采用方差估计算法，先获得内参基因的M值，再根据M值大小来筛选最佳内参基因，M值最小的基因为最适合的内参基因[35]。BestKeeper软件主要通过比较Ct值的标准偏差（SD）和变异系数（CV）来判断各候选内参基因的稳定性，SD值越小，内参基因的表达稳定性越好，当SD > 1时，认为该基因不适合作为内参基因[36]。RefFinder程序是在geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct分析的基础上，根据稳定性结果来计算几何平均值，从而获取候选内参基因的综合排名，确定最终的最佳内参基因[37-38]。
2. 结果与分析
2.1 蔷薇盘二孢侵染蔷薇属植物的结果
如图1所示：在6种材料离体叶片侵染过程中，黑斑病易感材料（红叶蔷薇、‘波塞尼娜’、R12-26）于第6天开始出现病斑，随着侵染时间的延长，黑斑面积也随之扩大。3种易感植物中，R12-26的病斑面积相对较少，且在第10天时R12-26并未出现红叶蔷薇、‘波塞尼娜’的叶片腐烂现象。而黑斑病高抗材料（荷花蔷薇、单瓣黄刺玫、玫瑰）在侵染10 d时仍未见形成明显黑斑。
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图 1 6种蔷薇属植物离体叶片侵染蔷薇盘二孢的发病情况红色圆圈表示病斑开始出现。黑色圆圈表示病斑蔓延至整个叶片。Red circle indicates the disease onset with the appearance brown necrotic lesions. Black circles indicate the spread of the brown necrotic lesions throughout the whole leaf.Figure 1. Incidence of in vitro leaves infected by M. rosae of 6 Rosa species and cultivars2.2 总RNA浓度检测及内参基因引物特异性
对所有样品提取的RNA浓度和质量进行检测，结果显示实验A260/A280值在1.9 ~ 2.2之间，A260/A230值在1.7 ~ 2.0之间，浓度大于230 ng/µL，说明提取的RNA纯度较高，无蛋白质和无机盐污染，满足后续实验的要求。以各样品进行梯度稀释后的cDNA为模板进行qRT-PCR，结果显示：所有引物的扩增效率均在95% ~ 104%之间，相关系数r均在0.95以上（表1），表明DNA浓度与响应的Ct值线性关系明确，实验结果稳定且可靠性高。
分别以蔷薇属植物各侵染时间点的cDNA为模板进行qRT-PCR，结果显示：9个候选内参基因的熔解曲线均为明显的单一信号峰，在达到退火温度之前未出现明显的杂峰，说明各对引物扩增特异性较好，扩增过程中无引物二聚体和非特异扩增情况，可用于后续的qRT-PCR分析。
2.3 候选内参基因的表达稳定性
通过qRT-PCR得到各候选内参基因在不同蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的Ct值，Ct值与基因的表达量成反比，即Ct值越大，表达量越小。结果显示：9个候选内参基因的Ct值均在17 ~ 28之间，其中GAPDH和UBC的表达丰度较高，表达水平变异小，Rcl2表达丰度和前两者无差别，但变异较大。从Ct值推测GAPDH和UBC更适合作为候选内参基因（图2）。
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图 2 9个候选内参基因响应蔷薇盘二孢侵染时的Ct值Figure 2. Ct value of 9 candidate reference genes in response to M. rosaegeNorm软件分析结果显示：在荷花蔷薇和红叶蔷薇中，TIP和UBC的表达稳定性最好，V2/3 < 0.15，2种植物均可选择UBC和TIP2个内参基因的组合；在单瓣黄刺玫中，PP2A和TIP的表达稳定性最好，V2/3 = 0.121 < 0.15，因此，可选PP2A和TIP 2个内参基因的组合；在玫瑰中，UBC和TIP的表达稳定性最好，V2/3 = 0.185 > 0.15，而V3/4 = 0.104 < 0.15，可选择UBC、TIP和TUB 3个内参基因的组合；在R12-26和‘波塞尼娜’中，TIP和SAND的表达稳定性最好，V2/3 < 0.15，可选择SAND和TIP2个内参基因的组合（图3）。
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图 3 利用geNorm软件计算的候选内参基因的表达稳定性及配对变异值M代表各候选内参基因的表达稳定度。下同。M represents the average expression stability of each candidate reference gene. The same below.Figure 3. Average expression stability values and variation values of candidate reference genes calculated by geNormNormFinder软件分析结果显示：在玫瑰、荷花蔷薇和红叶蔷薇中，UBC的表达稳定性最好，TIP次之；在单瓣黄刺玫中，PP2A的表达稳定性最好，UBC次之；在‘波塞尼娜’中，GAPDH和TIP的表达稳定性最好，UBC次之；在R12-26中，TIP的表达稳定性最好，GAPDH次之（图4）。
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图 4 Normfinder软件计算获得的候选内参基因的表达稳定性Figure 4. Expression stability of candidate reference genes and by pairwise variation using NormfinderBestKeeper软件分析结果显示：在荷花蔷薇中，TIP的表达稳定性最好，ACT次之；单瓣黄刺玫中，PP2A的表达稳定性最好，TIP次之；玫瑰中，UBC和TIP的SD值都较小，但前者的CV值高于后者，因此认为TIP的表达稳定性最好，UBC次之；在R12-26，UBC的表达稳定性最好，ACT次之；在红叶蔷薇中，SAND的表达稳定性最好，TIP次之；在‘波塞尼娜’中，PP2A的表达稳定性最好，UBC次之（图5）。
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图 5 BestKeeper软件计算获得的候选内参基因的表达稳定性SD代表各候选内参基因Ct值的标准偏差。SD represents the standard deviation of Ct value of each candidate reference gene.Figure 5. Expression stability of candidate reference genes calculated by BestKeeper通过RefFinder对3个软件分析结果的排序进行一个几何平均值的计算，综合上述结果分析9个候选内参基因的稳定性。候选内参基因的综合排名如表2所示。UBC和TIP基因在玫瑰响应蔷薇盘二孢侵染过程中的综合表达稳定性最高，又因geNorm软件V3/4 = 0.104 < 0.15，说明在玫瑰中最佳的内参基因和基因组合为UBC、TIP、UBC + TIP + GAPDH。UBC和PP2A在单瓣黄刺玫响应蔷薇盘二孢侵染过程中的综合表达稳定性最高，又因geNorm软件的V2/3 = 0.121 < 0.15，说明在单瓣黄刺玫中最佳的内参基因和基因组合为UBC、PP2A、UBC + PP2A。UBC和TIP基因在荷花蔷薇、红叶蔷薇响应蔷薇盘二孢侵染过程中的综合表达稳定性最高，且V2/3 < 0.15，说明在荷花蔷薇、红叶蔷薇及R12-26中最佳的内参基因和基因组合为UBC、TIP、UBC + TIP。其中UBC是6种蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的共同适用的内参基因，故选UBC作为后续基因表达分析的内参基因。
表 2 9个候选内参基因的表达稳定性排序Table 2. Expression stability ranking of 9 candidate internal reference genes种/品种
Species/cultivar方法 Method 1 2 3 4 5 6 7 8 9 荷花蔷薇
R. multiflora f. carneageNorm UBC TIP PP2A GAPDH TUB ACT SAND TUA Rcl2 Normfinder UBC TIP PP2A GAPDH TUB ACT TUA SAND Rcl2 Bestkeeper TIP ACT UBC TUB SAND PP2A TUA GAPDH Rcl2 RefFinder UBC TIP PP2A TUB ACT GAPDH SAND TUA Rcl2 单瓣黄刺玫
R. xanthina f. spontaneageNorm UBC PP2A SAND TIP GAPDH ACT Rcl2 TUB TUA Normfinder PP2A UBC TIP SAND GAPDH ACT Rcl2 TUB TUA Bestkeeper PP2A TIP UBC ACT GAPDH SAND Rcl2 TUB TUA RefFinder PP2A UBC TIP SAND GAPDH ACT Rcl2 TUB TUA 玫瑰
R. rugosageNorm UBC TIP GAPDH TUB TUA PP2A SAND Rcl2 ACT Normfinder UBC TIP PP2A GAPDH TUB SAND TUA Rcl2 ACT Bestkeeper UBC TIP TUA TUB GAPDH SAND ACT PP2A Rcl2 RefFinder UBC TIP GAPDH TUB TUA PP2A SAND ACT Rcl2 R12-26 geNorm PP2A TIP UBC SAND GAPDH TUB TUA ACT Rcl2 Normfinder TIP GAPDH UBC PP2A SAND TUB TUA ACT Rcl2 Bestkeeper UBC ACT GAPDH TIP PP2A SAND Rcl2 TUB TUA RefFinder UBC TIP PP2A GAPDH SAND ACT TUB TUA Rcl2 红叶蔷薇
R. glaucageNorm UBC TIP SAND PP2A TUA TUB GAPDH Rcl2 ACT Normfinder UBC TIP TUA SAND PP2A TUB GAPDH Rcl2 ACT Bestkeeper SAND TIP PP2A UBC ACT TUA TUB GAPDH Rcl2 RefFinder UBC TIP SAND PP2A TUA TUB GAPDH ACT Rcl2 ‘波塞妮娜’
R. hybrida ‘Porcelina’geNorm SAND TIP UBC GAPDH PP2A ACT TUB Rcl2 TUA Normfinder GAPDH TIP UBC SAND TUB PP2A ACT Rcl2 TUA Bestkeeper PP2A UBC SAND TIP GAPDH ACT TUB Rcl2 TUA RefFinder UBC TIP SAND GAPDH PP2A TUB ACT Rcl2 TUA 2.4 内源茉莉酸含量变化
6种蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的JA含量变化如图6所示。在侵染0 ~ 1 d间，仅荷花蔷薇的内源JA含量无明显波动，其他5种植物材料均发生明显下调。在侵染2 ~ 4 d间，6种植物材料的JA含量变化趋势相同，均发生明显下调。综上，在侵染0 ~ 4 d间，除荷花蔷薇外，其他植物材料的变化无明显差异。然而在侵染后期，JA含量的变化在高抗植物和易感植物间发生明显差异。在侵染6 ~ 8 d间，高抗植物中的JA含量处上调趋势，在易感植物中含量下调。
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图 6 内源茉莉酸在蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的含量Figure 6. Content of JA in Rosa species and cultivars responding to M. rosae2.5 茉莉酸信号通路相关基因的表达
以UBC为内参基因，分析了COI1、MYC2、OPR3及JAR1共4个茉莉酸相关基因在6种蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染过程中的表达水平（图7）。
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图 7 茉莉酸相关基因在蔷薇盘二孢侵染不同时间的相对表达量Figure 7. Relative expression level of JA-related genes at different time of M. rosae infectionOPR3的实时荧光定量实验结果显示：荷花蔷薇在整个侵染周期OPR3表达水平波动较大，分别在侵染0.5、2、6 d时表达水平显著上调，在侵染1、4 d时表达水平迅速下调。单瓣黄刺玫和玫瑰在响应侵染前期OPR3基因表达均下调，且在侵染1 ~ 2 d及4 ~ 8 d间基因表达上调。3种易感植物材料在响应侵染0 ~ 1 d间OPR3表达受抑制，在响应侵染4 ~ 8 d间发生了相反于高抗植物的下调表达。
JAR1的实时荧光定量实验结果显示：荷花蔷薇在接种病原菌后，JAR1基因表达水平下调，且整个侵染周期内持续低水平表达。其他5种材料在侵染0.5 d时JAR1基因均显著上调，且易感植物中上调程度明显高于高抗植物。单瓣黄刺玫在整个侵染周期内表达水平低于玫瑰及易感植物。玫瑰JAR1表达水平波动较大，分别在响应侵染0.5及4 d时达到表达量峰值。易感植物R12-26及‘波塞妮娜’在整个侵染周期内JAR1基因表达水平相似，在响应侵染0 ~ 4 d及6 ~ 10 d间JAR1基因表达水平上调。红叶蔷薇在整个侵染周期内JAR1基因表达水平呈上调趋势。
COI1的实时荧光定量实验结果显示：0 ~ 1 d/2 d间，高抗植物的COI1基因表达水平呈“上调—下降”表达趋势，且荷花蔷薇在侵染0.5 d时表达水平出现峰值；易感植物COI1基因表达水平中呈“下降—上调”趋势。R12-26、红叶蔷薇、‘波塞尼娜’ 3种易感植物分别在2、4、6 d时COI1的表达量达到峰值。在8 ~ 10 d间易感植物的COI1的上调表达程度明显高于高抗材料。
MYC2的实时荧光定量实验结果显示：在侵染0 ~ 1 d或2 d间，6种材料MYC2基因表达水平呈下调趋势，其中高抗植物在侵染4 d时表达水平出现峰值，易感植物在侵染6 d后表达水平出现峰值。之后在侵染6 d后，MYC2基因表达水平再次上调，但易感植物中MYC2基因上调表达程度明显高于高抗植物。
3. 讨 论
随着分子生物学研究的深入，近年来有关月季抗病性功能基因的研究逐渐增多。研究月季抗性基因是解析其抗性形成的重要手段，可为培育抗性优良的月季新品种提供依据。合适内参基因的选择是准确分析基因在不同实验条件下或不同组织中表达的重要前提[39]。我们对3个软件分析结果进行综合排序后发现，在响应蔷薇盘二孢侵染时，6种植物适宜的内参基因并不一致，但都包括UBC。UBC是近年来在拟南芥中发现的新型管家基因[24]，也是现代月季抗胁迫实验中常用的内参基因[40]。因而UBC可作为蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的适用内参基因。
寄主植物在识别病原菌入侵过程中，大量的信号分子会被诱导积累，包括在下游防御反应激活中起主要调控作用的植物激素SA和JA及其衍生物[5]。JA作为一种抗病物质，不仅扮演着信号分子的角色，同时也是诱导植物抗病性的关键物质[6]。大量研究表明：JA在植物抗病、抗虫防御以及逆境反应中具有重要的生理功能[41]，外施JA或JA衍生物可以提高一些植物如番茄（Solanum lycopersicum）[42]、小麦对灰霉病、白粉病的抗性[43]。刘瑞峰等[8]在月季‘粉和平’（R. hybrida ‘Pink peace’）接种蔷薇盘二孢后的早期差异响应中，发现了与JA相关的富集，并认为蔷薇盘二孢在侵染16 h左右可萌发出芽管刺入或已经刺入叶片[9]。本研究中，我们发现高抗材料荷花蔷薇的OPR3和JAR1基因表达水平不同于其他5种材料，这可能与荷花蔷薇的高抗性相关，但具体原因还需进一步探究。在另外5种材料的侵染早期，OPR3基因表达受到抑制，JAR1基因表达上调，JA合成受抑制，但JA衍生物合成被促进，推测这是内源JA含量早期明显下调的原因。此外，在黑斑病病菌刺入叶片之后，更为强烈的ETI反应（伴随SA、JA以及IAA等内源激素的响应）发生，SA等抗性相关物质的积累可能抑制了JA的积累。JAR1基因在早期上调表达，推测病原菌可能通过调控JAR1在侵染早期的高表达从而使感病材料中JA合成受抑制程度低于抗病材料，进而导致ETI反应减弱，使植物抗病性减弱。在侵染4和6 d时，抗黑斑病植物中JA合成相关基因上调表达，而在易感植物中出现下调表达，推测在该阶段蔷薇盘二孢的营养生殖在易感材料中达到顶峰，引起了更为强烈的植物免疫反应，使JA合成受到抑制，内源JA含量减少，因此该阶段间易感植物材料逐渐表现出黑斑病病症。在易感植物中，R12-26在侵染6 ~ 8 d间，OPR3及JAR1的基因表达受抑制程度低于红叶蔷薇和‘波塞妮娜’，且R12-26的黑斑病病症相较于红叶蔷薇及‘波塞妮娜’的较轻，说明R12-26在侵染后期发生的植物免疫反应弱于后二者。在侵染后期，6种植物均表现出JA及JA衍生物合成基因的上调表达，但黑斑病易感植物上调程度明显高于高抗种类，这一结果也证实了腐生型病原菌入侵引起的寄主植物的抗病性是由JA通路参与调控的。JAR1基因表达水平明显高于OPR3基因，进而导致侵染后期内源JA含量明显下调。
茉莉酸信号传导相关基因的表达动态在6种蔷薇属植物中具有明显差异，在抗黑斑病材料玫瑰和单瓣黄刺玫中，响应蔷薇盘二孢侵染0.5 d时，茉莉酸−异亮氨酸（JA-Ile）合成的增加调控了COI1基因的上调表达。然而，这一情况并未在易感材料中发生，推测COI1基因的上调并不完全依赖于JA-Ile的合成。前人研究认为：某些病原菌能够通过对COI1的调节来增强其毒性，并进一步抑制植物的防御系统[44-46]。在本研究中，6种植物在侵染0 ~ 1 d/2 d时COI1表达量变化相反，我们推测，蔷薇盘二孢可能通过COI1的早期上调表达来增加其毒性，抗黑斑病植物能够一定程度上抑制该基因的上调。有意思的是，易感材料R12-26在侵染0 ~ 1 d间也能够明显抑制COI1基因的上调表达，推测这种现象减弱了蔷薇盘二孢早期在R12-26中的毒性，所以在侵染后期R12-26的病症表现明显弱于红叶蔷薇和‘波塞妮娜’。MYC2被认为是SA和JA/ET抗病信号途径的负调控因子[47]，有研究表明：黑斑病菌可通过增强MYC2的表达来抑制JA/ET信号的防御系统，这一结果在该实验中也得到验证。前期MYC2基因的表达可能受到SA的抑制，从而该基因表达下调。在病原菌发生生活型转变，6种材料均相继发生了MYC2基因的上调表达。基于以上结果，我们认为与JA信号传导相关的MYC2、COI1在蔷薇属植物抵御蔷薇盘二孢入侵防御中发挥着负调控作用。
本研究中利用qRT-PCR对6种蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢子侵染的内参基因进行了筛选，确定了每种植物的最适用内参基因，并选出6种植物的共用内参基因UBC。利用UBC对6种植物与JA合成以及传导相关的4个基因的表达水平进行了分析，结果发现：JA的早期合成可能受其他抗病物质的抑制，高抗植物受抑制程度大于易感植物，内源JA含量在高抗植物（玫瑰和单瓣黄刺玫）中强烈下调；在后期，病原菌开始营腐生生长，抵御死体营养型病原菌侵染的JA通路开始发挥作用，相关基因上调表达。此外，我们还发现病原菌可能通过调控COI1和MYC2的上调表达来抑制植物抗病系统的响应，从而增强了植物对黑斑病菌的敏感性。
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图 1 6种蔷薇属植物离体叶片侵染蔷薇盘二孢的发病情况
红色圆圈表示病斑开始出现。黑色圆圈表示病斑蔓延至整个叶片。Red circle indicates the disease onset with the appearance brown necrotic lesions. Black circles indicate the spread of the brown necrotic lesions throughout the whole leaf.
Figure 1. Incidence of in vitro leaves infected by M. rosae of 6 Rosa species and cultivars
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图 2 9个候选内参基因响应蔷薇盘二孢侵染时的Ct值
Figure 2. Ct value of 9 candidate reference genes in response to M. rosae
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图 3 利用geNorm软件计算的候选内参基因的表达稳定性及配对变异值
M代表各候选内参基因的表达稳定度。下同。M represents the average expression stability of each candidate reference gene. The same below.
Figure 3. Average expression stability values and variation values of candidate reference genes calculated by geNorm
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图 4 Normfinder软件计算获得的候选内参基因的表达稳定性
Figure 4. Expression stability of candidate reference genes and by pairwise variation using Normfinder
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图 5 BestKeeper软件计算获得的候选内参基因的表达稳定性
SD代表各候选内参基因Ct值的标准偏差。SD represents the standard deviation of Ct value of each candidate reference gene.
Figure 5. Expression stability of candidate reference genes calculated by BestKeeper
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图 6 内源茉莉酸在蔷薇属植物响应蔷薇盘二孢侵染的含量
Figure 6. Content of JA in Rosa species and cultivars responding to M. rosae
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图 7 茉莉酸相关基因在蔷薇盘二孢侵染不同时间的相对表达量
Figure 7. Relative expression level of JA-related genes at different time of M. rosae infection
表 1 基因引物基本信息
Table 1 Basic information of gene primers
基因
Gene引物序列（5′—3′）
Primer sequence (5′-3′)退火温度
Annealing temperature (Tm)/℃扩增效率
Amplification efficiency (E)/%r ACT F: TCAAGGATTGGTGGACTTCAGT
R: ACCAGAGAACAAGAATGCAAGC55 96.0 0.970 GAPDH F: TATGACCAGATCAAGGCTGCT
R: ACCAATGAAGTCGGTTGACAC55 102.5 0.999 PP2A F: TGTCACTGCATCAAAGGACAG
R: GACGAATTGTCTTCTCCACCA55 102.0 0.982 Rcl2 F: ATGGGAAATGCCCTACCT
R: CACTTGTCCGACTGTTGC55 95.7 0.969 SAND F: BGTGTTGAGGAGTTGCCTCTTG
R: AACCTGTCGGGAGAATCTGTT55 98.5 0.989 TIP F: GAATCCACGGCTGGGAAA
R: CAGTTCGTGGGTGGAGGAGTT55 104.2 0.998 TUA F: CATTGAGCGTCCCACCTA
R: CACATCCACATTCAGAGCC55 103.2 0.987 TUB F: GTACATGGCCTGCTGTTTGAT
R: ATGGTACGCTTGGTCTTGATG55 96.1 0.972 UBC F: GCCAGAGATTGCCCATATGTA
R: TCACAGAGTCCTAGCAGCACA55 103.5 0.996 COI1 F: AATGAGGGGCTGTTGCTTCA
R: GATCCCCTGTACCCTTGCAC56 102.2 0.984 MYC2 F: CGGCAGCAGCGTCAAGAAT
R: GAGGTCGGAGTGGTGGGAAT57 101.0 0.957 OPR3 F: CATCAGCGAAGGCACTTTGG
R: GGCGTCGACTACCTTCTTCC55 103.6 0.951 JAR1 F: TTGGGTGCTACTTCTTTCTCAG
R: AATTGGAGGAAGGAGGGTG57 104.4 0.952 
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表 2 9个候选内参基因的表达稳定性排序
Table 2 Expression stability ranking of 9 candidate internal reference genes
种/品种
Species/cultivar方法 Method 1 2 3 4 5 6 7 8 9 荷花蔷薇
R. multiflora f. carneageNorm UBC TIP PP2A GAPDH TUB ACT SAND TUA Rcl2 Normfinder UBC TIP PP2A GAPDH TUB ACT TUA SAND Rcl2 Bestkeeper TIP ACT UBC TUB SAND PP2A TUA GAPDH Rcl2 RefFinder UBC TIP PP2A TUB ACT GAPDH SAND TUA Rcl2 单瓣黄刺玫
R. xanthina f. spontaneageNorm UBC PP2A SAND TIP GAPDH ACT Rcl2 TUB TUA Normfinder PP2A UBC TIP SAND GAPDH ACT Rcl2 TUB TUA Bestkeeper PP2A TIP UBC ACT GAPDH SAND Rcl2 TUB TUA RefFinder PP2A UBC TIP SAND GAPDH ACT Rcl2 TUB TUA 玫瑰
R. rugosageNorm UBC TIP GAPDH TUB TUA PP2A SAND Rcl2 ACT Normfinder UBC TIP PP2A GAPDH TUB SAND TUA Rcl2 ACT Bestkeeper UBC TIP TUA TUB GAPDH SAND ACT PP2A Rcl2 RefFinder UBC TIP GAPDH TUB TUA PP2A SAND ACT Rcl2 R12-26 geNorm PP2A TIP UBC SAND GAPDH TUB TUA ACT Rcl2 Normfinder TIP GAPDH UBC PP2A SAND TUB TUA ACT Rcl2 Bestkeeper UBC ACT GAPDH TIP PP2A SAND Rcl2 TUB TUA RefFinder UBC TIP PP2A GAPDH SAND ACT TUB TUA Rcl2 红叶蔷薇
R. glaucageNorm UBC TIP SAND PP2A TUA TUB GAPDH Rcl2 ACT Normfinder UBC TIP TUA SAND PP2A TUB GAPDH Rcl2 ACT Bestkeeper SAND TIP PP2A UBC ACT TUA TUB GAPDH Rcl2 RefFinder UBC TIP SAND PP2A TUA TUB GAPDH ACT Rcl2 ‘波塞妮娜’
R. hybrida ‘Porcelina’geNorm SAND TIP UBC GAPDH PP2A ACT TUB Rcl2 TUA Normfinder GAPDH TIP UBC SAND TUB PP2A ACT Rcl2 TUA Bestkeeper PP2A UBC SAND TIP GAPDH ACT TUB Rcl2 TUA RefFinder UBC TIP SAND GAPDH PP2A TUB ACT Rcl2 TUA
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