Effects of pesticides on soil microbial population and preliminary screening of resistant strains
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摘要:目的 筛选对乐果（有机磷类）、高效氯氰菊酯（菊酯类）和吡虫啉（新烟碱类）有抗药性的优势菌株，探究上述农药对土壤微生物种群生长的影响。方法 通过人为施药筛掉敏感菌，采用稀释涂布法和连续划线法分离纯化对农药有一定抗性的优势细菌进行表型特征和16SrDNA的鉴定。结果 从农药处理后的土壤中筛选到的优势细菌主要为芽孢杆菌属、金黄杆菌属、假单胞菌属和不动杆菌属4类：芽孢杆菌属中的C3菌株在高质量浓度4.000 g/L乐果和0.100 g/L的吡虫啉处理的土壤中不存在其菌落；不动杆菌属中的C5菌株在0.120 g/L和0.040 g/L的高效氯氰菊酯以及0.100 g/L吡虫啉处理组中均未发现该菌生长；假单胞菌属中的C6菌株在4.000 g/L的乐果及0.050 g/L和0.100 g/L的吡虫啉处理的土壤中无此菌株生长。不同质量浓度农药对土壤菌落均有不同程度的抑制。土壤中细菌和真菌菌落的抑制率与质量浓度之间呈正相关，且随时间推移，抑制率呈递减趋势，第14天仅有0.100 g/L吡虫啉处理组中的土壤细菌和真菌菌落数未恢复至正常水平；真菌中乐果和吡虫啉处理组间，第14天低质量浓度的土壤真菌菌落数显著（P < 0.05）高于高质量浓度的土壤菌落数。结论 土壤中存在对乐果、高效氯氰菊酯和吡虫啉农药有一定抗药性的优势细菌，为后续定向培育优良菌株提供理论基础；各农药的种类不同对土壤真菌和细菌菌落数量的抑制程度也有差异，其抑制程度为：吡虫啉 > 乐果 > 高效氯氰菊酯，且吡虫啉对土壤细菌数量抑制程度最高，对土壤真菌影响较小。Abstract:Objective The dominant strains with degradation ability to dimethoate (organic phosphorus), beta-cypermethrin (pyrethroids) and imidacloprid (neonicotinoid) were screened and the effects of the above pesticides on the growth of soil microbial populations were explored.Method The sensitive bacteria were screened out by artificial application, and the phenotypic characteristics and 16S rDNA of the dominant bacteria with certain resistance to pesticides were identified by dilution coating method and continuous streaking method.Result The dominant bacteria screened from the soil after pesticide treatment were mainly Bacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas and Acinetobacter; C3 strain in Bacillus did not have colonies in the soil treated with 4.000 g/L dimethoate and 0.100 g/L imidacloprid at high mass concentrations; strain C5 of Acinetobacter did not grow in 0.120 g/L, 0.040 g/L beta-cypermethrin and 0.100 g/L imidacloprid treatment groups; strain C6 of Pseudomonas did not grow in 4.000 g/L dimethoate and 0.050 g/L and 0.100 g/L imidacloprid-treated soils. Different concentrations of pesticides had different degrees of inhibition on soil colonies. The inhibition rate of bacterial and fungal colonies in soil was positively correlated with the concentration, and the inhibition rate showed a decreasing trend over time. On the 14th day, only 0.100 g/L imidacloprid treatment group did not recover to the normal level. In the treatment groups of dimethoate and imidacloprid in fungi, the number of fungal colonies in the low concentration soils on the 14th day was significantly higher than that in the high concentration soils (P < 0.05).Conclusion There are dominant bacteria with certain resistance to dimethoate, beta-cypermethrin and imidacloprid pesticides in soils, which provide theoretical basis for directional culture of excellent strains. The inhibitory effects of different pesticides on the number of soil fungi and bacterial colonies are also different, and the inhibitory effects are as follows: imidacloprid > dimethoate > beta-cypermethrin. Moreover, imidacloprid has the highest inhibitory effect on the number of soil bacteria, and has little effect on soil fungi.
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多倍化是一种普遍的自然现象，是植物进化和物种形成的重要推动力[1]。利用2n配子的有性多倍化是植物多倍化的主要途径之一。但自然界中天然2n配子发生频率一般较低，难以应用于植物多倍体育种实践。为了提高2n配子的发生频率，进而提高多倍体得率，育种学家们常常利用物理或化学方法进行2n配子人工诱导。
秋水仙碱作为一种重要的化学诱变剂，已成功应用于诱导林木大孢子、胚囊、合子以及体细胞染色体加倍、选育多倍体的育种实践，获得了数以百计的杨树（Populus spp.）[2-8]、刺槐（Robinia pseudoacacia）[9]、杜仲（Eucommia ulmoides）[10]、尾叶桉（Eucalyptus urophylla）[11]等林木三倍体与四倍体新种质。秋水仙碱也曾用于诱导杨树[12-13]、杜仲[14]以及桉树（Eucalyptus）[15]等树种的花粉染色体加倍研究，获得了20.0% ~ 88.0%的2n花粉。但是，秋水仙碱价格昂贵，且具有剧毒性，容易导致加倍处理操作人员中毒。
高温是一种有效的物理诱导方法，目前已成功应用于诱导杨树[16-19]、杜仲[20]、桉树[21]等树种的大孢子、胚囊以及合子染色体加倍、选育多倍体的育种实践，获得了大量的毛白杨（Populus tomentosa）[16-17]、‘折引3号’杨（P. pseudo-simonⅡ × P. nigra ‘Zheyin3#’）[18]、毛新杨（P. tomentosa × P. bolleana）[19]以及银腺杨（P. alba × P. glandulosa）[19]等杂种三倍体。高温也曾用于诱导毛新杨[22]、响叶杨（P. adenopoda） [23]、银白杨（P. alba）[24]及银灰杨（P. canescens）[25]的花粉染色体加倍研究，确定了高温诱导2n花粉的有效时期为终变期附近，且获得了60.0% ~ 80.0%的高频率2n花粉。但有研究表明：高温诱导获得的2n配子均为SDR型[26]，其遗传亲本的杂合性仅为FDR型2n配子的一半，严重限制了高温在多倍体育种中的应用。
赤霉素（gibberellins，GA3）是一类重要的内源植物激素，具有调控细胞分化、种子萌发、叶片扩展、毛状体发育、花粉成熟以及开花转换等方面的功能[27-30]。赤霉素还是一种非生物逆境应激信号分子，水稻（Oryza sativa）经历冷胁迫时，通过降低内源赤霉素水平以抑制根系生长，并阻滞花粉发育[31]。此外，赤霉素能够调节拟南芥（Arabidopsis thaliana）小孢子发生和花粉发育[32]，具有诱导拟南芥产生2n花粉的功能[33]。但赤霉素是否能够有效地诱导杨树产生2n花粉尚不清楚。
减数分裂是植物有性生殖过程中配子形成的必要阶段。在植物花粉母细胞减数分裂过程中，微管骨架参与纺锤体和成膜体的形成，以及核周和胞质微管网络的构建，从而决定同源染色体和姐妹染色单体分离以及细胞质的正常分裂[34-36]。有研究表明：植物天然2n花粉的产生与花粉母细胞减数分裂以及胞质分裂的异常密切相关[37]，而这些异常的现象均受细胞内微管网络系统的严格调控。研究赤霉素喷洒处理后新疆杨（Populus bolleana）花粉母细胞微管骨架的异常变化，可为赤霉素喷洒处理诱导新疆杨2n花粉的发生机制提供有力的细胞学依据。
新疆杨为杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus）白杨派乔木，是银白杨的变种，广泛种植于新疆、内蒙、北京、陕西、辽宁等省市。新疆杨是分布区内生态防护林建设和城市绿化的主要树种之一，在防风固沙和涵养水源方面具有重要作用。但有关新疆杨多倍体育种研究的报道甚少。本研究以新疆杨花粉母细胞为研究对象，在掌握新疆杨花粉母细胞减数分裂规律的基础上，研究赤霉素喷洒处理诱导新疆杨产生2n花粉的可行性及其对花粉母细胞微管骨架的影响，旨在为开发诱导效果好且价格低廉的新型化学诱变剂、构建高效的林木多倍体育种技术体系奠定重要的理论和实践基础。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
每年冬季落叶后，从内蒙古自治区包头市国家杨树良种基地采集新疆杨雄花枝，塑料布包裹后运输至北京林业大学温室待用。
1.2 研究方法
1.2.1 新疆杨花粉母细胞减数分裂进程观察
新疆杨雄花枝水培于10 ~ 20 ℃的温室，每隔2 ~ 3 h摘取2 ~ 3个花芽，去除鳞片后，将其放于5 mL的离心管内，利用新配的卡诺固定液进行固定。在4 ℃冰箱固定24 h后，摘取花药，利用醋酸洋红染色法观察花粉母细胞减数分裂进程。染色体制片具体操作参照鲁敏等[23]的方法。在Olympus BX-51光学显微镜下观察花粉母细胞减数分裂进程[38]，并运用Olympus DP70数码摄像系统进行照相。
1.2.2 新疆杨雄花芽的赤霉素喷洒处理
以育性良好的新疆杨雄花芽为材料，于花粉母细胞、第一次减数分裂和第二次减数分裂时期，使用浓度为50、100、200 μmol/L的赤霉素对花芽分别进行3、5、7次喷洒处理。当观察到大部分新疆杨花粉母细胞发育至第二次减数分裂时，使用水对花芽分别进行3、5、7次喷洒处理作为对照（表1）。处理后的雄花芽继续在温室中水培至花粉成熟，按照不同处理收集花粉，放置于1.5 mL的离心管中，添加适量的变色硅胶，密封保存于–20 ℃的冰箱。
表 1 新疆杨雄花芽的赤霉素喷洒处理Table 1. GA3 spraying treatment of flower buds in P. bolleana减数分裂时期
Meiotic stage赤霉素浓度
Concentration of
GA3/(μmol· L−1)喷洒次数
Spraying time花粉母细胞时期
Pollen mother cell (PMC) stage50 3 5 7 100 3 5 7 200 3 5 7 第一次减数分裂
Meiosis Ⅰ50 3 5 7 100 3 5 7 200 3 5 7 第二次减数分裂
Meiosis Ⅱ50 3 5 7 100 3 5 7 200 3 5 7 第二次减数分裂（对照）
Meiosis Ⅱ (control)0 3 5 7 1.2.3 新疆杨2n花粉发生频率的统计
用镊子分别夹取少量不同处理组合的花粉，均匀地洒在滴有醋酸洋红的载玻片上制作临时涂片，在Olympus BX-51光学显微镜下随机选取5个视野观察并进行拍照，进一步利用Image J软件测量花粉粒直径。以对照组花粉粒平均直径的1.28倍作为判别2n花粉的标准[39]，统计每个视野中总花粉粒数与2n花粉粒的数量，以2n花粉占花粉粒总数的百分比作为2n花粉发生频率，计算出不同处理组合的2n花粉发生频率。试验重复3次，每次重复测量200 ~ 300个花粉粒。
1.2.4 新疆杨成熟花粉精核和营养核的细胞学观察
用镊子夹取少量不同处理组合的花粉，均匀的洒在滴有蒸馏水的载玻片上水合2 h，用DAPI（4,6-diamidino-2-phenylindole）对细胞核进行染色，用Olympus BX-51荧光显微镜观察新疆杨单倍性与2n花粉粒精核与营养核的形态差异。
1.2.5 新疆杨花粉母细胞减数分裂微管骨架的免疫荧光标记
摘取赤霉素处理后的新疆杨雄花芽新鲜花药，迅速投入PEM缓冲液（50 mmol/L PIPES，5 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgSO4，pH 6.8）配制的4%多聚甲醛固定液中固定45 min后，参考Brown等[40]的方法，开展赤霉素处理对新疆杨花粉母细胞减数分裂微管骨架的影响研究，利用激光共聚焦扫描显微镜观察并照相。
1.2.6 数据处理方法
2n花粉诱导率等百分比数据经反正弦变换[41]后，利用SPSS18.0统计软件进行差异显著性分析和多重比较。
2. 结果与分析
2.1 新疆杨雄花芽减数分裂进程的观察
温室水培条件下，新疆杨花粉母细胞由减数分裂细线期发育至四分体时期历时约4 d（图1，表2）。其花粉母细胞的减数分裂是一个连续而非同步的过程（表2）。温室水培96 h后，花粉母细胞开始进入减数分裂，大部分花粉母细胞发育至细线期（65.5%）（图1A），此时期染色体呈细丝状，分布杂乱无章。水培至124 h，减数分裂发育至粗线期（40.0%）（图1B），染色体收缩变粗，形态较细线期明显。水培136 h后，大部分花粉母细胞进入双线期（47.5%）（图1C），染色体进一步缩聚，可明显观察到同源染色体非姊妹染色单体间的交叉。水培144 h后，大部分花粉母细胞进入终变期（46.0%）（图1D），此时染色体长度继续缩短，核仁缩小乃至消失，染色体缩聚呈点状，形态清晰可见。水培至152 h时，花粉母细胞发育至中期Ⅰ（27.0%）（图1E），联会的同源染色体整齐地排列在赤道板中央。水培160 h后，大部分花粉母细胞进入后期Ⅰ（22.5%）和末期Ⅰ（37.5%），联会的同源染色体开始分离，移向细胞的两极（图1F）。当染色体抵达细胞的两极后，开始解聚（图1G），随后核仁重新出现，形成2个子核，标志着第一次减数分裂结束。新疆杨花粉母细胞完成第一次减数分裂大约需要64 h。
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图 1 新疆杨花粉母细胞减数分裂进程A. 细线期；B. 粗线期；C. 双线期；D. 终变期；E. 中期Ⅰ；F. 后期Ⅰ；G. 末期Ⅰ；H. 前期Ⅱ；I. 中期Ⅱ；J. 后期Ⅱ；K ~ L. 末期Ⅱ；M. 末期Ⅱ多核仁现象；N. 四分体；O. 三分体。标尺 = 10 μm。A, leptotene; B, pachytene; C, diplotene; D, diakinesis; E, metaphase I; F, anaphase I; G, telophase I; H, prophase Ⅱ; I, metaphase Ⅱ; J, anaphase Ⅱ; K-L, telophase Ⅱ; M, multi-nucleoli phenomena at telophase Ⅱ; N, tetrad; O, triad. Bar = 10 μm.Figure 1. Meiotic process of PMC in P. bolleana表 2 新疆杨花粉母细胞的减数分裂进程Table 2. Meiotic process of PMC in P. bolleana% 减数分裂时期
Meiotic stage水培时间 hydroponics time/h 96 110 124 136 144 152 160 168 174 180 186 192 细线期 Leptotene 65.5 28.5 9.0 3.5 偶线期 Zygotene 25.5 51.5 36.5 14.5 5.0 粗线期 Pachytene 9.0 16.5 40.0 27.5 18.0 12.5 双线期 Diplotene 3.5 14.5 47.5 22.0 14.0 终变期 Diakinesis 7.0 46.0 20.5 中期Ⅰ Metaphase Ⅰ 9.0 27.0 8.5 6.0 后期Ⅰ Anaphase Ⅰ 10.0 22.5 8.5 末期Ⅰ Telophase Ⅰ 12.0 37.5 13.0 5.5 2.0 前期Ⅱ Prophase Ⅱ 4.0 21.0 34.0 28.0 11.0 5.5 0.5 中期Ⅱ Metaphase Ⅱ 10.5 30.5 37.0 25.5 6.5 2.0 后期Ⅱ Anaphase Ⅱ 8.0 21.0 39.0 10.5 2.5 末期Ⅱ Telophase Ⅱ 8.5 19.5 50.5 14.0 四分体 Tetrad 3.0 27.0 81.0 注：表中数据为所在时期花粉母细胞比例。 Note: data in the table are the proportion of PMCs in the period. 第一次减数分裂结束后，花粉母细胞未进行细胞质分裂，继续开始第二次分裂。当雄花枝水培至168 h时，花粉母细胞发育至前期Ⅱ（34.0%）（图1H），此时2个子核区的染色体重新缩聚，核仁逐渐消失。水培174 h后，大部分花粉母细胞进入中期Ⅱ（37.0%）（图1I），2组染色体整齐地排列在子细胞的赤道板上。水培180 h后，大部分花粉母细胞进入后期Ⅱ（39.0%）（图1J），姐妹染色单体开始分开，移向子细胞的两极。水培186 h后，花粉母细胞发育至末期Ⅱ（50.5%）（图1K），染色单体抵达子细胞的两极，染色体解螺旋，核仁重新出现（图1L），此时期部分花粉母细胞存在多核仁现象（图1M）。水培192 h后，绝大部分花粉母细胞进入四分体时期（81.0%）（图1N）。此时期还可以观察到少量的三分体存在（图1O）。第二次减数分裂经历的时间明显少于第一次减数分裂，仅需要32 h。
2.2 新疆杨2n花粉的赤霉素诱导
新疆杨雄花芽经不同浓度的赤霉素喷洒处理后，部分花芽因赤霉素的刺激而生长发育过快，导致干枯死亡或提早脱落（图2A），未收集到花粉。存活花芽继续水培于温室，直至花药成熟开裂，均可收集到一定量的花粉。花粉经2%的醋酸洋红染色后，在光学显微镜下进行花粉粒镜检，可观察大部分花粉粒被染成红色，且着色均匀，这说明该花粉粒具有较好的生活力。通过花粉粒形态比较可以发现：新疆杨对照组中存在少量的天然2n花粉（图2B），其发生频率为0.11% ~ 0.42%（表3）。
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图 2 赤霉素喷洒处理诱导新疆杨2n花粉及其对花芽发育的影响A. 赤霉素处理后干瘪的花芽；B. 天然2n花粉（箭头指向）；C.赤霉素诱导的2n花粉（箭头指向）；D. DAPI染色后的单倍性花粉；E. DAPI染色后的赤霉素诱导的2n花粉。A, the dry flower buds after GA3 treatment; B, natural 2n pollen (arrow); C, induced 2n pollen by GA3 treatment (arrow); D, haploid pollen after DAPI staining; E. induced 2n pollen by GA3 treatment after DAPI staining.Figure 2. 2n pollen induced by GA3 and its effects on the development of male flower buds in P. bolleana表 3 不同赤霉素喷洒处理组合的新疆杨2n花粉诱导率Table 3. Induction rates of 2n pollen with different combinations of GA3 spraying treatments in P. bolleana减数分裂时期 Meiotic stage 赤霉素浓度
Concentration of GA3/（μmol· L−1）喷洒次数
Spraying time2n花粉诱导率
Induction rate of 2n pollen/%花粉母细胞时期 PMC stage 50 3 0.40 ± 0.26 5 1.03 ± 0.92 7 5.01 ± 1.74 100 3 3.01 ± 0.36 5 4.69 ± 0.44 7 5.04 ± 2.16 200 3 3.22 ± 0.40 5 4.89 ± 0.53 7 5.00 ± 3.63 第一次减数分裂 Meiosis Ⅰ 50 3 2.15 ± 1.18 5 2.12 ± 0.21 7 5.98 ± 1.35 100 3 2.67 ± 1.76 5 2.55 ± 0.80 7 4.98 ± 3.78 200 3 5.53 ± 1.64 5 4.03 ± 1.29 7 4.72 ± 0.44 第二次减数分裂 Meiosis Ⅱ 50 3 4.72 ± 1.83 5 5.50 ± 1.89 7 8.83 ± 3.10 100 3 4.08 ± 1.25 5 3.09 ± 0.96 7 3.04 ± 2.75 200 3 4.25 ± 2.13 5 5.66 ± 1.29 7 5.22 ± 1.35 第二次减数分裂（对照） Meiosis Ⅱ （control） 0 3 0.11 ± 0.04 5 0.42 ± 0.27 7 0.26 ± 0.11 不同赤霉素处理组合中，均可观察到一定比例的2n花粉（图2C）。花粉粒经DAPI染色后，无论是单倍性花粉粒（图2D）还是2n花粉粒（图2E），均可观察到1个较大的营养核和2个高度凝缩的精核。但2n花粉粒的营养核和精核明显大于正常的单倍性花粉。这说明赤霉素喷洒处理诱导产生的大花粉的确是2n花粉。
从表3可以看出：不同处理组合的2n花粉诱导率存在明显的差异，其中以50 μmol/L的赤霉素于第二次减数分裂时期喷洒处理7次的效果最好，平均2n花粉诱导率达到（8.83 ± 3.10）%；以50 μmol/L的赤霉素于花粉母细胞时期喷洒处理3次的效果最差，平均2n花粉诱导率仅为（0.40 ± 0.26）%。不同处理组合2n花粉诱导率的方差分析结果表明（表4）：处理次数（F = 9.600，P < 0.001）对新疆杨2n花粉诱导率具有极显著影响；处理时期（F = 4.426，P = 0.017）对2n花粉诱导率具有显著影响；赤霉素浓度（F = 2.538，P = 0.088）对2n花粉诱导率的影响不显著。处理时期和处理次数的多重比较结果表明（表5）：第二次减数分裂时期的2n花粉诱导率显著高于花粉母细胞时期和第一次减数分裂时期；赤霉素喷施7次的2n花粉诱导率显著高于3次和5次。因此，当花粉母细胞发育至第二次减数分裂时，以50 μmol/L的赤霉素进行7次喷洒处理是诱导新疆杨花粉染色体加倍的最佳处理组合。
表 4 不同处理组合新疆杨2n花粉诱导率的方差分析Table 4. Variance analysis on induction rates of GA3-induced 2n pollen in P. bolleana under different treatment combinations变异来源 Source of variation df F P 减数分裂时期 Meiotic stage 2 4.426* 0.017 喷洒次数 Spraying time 2 9.600** 0.000 赤霉素浓度 Concentration of GA3 2 2.538 0.088 减数分裂时期 × 喷洒次数 Meiotic stage × spraying time 4 0.940 0.448 减数分裂时期 × 赤霉素浓度 Meiotic stage × concentration of GA3 4 5.103** 0.001 喷洒次数 × 赤霉素浓度 Spraying time × concentration of GA3 4 3.565* 0.012 减数分裂时期 × 喷洒次数 × 赤霉素浓度
Meiotic stage × spraying time × concentration of GA38 0.562 0.804 注：**代表差异极显著（P < 0.01），*代表差异显著（P < 0.05）。Notes: ** represents extremely significant differences (P < 0.01), * represents significant differences (P < 0.05). 表 5 不同减数分裂时期和不同喷洒次数新疆杨2n花粉诱导率的多重比较Table 5. Multiple comparisons in induction rates of 2n pollen under different meiotic stages anddifferent spraying times in P. bolleana减数分裂时期
Meiotic stage平均2n花粉诱导率
Average induction rate of 2n pollen/%喷洒次数
Spraying time平均2n花粉诱导率
Average induction rate of 2n pollen/%花粉母细胞时期 PMC stage 3.59 ± 2.18b 3 3.34 ± 1.85b 第一次减数分裂 Meiosis Ⅰ 3.86 ± 2.03b 5 3.73 ± 1.78b 第二次减数分裂 Meiosis Ⅱ 4.93 ± 2.33a 7 5.31 ± 2.54a 注：不同小写字母代表差异显著（P < 0.05）。 Note: different lowercase letters represent significant differences (P < 0.05). 2.3 赤霉素喷洒处理对新疆杨花粉母细胞减数分裂微管骨架的影响
在新疆杨花粉母细胞减数分裂过程中，其微管骨架的分布总体表现出规律性变化（图3A ~ L）。花粉母细胞进入减数分裂前期Ⅰ时，网状核周微管分布于细胞质中，包裹着细胞核（图3A ~ B）。花粉母细胞发育至终变期时，微管发生方向改变，原来分布于胞质中的微管减少，逐步转向细胞核内，包围着细胞核内的染色体（图3C）。当花粉母细胞进入中期Ⅰ时，从两极发出的细而长的极丝微管和与着丝粒相连的短而粗的着丝粒微管聚集形成狭窄的纺锤体维管束，连接着排列在赤道板上的染色体（图3D）。花粉母细胞发育至后期Ⅰ时，纺锤体微管牵引着同源染色体移向细胞两极（图3E）。同源染色体抵达细胞两极后，花粉母细胞进入末期I，此时微管又一次转向，分布至整个细胞质区域（图3F）。
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图 3 新疆杨花粉母细胞减数分裂过程中微管骨架的动态变化A. 细线期；B. 偶线期；C. 终变期；D. 中期Ⅰ；E. 后期Ⅰ；F. 末期Ⅰ；G. 前期Ⅱ；H. 中期Ⅱ；I. 后期Ⅱ；J. 末期Ⅱ；K. 四分体；L. 三分体；M. 赤霉素处理后的前期Ⅱ；N. 赤霉素处理后的中期Ⅱ；O. 赤霉素处理后的后期Ⅱ；P ~ S. 赤霉素处理后的末期Ⅱ；T. 赤霉素诱导的三分体。标尺 = 10 μm。 A, leptotene; B, zygotene; C, diakinesis; D, metaphase I; E, anaphase I; F, telophase I; G, prophase Ⅱ; H, metaphase Ⅱ; I, anaphase Ⅱ; J, telophase Ⅱ; K, tetrad; L, triad; M, prophase Ⅱ by GA3 treatment; N, metaphase Ⅱ by GA3 treatment; O, anaphase Ⅱ by GA3 treatment; P–S, telophase Ⅱ in treated PMCs by GA3 treatment; T, induced triad by GA3 treatment. Bar = 10 μm.Figure 3. Dynamic changes of microtubule cytoskeleton during meiosis of PMCs in P. bolleana第一次减数分裂结束后，花粉母细胞不进行细胞质分裂，立即进入第二次减数分裂。花粉母细胞发育至前期Ⅱ时，核周微管移向2个子细胞核内，与染色体相连（图3G）。随着微管的进一步聚合，2个子细胞核内分别出现纺锤体微管，连接着排列在赤道板上的染色体，此时花粉母细胞已发育至中期Ⅱ（图3H）。当花粉母细胞发育至后期Ⅱ时，子细胞内的纺锤体微管牵引着姐妹染色体单体移向两极（图3I），当姐妹染色体抵达子细胞的两极后，辐射状微管在核膜处扩散，延伸至整个细胞质，联系着4个子核，标志着第二次减数分裂结束（图3J）。在辐射状微管的驱动下，自细胞周沿发生向心胞质分裂，形成四分体（图3K），偶尔还可观察到三分体（图3L）。
与对照组相比，在第二次减数分裂时期赤霉素喷洒处理7次的处理组中，其微管骨架除末期Ⅱ呈现异常外（图3P ~ S），其他减数分裂时期的微管变化规律与对照组相似（图3M ~ O）。在新疆杨花粉母细胞第二次减数分裂时期赤霉素喷洒处理7次后，末期Ⅱ相邻子核之间的辐射状微管发生部分缺失（图3P ~ S），与对照组末期Ⅱ的微管骨架明显不同。末期Ⅱ辐射状微管的部分缺失可导致2个相邻子核间胞质分裂失败，从而产生核复原现象，形成三分体（图3T），进而发育成1个单倍性配子和1个2n配子。
3. 讨 论
新疆杨花粉母细胞减数分裂具有连续而不同步性，这可能是植物性母细胞减数分裂过程中的一种普遍现象。研究人员曾在银灰杨[25]、毛白杨[42]、通辽杨（Populus simonⅡ × P. nigra ‘Tongliao’）[43]、响叶杨[44]、美洲黑杨（Populus deltoides）[45]以及胡杨（Populus euphratica）等[46]物种的花粉母细胞减数分裂的研究中均发现不同步性。同一花枝不同部位花芽，其花粉母细胞减数分裂进程不同；同一花芽的不同小花内花粉母细胞减数分裂时期亦不相同；甚至同一小花内的不同花粉母细胞，其减数分裂进程也不相同。在恶劣环境条件下，这种复杂的花芽发育不同步性可以延长花期，有利于增强两性功能的有效作用时间，对其种群繁殖后代有利[47]。
利用化学诱变剂人工诱导植物花粉染色体加倍获得2n花粉时，诱变剂浓度、处理方式和处理时期是影响2n花粉得率的关键影响因素。李赟等[48]利用0.5%的秋水仙碱于细线末期至粗线期时对银白杨花粉母细胞进行7次注射处理，获得了高达82.33%的2n花粉。Zhou等[49]利用0.5%的秋水仙碱于粗线期时对银灰杨花粉母细胞进行11次注射处理，获得了30.3 %的2n花粉。本研究利用50、100、200 μmol/L赤霉素于花粉母细胞、第一次减数分裂以及第二次减数分裂时期对新疆杨雄花芽进行喷洒处理，不同处理组合均可获得一定比例的2n花粉，说明利用赤霉素处理诱导杨树2n花粉是可行的。其中，以50 μmol/L赤霉素于第二次减数分裂时期喷洒处理7次的最佳处理组合仅获得8.83%的2n花粉，原因主要包括2个方面：一是当花粉母细胞发育至第二次减数分裂前后，花芽一直被芽鳞包被，喷洒的赤霉素未能直接与花药接触而被蒸发，降低了赤霉素的处理效果；另一方面则是新疆杨同一花芽不同花药内花粉母细胞减数进程同步性差，影响了赤霉素的处理效果。
微管骨架在细胞分裂过程中发挥着重要作用。植物减数分裂的正常进行与微管骨架的有序分布和动态变化密切相关[47]。王君[18]对通辽杨的减数分裂免疫荧光分析研究发现：减数分裂末期Ⅱ细胞成膜体缺失导致胞质分裂失败，细胞内子核未能正常分离而共存于同1个小孢子内，形成二分体和三分体，进一步发育形成2n花粉。鲁敏[23]在响叶杨天然2n花粉发生机制的研究中发现：减数分裂后期Ⅱ纺锤体微管缺失导致姐妹染色单体不分离，末期Ⅱ成膜体微管缺失导致胞质分裂异常，二者是天然2n花粉产生的细胞学机制。张平冬等[50]在胡杨减数分裂过程中观察到平行纺锤体、三极纺锤体和融合纺锤体，这些异常的纺锤体与胡杨天然2n花粉发生密切相关。Liu等[33]对拟南芥施加赤霉素处理后研究发现：减数分裂末期Ⅱ相邻子核间的微管缺失，导致子核聚集在同1个小孢子中，发育形成2n花粉。本研究通过免疫荧光技术探索了赤霉素处理对新疆杨花粉母细胞微管骨架构建及分布的影响，发现赤霉素处理可导致减数分裂末期Ⅱ辐射状微管产生部分缺失，致使相邻子核间胞质分裂失败，从而产生核复原现象，形成三分体，进而发育成1个单倍性配子和1个2n配子。
针对杨树花药被芽鳞包被而导致赤霉素喷洒处理效果不理想的问题，下一阶段的工作应聚焦于赤霉素处理方式、药剂浓度以及处理时间等技术条件优化研究，旨在提高赤霉素诱导2n花粉的效率。
4. 结 论
在温室水培条件下，新疆杨花粉母细胞完成减数分裂历时约4 d，且存在明显的不同步性。利用浓度为50、100、200 μmol/L赤霉素于花粉母细胞、第一次减数分裂以及第二次减数分裂时期分别对新疆杨雄花芽进行喷洒处理，不同处理组合均可获得一定比例的2n花粉，说明利用赤霉素处理诱导新疆杨获得2n花粉是可行的。其中以50 μmol/L赤霉素于第二次减数分裂时期喷施处理7次为最佳处理组合，可以获得8.83%的2n花粉。在最佳处理组合条件下，新疆杨雄花芽经赤霉素喷洒处理可导致减数分裂末期Ⅱ辐射状微管产生部分缺失，致使相邻子核间胞质分裂失败，从而产生核复原现象，形成三分体，进而产生2n花粉。
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图 1 C1~C8菌株的表型特征
A~H. 菌株C1~C8的菌落形态；a~h. 菌株C1~C8的超微形态。A−H, colony morphology of strain C1−C8；a−h, ultramorphology of strain C1−C8.
Figure 1. Phenotypic characteristics of C1−C8 strains
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图 2 不同质量浓度农药对土壤真菌菌落数量的影响
不同小写字母表示不同处理组间差异显著（P<0.05）。Different lowercase letters represent significant differences between different treatment groups (P<0.05).
Figure 2. Effects of pesticides on the number of soil fungal colonies
表 1 部分微生物及其降解的部分农药种类
Table 1 Some microorganisms and some pesticide types degraded by them
微生物
Microorganism降解菌株
Degraded strain农药名称
Name of pesticide细菌
Bacteria假单胞菌属 Pseudomonas 甲胺磷 Methamidophos、2,4-D、DDT、敌敌畏 DDVP、二嗪农 Diazinon、地乐酚 Dinoseb、二硝甲酚 DNC、狄氏剂 Dieldrin、乐果 Dimethoate、敌稗 Propanil、林丹 Lindane、阿特拉津 Atrazine、1605、西玛津 Simazine、毒死蜱 Chlorpyrifos[10]、草甘膦 Glyphosate[11]、吡虫啉 Imidacloprid[12]、高效氯氰菊酯 Beta-cypermethrin[13] 芽孢杆菌属
Bacillus敌敌畏 DDVP、甲胺磷 Methamidophos、乐果 Dimethoate、甲基1605 Parathion-methyl、杀螟松 Sumithion、狄氏剂 Dieldrin、茅草枯2,2-dichloropropionic acid、DDT、毒莠定 Picloram、灭草隆 Monuron、吡虫啉 Imidacloprid[14]、高效氯氰菊酯Beta-cypermethrin[15] 不动杆菌属 Acinetobacter 乐果Dimethoate、PCB、敌敌畏DDVP、甲胺磷Methamidophos、1605、高效氯氰菊酯Beta-cypermethrin[16]、吡虫啉Imidacloprid[17] 金黄杆菌属 Chryseobacterium 草甘膦Glyphosate[18]、有机氯农药OCPs[19]、氟虫双酰胺Flubendiamide[20]、克百威Carbofuran[21]、多菌灵Carbendazim[22] 节杆菌属 Arthrobacter 茅草枯2,2-dichloropropionic acid、2,4-D、二嗪农Diazinon、毒莠定Picloram、西玛津Simazine、草藻灭Endothall、二甲四氯2-Methyl-4-chlorophenoxyacetic acid 土壤杆菌属
AgrobacterDDT、氯苯胺灵Chloropropham、茅草枯2,2-dichloropropionic acid、毒莠定Picloram 无色杆菌属
AchromobacterDDT、2,4-D、氯苯胺灵Chloropropham、2,4,5-T、PCB 黄杆菌属
Flavobacterium茅草枯2,2-dichloropropionic acid、毒莠定Picloram、三氯乙酸Trichloroacetic acid、氯苯胺灵Chloropropham、甲胺磷Methamidophos、2,4-D、灭草隆Monuron、1605 放线菌
Actinomycetes小单胞菌属
Micromonospora七氯Heptachlor、三氯乙酸Trichloroacetic acid 诺卡氏菌属
NocardiaDDT、2,4-D、七氯Heptachlor、茅草枯2,2-dichloropropionic acid、三氯乙酸Trichloroacetic acid、五氯硝基苯Pentachloronitrobenzene 链霉菌属
Streptomyces2,4,5-T、2,4-D、西玛津Simazine、DDT、茅草枯2,2-dichloropropionic acid、五氯硝基苯Pentachloronitrobenzene、二嗪农Diazinon 真菌
Fungi青霉
Penicillium七氯Heptachlor、五氯硝基苯Pentachloronitrobenzene、茅草枯2,2-Dichloropropionic acid、西玛津Simazine、毒莠定Picloram、灭草隆Monuron、除草醚Nitrofen、阿特拉津Atrazine、扑草津Prometryne、狄氏剂Dieldrin、敌稗Propanil、敌百虫Dipterex 曲霉
Aspergillus七氯Heptachlor、五氯硝基苯Pentachloronitrobenzene、2,4-D、敌百虫Dipterex、除草醚Nitrofen、扑草津Prometryne、敌蜱Propanil、毒莠定Picloram、西玛津Simazine、灭草隆Monuron 根霉属
Rhizopus七氯Heptachlor、地可松Fenaminosulf、阿特拉津Atrazine 毛霉属
Mucor五氯硝基苯Pentachloronitrobenzene、DDT 镰刀菌属
Fusarium阿特拉津Atrazine、DDT、艾氏剂Aldrin metabolized to dieldrin、西玛津Simazine、敌百虫Dipterex、七氯Heptachlor、五氯硝基苯Pentachloronitrobenzene 注：未标注文献的农药均来自文献 [23]。Note: pesticides not annotated are all from reference [23]. 
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表 2 施用农药质量浓度
Table 2 Mass concentration of pesticides applied
g/L 农药种类
Pesticide type低于推荐质量浓度
Lower than recommended
mass concentration推荐质量浓度
Recommended mass
concentration高于推荐质量浓度
Higher than recommended
mass concentration乐果 Dimethoate 1.333 2.000 4.000 吡虫啉 Imidacloprid 0.017 0.050 0.100 高效氯氰菊酯 Beta-cypermethrin 0.024 0.040 0.120
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表 3 部分细菌基本特征
Table 3 Basic characteristics of some bacteria
菌株
Strain表型特征 Phenotypic characteristics 16SrDNA测序
16SrDNA sequencing菌落颜色
Colony color菌落特征
Colony characteristics革兰氏染色
Gram stain菌株形状
Strain shape芽孢
EndosporeBlast比对
Blast aligningC1 白色 White 不透明 Non-transparent 阳性 Positive 长杆状 Long rod-shaped 有 Exist 芽孢杆菌属 Bacillus C2 深黄色 Deep yellow 不透明 Non-transparent 阴性 Negative 长杆状 Long rod-shaped 无 Without 金黄杆菌属 Chryseobacterium C3 白色 White 半透明 Semi-transparent 阳性 Positive 长杆状 Long rod-shaped 有 Exist 芽孢杆菌属 Bacillus C4 白色 White 半透明 Semi-transparent 阴性 Negative 短杆状 Short rod-shaped 无 Without 假单胞菌属 Pseudomonas C5 无色 Colourless 透明 Transparent 阴性 Negative 球杆状 Ball and rod-shaped 无 Without 不动杆菌属 Acinetobacter C6 白色 White 半透明 Semi-transparent 阴性 Negative 短杆状 Short rod-shaped 无 Without 假单胞菌属 Pseudomonas C7 无色 Colourless 透明 Transparent 阴性 Negative 球杆状 Ball and rod-shaped 无 Without 不动杆菌属 Acinetobacter C8 淡黄色 Faint yellow 不透明 Non-transparent 阳性 Positive 长杆状 Long rod-shaped 有 Exist 芽孢杆菌属 Bacillus
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表 4 各处理组土壤内部分优势菌株的存在情况
Table 4 Presence of some dominant strains in the soil of each treatment group
菌株
StrainCK 乐果 Dimethoate/(g·L−1) 高效氯氰菊酯 Beta-cypermethrin/(g·L−1) 吡虫啉 Imidacloprid/(g·L−1) 4.000 2.000 1.333 0.120 0.040 0.024 0.100 0.050 0.017 C1 * * * * * * * * * * C2 * * * * * * * * * * C3 * * * * * * * * C4 * * * * * * * * * * C5 * * * * * * * C6 * * * * * * * C7 * * * * * * * * * * C8 * * * * * * * 注：*表示该菌株存在。Note: * indicates the presence of strain.
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表 5 不同质量浓度农药对土壤细菌生长的影响（抑制率）
Table 5 Effects of different mass concentrations of pesticides on soil microbial growth (inhibition rate)
% 天数
Day number乐果
Dimethoate/(g·L−1)高效氯氰菊酯
Beta-cypermethrin/(g·L−1)吡虫啉
Imidacloprid/(g·L−1)4.000 2.000 1.333 0.120 0.040 0.024 0.100 0.050 0.017 1 68.60 34.45 19.21 74.09 61.28 51.83 86.89 71.95 44.51 7 37.62 20.48 3.33 37.14 27.62 15.71 60.95 45.24 18.1 14 6.33 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 25.95 3.80 0.00 注：菌落数大于对照组，则抑制率为0。Notes: the colony number is greater than the control group, and the inhibition rate is 0.
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