Molecular characteristics of CML genes in Chinese jujube and their expression patterns in resistance to cold stress
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摘要:目的 探究枣类钙调蛋白（ZjCML）在抗寒性中的重要作用，旨在挖掘关键抗寒ZjCML基因，为进一步利用其进行枣抗寒育种提供理论参考。方法 本研究利用生物信息学技术，全面分析了枣CML基因家族成员的数目及相关结构特征，并利用RNA-seq和实时荧光定量PCR技术分析其响应低温胁迫时的表达模式，为筛选关键抗寒基因奠定基础。结果 在枣基因组数据中共鉴定到23个ZjCML基因，不均匀地分布在12条染色体上。与拟南芥CMLs蛋白构建进化树分析发现ZjCMLs可被分为12个类群。蛋白网络互作预测发现16个ZjCMLs存在于该网络中，且具有一定的互作关系。RNA-seq结果表明ZjCML13和ZjCML6基因表达模式在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫中具有显著差异，其中ZjCML13在‘冬枣’响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达，而在‘冬枣’同源四倍体中表达差异不显著。外源CaCl2和褪黑素处理后，ZjCML13在‘冬枣’同源四倍体响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达，说明其可能通过诱导ZjCML13表达调控‘冬枣’同源四倍体抗寒性。结论 枣CML基因家族具有特定的结构特征及响应低温胁迫，ZjCML13可能在调控‘冬枣’及其同源四倍体抗寒性差异中发挥重要作用。
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关键词:
- 枣 /
- 类钙调蛋白（CML） /
- 基因家族 /
- 抗寒性 /
- 表达分析
Abstract:Objective This paper aims to investigate the important founction of CaM-like proteins in Chinese jujube in resistance to cold stress and identify the key ZjCML, which could provide theoretical basis for cold breeding in Chinese jujube by using them.Method Through using bioinformatics technology, the number and related structural information of CML in Chinese jujube were analyzed comprehensively in the current study. And then, we used RNA-seq and real-time fluorescence quantitative PCR technology to analyze its expression pattern in response to low temperature stress, laying a foundation for screening key cold resistance genes.Result A total of 23 ZjCML genes were identified in Chinese jujube genome. All of them distributed unevenly on 12 chromosomes. In addition, ZjCML can be divided into 12 subgroups, and protein interaction network prediction showed that 16 ZjCML existed in the network and they had mutual interaction relationships. Moreover, RNA-seq analysis showed that the expression patterns of ZjCML13 and ZjCML6 in response to cold stress between ‘Dongzao’ and its autotetraploids were significantly different. The expression level of ZjCML13 in response to cold stress in ‘Dongzao’ was significantly higher than that in its autotetraploid at 6 and 24 h. External CaCl2 and melatonin treatments could significantly induce the expression of ZjCML13 in autotetraploids ‘Dongzao’ under cold stress at 6 and 24 h, indicating that it may regulate cold resistance of autotetraploid ‘Dongzao’ by inducing the expression of ZjCML13.Conclusion The ZjCML gene family have specific characteristics and expression patterns, ZjCML13 might play important role in regulation of cold difference between ‘Dongzao’ and its autotetraploids.-
Keywords:
- Chinese jujube /
- CaM-like protein (CML) /
- gene family /
- cold resistance /
- expression analysis
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钙离子（Ca2+）作为第二信使，在植物生长发育和响应逆境胁迫信号转导中发挥重要的作用。逆境胁迫下，向细胞质中快速流入的Ca2+信号首先被Ca2+感受器或钙受体蛋白感知[1-2]。钙调素（calmodulin，CaM）和类钙调蛋白（CaM-like protein，CML）是主要的钙受体蛋白之一，在Ca2+信号转导过程中具有重要功能。CML与CaM氨基酸的相似性不少于16%[3]，当CML等钙受体蛋白结合Ca2+后，蛋白的空间构象发生变化，然后与下游受体蛋白结合，启动Ca2+依赖的级联信号放大反应，广泛参与生物胁迫和非生物胁迫等生物学过程[4-6]。
CML在植物中普遍存在，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[7]、水稻（Oryza sativa）[8]、番茄（Solanum lycopersicum） [9]、大豆（Glycine max）[10]、大白菜（Brassica rapa ssp. pekinensis）[11]、小兰屿蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris）和铁皮石斛（Dendrobium officinale）[12]、甜瓜（Cucumis melon）[13]等基因组中分别鉴定到50、32、52、68、79、60和54个CML家族基因，该家族均含有保守的EF-hand结构域，在植物应答逆境胁迫中发挥重要功能。在拟南芥中，通过SDS-PAG迁移率变动分析法证明AtCML20可与Ca2+结合，过表达AtCML20可显著降低其抗旱性，说明AtCML20受到Ca2+激活负调控拟南芥抗干旱胁迫能力[14]。拟南芥中敲除AtCML9可以增强其对盐、干旱胁迫的耐受性，并且促进根系的生长与发育[15]，而CML24参与编码一种潜在的Ca2＋传感器，响应ABA、日照及盐胁迫[16]。在水稻中研究发现，OsCML16在低温、干旱和盐胁迫下显著高表达，并与OsERD2互作[17]。在茶树（Camellia sinensis）中研究发现，CsCML16、CsCML18-2和CsCML42在盐胁迫下显著上调表达[18]。葡萄（Vitis vinifera）中研究发现：VaCML21v2在拟南芥中过表达可增强低温胁迫相关基因DREB1A和DREB2A的表达，从而提高其抗寒性[19]。而枣（Ziziphus jujuba）中CML基因家族成员的特征和功能尚不清楚。
枣为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物[20]，是我国重要的经济果树之一，在我国栽培范围较广。我国北方冬季低温异常频发，经常对枣树带来不同程度的低温伤害，严重可导致整株枣树死亡。目前，枣树抗寒性方面的研究主要集中在对不同枣树品种抗寒性比较和相关生理生化指标的测定等方面，对枣树抗寒性的分子机制研究较少[21]。本研究将利用各种生物信息学手段，全面挖掘枣CML基因家族成员，具体分析枣CML基因家族成员的基因结构、进化树、染色体定位、保守结构域等信息；并探讨部分CML家族基因在‘冬枣’（Ziziphus jujuba ‘Dongzao’）及其同源四倍体中响应低温胁迫，以及在Ca2+和褪黑素处理下的表达特性，旨在挖掘关键抗寒CML基因，为进一步进行枣CML家族基因功能验证提供数据基础和参考。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
试验材料为‘冬枣’及其由秋水仙素田间诱导的同源四倍体，生长于河北省赞皇县皇农有限责任公司试验基地，年平均气温为13.3 ℃，年降水量568 mm，管理水平一致。供试材料的接穗于2006年分别嫁接到生长状态一致的砧木上，在田间稳定生长且已进入稳定的结果期。本研究于2021年5月19日在该试验基地进行样品采集，每棵树采集至少3个枣头，每个品种至少采集3棵树，放于冰盒中立即带回实验室用于本次研究[22]。将采回来‘冬枣’同源四倍体枣头每3个一组，共3组，分别进行100 μmol/L氯化钙和100 μmol/L褪黑素处理后，低温（4 ℃）处理0、6和24 h，后采集叶片，并进行液氮速冻，保存于−80 ℃，用于后续RNA提取和枣CML家族基因表达分析。以同时期未处理的叶片（0 h）作为对照，生物学重复为3次。
1.2 试验方法
1.2.1 枣CML基因家族的鉴定和理化性质分析
为筛选获得枣CML家族基因序列，在TAIR基因组序列数据库（https://www.arabidopsis.org/）下载拟南芥已公布的50条CML已知基因，通过在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行blastp比对搜索，初步得到枣CML基因家族的候选蛋白编码序列。然后，将蛋白序列提交Pfam、cd-search、InterProscan等鉴定上述候选蛋白序列，剔除不含EF-hand结构域的CML基因，将含有EF-hand结构域的基因认定为枣CML基因家族成员。进而利用在线分析软件ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）对鉴别出的全部枣CML基因家族成员进行等电点、氨基酸数量和相对分子量等理化属性分析[23]。
1.2.2 枣CML家族成员染色体定位、基因结构和亚细胞定位预测峰分析
运用MG2C在线软件（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）绘制染色体定位图，运用GSDS在线软件（http://gsds.gao-lab.org/）进行基因结构分析，采用Cell-Ploc2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-Ploc-2/）在线预测蛋白的亚细胞定位，最后使用Tbtools本地工具对基因结构进行分析并绘图[24]。
1.2.3 枣CML家族保守基序分析
利用MEME在线工具[25]预测分析枣CML家族基因的保守基序，参数设置为：保守基序最小宽度设置为6，最大为50，保守基序数目为5，其他参数按默认值设置。
1.2.4 枣CML家族系统发育分析
使用MEGA-X中的ClustaW程序将拟南芥、枣的CML蛋白序列进行多序列比对，其中Max Iterations参数设置为100，其他参数按照默认设置。采用邻接法（neighbor-joining，NJ），bootstrap值设置为1000，构建进化树。
1.2.5 枣CML家族成员蛋白互作预测分析
利用STRING 数据库（https://string-db.org/）对所获得的23个枣CML家族成员氨基酸序列进行互作共表达预测分析，以拟南芥的相关同源序列作为参考。
1.2.6 枣CML家族成员在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫RNA-seq表达分析
利用本课题组在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫时的转录组数据[26]分析ZjCMLs家族成员的表达模式，利用Tbtools软件以log2（FPKM）构建热图，以显示不同基因的表达谱。
1.2.7 枣CML家族基因表达特性分析
首先，利用RNA Easy Fast植物组织RNA快速提取试剂盒对‘冬枣’及其同源四倍体材料进行总RNA提取，参照反转录试剂盒说明书进行，反应条件为：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，4 ℃ 保存。产物−20 ℃保存。
以枣Actin基因作为内参基因，通过NCBI根据各基因序列设计特异性引物（表1），进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析，反应条件为：95 ℃ 15 min，40个循环的95℃ 5 s、50~60℃ 30 s、72℃ 20 s ，4 ℃保存。反应体系为：2 × SuperReal PreMix Plus 10 μL，ddH2O 8.2 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，最后采用2−ΔΔCt法进行基因相对表达量计算[27]。
表 1 实时荧光定量PCR引物表Table 1. Primers used in qRT-PCR基因名称
Gene name引物序列（5′—3′）
Primer sequence （5′−3′）ZjCML1 F: AGCACATGAAGCCCGAACC
R: CGGACCCAACATCCACCTCZjCML2 F: GGGGTGTAGTAGGAAAGGCT
R: TTCCTTGAGATGACCTCCGCZjCML3 F: TAGCCTTGGGACTATCCGCT
R: CGCCAGTGACCAAGACAACTZjCML4 F: TGCTGAAGAGGAGCTTCGAG
R: CCATCACCATCCAAATCAGCTTZjCML5 F: CGAAGGTTCGGTCCGTGAAA
R: TTGCTTTCTGGGCTGCAAAAZjCML6 F: AACGGCAAGTCTGTAGACGA
R: CAATGTGTCCGTCGCCATTCZjCML7 F: CGTGACCGCATTTTCAAGCG
R: GGCCATCATACGACTCACCTZjCML8 F: TTGCAGGTTCAATGGCGAAG
R: GCTGACTTTGCCATCACAGAZjCML9 F: TCTGTGGGAAAACCATGCCT
R: ATGAAACCGTCGCCGTTGATZjCML10 F: AGGAGGACATGAGAGAGGCTT
R: GTTGACCATCCCATCACCGTZjCML11 F: AGCTGAAAGAGGCATTCCGA
R: GGTTAGCTTCTCACCGAGGTTZjCML12 F: ACAAGGATGGAAGTGGTGCAA
R: TCTCACCAAGATCCTTTGCCAZjCML13 F: ACCAAGAATCAACAGCGGCA
R: TACTCACCGACCGATCCGAAZjCML14 F: GATTCAGACGGCTTCATT
R: TCTATTGTCCCATTTCCAZjCML15 F: ATCCCAAGACAGGCAAAGCTC
R: GATGCCCTTGTATTCGTGCTGZjCML16 F: ATGGAGACGGGAAGATATCGC
R: CCAAACCAAGCAACCCATCTCZjCML17 F: GCCAGCGAAAACGACAACAA
R: CGGTGGCATGTTGACCTAGAZjCML18 F: TCATGGAGGTTTTCCGGTCG
R: CGACAGCTCACGGTATGTCAZjCML19 F: CTCCATACACAGAGGACCAGC
R: GCCTCCTTGATCATCCCTGTCZjCML20 F: TCGACAAGAACAGAGACGGC
R: GTCCCTCATTTCCGGGTCTTZjCML21 F: CGCCATGATGTTGAGCGAAG
R: GCCGTGATTTTCCCATCGTGZjCML22 F: AGAGGTTTGACCGTGACAGG
R: ACTTGGACACCAGCAAATCCAZjCML23 F: TCGGGACCATAACGGACTCA
R: ACAGATCGGATCATGCGTCGZjActin F: AGCCTTCCTGCCAACGAGT
R: TTGCTTCTCACCCTTGATGC2. 结果与分析
2.1 枣CML基因家族鉴定及理化特性分析
利用生物信息学手段，最终以含EF-hand且不含其他结构域的蛋白作为枣类钙调素蛋白，最终筛选得到23个ZjCML基因成员。所有ZjCMLs基因依照其在染色体上的分布和排列顺序（从上到下）命名为ZjCML1 ~ ZjCML23（表2）。经分析可知：ZjCMLs基因编码区序列（CDS）全长为255 ~ 807 bp，蛋白序列全长为84 ~ 268 aa，分子量为9.34 ~ 29.25 kDa，蛋白等电点位于4.07 ~ 6.62之间。ZjCML基因家族成员EF-hand结构域个数为1 ~ 5，结构域个数为4的ZjCML蛋白最多。另外，亚细胞定位预测分析发现：ZjCML家族蛋白主要分布在细胞膜、细胞质、液泡和细胞核中，其中定位在细胞膜的最多。
表 2 枣CML基因家族基本信息Table 2. Basic information of CML gene family in Chinese jujube基因名称
Gene name基因登录号
Gene ID染色体
定位
Chromosome
location基因组
全长
Genomic total
length/bpCDS长度
CDS
length/bpEF-hand
数目
Number of
EF-hand氨基酸数量
Number
of amino
acid/aa分子量
Molecular
mass/
kDa等电点
Isoelectric
point亚细胞定位
Subcellular locationZjCML1 LOC107420771 1 962 444 3 147 16.52 4.73 细胞膜、液泡
Cell membrane and vacuoleZjCML2 LOC107417331 1 1 325 582 3 193 21.71 5.17 细胞核
Cell nucleusZjCML3 LOC107409684 2 1 250 777 3 258 28.86 6.16 细胞膜、细胞核
Cell membrane and nucleusZjCML4 LOC107413144 3 846 483 3 160 18.10 4.12 细胞膜、细胞质
Cell membrane and cytoplasmZjCML5 LOC107415541 4 1 014 642 2 213 24.62 4.72 细胞膜
Cell membraneZjCML6 LOC107416249 4 562 459 4 152 16.68 4.80 液泡
VacuoleZjCML7 LOC107416258 4 667 255 2 84 93.44 4.45 细胞膜
Cell membraneZjCML8 LOC107418957 5 782 486 4 161 17.45 4.14 液泡
VacuoleZjCML9 LOC107421107 6 1 158 507 3 168 19.01 4.33 细胞膜
Cell membraneZjCML10 LOC107422102 7 1 214 729 5 242 27.62 4.93 细胞膜
Cell membraneZjCML11 LOC107423403 7 952 450 4 149 16.84 4.11 细胞膜、细胞质
Cell membrane and cytoplasmZjCML12 LOC107424787 8 889 516 4 171 19.44 4.88 细胞膜
Cell membraneZjCML13 LOC107424831 8 856 573 3 190 21.34 4.82 细胞膜
Cell membraneZjCML14 LOC107425895 9 887 447 4 148 16.77 4.07 细胞膜、细胞质
Cell membrane and cytoplasmZjCML15 LOC107427067 9 1 294 561 4 186 21.34 6.62 细胞膜
Cell membraneZjCML16 LOC107427847 9 580 423 4 140 15.56 4.30 细胞膜
Cell membraneZjCML17 LOC107429242 10 1 224 606 4 201 22.19 4.50 细胞膜
Cell membraneZjCML18 LOC107429541 10 721 480 4 159 17.65 4.34 液泡
VacuoleZjCML19 LOC107431195 11 1 286 492 4 163 18.02 4.57 液泡
VacuoleZjCML20 LOC107431392 11 1 219 645 3 214 23.89 4.34 细胞膜
Cell membraneZjCML21 LOC107431644 12 1 192 693 3 230 25.22 4.74 细胞核
Cell nucleusZjCML22 LOC107431634 12 1 166 807 3 268 29.24 6.59 细胞核
Cell nucleusZjCML23 LOC107434111 930 507 4 168 18.60 4.37 液泡
Vacuole2.2 枣CML家族基因的染色体定位
对23个ZjCML基因进行了染色体定位分析，并利用MG2C在线软件绘制枣CML染色体物理图谱（图1），发现22个ZjCML家族成员不均匀分布于12条染色体上，其中1个不能明显定位于任何染色体上，第4条和第9条染色体分布最多，各分布3个基因，分别是ZjCML5、ZjCML6、ZjCML7以及ZjCML14、ZjCML15和ZjCML16。
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图 1 枣CML基因在染色体上的定位Figure 1. Position of CML genes on the chromosomes of Chinese jujube2.3 枣CML家族保守基序与进化树联合分析
保守结构域的分析在确定基因功能方面发挥了重要作用，本研究利用在线工具MEME对冬枣CML家族蛋白进行预测分析，同时利用最大似然法构建进化树，并将其与保守基序预测结果相结合（图2）。结果发现：ZjCML基因家族可聚为8类，且5个保守基序存在于该家族中。其中所有ZjCML蛋白均含有Motif 1和Motif 2，即为EF-hand结构域。另外，大部分ZjCML蛋白含有Motif 3和Motif 4，也为EF-hand结构域，而ZjCML5只含有Motif 1和Motif 2，Motif 5只存在于ZjCML3、ZjCML10和ZjCML22。
2.4 枣CML家族基因结构分析
在鉴定到的23个ZjCML成员中，只有1个家族成员ZjCML3含有内含子，其余的ZjCML缺乏内含子结构（图3）。
2.5 枣CML家族蛋白系统进化分析
为揭示ZjCML基因家族的同源进化关系，对23个ZjCML家族成员的编码蛋白与拟南芥的50个CML蛋白采用NJ法构建系统进化树（图4）。结果表明：23个ZjCML蛋白被分为Ⅰ ~ Ⅻ 个亚家族，每个亚家族分别包含1 ~ 3个ZjCML，2 ~ 9个AtCML，且每个亚类群蛋白具有较高的同源性，进化关系较近。其中ZjCML9、ZjCML10和ZjCML20为Ⅱ亚类，ZjCML13和ZjCML16为Ⅲ亚类，ZjCML7和ZjCML17为V亚类，ZjCML6和ZjCML23为Ⅵ亚类，ZjCML2、ZjCML3和ZjCML22为Ⅷ亚类，ZjCML8、ZjCML18和ZjCML19为Ⅸ亚类，ZjCML4、ZjCML11和ZjCML14为Ⅻ亚类，其中，ZjCML13和AtCML41高度同源，属于第Ⅲ亚类。
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图 4 枣和拟南芥CML蛋白系统进化树Figure 4. Phylogenetic tree of CML protein in Chinese jujube and Arabidopsis thaliana2.6 枣CML家族蛋白网络互作预测分析
对所获得的23个ZjCML家族成员氨基酸序列进行互作共表达预测分析，以拟南芥的相关同源序列作为参考。结果表明（图5）：16个ZjCML存在于该网络中且具有一定的互作关系，4个ZjCML与其他ZjCML不存在任何关系。其中，ZjCML6、ZjCML10、ZjCML15、ZjCML17、ZjCML21形成更密切的蛋白互作网络。同样的现象存在于ZjCML8和ZjCML20、ZjCML13和ZjCML21之间。
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图 5 枣CML蛋白网络互作预测分析Figure 5. Putative interaction network of CML protein in Chinese jujube2.7 ZjCML家族基因在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温时RNA-seq表达模式分析
‘冬枣’二倍体抗寒性显著高于其同源四倍体，为了进一步探究ZjCML家族在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫时的功能，我们对其在二者响应低温胁迫时的RNA-seq数据表达模式进行分析。研究结果表明：8个ZjCML基因存在一定的表达，其中ZjCML6和ZjCML13在低温0、6和24 h处理过程中表达水平存在明显差异（图6）。进一步分析发现：ZjCML13在‘冬枣’中显著上调表达（24 h），在其同源四倍体中上调表达不显著；ZjCML6在‘冬枣’及其同源四倍体中均上调表达；其他基因在低温处理后表达差异不明显。然后，对ZjCML6和ZjCML13进行qRT-PCR发现：ZjCML6在‘冬枣’响应低温胁迫6和24 h时显著上调表达，在其同源四倍体中表达无变化；ZjCML13在‘冬枣’响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达，在其同源四倍体中表达差异不显著（图7）。因此，ZjCML6和ZjCML13基因可能在调控‘冬枣’及其同源四倍体抗寒性差异中发挥重要作用。
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图 6 ZjCML基因在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫时的RNA-seq热图Figure 6. Heat map of ZjCMLs expressing profiles in response to cold stress between ‘Dongzao’ and its autotetraploids from RNA-seq data![]()
图 7 ZjCML6和ZjCML13基因在‘冬枣’及其同源四倍体中响应低温胁迫时qRT-PCR表达模式分析*表示在P < 0.05水平上有显著性差异；**表示在P < 0.01水平上有极显著性差异。下同。* represents significant difference at P < 0.05 level; ** represents extremely significant difference at P < 0.01 level. The same below.Figure 7. Expression profiles in response to cold stress between ‘Dongzao’ and its autotetraploids from qRT-PCR test of ZjCML6 and ZjCML132.8 ZjCML家族基因响应CaCl2和褪黑素处理后低温胁迫下的表达模式分析
对外源CaCl2和褪黑素处理的‘冬枣’同源四倍体中ZjCML6、ZjCML9、ZjCML10、ZjCML13、ZjCML14和ZjCML21响应低温胁迫时的表达模式分析发现（图8）：外源CaCl2和褪黑素处理后，ZjCML6、ZjCML21表达水平在响应低温胁迫时无显著变化；ZjCML9表达水平在响应低温胁迫时下调；ZjCML10在褪黑素处理后低温胁迫24 h时显著上调；而ZjCML13在CaCl2和褪黑素处理后响应低温胁迫6和24 h时极显著上调表达。研究结果表明：外源CaCl2和褪黑素处理可以诱导ZjCML13表达，进而为探究外源CaCl2和褪黑素处理是否能提高‘冬枣’同源四倍体抗寒性提供理论依据。
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图 8 ZjCML家族基因在CaCl2和褪黑素处理冬枣四倍体后响应低温胁迫时的相对表达量分析Figure 8. Relative expression levels of some CML genes in tetraploid of ‘Dongzao’ in response to cold stress under CaCl2 and melatonin treatments3. 讨论与结论
类钙调素蛋白是一类具有独特的EF-hand结构域的蛋白，能感知Ca2＋信号并与之结合调节下游靶蛋白，参与植物信号转导过程[28]。目前CML基因已在拟南芥、番茄等多种植物中鉴定出来，并对其生物学功能进行了研究。本研究利用生物信息学方法从枣中鉴定出23个CML基因，其不均匀地分布于枣12条染色体上。相较于最早在拟南芥和水稻中分别发现的50个和32个CML基因，枣中CML基因数量远低于拟南芥，略低于水稻，表明不同物种CML基因家族数量差异较大。在拟南芥和水稻中，片段复制和串联复制可能是导致CML基因家族扩张及其数目较多的主要原因[29]，而枣近年来未发生全基因组复制，可能是导致枣的CML基因家族成员数量较少的原因。同样在枣环核苷酸门控离子通道（ZjCNGC）的研究中也发现了类似的结果，即ZjCNGC的成员数量低于其他植物物种的CNGC的数量[30]。
CML家族成员中存在1种EF-hand结构域，该结构域可以与Ca2＋结合，在Ca2＋调控其活性和信号转导中发挥重要的作用[13]。在本研究中，经比对发现ZjCML家族成员含有1 ~ 5个EF-hand结构域，与拟南芥的特点相似，说明其均可与Ca2＋结合。进而我们通过将枣与拟南芥CML基因家族进行进化树分析，发现其可划分为12个亚族（图4），说明枣CML家族蛋白成员起源不同且功能多样。另外，研究表明，在相同的亚家族或更细小的分支结构中，不同基因基本发挥相似的功能[31]。在聚类分析中发现一些ZjCML与拟南芥CML蛋白具有同源性，且聚到1个亚类中，推测该家族成员功能存在相似性且与拟南芥CML蛋白之间存在较近的进化关系。同时保守基序分析表明：鉴定出的2个基序存在于大多数ZjCML家族成员中，即ZjCML在枣生长发育中可能表现出相对保守的功能，从而为进一步进行系统发育、基因表达分析和功能研究提供重要信息。Ca2＋信号在植物信号转导中发挥重要作用，多种胁迫均可诱导CML基因的表达[32-35]。其中，研究表明CML在植物抗寒性中发挥重要作用。例如：在拟南芥中研究发现，AtCaM4与Sec14类蛋白PATL1相互作用，以独立于CBF的方式负调控拟南芥的抗寒性[36]。在葡萄中发现，VaCML21v2基因在拟南芥中过表达可增强低温胁迫相关基因DREB1A和DREB2A的表达，从而提高其抗寒性[19]。课题组前期研究表明，‘冬枣’抗寒性显著高于‘冬枣’同源四倍体。转录组数据分析发现，低温处理下类钙调素蛋白相关基因ZjCML13和ZjCML6在‘冬枣’中表达水平显著高于‘冬枣’同源四倍体，进而我们通过实时定量表达分析对该结果进行了验证，与转录组数据变化趋势一致，说明ZjCML13和ZjCML6可能在调控‘冬枣’及其同源四倍体抗寒性差异中发挥重要作用，将来可对其功能及调控二者抗寒性差异分子机制进行深入研究。另外，研究表明：植物细胞内Ca2＋浓度的变化与植物抗逆性密切相关，外源CaCl2处理可使辣椒（Capsicum annuum）细胞内可溶性糖维持较高水平，从而提高其抗寒性[37]。对叶片喷施CaCl2可显著提高香蕉（Musa nana）苗的抗寒性[38]。褪黑素在调控植物逆境胁迫中发挥重要作用[39]，外源褪黑素可通过调控叶绿素和渗透调节物质含量，抗氧化酶活性等提高软枣猕猴桃（Actinidia chinensi）幼苗抗寒性[40]。本研究发现：外源CaCl2和褪黑素处理‘冬枣’同源四倍体可显著诱导ZjCML13表达，说明其可能在调控‘冬枣’同源四倍体抗寒性中发挥重要功能，但其调控分子机制还有待深入研究。
CML是所有真核生物中最保守的钙离子传感蛋白[41]，其主要通过调节各类靶点而在细胞信号网络中发挥关键作用，从而响应植物胁迫应答反应和系统发育。本研究在枣基因组数据中共鉴定到23个ZjCML基因，其不均匀地分布在12条染色体上，ZjCMLs可被分为12个类群，其中ZjCML13在‘冬枣’中表达水平显著高于其同源四倍体，且受外源CaCl2和褪黑素调控，表明ZjCML13在调控‘冬枣’及其同源四倍体抗寒性差异中发挥着重要作用，可为将来进行枣倍性育种提供理论依据。
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图 1 枣CML基因在染色体上的定位
Figure 1. Position of CML genes on the chromosomes of Chinese jujube
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图 4 枣和拟南芥CML蛋白系统进化树
Figure 4. Phylogenetic tree of CML protein in Chinese jujube and Arabidopsis thaliana
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图 5 枣CML蛋白网络互作预测分析
Figure 5. Putative interaction network of CML protein in Chinese jujube
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图 6 ZjCML基因在‘冬枣’及其同源四倍体响应低温胁迫时的RNA-seq热图
Figure 6. Heat map of ZjCMLs expressing profiles in response to cold stress between ‘Dongzao’ and its autotetraploids from RNA-seq data
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图 7 ZjCML6和ZjCML13基因在‘冬枣’及其同源四倍体中响应低温胁迫时qRT-PCR表达模式分析
*表示在P < 0.05水平上有显著性差异；**表示在P < 0.01水平上有极显著性差异。下同。* represents significant difference at P < 0.05 level; ** represents extremely significant difference at P < 0.01 level. The same below.
Figure 7. Expression profiles in response to cold stress between ‘Dongzao’ and its autotetraploids from qRT-PCR test of ZjCML6 and ZjCML13
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图 8 ZjCML家族基因在CaCl2和褪黑素处理冬枣四倍体后响应低温胁迫时的相对表达量分析
Figure 8. Relative expression levels of some CML genes in tetraploid of ‘Dongzao’ in response to cold stress under CaCl2 and melatonin treatments
表 1 实时荧光定量PCR引物表
Table 1 Primers used in qRT-PCR
基因名称
Gene name引物序列（5′—3′）
Primer sequence （5′−3′）ZjCML1 F: AGCACATGAAGCCCGAACC
R: CGGACCCAACATCCACCTCZjCML2 F: GGGGTGTAGTAGGAAAGGCT
R: TTCCTTGAGATGACCTCCGCZjCML3 F: TAGCCTTGGGACTATCCGCT
R: CGCCAGTGACCAAGACAACTZjCML4 F: TGCTGAAGAGGAGCTTCGAG
R: CCATCACCATCCAAATCAGCTTZjCML5 F: CGAAGGTTCGGTCCGTGAAA
R: TTGCTTTCTGGGCTGCAAAAZjCML6 F: AACGGCAAGTCTGTAGACGA
R: CAATGTGTCCGTCGCCATTCZjCML7 F: CGTGACCGCATTTTCAAGCG
R: GGCCATCATACGACTCACCTZjCML8 F: TTGCAGGTTCAATGGCGAAG
R: GCTGACTTTGCCATCACAGAZjCML9 F: TCTGTGGGAAAACCATGCCT
R: ATGAAACCGTCGCCGTTGATZjCML10 F: AGGAGGACATGAGAGAGGCTT
R: GTTGACCATCCCATCACCGTZjCML11 F: AGCTGAAAGAGGCATTCCGA
R: GGTTAGCTTCTCACCGAGGTTZjCML12 F: ACAAGGATGGAAGTGGTGCAA
R: TCTCACCAAGATCCTTTGCCAZjCML13 F: ACCAAGAATCAACAGCGGCA
R: TACTCACCGACCGATCCGAAZjCML14 F: GATTCAGACGGCTTCATT
R: TCTATTGTCCCATTTCCAZjCML15 F: ATCCCAAGACAGGCAAAGCTC
R: GATGCCCTTGTATTCGTGCTGZjCML16 F: ATGGAGACGGGAAGATATCGC
R: CCAAACCAAGCAACCCATCTCZjCML17 F: GCCAGCGAAAACGACAACAA
R: CGGTGGCATGTTGACCTAGAZjCML18 F: TCATGGAGGTTTTCCGGTCG
R: CGACAGCTCACGGTATGTCAZjCML19 F: CTCCATACACAGAGGACCAGC
R: GCCTCCTTGATCATCCCTGTCZjCML20 F: TCGACAAGAACAGAGACGGC
R: GTCCCTCATTTCCGGGTCTTZjCML21 F: CGCCATGATGTTGAGCGAAG
R: GCCGTGATTTTCCCATCGTGZjCML22 F: AGAGGTTTGACCGTGACAGG
R: ACTTGGACACCAGCAAATCCAZjCML23 F: TCGGGACCATAACGGACTCA
R: ACAGATCGGATCATGCGTCGZjActin F: AGCCTTCCTGCCAACGAGT
R: TTGCTTCTCACCCTTGATGC
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表 2 枣CML基因家族基本信息
Table 2 Basic information of CML gene family in Chinese jujube
基因名称
Gene name基因登录号
Gene ID染色体
定位
Chromosome
location基因组
全长
Genomic total
length/bpCDS长度
CDS
length/bpEF-hand
数目
Number of
EF-hand氨基酸数量
Number
of amino
acid/aa分子量
Molecular
mass/
kDa等电点
Isoelectric
point亚细胞定位
Subcellular locationZjCML1 LOC107420771 1 962 444 3 147 16.52 4.73 细胞膜、液泡
Cell membrane and vacuoleZjCML2 LOC107417331 1 1 325 582 3 193 21.71 5.17 细胞核
Cell nucleusZjCML3 LOC107409684 2 1 250 777 3 258 28.86 6.16 细胞膜、细胞核
Cell membrane and nucleusZjCML4 LOC107413144 3 846 483 3 160 18.10 4.12 细胞膜、细胞质
Cell membrane and cytoplasmZjCML5 LOC107415541 4 1 014 642 2 213 24.62 4.72 细胞膜
Cell membraneZjCML6 LOC107416249 4 562 459 4 152 16.68 4.80 液泡
VacuoleZjCML7 LOC107416258 4 667 255 2 84 93.44 4.45 细胞膜
Cell membraneZjCML8 LOC107418957 5 782 486 4 161 17.45 4.14 液泡
VacuoleZjCML9 LOC107421107 6 1 158 507 3 168 19.01 4.33 细胞膜
Cell membraneZjCML10 LOC107422102 7 1 214 729 5 242 27.62 4.93 细胞膜
Cell membraneZjCML11 LOC107423403 7 952 450 4 149 16.84 4.11 细胞膜、细胞质
Cell membrane and cytoplasmZjCML12 LOC107424787 8 889 516 4 171 19.44 4.88 细胞膜
Cell membraneZjCML13 LOC107424831 8 856 573 3 190 21.34 4.82 细胞膜
Cell membraneZjCML14 LOC107425895 9 887 447 4 148 16.77 4.07 细胞膜、细胞质
Cell membrane and cytoplasmZjCML15 LOC107427067 9 1 294 561 4 186 21.34 6.62 细胞膜
Cell membraneZjCML16 LOC107427847 9 580 423 4 140 15.56 4.30 细胞膜
Cell membraneZjCML17 LOC107429242 10 1 224 606 4 201 22.19 4.50 细胞膜
Cell membraneZjCML18 LOC107429541 10 721 480 4 159 17.65 4.34 液泡
VacuoleZjCML19 LOC107431195 11 1 286 492 4 163 18.02 4.57 液泡
VacuoleZjCML20 LOC107431392 11 1 219 645 3 214 23.89 4.34 细胞膜
Cell membraneZjCML21 LOC107431644 12 1 192 693 3 230 25.22 4.74 细胞核
Cell nucleusZjCML22 LOC107431634 12 1 166 807 3 268 29.24 6.59 细胞核
Cell nucleusZjCML23 LOC107434111 930 507 4 168 18.60 4.37 液泡
Vacuole
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