Effects of extraction methods on extraction components and antioxidant activity of Quercus mongolica shell
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摘要:目的 蒙古栎实壳富含多酚、黄酮等活性化合物，具有抗氧化和抑菌等功能。为了深度开发蒙古栎资源，获得抗氧化活性高且高效的制备方法，对不同方法提取的蒙古栎实壳提取物活性成分和抗氧化活性进行比较研究。方法 采用分光光度法测定溶剂浸提法、高剪切法、超声波法和酶解法这4种方法提取物的总酚、总黄酮、总三萜和可溶性糖物质含量，采用傅里叶变换红外光谱分析4种提取方法对蒙古栎实壳提取物的官能团变化的影响。结果 4种提取方法对蒙古栎实壳提取物的提取效果和抗氧化活性影响均存在显著性差异，其中酶解法对蒙古栎实壳中酚类化合物的提取效果最好，每100 g蒙古栎实壳的等量总酚含量高达（1.090 ± 0.570） g，FTIR显示酶解法提取的蒙古栎实壳提取物在3 401、1 039 cm−1 处的吸收峰强度最大，分别为酚类物质特征基团羟基O−H的伸缩振动和黄酮类物质特征基团C−O−C的伸缩振动。体外抗氧化试验结果表明酶解法提取的蒙古栎实壳提取物抗氧化作用最强，当提取物溶液的质量浓度在0.80 g/L时，·OH清除率高达98.55%，高于VC的清除率（82.03%）。相关性分析表明多酚类物质起主要抗氧化作用。结论 对溶剂浸提法、高剪切法、超声波法和酶解法提取物活性成分和抗氧化能力进行比较，发现酶解法提取物的活性物质含量最高，抗氧化活性最高。因此，酶解法是从蒙古栎实壳中提取富含抗氧化活性物质的有效方法，且酶解法提取操作简便、成本低，可用于蒙古栎实壳活性物质的制备和天然抗氧化剂的开发。本研究结果为蒙古栎实壳提取物提取技术的选择及抗氧化剂的开发利用提供了理论依据。Abstract:Objective The solid shell of Quercus mongolica is rich in polyphenols, flavonoids and other active compounds with a variety of functions. In order to further develop Q. mongolica resources and obtain high antioxidant activity and efficient preparation methods, the active components and antioxidant activity of Q. mongolica shell extracts extracted by different methods were compared.Method The contents of total phenols, total flavonoids, total triterpenoids and soluble sugar were determined by spectrophotometry. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was used to analyze the functional group changes of the extracts of Q. mongolica with 4 extraction methods.Result There were significant differences in the effects of the four extraction methods on the extraction efficiency and antioxidant activity of Q. mongolica shell, among which enzymatic hydrolysis method had the best extraction effect on phenolic compounds from Q. mongolica shell, and the total phenolic content per 100 g was as high as (1.090 ± 0.570) g. FTIR showed that the absorption peak intensity was the highest at 3401 and 1 039 cm−1, which were the stretching vibration of hydroxyl O−H and C−O−C of phenolic substances, respectively. In vitro antioxidant test results showed that the antioxidant activity of the extract was the strongest. When the concentration of the extract solution was 0.80 g/L, the scavenging rate of ·OH was 98.55%, which was higher than that of VC (82.03%). Correlation analysis showed that polyphenols played a major role in antioxidant activity.Conclusion The active components and antioxidant capacity of extracts extracted by solvent extraction, high shear method, ultrasonic method and enzymatic hydrolysis method were compared. It is found that enzymatic hydrolysis method has the highest content of active substances and antioxidant activity. Therefore, the enzymatic hydrolysis method is an effective method to extract rich antioxidant active substances from Q. mongolica shell, and the enzymatic hydrolysis extraction is simple, low cost, which can be used for the preparation of active substances and natural antioxidant development of Q. mongolica shell. The results of this study provide theoretical basis for the selection of extraction technology of Q. mongolica shell extract and the development and utilization of antioxidants.
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Keywords:
- extraction method /
- Quercus mongolica shell /
- chemical component /
- antioxidant /
- infrared spectrum
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蒙古栎（Quercus mongolica）为壳斗科（Fagaceae）栎属落叶乔木，主要分布于我国东北和华北地区[1]。蒙古栎资源丰富，全国种植面积1.33 × 107 ~ 1.67 × 107 hm2，年产栎实6 × 1010 ~ 7 × 1010 kg，副产物蒙古栎实壳7 × 109 ~ 8 × 109 kg。蒙古栎实可加工成淀粉或生产饲料，橡碗可作染料、栲胶。蒙古栎实壳作为蒙古栎的壳斗，除了少部分用作活性炭加工外，大部分作为废弃物被直接抛弃或者焚烧，造成了资源浪费和环境污染[2-3]。而栎实壳中富含多种活性化合物，是天然抗氧化剂的良好来源。栎实壳提取制备的栎实壳色素，为儿茶酚、花黄素、花色素连接糖基的化合物，安全性高，已经被GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[4]列入食品添加剂，作为功能性食品色素，允许在焙烤食品、碳酸饮料和调制酒中使用。
从植物中提取活性成分的方法各异，不同的提取方法对植物活性成分的提取和功能活性影响很大[5-6]。目前，栎实壳提取方法主要有溶剂浸提法、酸碱提取法、超声波法、酶解法、超临界流体萃取法。溶剂提取法提取栎实壳色素得率为6.625%，多酚含量达到27.8%，耗时长、效率低[7]。为了提高效率，董孝元[8]采用碱液加热提取，显著提高了提取率，但碱液对某些提取物结构破坏大，导致其抗氧化活性降低，且碱液回收困难，污染大。超声波的空化作用传递能量使细胞壁破碎，可以将目标物质有效分离，超声波法对栎实壳提取物的破坏较小，栎实壳色素得率为10.1%，总酚含量为70.04%，抗氧化活性较好[9]。超临界流体气体黏度低、扩散系数高和液体密度高，对目标物质分离效率高，且无污染、操作温度低，利用超临界CO2萃取法提取栎实壳色素，其提取率为10.98%。纤维素酶和果胶酶的酶解作用可以较温和地将植物的细胞壁软化、膨胀和崩溃等，从而改变细胞壁的通透性，加速有效成分的释放，从而提高提取率，纤维素酶酶解法提取栎实壳色素的提取率可达11.36%。
目前对于溶剂浸提法、高剪切法、超声波法和酶解法在有效成分提取方面已有较多的研究报道，但缺乏对于蒙古栎实壳不同提取方法效果和功能活性的比较研究。因此，本研究采用4种提取方法对蒙古栎实壳进行提取，对所得提取物的抗氧化能力（ABTS+·、DPPH·、O2 −·、·OH清除率和总还原力）和化学组成（总酚、可溶性糖、总黄酮和总三萜类物质的含量）进行了测定，进一步比较溶剂浸提法、高剪切法、超声波法、酶解法这4种提取方法的提取效果，分析其差异原因，以及对抗氧化功能的影响。
1. 材料与方法
1.1 材 料
蒙古栎于2020年9月采集于东北林业大学林场蒙古栎林（126°37′28″ E，45°45′58″ N，海拔141 m），采后将新鲜成熟的蒙古栎烘干，取其壳粉碎，过40目筛，得到蒙古栎实壳粉末，密封后−18 ℃避光保藏备用。
没食子酸标准品（纯度99.2%），购于中国食品药品检定研究所。儿茶素标准品（纯度90.0%）、DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）、ABTS（2,2′-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate））购于上海源叶科技有限公司。盐酸、硫酸、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司。所用化学试剂均为分析纯。
1.2 研究方法
1.2.1 蒙古栎实壳提取物制备
分别采用不同体积分数（0、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）乙醇溶液作为提取溶剂制备蒙古栎实壳提取物，具体步骤为每克蒙古栎实壳干粉加入20 mL提取溶剂，采用高剪切法（上海弗鲁克流体机械制造有限公司FLUKO高剪切乳化机）、超声波法（昆山市超声仪器有限公司KQ-500DE型数控超声波仪）、酶解法和溶剂浸提法制备蒙古栎实壳提取物，4 000 r/min离心10 min（上海安亭科学仪器厂TGL-16G台式离心机），按照上述提取步骤重复两次，待第3次提取完毕后，将3次提取液合并即得蒙古栎实壳提取液。取上清液用旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器公司RE-52旋转蒸发器）蒸发浓缩，−80 ℃真空冷冻干燥，得到蒙古栎实壳提取物，密封后−18 ℃避光保藏备用。
高剪切法借鉴Bello等[10]的研究方法：工艺参数为转速18 000 r/min、剪切时间6 min、剪切温度45 ℃、提取时间40 min。超声波法借鉴徐烨等[11]的研究方法：工艺参数为超声波功率300 W、超声温度45 ℃、超声提取时间40 min；酶解法借鉴Hu等[12]的研究方法：工艺参数为调节pH至4.95，加入质量分数0.6%的复合酶（纤维素酶和果胶酶的质量比为3∶4），酶解温度45 ℃，酶解时间40 min。溶剂浸提法借鉴李德海等[13]的研究方法：45 ℃水浴条件下提取2 h。
1.2.2 蒙古栎实壳提取物中活性成分含量的测定
称取10 mg蒙古栎实壳提取物，溶解在100 mL去离子水中，配制成质量浓度为0.10 g/L的提取物溶液，60 ℃溶解待用。
1.2.2.1 总酚含量的测定
参照孙朋真等[14]的福林−酚法并进行改进，具体步骤为：吸取125 μL制备好的提取液于试管中，依次加入125 μL福林酚溶液与0.5 mL蒸馏水，室温放置6 min，加入1.25 mL 7%的Na2CO3溶液，40 ℃水浴90 min，在波长760 nm处测定其吸光度D760 （上海第三分析仪器厂722s紫外分光光度计）。以没食子酸为标准品，得到没食子酸的标准曲线方程为：D760 = 2.239x + 0.068 5，R2 = 0.999 9。按式（1）换算得出蒙古栎实壳提取物的总酚含量，结果以每100 g 蒙古栎实壳的没食子酸的等价质量表示总酚含量。
P=100xfV/m (1) 式中：P为总酚含量，用100 g 蒙古栎实壳中没食子酸的等价质量表示总酚含量，g；x为没食子酸质量浓度，g/L；f为稀释倍数，V为试样溶液体积，L；m为蒙古栎实壳干粉的质量，g。
1.2.2.2 可溶性糖含量的测定
参照蒋鹏飞等[15]的苯酚–硫酸法，步骤如下：量取1.0 mL制备好的提取液，加入0.5 mL 6%苯酚溶液，旋涡振荡，加入2.5 mL浓硫酸溶液，摇匀，静置25 min，在波长490 nm处测定其吸光度D490。以葡萄糖为标准品，得葡萄糖标准曲线方程：D490 = 6.713 3x + 0.121 5，R2 = 0.999 9。结果以每100 g蒙古栎实壳的葡萄糖等价质量表示总可溶性糖含量，计算公式类似于式（1）。
1.2.2.3 总黄酮含量的测定
参照Kurkina等[16]的硝酸铝法，步骤如下：量取0.25 mL提取液，依次加入75 μL 5% NaNO2 溶液与0.5 mL蒸馏水，混合均匀；静置 6 min 后，加入150 μL 10% Al(NO3)3·9H2O溶液，摇匀静置5 min；最后加入1 mol/L NaOH溶液0.5 mL，加蒸馏水定容至2.5 mL，510 nm波长处测定其吸光度D510。以儿茶素为标准品，得到儿茶素标准曲线方程为 D510 = 2.246 3x – 0.011 3，R2 = 0.999 4。结果以每100 g 蒙古栎实壳的儿茶素等价质量表示总黄酮含量，计算公式类似于式（1）。
1.2.2.4 总三萜含量的测定
参照杜令娟等[13]的方法测定总三萜含量，具体步骤为：取50 mg蒙古栎实壳提取物溶于100 mL 95%乙醇溶液，即为待测液。准确吸取0.20 mL 待测液，置于5 mL的棕色容量瓶中，100 ℃水浴蒸干，加入0.20 mL 5%香草醛–冰醋酸溶液和0.80 mL的高氯酸溶液，摇匀。在70 ℃水浴锅中反应15 min 后，常温放置3 ~ 5 min，用乙酸乙酯定容至5 mL，摇匀，551 nm处测定吸光度D551。以齐墩果酸为标准品，绘制标准曲线，得回归方程为D551 = 10.364x + 0.102 9，R2 = 0.999 5。结果以每100 g 蒙古栎实壳的齐墩果酸等价质量表示总三萜含量，计算公式类似于式（1）。
1.2.3 蒙古栎实壳提取物的红外光谱分析
采用KBr压片法[17]，具体步骤如下：将4种提取方法提取的蒙古栎实壳提取液真空冻干，取100 mg干燥KBr粉末研细，加入1 mg 蒙古栎实壳提取物样品混合研细，压成透明薄片。在分辨率为4.0 cm−1的Vector22型红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）中对纯溴化钾薄片进行背景扫描32次，然后在400 ~ 4 000 cm−1波数范围用氖化硫三肽检测器对含有样品的溴化钾薄片进行测定。
1.2.4 体外抗氧化活性测定
通过上述试验筛选出40%乙醇溶液的提取率最高，对4种提取方法40%乙醇溶液的提取物进行抗氧化活性测定。以维生素C（vitamin C，VC）作为对照，测定了其DPPH·、ABTS+·、·OH、O2 −·清除率和总还原力。
1.2.4.1 DPPH·清除率的测定
参考Dong等[18]的方法稍作改动，具体步骤为：分别配置蒙古栎实壳提取物和VC的待测溶液，其质量浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80、1.00 g/L，在测定管中加入2 mL待测溶液和2 mL DPPH·溶液，在对照管中加入2 mL待测液和2 mL的无水乙醇，在空白管中加入2 mL DPPH·溶液和2 mL的无水乙醇作空白溶剂。摇匀后，在室温下避光静置30 min，于517 nm处测定吸光度，分别记为A1、A2、A0，测定时用无水乙醇调零。按式（2）计算待测样品对DPPH·的清除率。
A=[1−(A1−A2)/A0]×100% (2) 式中：A为蒙古栎实壳提取物对DPPH·的清除率，%；A1为待测液和DPPH·试剂混合液的吸光度；A2为待测液和空白溶剂混合液的吸光度；A0为 DPPH·试剂与空白溶剂混合液的吸光度。
1.2.4.2 ABTS+·清除率的测定
参照李伟等[19]的研究方法，评价蒙古栎实壳提取物的ABTS+·清除率。7 mmol/L ABTS与4.9 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1:1混合，避光反应16 h，作为自由基供体。使用前用50%乙醇稀释，使734 nm波长处的吸光度为（0.75 ± 0.02）。分别取0.1 mL不同质量浓度（0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 g/L）蒙古栎实壳提取液与VC标准品溶液，为待测液，加入1.5 mL ABTS+·溶液，混匀，室温放置10 min，在734 nm波长处测定吸光度。
B=[1−(B1−B2)/B0]×100% (3) 式中：B为蒙古栎实壳提取物对ABTS+·的清除率，%；B1为待测液和ABTS+·试剂混合液的吸光度；B2为待测液和空白溶剂混合液的吸光度；B0为ABTS+·试剂与空白溶剂混合液的吸光度。
1.2.4.3 ·OH清除率的测定
参考郭林新等[20]所述方法并稍作修改，分别配置蒙古栎实壳提取物与VC的待测溶液，其质量浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 g/L，在测定管分别加入1.0 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）、待测溶液和H2O2（9 mmol/L），室温放10 min，最后加1.0 mL水杨酸–乙醇溶液，充分摇匀，37 ℃水浴30 min，冷却离心。在510 nm处测吸光度，·OH清除率按式（4）计算。
C=[1−(C1−C2)/C0]×100% (4) 式中：C为蒙古栎实壳提取物对·OH的清除率，%；C1是样品吸光度；C2为样品对照组的吸光度（H2O代替H2O2）；C0则表示空白对照组的吸光度（H2O代替样品）。
1.2.4.4 O2 −·清除率的测定
参考田丹丹等[21]的方法，分别配置蒙古栎实壳提取物与VC的待测溶液，其质量浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 g/L，在测定管分别加入1.0 mL待测溶液，再加入4.5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl及1 mL 3 mmol/L邻苯三酚，混匀，静置4 min；加入0.5 mL 8 mol/L HCl终止反应，在320 nm波长处测定吸光度D1；以去离子水代替邻苯三酚在320 nm波长处测定吸光度D2；以去离子水代替样品在320 nm波长处测定吸光度D0。O2 −·的清除率按下式计算公式。
D=[1−(D1−D2)/D0]×100% (5) 1.2.4.5 总还原力的测定
参考羿月同等[22]方法，分别配置蒙古栎实壳提取物和VC的待测溶液，其质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.20 g/L。在试管中加入0.5 mL待测溶液、0.5 mL磷酸缓冲液（pH 6.6、0.2 mol/L）、0.5 mL铁氰化钾（10 g/L），混匀涡旋，50 ℃水浴 20 min，流水冷却，加0.5 mL三氯乙酸（100 g/L），静置。吸取0.5 mL上述反应液，加入0.5 mL蒸馏水和0.1 mL三氯化铁（10 g/L），反应10 min，在700 nm处检验溶液的吸光度，用来表示蒙古栎实壳提取物的总还原力。
以清除50%自由基对应的提取物溶液质量浓度为自由基清除能力半抑制浓度（IC50），自由基IC50越低，抗氧化能力越强。用吸光度达到0.5时的提取物溶液质量浓度代表总还原力C0.5，总还原力C0.5越低，抗氧化能力越强。
1.3 数据分析
所有实验均重复3 次，每个样品3个平行，数据结果以（平均值 ± 标准差）表示。数据均用Excel 2010、Origin 8.0和SPSS 17.0等软件处理完成。
2. 结果与分析
2.1 蒙古栎实壳提取物中活性成分分析
为明确不同提取方法蒙古栎实壳提取物中活性成分种类和含量的差异，本研究测定了其提取物中的可溶性糖、总酚、总黄酮、总三萜等活性成分的含量（图1）。由图1可知：不同提取方法得到的蒙古栎实壳提取物中各活性成分含量存在显著性差异（P < 0.05）。但从测得含量值上看，随着乙醇浓度的升高，4种方法提取的可溶性糖、总酚、总黄酮含量均呈先上升后下降的趋势，乙醇体积分数在40%左右达到最高。其中酶解法和高剪切法对蒙古栎实壳提取物中可溶性糖的提取效果较好（图1a），乙醇体积分数为40%时所得可溶性糖含量达（0.640 ± 0.060）g，溶剂浸提法提取的可溶性糖含量最低，为（0.360 ± 0.040）g。乙醇体积分数在60%时，高剪切法和酶解法对可溶性糖的提取差异不显著（P > 0.05），与溶剂浸提法相比差异显著（P < 0.05）。造成这种结果的原因可能是经过高剪切、酶解处理，蒙古栎实壳中的糖类物质可以充分释放出来，使糖类物质的含量增加。
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图 1 不同提取方法所得蒙古栎实壳提取物各活性成分含量以每100 g 蒙古栎实壳中没食子酸、葡萄糖、儿茶素、齐墩果酸的等价质量分别表示总酚含量、总可溶性糖含量、总黄酮含量、总三萜含量。图中的不同字母表示不同提取方法提取物之间存在显著性差异（P < 0.05）。下同。The contents of total phenol, total soluble sugar, total flavonoids and total triterpenoids are determined by the equivalent mass of gallic acid, glucose, catechin and oleanolic acid in 100 g of Quercus mongolica solid shell. Different letters in the figure indicate that there are significant differences among extracts of different extraction methods (P < 0.05). The same below.Figure 1. Contents of active components of Quercus mongolica shell extract obtained by different extraction methods不同提取方法提取物中的酚类物质含量如图1b所示，酶解法对蒙古栎实壳中酚类化合物的提取效果最好，每100 g蒙古栎实壳的等量总酚含量高达（1.090 ± 0.570）g，其次是超声波法（0.950 ± 0.030）g、高剪切法（0.690 ± 0.030）g，溶剂浸提法得到的总酚含量最低，为（0.670 ± 0.010）g。在本研究中，酶解法和超声波法是从蒙古栎实壳中提取酚类化合物有效的方法。
黄酮含量以每100 g蒙古栎实壳中儿茶素的等价量表示。由图1c可知：不同提取方法提取物中的黄酮得率高低顺序为酶解法 > 超声波法 > 高剪切法 > 溶剂浸提法，酶解法提取物中黄酮类化合物含量最丰富，是溶剂浸提法的2倍多。
不同提取方法得到的三萜类物质含量如图1d所示，三萜类物质的含量随着乙醇体积分数的增加呈上升趋势。主要原因是蒙古栎实壳三萜类物质多为低极性化合物，根据“相似相溶”原理，溶剂中乙醇的比例越高，溶剂极性越小，对三萜类化合物溶解性更好。以乙醇为溶剂，超声波法提取物中三萜类化合物含量最高，可达（0.390 ± 0.005） g。
2.2 不同提取方法蒙古栎实壳提取物红外光谱分析
用红外光谱仪扫描分析溶剂浸提法、超声波法、高剪切法、酶解法这4种提取方法所得的蒙古栎实壳提取物，所得红外图谱如图2所示。由图2可以看出：4种提取物特征吸收峰位置基本相同，但吸收峰的强度有明显差异。这说明超声波、高剪切和酶解处理前后提取物的主要官能团没有变化，但官能团的数目差异明显。酶解法提取物的吸收峰最强，官能团数目最多，这与图1显示的酶解法提取物的活性物质含量最多的结果一致。在3 401 cm−1 处的峰为羟基O—H的伸缩振动吸收峰，宽吸收峰说明存在分子内和分子间氢键[23-24]。在2 928 cm−1处的峰是糖类的—CH3、—CH2、—CH、苯环等C—H伸缩振动峰。1 723 cm−1处吸收峰为羰基C=O伸缩振动吸收峰，其吸收峰可能归属于糖类和黄酮类物质[25]。1 615 cm−1处吸收峰可能是芳香族环的骨架振动，其吸收峰主要归属于酚类[26]。在1 445 cm−1处高剪切法提取物吸收峰最强（图1），为—CH2的变形吸收峰，主要归属于糖苷类物质[27]，高剪切法提取物的糖类物质含量最多，与该结果一致。在1 039 cm−1 处的特征吸收峰为C—O、C—O—C的伸缩振动，可能归属于多酚、黄酮类物质，酶解法提取物在此处峰强度最大，验证了图1中酶解法提取物中多酚、黄酮类物质含量最高的结果。而在650 ~ 900 cm−1 附近的多个吸收峰表明其可能含有苯环、葡萄糖环[28-29]。对比蒙古栎实壳提取物的红外光谱图，可以看出酶解法提取物的官能团含量最高。
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图 2 不同提取方法蒙古栎实壳提取物的红外光谱Figure 2. Infrared spectra of Q. mongolica shell extracted with different extraction methods2.3 不同提取方法蒙古栎实壳提取物的抗氧化活性
2.3.1 不同提取方法对DPPH·清除率的影响
DPPH·是一种稳定的自由基，常被用作自由基清除分析，以评估各种天然化合物的抗氧化能力。本研究开展了不同提取方法所得蒙古栎实壳提取物对DPPH·清除率的影响，结果如图3a所示。4种提取法的提取物对DPPH·均具有显著清除能力，且存在剂量依赖关系，但整体上提取物对DPPH·的清除能力弱于VC对照溶液的。其中，酶解法提取物的DPPH·清除率最高，其次是超声波法提取物和高剪切法提取物，溶剂浸提法提取物的清除率最低，这表明酶解法能显著提高蒙古栎实壳提取物清除DPPH·的能力（P < 0.05）。从图1中也可以看出酶解法提取的蒙古栎实壳提取物中活性物质含量最高，与该结果一致。当提取物溶液质量浓度为0.60 g/L时，酶解法提取物的DPPH·清除率最大，为(85.07 ± 2.53)%。当提取物溶液质量浓度为1.00 g/L时，酶解法提取物的DPPH·清除率达到(90.05 ± 2.99)%，与VC无显著差异，说明蒙古栎实壳提取物溶液在一定质量浓度时具有良好的DPPH·清除能力。此外，从图4也可以看出总酚含量与清除DPPH·的活性呈良好的相关性（r = −0.913，P < 0.01），表明多酚类物质增强了蒙古栎实壳提取物清除DPPH·的活性。
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图 3 不同提取方法蒙古栎实壳提取物的抗氧化活性图中的不同字母表示不同提取方法提取物之间存在显著性差异（P < 0.05）。Different letters in the figure indicate that there are significant differences among extracts of different extraction methods (P < 0.05).Figure 3. Antioxidant activity of Q. mongolica shell extract with different extraction methods![]()
图 4 不同活性成分和抗氧化活性的相关性热图* 代表P < 0.05为显著性相关；** 代表P < 0.01为极显著性相关。* means that P < 0.05 is a significant correlation; ** means P < 0.01 is a extremely significant correlation.Figure 4. Heat map of the correlation between different active ingredients and antioxidant activity2.3.2 不同提取方法对ABTS+·清除率的影响
ABTS+·是一种稳定的自由基，常用于分析生物样品的抗氧化能力。不同方法所得提取物对ABTS+·的清除率如图3b所示。4种提取方法蒙古栎实壳提取物在检测浓度下都表现出良好的清除能力，且清除能力与剂量呈依赖关系，但整体上提取物对ABTS+·的清除率弱于VC对照溶液的。酶解法提取物的ABTS+·清除率最高，依次分别为超声波法提取物、高剪切法提取物，溶剂浸提法提取物的ABTS+·的清除率最低。结果表明：酶解处理能显著提高蒙古栎实壳提取物在受试浓度范围内的ABTS+·清除率（P < 0.05）。当蒙古栎实壳提取物溶液质量浓度为0.50 g/L时，4种提取物中酶解法提取物的ABTS+·清除率最大，为(92.28 ± 4.25)%，当提取物溶液质量浓度为0.90 g/L时，酶解法提取物的ABTS+·清除率高达(97.45 ± 2.38)%，具有良好的ABTS+·清除能力。由图4可知：所有样品的总酚含量与ABTS+·清除能力之间呈良好的相关性。这表明酚类化合物在蒙古栎实壳的ABTS+·清除活性中起着关键作用。
2.3.3 不同提取方法对·OH清除率的影响
由图3c可知：随着提取物溶液质量浓度增大，4种方法提取的蒙古栎实壳提取物和VC对照溶液清除·OH的能力均逐渐增强，提取物浓度与·OH 清除率呈量效关系。蒙古栎实壳提取物的·OH清除能力总体上比VC对照溶液弱，但当提取物溶液质量浓度大于0.40 g/L时，酶解法提取的蒙古栎实壳提取物对·OH 的清除率优于VC对照溶液的，表明酶解法提取的蒙古栎实壳提取物具有较好的抗氧化活性，该结果与魏园园等[30]的研究一致。比较4种方法提取的蒙古栎实壳提取物对·OH清除率可知：酶解法提取物对·OH的清除能力最强，其次是超声波法提取物、高剪切法提取物，溶剂浸提法提取物对·OH的清除能力最弱。
2.3.4 不同提取方法对O2 −·清除率的影响
图3d显示：随着蒙古栎实壳提取物溶液质量浓度的增加，其对O2 −·的清除率也相应增加，蒙古栎实壳提取物溶液质量浓度与 O2 −·清除率之间呈量效关系。魏园园等[30]研究认为橡子壳多酚的抗氧化能力与提取物溶液质量浓度正相关，这同本研究的结果相似。在提取物溶液质量浓度为0.10 ~ 1.00 g/L范围内，酶解法提取的蒙古栎实壳提取物对O2 −·的清除率最高，远高于溶剂浸提法提取物。然而，在相同质量浓度下，蒙古栎实壳提取物对O2 −·的清除率低于VC对照溶液的。当提取物溶液质量浓度为1.00 g/L时，酶解法提取的蒙古栎实壳提取物对O2 −·清除率高达（92.54 ± 4.25）%。4种提取方法获得的提取物对O2 −·的清除率大小顺序为酶解法 > 超声波法 > 高剪切法 > 溶剂浸提法。
2.3.5 不同提取方法对总还原力的影响
总还原力是评价生物样品抗氧化能力的重要指标，在700 nm处样品的吸光度越大，表示总还原力越强。不同提取方法蒙古栎实壳提取物的总还原力结果如图3e所示。4种方法提取物和VC对照溶液的总还原力随着溶液质量浓度的增加而增加，提取物溶液质量浓度与总还原力之间呈剂量依赖关系。当提取物溶液质量浓度为0.20 g/L时，4种方法提取的蒙古栎实壳提取物的吸光度最大，其中酶解法提取的蒙古栎实壳提取物总还原力最强，几乎是溶剂浸提法的2倍。由此可见，不同提取方法对蒙古栎实壳提取物的总还原力有明显影响，酶解法能显著提高蒙古栎实壳提取物的抗氧化能力，是提取蒙古栎实壳的有效手段。值得注意的是，当提取物溶液质量浓度大于0.16 g/L时，酶解法提取的蒙古栎实壳提取物的总还原力强于VC对照溶液的。
2.3.6 不同提取方法对自由基IC50和总还原力C0.5的影响
以VC溶液为对照，计算自由基IC50和总还原力C0.5来评价蒙古栎实壳提取物的抗氧化活性，结果如图3f所示。4种不同方法提取物之间的自由基IC50、总还原力C0.5有显著差异（P < 0.05）。酶解法提取物的自由基清除能力最高，其次为超声波法、高剪切法提取物，溶剂浸提法提取物的自由基清除能力最低，但整体上4种提取物对自由基的清除能力都低于VC对照溶液的。其中酶解法提取物对·OH的清除率最高，其IC50为（0.163 ± 0.019）g/L，与VC的IC50（0.127 ± 0.008）g/L接近。这可能是由于纤维素酶和果胶酶的水解作用，使组织细胞壁破裂，有利于抗氧化活性物质的溶出，这一结果可以从图1得到验证。
提取方法的不同可能影响蒙古栎实壳提取物中活性物质的种类和含量，同时破坏活性物质的结构。其中酶解、超声波和高剪切处理对蒙古栎实壳的细胞壁均有不同程度的破碎作用，促进了有效成分向溶剂中的扩散能力，使具有抗氧化的活性物质溶出度增加，从而导致其抗氧化活性增强。但超声波的空化作用和高剪切的剪切作用对提取液中的抗氧化成分结构造成了一定程度的破坏，而酶解法相对温和，对抗氧化成分结构破坏小，故酶解法提取物抗氧化活性要高于其他3种提取方法。李凤伟等[31]比较不同提取方法对手掌参（Gymnadenia conopsea）多糖提取率、理化性质和体外抗氧化活性的影响，发现酶解法提取物的抗氧化活性最强，这与本研究的研究结果一致。
2.4 活性成分对抗氧化作用的相关性分析
采用统计学手段，对不同活性成分的抗氧化活性进行Pearson相关性分析。本研究中活性成分含量和抗氧化数据均为连续变量且成对出现，服从正态分布，在SPSS中绘制箱形图和散点图检验数据不存在异常值，活性成分含量与自由基IC50、总还原力C0.5基本呈线性相关关系，符合数据分析的条件，相关性分析结果如图4所示。
由图4可知不同方法提取的蒙古栎实壳提取物抗氧化活性与功能成分间存在良好的相关性。DPPH·的IC50与总酚、总黄酮含量呈极显著负相关（P < 0.01），相关系数（r）分别为−0.913和−0.988。而DPPH·的IC50与总三萜含量的相关性较差（r = 0.392，P > 0.05）。ABTS+·的IC50与总酚、总黄酮、可溶性糖含量呈极显著负相关（P < 0.01），r分别为0.794、0.857和0.614。·OH的IC50与总酚、总黄酮之间的相关性较好，r分别为−0.978和−0.936，其次是总三萜，与可溶性糖含量的相关性最差（r = −0.303，P > 0.05）。O2 −·的IC50与总酚、总黄酮含量呈极显著负相关（P < 0.01），r分别为0.827、0.860。总还原力C0.5与总酚、总黄酮含量呈极显著负相关（P < 0.01），r分别为0.794、0.849。其抗氧化指标间存在极好的相关性，总还原力C0.5与DPPH·、ABTS+·、·OH、O2 −·的IC50呈极显著正相关（P < 0.01），r分别为0.920、1.000、0.901和0.998。其活性成分间也存在良好的相关性，总酚含量与总黄酮含量呈极显著正相关（P < 0.01），r为0.931。此统计学结果进一步证明蒙古栎实壳提取物中总酚、总黄酮、可溶性糖和三萜类化合物含量与抗氧化作用密切相关，蒙古栎实壳中酚类物质起主要抗氧化作用。侯盼盼 [3]的研究表明栓皮栎（Quercus variabilis）实壳多酚具有较好的抗氧化活性，与本研究结果一致。
3. 结 论
本研究结果表明提取方法对蒙古栎实壳提取物活性成分及其抗氧化活性具有显著影响，其中酶解法显著优于超声波法、高剪切法和溶剂浸提法。酶解法制备的多酚和黄酮类物质提取率最高，每100 g 蒙古栎实壳的等价总酚含量为（1.090 ± 0.570）g，与红外光谱分析结果一致，即酚羟基和黄酮特征基团C—O—C吸收峰最强。抗氧化试验结果表明酶解法提取的蒙古栎实壳提取物活性最强，对于DPPH·、ABTS+·、·OH、O2 −·的IC50和总还原力C0.5均具有最低值。相关性分析表明蒙古栎实壳提取物中起主要抗氧化作用的是多酚类物质。因此，酶解法是从蒙古栎实壳中提取富含抗氧化活性物质的有效方法，且酶解法提取操作简便，成本低，可用于蒙古栎实壳活性物质的制备和天然抗氧化剂的开发。但关于不同提取方法对酚类化合物结构的影响而导致其体外抗氧化活性不同的具体机制还需要进一步研究。
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图 1 不同提取方法所得蒙古栎实壳提取物各活性成分含量
以每100 g 蒙古栎实壳中没食子酸、葡萄糖、儿茶素、齐墩果酸的等价质量分别表示总酚含量、总可溶性糖含量、总黄酮含量、总三萜含量。图中的不同字母表示不同提取方法提取物之间存在显著性差异（P < 0.05）。下同。The contents of total phenol, total soluble sugar, total flavonoids and total triterpenoids are determined by the equivalent mass of gallic acid, glucose, catechin and oleanolic acid in 100 g of Quercus mongolica solid shell. Different letters in the figure indicate that there are significant differences among extracts of different extraction methods (P < 0.05). The same below.
Figure 1. Contents of active components of Quercus mongolica shell extract obtained by different extraction methods
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图 2 不同提取方法蒙古栎实壳提取物的红外光谱
Figure 2. Infrared spectra of Q. mongolica shell extracted with different extraction methods
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图 3 不同提取方法蒙古栎实壳提取物的抗氧化活性
图中的不同字母表示不同提取方法提取物之间存在显著性差异（P < 0.05）。Different letters in the figure indicate that there are significant differences among extracts of different extraction methods (P < 0.05).
Figure 3. Antioxidant activity of Q. mongolica shell extract with different extraction methods
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