Establishment of high-efficiency regeneration system from in vitro leaves of ‘Jingzao 39’
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摘要:目的 ‘京枣39’是一种优质的枣鲜食新品种，目前尚无有效的离体再生体系，影响了自根苗的培育和苗木纯度。为了解决枣遗传转化效率低等问题，本研究探究了枣叶片再生的不同影响因素，以期建立高效的叶片再生体系。方法 以‘京枣39’组培苗叶片为试材，研究了不同接种方式、基本培养基种类、植物生长调节剂种类和浓度配比对离体叶片直接诱导不定芽再生的影响。结果 正交试验结果表明：叶片正放的接种方式再生率远高于叶片反放，是‘京枣39’叶片再生不定芽的最佳放置方式；基本培养基对‘京枣39’叶片再生的影响要大于植物生长调节剂，且最优培养基为1/2 MS，最佳植物生长调节剂为细胞分裂素6-BA，本研究确立的‘京枣39’组培苗叶片再生的最优体系为1/2 MS + 1 mg/L噻苯隆 + 0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 30 g/L麦芽糖 + 6 g/L琼脂，再生率可达79.17%，平均每叶片再生不定芽能达到4.67个。进而初探并建立了‘京枣39’组培苗的最佳扩繁体系为：MS + 20 g/L麦芽糖 + 6 g/L琼脂 + 3 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA，分枝率高达88%，平均分枝数达2.76枝；以及最适生根体系为：1/2MS + 20 g/L蔗糖 + 8 g/L琼脂 + 1.5 mg/L IBA + 0.3 mg/L NAA，生根率达90.91%，平均根长达4.08 cm。结论 ‘京枣39’叶片再生效率受外界影响因素很大，尤其是基本培养基种类和接种方式，且每个因素都不是独立起作用的。本研究为之后以‘京枣39’叶片为转基因材料进行枣相关基因功能验证建立了完整的培育体系，同时为加快枣的相关研究进程奠定基础。Abstract:Objective ‘Jingzao 39’ is a new high-quality jujube variety. There is no effective regeneration system in vitro at present, which affects the cultivation of self-rooted seedlings and the purity of seedlings. In order to solve the problems of low genetic transformation efficiency of jujube, different influencing factors of jujube leaf regeneration were explored in this study, in order to establish an efficient leaf regeneration system.Method Using the leaves of tissue cultured seedlings of ‘Jingzao 39’ as experimental materials, the effects of different inoculation methods, types of basic culture medium, types and concentration ratio of plant growth regulators on the direct induction of adventitious bud regeneration from detached leaves were studied.Result The results showed that the regeneration rate of the inoculation method with the leaves being placed upward was much higher than that of back up, which was the best placement method for the regeneration of adventitious buds from leaves of ‘Jingzao 39’. The effect of basic culture medium on leaf regeneration of ‘Jingzao 39’ was greater than that of plant growth regulator, and the optimal basic medium and plant growth regulator were 1/2 MS and cytokinin 6-BA, respectively. The optimal regeneration system for leaves of ‘Jingzao 39’ tissue cultured seedlings established in this study was 1/2 MS medium + 1.0 mg/L thiabenduron + 0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA + 30 g/L maltose + 6 g/L agar, an average of 4.67 adventitious buds could be regenerated for each leaf. Then, the optimal propagation system of ‘Jingzao 39’ tissue culture seedlings was initially explored and established: MS + 20 g/L maltose + 6 g/L agar + 3.00 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA, with the branching rate up to 88%, and the average branch number of 2.76; the most suitable rooting medium was: 1/2MS + 20 g/L sucrose + 8 g/L agar + 1.50 mg/L IBA + 0.30 mg/L NAA, with rooting rate of 90.91%, and the average root length up to 4.08 cm.Conclusion The leaf regeneration efficiency of ‘Jingzao 39’ is greatly influenced by external factors, especially the basic medium type and inoculation method, and each factor does not play an independent role. This study establishes a complete cultivation system for the functional verification of interested gene with the leaves of ‘Jingzao 39’ as transgenic materials, and lays a foundation for accelerating the jujube research process.
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Keywords:
- ‘Jingzao 39’ leaf /
- direct regeneration /
- adventitious bud /
- optimal medium
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枣（Ziziphus jujuba）是我国重要的乡土树种，也是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）中栽培范围最广、经济和生态价值最高的树种，被列为全国优势特色经济林树种之一[1-2]。目前枣树培育一般采用嫁接的方式，但枣苗成活率与工人的嫁接技术、嫁接时间以及后期管理技术有很大的关系，这限制了枣产业的快速发展，故为了加速枣树优良新品种的培育，利用现代生物技术探索高效的再生体系具有重要的意义。在众多离体材料中，叶片具有取材方便、操作容易、来源广泛等优点，常被用作培养的起始材料[3-6]。根据相关文献[7-8]可知，离体叶片再生技术是筛选优良变异、分离嵌合体及进行遗传转化等方面的重要手段，也是优良品种高效繁殖的关键技术。枣叶片再生植株一般分2种途径，一是先由叶片诱导出愈伤组织，再由愈伤诱导出不定芽，进而培养得到再生植株[3,9-12]；二是由叶片直接诱导产生不定芽，获得完整的再生植株[3,5,11]。例如：在已有的报道中，狗头枣（Z. jujuba ‘Goutouzao’）[9]、灌阳长枣（Z. jujuba ‘Guanyangchangzao’）[3]、毛叶枣（Z. mauritiana）[13]、梨枣（Z. jujuba ‘Lizao’）[14-15]、沾化冬枣（Z. jujuba ‘Zhanhuadongzao’）[16]等品种是通过第一种途径先诱导愈伤，再由愈伤诱导不定芽获得再生植株。骏枣（Z. jujuba ‘Junzao’）[17]、木枣（Z. jujuba ‘Muzao’）[18]、黄骅冬枣（Z. jujuba ‘Huanghuadongzao’）[4]、灰枣（Z. jujuba ‘Huizao’）[19] 等品种是通过第二种途径直接诱导不定芽再生，获得完整植株。
‘京枣39’（Z. jujuba ‘Jingzao 39’，简称J39）是北京市农林科学院林果研究院选育的鲜食大枣良种，具有果实大、果形整齐、结实早、高产优质等特性，并且其适应性及抗虫、抗病能力强[20]，具有很好的生产利用以及作为鲜食大果型枣遗传改良模式品种的研究价值。目前，科研工作者已建立了民勤小枣（Z. jujuba ‘Minqinxiaozao’）[21]、骏枣（Z. jujuba ‘Junzao’）[17]、鸡心枣（Z. jujuba ‘Jixinzao’）[22]等枣品种的叶片再生体系，但总体来说效率不高、稳定性差，且缺乏在鲜食大果型良种基础上再进行基因工程遗传改良的稳定转化体系。本课题组通过对沧县枣树国家良种基地216份枣种质的叶片再生率的对比筛选，发现J39不定芽再分化率最高，并通过第三代测序技术获得了高质量的J39全基因组（庞晓明，未发表资料），J39有望成为枣功能基因组研究的重要工具，但J39离体培养体系还需要进一步的优化和改进。
本研究以J39为试材，探索了基本培养基种类、植物生长调节剂（6-BA、TDZ、NAA以及IBA）对其叶片再生的影响，旨在确定J39叶片再生的最佳条件，建立高效稳定的J39叶片再生体系，从而以J39做为枣树同源验证受体材料且提高遗传转化效率奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以花药培养试验得到的J39组培苗叶片作为探索叶片再生体系的试材，之后再以叶片再生试验得到的无菌苗作为探索扩繁和生根体系的试材。
1.2 培养基与培养条件
不定芽的再生培养在1/2 MS、MS和WPM 3种培养基中探索最适培养基，在此基础上添加30 g/L的麦芽糖和6 g/L的琼脂粉。无菌苗的扩繁培养采用MS培养基，此外再添加6 g/L的琼脂粉。生根培养采用1/2 MS培养基，以此为基础添加8 g/L的琼脂粉。试验材料均置于组培室培养，培养条件：温度（25 ± 1） ℃、光周期16 h/d、光照强度2 000 lx。
1.3 不定芽诱导再生试验设计
1.3.1 试验设计
查阅相关文献资料，确定基本培养基种类、植物生长调节剂（TDZ、6-BA、NAA和IBA），5个参试因素，每个因素3水平，选用L18（37）设计，进行5因素3水平的正交试验。研究分析不同因素在不同水平条件下对J39组培苗叶片再生植株的影响（表1）。
表 1 离体叶片不定芽诱导再生正交试验Table 1. Orthogonal test of induction of adventitious bud regeneration from detached leaves水平
Level培养基种类
Type of medium （A）TDZ（B）/（mg·L−1） NAA（C）/（mg·L−1） 6-BA（D）/（mg·L−1） IBA（E）/（mg·L−1） 1 1/2 MS 0.00 0.00 0.00 0.00 2 MS 0.50 0.20 0.50 0.20 3 WPM 1.00 0.40 1.00 0.40 1.3.2 试验方法
选取生长健壮的J39植株，剪取组培苗中上部叶片，每株苗顶梢未展平以及最底部成熟度过大的1 ~ 2片叶子舍弃，用手术刀垂直于叶脉方向割3 ~ 5刀，然后平铺于培养基上。每皿放置4片叶，其中2个叶片正面接触培养基（反放），另外2个叶片背面接触培养基（正放）。采用正交试验设计，共形成18组培养基，每组培养基接6皿，接种完暗培养14 d，之后弱光培养3 ~ 5 d，最后移至光下培养，35 d后调查统计再生率和平均芽数，试验重复6次，计算公式如下：
再生率=(再生叶片数/接种的总叶片数)×100% (1) 平均芽数=再生芽总数/接种的总叶片数 (2) 1.4 无菌苗扩繁试验设计
1.4.1 试验设计
查阅相关文献资料，确定糖源、植物生长调节剂（6-BA、IBA和NAA）4个参试因素，每个因素3水平，选用L9（34）设计，进行4因素3水平的正交试验。研究分析不同因素在不同水平条件下对J39无菌苗扩繁的影响（表2）。
表 2 离体叶片不定芽诱导再生正交试验因素水平Table 2. Orthogonal test factor level of adventitious bud induction and regeneration from detached leaves水平
Level糖源
Glycogen （a）6-BA（b）/（mg·L−1） IBA（c）/（mg·L−1） NAA（d）/（mg·L−1） 1 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 1.00 0.00 0.00 2 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L 2.00 0.40 0.10 3 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 3.00 0.80 0.20 1.4.2 试验方法
选长势一致且株高在2 ~ 3 cm的单株无菌苗进行扩繁体系的探索，采用正交试验设计，共形成9个处理，每个处理接6瓶，每瓶接3 ~ 4株苗。接完先置于不开灯的组培架上培养3 d，之后再开灯进行培养，60 d后统计分枝率和平均分枝数，试验重复6次。计算公式如下：
增殖率=(增殖株数/原接种株数)×100% (3) 扩繁系数=增殖数/原接种株数 (4) 1.5 不定根的诱导
将株高不低于4 cm且长势稳定的无菌苗接种到1/2 MS基本培养基和蔗糖以及生长素IBA和NAA浓度组合不同的培养基上培养。蔗糖的质量浓度梯度设置为10、20、30 g/L，IBA质量浓度梯度设置为0.50、1.00、1.50 mg/L，NAA质量浓度梯度设置为0、0.30 mg/L，培养基中琼脂质量浓度为8 g/L。采用完全随机区组试验设计，共有18个处理，每个处理接种4瓶，每瓶接2 ~ 3株苗，接完先放置在不开灯的组培架上培养3 d，之后开灯培养，60 d后统计生根率和平均根长，试验重复4次。计算公式如下：
生根率=(生根株数/接种总株数)×100% (5) 平均根长=生根总长/生根数 (6) 1.6 数据分析
使用Microsoft Excel 2010和SPSS 26软件分别完成实验数据的整理、方差分析和多重比较。比较方法为LSD检验法，最小显著差异水平P设置为0.05。
2. 结果与分析
2.1 叶片再生培养基的确立
2.1.1 不同接种方式对叶片再生的影响
试验每个处理接6皿，每皿接4片叶，且每皿叶片接种方式都为2正2反，统计数据时按照接种方式的不同进行统计，表3是以2、11和12号培养基为例，列出J39叶片在这3种培养基中正放和反放2种接种方式下的平均再生芽数。结果显示：2、11、12号培养基中叶片正放时平均芽数分别为2.31、1.93、4.79，叶片反放时对应的平均芽数为0.52、0.67、0.71，正放的不定芽再生数均大于反放，图1可以更直观地看到离体叶片在2种接种方式下不定芽再生数量的差别。
表 3 不同接种方式对J39叶片再生的影响Table 3. Effects of different inoculation methods on leaf regeneration of ‘Jingzao 39’试验号
Test No.接种方式
Vaccination method接种叶片数
Number of inoculated leaf平均芽数
Average number of bud2 叶正面朝上（正）
Leaf face up (positive)12 2.31 叶背面朝上（反）
Leaf dorsal facing up (reverse)12 0.52 11 叶正面朝上（正）
Leaf face up (positive)12 1.93 叶背面朝上（反）
Leaf dorsal facing up (reverse)12 0.67 12 叶正面朝上（正）
Leaf face up (positive）12 4.79 叶背面朝上（反）
Leaf dorsal facing up (reverse)12 0.71 ![]()
图 1 J39离体叶片在3种培养基中不同接种方式直接再生不定芽示意图A ~ C. 离体叶片分别在2、11、12号培养基中的初始诱导状；D ~ E. 叶片分别在2、11、12号培养基中暗培养14 d后的状态；G ~ I. 叶片分别在2、11、12号培养基以及2种接种方式下分化出不定芽，其中红箭头所指为叶片正放，其他为反放。A−C, the initial induction state of detached leaves in medium 2, 11, and 12; D−E, the state of leaves after dark culture in medium 2, 11, and 12 for 14 days; G−I, the leaves are differentiated into adventitious buds on medium 2, 11, and 12 under the two inoculation methods: the red arrow points to the leaf being placed upright and the other is reversed.Figure 1. Schematic diagram of adventitious buds directly regenerated from J39 detached leaves in three media with different inoculation methods另外，从图1中也可发现：再生培养过程中J39颗粒状的薄壁细胞最先在切口处形成，而且大多是在主叶脉的切口处出现，这些颗粒状的薄壁细胞团是后期再生不定芽的细胞基础，所以对叶片进行切割处理有利于不定芽的再生。
2.1.2 不同培养基对叶片再生的影响
本实验采用L18（37）正交表进行5因素3水平的正交试验，旨在找出J39叶片高效再生体系的最佳培养基。从表4可以直接看出：第12个组合的不定芽再生数最高，均值达每叶片4.67个。此外，根据表4中基本培养基种类对应的均值（xi）的大小还可得出：1/2 MS、MS和WPM 3种基本培养基对于J39叶片再生不定芽的影响大小为：1/2 MS > MS > WPM，即叶片在低盐浓度的1/2 MS培养基中不定芽直接再生的数量最多。
表 4 离体叶片不定芽诱导再生正交试验结果Table 4. Orthogonal test results of adventitious bud induced regeneration of detached leaves试验号
Test No.A B/(mg·L−1) C/(mg·L−1) D/(mg·L−1) E/(mg·L−1) 平均芽数
Average number of bud1 1/2 MS 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 2 1/2 MS 0.50 0.20 0.50 0.20 2.24 3 1/2 MS 1.00 0.40 1.00 0.40 0.33 4 MS 0.00 0.00 0.50 0.20 0.00 5 MS 0.50 0.20 1.00 0.40 0.00 6 MS 1.00 0.40 0.00 0.00 0.00 7 WPM 0.00 0.20 0.00 0.40 0.00 8 WPM 0.50 0.40 0.50 0.00 0.00 9 WPM 1.00 0.00 1.00 0.20 0.23 10 1/2 MS 0.00 0.40 1.00 0.20 0.18 11 1/2 MS 0.50 0.00 0.00 0.40 2.22 12 1/2 MS 1.00 0.20 0.50 0.00 4.67 13 MS 0.00 0.20 1.00 0.00 0.00 14 MS 0.50 0.40 0.00 0.20 0.46 15 MS 1.00 0.00 0.50 0.40 0.08 16 WPM 0.00 0.40 0.50 0.40 0.00 17 WPM 0.50 0.00 1.00 0.00 0.04 18 WPM 1.00 0.20 0.00 0.20 0.00 K1 9.64 0.18 2.58 2.68 4.71 K2 0.54 4.97 6.91 6.99 3.11 K3 0.27 5.31 0.97 0.78 2.64 x1 1.60 0.03 0.43 0.45 0.78 x2 0.09 0.83 1.15 1.17 0.52 x3 0.05 0.89 0.16 0.13 0.44 R 1.56 0.86 0.99 1.03 0.34 注：Ki = Σ（该因素在i水平下的平均芽数），xi = Ki/n（n = 该水平的重复数），R为极差。下同。Note: Ki = Σ (the average number of buds of the factor at the i level), xi = Ki/n (n = the number of replicates at this level), R means range. The same below. 极差分析（表5）结果表明：极差值大小排序为RA > RD > RC > RB > RE，因此可知影响J39不定芽再生数的因素主次顺序为A > D > C > B > E，即基本培养基种类影响最大，其次分别是细胞分裂素6-BA、生长素NAA、细胞分裂素TDZ，影响最小的是生长素IBA。根据各因素水平均值的大小，可得不定芽再生数最高的培养基组合为A1B3C2D2E1，即1/2 MS + 1.00 mg/L TDZ + 0.20 mg/L NAA + 0.50 mg/L 6-BA。
表 5 不同因素对J39不定芽再生数影响的极差分析Table 5. Range analysis of effects of different factors on the regeneration number of J39 adventitious buds因子
Factor水平1
Level 1水平2
Level 2水平3
Level 3R A 1.61 0.09 0.05 1.56 B 0.03 0.83 0.89 0.86 C 0.43 1.15 0.16 0.99 D 0.45 1.17 0.13 1.03 E 0.78 0.52 0.44 0.34 为了解这5个因素对于J39叶片再生不定芽数量影响的大小以及显著性，本研究进一步做了方差分析，以期定位到关键的影响因素。方差分析（表6）结果表明：基本培养基对直接再生不定芽数的影响最大，且达到显著水平（P < 0.05），而4种植物生长调节剂对不定芽再生数的影响并不显著。经对基本培养基种类这一因素做进一步多重比较分析，此因素的3个水平对J39叶片再生不定芽数具体影响情况如表7所示：J39分别接种在MS和WPM基本培养基中，其平均不定芽数差异不显著，接种在1/2/MS基本培养基中平均不定芽数显著高于接种在MS和WPM中，故1/2MS对于J39叶片再生不定芽更为适宜。
表 6 不同因素对J39不定芽再生数影响的方差分析Table 6. Variance analysis of effects of different factors on the regeneration number of J39 adventitious buds因子 Factor SS df MS F P A 9.48 2 4.74 4.77* 0.05 B 2.75 2 1.37 1.38 0.31 C 3.14 2 1.57 1.58 0.27 D 3.37 2 1.69 1.70 0.25 E 0.39 2 0.20 0.20 0.83 误差 Error 6.95 7 1.00 总计 Total 26.08 17 注：F值 > F0.05表示显著差异，数值右上角标注“*”。Notes: F value > F0.05 means significant difference, with a “*” in the upper right corner of the value. 表 7 3种基本培养基对J39不定芽再生数影响的LSD多重比较Table 7. Multiple comparisons of LSD of the effects of 3 basic media on the regeneration number of J39 adventitious buds基本培养基
Basic medium基本培养基
Basic medium平均值差值
Mean difference标准误
Standard error显著性
Significance95% 置信区间
95% confidence interval下限
Lower limit上限
Upper limit1/2 MS MS 1.52* 0.61 0.03 0.22 2.81 WPM 1.56* 0.61 0.02 0.27 2.86 MS 1/2 MS −1.52* 0.61 0.03 −2.81 −0.22 WPM 0.05 0.61 0.94 −1.25 1.34 WPM 1/2 MS −1.56* 0.61 0.02 −2.86 −0.27 MS −0.05 0.61 0.94 −1.34 1.25 注：*显著性水平为0.05。Note: * means the significance level of 0.05. 2.1.3 植物生长调节剂对叶片再生的影响
根据表5可知：植物生长调节剂中细胞分裂素6-BA对J39叶片再生的影响最大，其次是生长素NAA，再次是细胞分裂素TDZ，最后是生长素IBA。总体看来，在探究的这4种激素中，细胞分裂素对于J39叶片再生效率的影响比生长素的大，具体原因有待进一步考究。
综合上述结果，J39叶片再生的最佳培养基组合是1/2 MS + 1.00 mg/L TDZ + 0.50 mg/L 6-BA + 0.20 mg/L NAA + 30 g/L麦芽糖 + 6 g/L琼脂。
2.2 扩繁培养基的确立
在扩繁培养过程中发现，糖源为蔗糖的培养基中幼苗基部愈伤褐化严重（图2A），导致幼苗对培养基中营养成分利用率大大降低，组培苗的生长势下降，叶片黄化脱落（图2B）。培养基中既有麦芽糖又有蔗糖时褐化情况次之（图2C），叶片黄化现象减少（图2D）；只有麦芽糖时基部愈伤基本无褐化（图2E），幼苗生长良好，叶片翠绿（图2F）。故得出麦芽糖是J39组培苗扩繁培养的最佳糖源。
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图 2 无菌苗在3种糖源的扩繁体系中生长情况A ~ B. 糖源为20 g/L蔗糖；C ~ D. 糖源为15 g/L麦芽糖和7.50 g/L蔗糖；E ~ F. 糖源为20 g/L麦芽糖。A−B, the source of sugar is 20 g/L sucrose; C−D, the sugar source is 15 g/L maltose and 7.50 g/L sucrose; E−F, the source of sugar is 20 g/L maltose.Figure 2. Growth condition of sterile seedlings in the propagation system of three glycogens由表8可以看出：细胞分裂素6-BA的极差最大，说明其对于J39组培苗的扩繁影响最大，且根据平均值分析得出，糖源和细胞分裂素6-BA以及生长素IBA、NAA最佳的质量浓度配比是a3b3c1d2，即20 g/L麦芽糖 + 3.00 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA，然而在9次试验中并无此组合，之后根据本次试验确定的最佳组合再次进行了试验进行验证，在相同的操作和培养条件下，最后统计得出分枝率为88%，扩繁系数为2.76，而之前9个处理中最高分枝率为85%，因此可得本组合为J39幼苗的最佳扩繁体系。
表 8 J39幼苗扩繁正交试验结果Table 8. Orthogonal test results of J39 seedling proliferation试验号
Test No.a b/（mg·L−1） c/（mg·L−1） d/（mg·L−1） 分枝率
Branching rate/%1 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 1.00 0.00 0.00 47.37 2 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 2.00 0.40 0.10 85.00 3 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 3.00 0.80 0.20 68.42 4 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L
Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L1.00 0.40 0.20 40.00 5 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L
Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L2.00 0.80 0.00 56.52 6 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L
Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L3.00 0.00 0.10 80.00 7 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 1.00 0.80 0.10 56.52 8 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 2.00 0.00 0.20 78.26 9 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 3.00 0.40 0.00 71.43 K1 200.79 143.89 205.63 175.32 K2 176.52 219.78 196.43 221.52 K3 206.21 219.85 181.46 186.68 x1 66.93 47.96 68.54 58.44 x2 58.84 73.26 65.48 73.84 x3 68.74 73.28 60.49 62.23 R 9.90 25.32 8.05 15.40 2.3 不定根培养基的确立
将无菌苗基部修剪后接种到各生根培养基中（图3A），培养60 d后观察并统计各个培养基中幼苗的生根情况（表9），可以明显观察到无菌苗基部生长分化出粗细不一的根，有的根粗壮（图3B），有的根纤细（图3C），甚至有的根上有须根长出（图3D），极大提高了幼苗对营养成分的吸收效率。此外，在不定根诱导过程中发现：无菌苗基部愈伤诱导较多时，不定根分化较少，如图3C黑色箭头所指；而愈伤较少或没有时，不定根分化较多，如图3C红色箭头所指。
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图 3 无菌苗的生根情况A. 无菌苗接种初期的基部形态；B. 粗壮根；C. 纤细根；D. 根上长出须根。A, the basal morphology at the initial stage of inoculation; B, thick roots; C, slender roots; D, fibrous roots growing on the roots.Figure 3. Rooting situation of aseptic seedlings表 9 无菌苗在不同培养基中不定根的诱导情况Table 9. Adventitious root induction of aseptic seedlings on different media培养基号
Medium No.蔗糖
Sucrose/（g·L−1）IBA/（mg·L−1） NAA/（mg·L−1） 生根率
Rooting rate/%平均根长
Average root length/cm1 10 0.50 0.00 62.50cd 3.68def 2 20 0.50 0.00 66.67bcd 5.03cd 3 30 0.50 0.00 60.00cd 2.73f 4 10 0.50 0.30 81.82abc 2.74f 5 20 0.50 0.30 72.73abcd 3.58def 6 30 0.50 0.30 75.00abcd 4.24cdef 7 10 1.00 0.00 55.56de 4.80cd 8 20 1.00 0.00 80.00abc 4.22cdef 9 30 1.00 0.00 72.73abcd 4.43cde 10 10 1.00 0.30 63.64cd 4.26cdef 11 20 1.00 0.30 88.89ab 5.25c 12 30 1.00 0.30 63.64cd 2.84f 13 10 1.50 0.00 61.54cd 6.83ab 14 20 1.50 0.00 81.82abc 7.23a 15 30 1.50 0.00 70.00abcd 4.13cdef 16 10 1.50 0.30 25.00f 5.30bc 17 20 1.50 0.30 90.91a 4.08cdef 18 30 1.50 0.30 35.71ef 2.93ef 注：a ~ f表示生根率和平均根长指标下数据之间的显著性，带有相同字母表示差异不显著，反之则表示差异显著。Notes: a−f indicate the significance between the data under the rooting rate and average root length index, with the same letter indicates that the difference is not significant, and vice versa indicates that the difference is significant. 通过显著性分析得出：蔗糖浓度对于生根影响最大，并且20 mg/L的蔗糖对 J39的生根率和平均根长的影响都达到显著水平。根据表9可以发现：J39在11号培养基和17号培养基中生根率较高，分别为88.89%和90.91%，差异不显著。但为了得到更多生根苗，17号培养基最为适合。故得出17号培养基是诱导不定根的最佳培养基，即1/2 MS + 20 g/L 蔗糖 + 1.50 mg/L IBA + 0.30 mg/L NAA + 8 g/L 琼脂。
3. 结论与讨论
本研究以J39为研究对象，系统地探究了不同接种方式、基本培养基种类、植物生长调节剂种类和浓度配比对离体叶片诱导不定芽再生的影响，进而还探索了J39幼苗的最佳扩繁和生根体系，建立了完整的同源验证培育体系。
叶片正放是J39离体叶片诱导不定芽的最佳接种方式，这可能与叶片结构有关。叶背面具有大量气孔结构，其细胞排列比较疏松，叶正面气孔结构较少，因而其细胞结构较背面紧凑。因此，叶背面接触到培养基时，其更容易吸收培养基中的营养成分，促进材料的再分化，从而产生比叶正面接触培养基更多的不定芽。
经过方差分析和多重比较得出，基本培养基1/2 MS对J39叶片再生不定芽的影响最大，且达到显著水平。前人[4]研究发现，高盐培养基适合生长较快的木本植物，枣树属于慢生树种，适当降低盐的浓度对其组织生长分化有利。肖蓉等[23]在探索辣椒枣（Z. jujuba ‘Lajiaozao’）的最优再生体系时得出，1/2 MS相较于WPM更适合其叶片再生，本研究得出与其相似的结论。周瑞金[24]得出WPM最适合‘黄骅冬枣’直接再生不定芽且分化质量较高，这可能与基因型的不同有关。
植物生长调节剂中对J39叶片再生影响最大的是细胞分裂素6-BA，而在冬枣[25]、黄骅冬枣[4]、骏枣[17]以及哈密大枣（Z. jujuba ‘Hamidazao’）[26]的叶片再生研究中认为再生不定芽的最适激素是TDZ，这种结果说明不同的品种对于不同的激素可能反应不同，并且不同生长阶段对于激素的要求也不同。此外，本研究只探讨了单个激素对于J39叶片再生的影响效果，没有探究激素之间的互作。激素之间的互作对于材料的影响效果可能比单个激素的更大，所以后者可以在本研究的基础上进一步研究最适激素配比，使不定芽再生培养基配方得到优化，以期得到更高的离体叶片再生效率。经过以上因素的研究，最终得出J39离体叶片的最佳再生体系为1/2MS培养基 + 1.00 mg/L TDZ + 0.50 mg/L 6-BA + 0.20 mg/L NAA + 30 g/L 麦芽糖 + 6 g/L琼脂。
在探索J39幼苗扩繁体系的实验中发现：糖源对其影响很大，幼苗在含有蔗糖的培养基中，基部会出现褐化现象，而在含麦芽糖的培养基中没有褐化，且在麦芽糖的培养基中幼苗的扩繁系数高于在蔗糖的培养基，故得出麦芽糖是J39幼苗扩繁培养的最适糖源。通过正交试验分析得出，植物生长调节剂对J39幼苗扩繁的影响大小顺序为6-BA > NAA > IBA，最终得到J39幼苗最佳扩繁体系为MS + 20 g/L麦芽糖 + 6 g/L琼脂 + 3.00 mg/L 6-BA + 0.10 mg/L NAA。
在生根实验中观察发现：有不定根发生的J39无菌苗株高一般不低于4 cm，此外还发现无菌苗基部愈伤诱导越多，越不利于不定根的发生，可能是不定根的分化与愈伤的生长状态有关，这一结论和李静等[27]得出的相类似。故进行生根培养时需要把无菌苗基部愈伤去除，让其更好地诱导不定根。通过显著性分析得出：无菌苗在20 g/L的蔗糖培养基中生根率显著高于在10 g/L和30 g/L的蔗糖培养基。激素IBA对J39无菌苗生根影响最大，与刘晓光等[28]探索山杏（Armeniaca sibirica）组培苗的生根体系所得结论一致。本研究还发现IBA与NAA的搭配使用对J39的生根效果比单独使用IBA或NAA更好，最后得出J39无菌苗最佳生根体系为1/2 MS + 20 g/L蔗糖 + 8 g/L琼脂 + 1.50 mg/L IBA + 0.30 mg/L NAA。
在探索J39离体叶片高效再生体系时，本实验没有对最适苗龄以及最佳暗培养时间进行系统的研究，且在叶片再生培养过程中发现，叶片再生出不定芽的周期较长，甚至部分叶片诱导出大量芽点之后并没有继续再生为不定芽，可能是由于培养皿中的营养成分供应不足，导致不定芽的发生较慢，因此可以尝试采用组培瓶进行叶片再生实验，加大瓶中培养基的量，以便能更好地满足材料在后期生长发育的需求。因此，后者可以从这几个方面进行更深入的探究，以期获得生长周期更短、再生效率更高的J39离体叶片再生体系。
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图 1 J39离体叶片在3种培养基中不同接种方式直接再生不定芽示意图
A ~ C. 离体叶片分别在2、11、12号培养基中的初始诱导状；D ~ E. 叶片分别在2、11、12号培养基中暗培养14 d后的状态；G ~ I. 叶片分别在2、11、12号培养基以及2种接种方式下分化出不定芽，其中红箭头所指为叶片正放，其他为反放。A−C, the initial induction state of detached leaves in medium 2, 11, and 12; D−E, the state of leaves after dark culture in medium 2, 11, and 12 for 14 days; G−I, the leaves are differentiated into adventitious buds on medium 2, 11, and 12 under the two inoculation methods: the red arrow points to the leaf being placed upright and the other is reversed.
Figure 1. Schematic diagram of adventitious buds directly regenerated from J39 detached leaves in three media with different inoculation methods
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图 2 无菌苗在3种糖源的扩繁体系中生长情况
A ~ B. 糖源为20 g/L蔗糖；C ~ D. 糖源为15 g/L麦芽糖和7.50 g/L蔗糖；E ~ F. 糖源为20 g/L麦芽糖。A−B, the source of sugar is 20 g/L sucrose; C−D, the sugar source is 15 g/L maltose and 7.50 g/L sucrose; E−F, the source of sugar is 20 g/L maltose.
Figure 2. Growth condition of sterile seedlings in the propagation system of three glycogens
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图 3 无菌苗的生根情况
A. 无菌苗接种初期的基部形态；B. 粗壮根；C. 纤细根；D. 根上长出须根。A, the basal morphology at the initial stage of inoculation; B, thick roots; C, slender roots; D, fibrous roots growing on the roots.
Figure 3. Rooting situation of aseptic seedlings
表 1 离体叶片不定芽诱导再生正交试验
Table 1 Orthogonal test of induction of adventitious bud regeneration from detached leaves
水平
Level培养基种类
Type of medium （A）TDZ（B）/（mg·L−1） NAA（C）/（mg·L−1） 6-BA（D）/（mg·L−1） IBA（E）/（mg·L−1） 1 1/2 MS 0.00 0.00 0.00 0.00 2 MS 0.50 0.20 0.50 0.20 3 WPM 1.00 0.40 1.00 0.40 
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表 2 离体叶片不定芽诱导再生正交试验因素水平
Table 2 Orthogonal test factor level of adventitious bud induction and regeneration from detached leaves
水平
Level糖源
Glycogen （a）6-BA（b）/（mg·L−1） IBA（c）/（mg·L−1） NAA（d）/（mg·L−1） 1 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 1.00 0.00 0.00 2 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L 2.00 0.40 0.10 3 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 3.00 0.80 0.20
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表 3 不同接种方式对J39叶片再生的影响
Table 3 Effects of different inoculation methods on leaf regeneration of ‘Jingzao 39’
试验号
Test No.接种方式
Vaccination method接种叶片数
Number of inoculated leaf平均芽数
Average number of bud2 叶正面朝上（正）
Leaf face up (positive)12 2.31 叶背面朝上（反）
Leaf dorsal facing up (reverse)12 0.52 11 叶正面朝上（正）
Leaf face up (positive)12 1.93 叶背面朝上（反）
Leaf dorsal facing up (reverse)12 0.67 12 叶正面朝上（正）
Leaf face up (positive）12 4.79 叶背面朝上（反）
Leaf dorsal facing up (reverse)12 0.71
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表 4 离体叶片不定芽诱导再生正交试验结果
Table 4 Orthogonal test results of adventitious bud induced regeneration of detached leaves
试验号
Test No.A B/(mg·L−1) C/(mg·L−1) D/(mg·L−1) E/(mg·L−1) 平均芽数
Average number of bud1 1/2 MS 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 2 1/2 MS 0.50 0.20 0.50 0.20 2.24 3 1/2 MS 1.00 0.40 1.00 0.40 0.33 4 MS 0.00 0.00 0.50 0.20 0.00 5 MS 0.50 0.20 1.00 0.40 0.00 6 MS 1.00 0.40 0.00 0.00 0.00 7 WPM 0.00 0.20 0.00 0.40 0.00 8 WPM 0.50 0.40 0.50 0.00 0.00 9 WPM 1.00 0.00 1.00 0.20 0.23 10 1/2 MS 0.00 0.40 1.00 0.20 0.18 11 1/2 MS 0.50 0.00 0.00 0.40 2.22 12 1/2 MS 1.00 0.20 0.50 0.00 4.67 13 MS 0.00 0.20 1.00 0.00 0.00 14 MS 0.50 0.40 0.00 0.20 0.46 15 MS 1.00 0.00 0.50 0.40 0.08 16 WPM 0.00 0.40 0.50 0.40 0.00 17 WPM 0.50 0.00 1.00 0.00 0.04 18 WPM 1.00 0.20 0.00 0.20 0.00 K1 9.64 0.18 2.58 2.68 4.71 K2 0.54 4.97 6.91 6.99 3.11 K3 0.27 5.31 0.97 0.78 2.64 x1 1.60 0.03 0.43 0.45 0.78 x2 0.09 0.83 1.15 1.17 0.52 x3 0.05 0.89 0.16 0.13 0.44 R 1.56 0.86 0.99 1.03 0.34 注：Ki = Σ（该因素在i水平下的平均芽数），xi = Ki/n（n = 该水平的重复数），R为极差。下同。Note: Ki = Σ (the average number of buds of the factor at the i level), xi = Ki/n (n = the number of replicates at this level), R means range. The same below.
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表 5 不同因素对J39不定芽再生数影响的极差分析
Table 5 Range analysis of effects of different factors on the regeneration number of J39 adventitious buds
因子
Factor水平1
Level 1水平2
Level 2水平3
Level 3R A 1.61 0.09 0.05 1.56 B 0.03 0.83 0.89 0.86 C 0.43 1.15 0.16 0.99 D 0.45 1.17 0.13 1.03 E 0.78 0.52 0.44 0.34
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表 6 不同因素对J39不定芽再生数影响的方差分析
Table 6 Variance analysis of effects of different factors on the regeneration number of J39 adventitious buds
因子 Factor SS df MS F P A 9.48 2 4.74 4.77* 0.05 B 2.75 2 1.37 1.38 0.31 C 3.14 2 1.57 1.58 0.27 D 3.37 2 1.69 1.70 0.25 E 0.39 2 0.20 0.20 0.83 误差 Error 6.95 7 1.00 总计 Total 26.08 17 注：F值 > F0.05表示显著差异，数值右上角标注“*”。Notes: F value > F0.05 means significant difference, with a “*” in the upper right corner of the value.
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表 7 3种基本培养基对J39不定芽再生数影响的LSD多重比较
Table 7 Multiple comparisons of LSD of the effects of 3 basic media on the regeneration number of J39 adventitious buds
基本培养基
Basic medium基本培养基
Basic medium平均值差值
Mean difference标准误
Standard error显著性
Significance95% 置信区间
95% confidence interval下限
Lower limit上限
Upper limit1/2 MS MS 1.52* 0.61 0.03 0.22 2.81 WPM 1.56* 0.61 0.02 0.27 2.86 MS 1/2 MS −1.52* 0.61 0.03 −2.81 −0.22 WPM 0.05 0.61 0.94 −1.25 1.34 WPM 1/2 MS −1.56* 0.61 0.02 −2.86 −0.27 MS −0.05 0.61 0.94 −1.34 1.25 注：*显著性水平为0.05。Note: * means the significance level of 0.05.
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表 8 J39幼苗扩繁正交试验结果
Table 8 Orthogonal test results of J39 seedling proliferation
试验号
Test No.a b/（mg·L−1） c/（mg·L−1） d/（mg·L−1） 分枝率
Branching rate/%1 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 1.00 0.00 0.00 47.37 2 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 2.00 0.40 0.10 85.00 3 蔗糖20.00 g/L Sucrose 20.00 g/L 3.00 0.80 0.20 68.42 4 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L
Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L1.00 0.40 0.20 40.00 5 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L
Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L2.00 0.80 0.00 56.52 6 麦芽糖15.00 g/L + 蔗糖7.50 g/L
Maltose 15.00 g/L + sucrose 7.50 g/L3.00 0.00 0.10 80.00 7 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 1.00 0.80 0.10 56.52 8 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 2.00 0.00 0.20 78.26 9 麦芽糖20.00 g/L Maltose 20.00 g/L 3.00 0.40 0.00 71.43 K1 200.79 143.89 205.63 175.32 K2 176.52 219.78 196.43 221.52 K3 206.21 219.85 181.46 186.68 x1 66.93 47.96 68.54 58.44 x2 58.84 73.26 65.48 73.84 x3 68.74 73.28 60.49 62.23 R 9.90 25.32 8.05 15.40
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表 9 无菌苗在不同培养基中不定根的诱导情况
Table 9 Adventitious root induction of aseptic seedlings on different media
培养基号
Medium No.蔗糖
Sucrose/（g·L−1）IBA/（mg·L−1） NAA/（mg·L−1） 生根率
Rooting rate/%平均根长
Average root length/cm1 10 0.50 0.00 62.50cd 3.68def 2 20 0.50 0.00 66.67bcd 5.03cd 3 30 0.50 0.00 60.00cd 2.73f 4 10 0.50 0.30 81.82abc 2.74f 5 20 0.50 0.30 72.73abcd 3.58def 6 30 0.50 0.30 75.00abcd 4.24cdef 7 10 1.00 0.00 55.56de 4.80cd 8 20 1.00 0.00 80.00abc 4.22cdef 9 30 1.00 0.00 72.73abcd 4.43cde 10 10 1.00 0.30 63.64cd 4.26cdef 11 20 1.00 0.30 88.89ab 5.25c 12 30 1.00 0.30 63.64cd 2.84f 13 10 1.50 0.00 61.54cd 6.83ab 14 20 1.50 0.00 81.82abc 7.23a 15 30 1.50 0.00 70.00abcd 4.13cdef 16 10 1.50 0.30 25.00f 5.30bc 17 20 1.50 0.30 90.91a 4.08cdef 18 30 1.50 0.30 35.71ef 2.93ef 注：a ~ f表示生根率和平均根长指标下数据之间的显著性，带有相同字母表示差异不显著，反之则表示差异显著。Notes: a−f indicate the significance between the data under the rooting rate and average root length index, with the same letter indicates that the difference is not significant, and vice versa indicates that the difference is significant.
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-
[1] Liu M J, Cheng C Y. A taxonomy study on the genus Ziziphus[J]. Acta Horticulturae, 1995, 390: 161−165.
[2] Liu M J. Chinese jujube: botany and horticulture[J]. Horticultural Review, 2006, 32: 229−298.
[3] 何业华, 熊细满, 谢碧霞, 等. 枣树组织培养愈伤组织诱导的研究[J]. 中南林学院学报, 1997, 17(1): 13−18. He Y H, Xiong X M, Xie B X, et al. Inducement of calluses in the tissue culture of jujube trees[J]. Journal of Central South Forestry College, 1997, 17(1): 13−18.
[4] 周瑞金, 刘孟军. 枣离体叶片高效再生植株的研究[J]. 园艺学报, 2006, 33(3): 625−628. doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.2006.03.034 Zhou R J, Liu M J. Establishment of high-efficient in vitro leaf regeneration system in Chinese jujube[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2006, 33(3): 625−628. doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.2006.03.034
[5] 李云, 王宇, 田砚亭, 等. 赞皇大枣叶片再生植株的初步研究[J]. 核农学报, 2003, 17(3): 187−190. doi: 10.3969/j.issn.1000-8551.2003.03.006 Li Y, Wang Y, Tian Y T, et al. A preliminary study on the plant regeneration from leaves of Zanhuang jujube[J]. Acta Agriculturae Nu-cleatae Sinica, 2003, 17(3): 187−190. doi: 10.3969/j.issn.1000-8551.2003.03.006
[6] 胡影, 崔建国, 施满, 等. 枣叶片愈伤组织的诱导和器官分化[J]. 甘肃林业科技, 1993, 18(4): 18−19. Hu Y, Cui J G, Shi M, et al. Induction and organ differentiation of calluses in jujube leaves[J]. Gansu Forestry Science and Technology, 1993, 18(4): 18−19.
[7] 张春雨. 黑果腺肋花楸离体叶片再生体系建立与原生质体分离培养研究[D]. 长春: 吉林农业大学, 2005. Zhang C Y. Study on the establishment of ex vivo leaf regeneration system and protoplast isolation and culture of black fruit glandular rib rowan[D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2005.
[8] 李晓青, 张晓申. 灰枣试管苗移栽技术研究[J]. 河南农业科学, 2007, 36(8): 97−98. doi: 10.3969/j.issn.1004-3268.2007.08.032 Li X Q, Zhang X S. Research on transplanting technology of gray jujube test tube seedlings[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2007, 36(8): 97−98. doi: 10.3969/j.issn.1004-3268.2007.08.032
[9] 陈宗礼, 延志莲, 齐龙. 枣叶片离体培养再生植株[J]. 植物生理学通讯, 1996, 32(1): 27−28. Chen Z L, Yan Z L, Qi L. Plantlet regeneration from leaves cultures of Ziziphus jujuba[J]. Plant Physiology Communications, 1996, 32(1): 27−28.
[10] 孙清荣, 孙洪雁, 郑红军, 等. 酸枣叶片不定植株的诱导[J]. 果树科学, 2000(1): 48−51. Sun Q R, Sun H Y, Zheng H J, et al. Study on the plant regeneration from leaves of sour jujube (Zizyphus spinosus Hu.)[J]. Journal of Fruit Science, 2000(1): 48−51.
[11] 王玖瑞, 刘孟军, 代丽. 枣树组织培养研究进展[J]. 果树学报, 2002(5): 336−339. doi: 10.3969/j.issn.1009-9980.2002.05.011 Wang J R, Liu M J, Dai L. Advances in tissue culture of Chinese jujube[J]. Journal of Fruit Science, 2002(5): 336−339. doi: 10.3969/j.issn.1009-9980.2002.05.011
[12] 陈宗礼, 延志莲, 薛皓, 等. 沾化冬枣叶片培养和植株再生[J]. 植物生理学通讯, 2002, 38(6): 584. Chen Z L, Yan Z L, Xue H, et al. In vitro culture of leaves and plantlet regeneration of Ziziphus jujuba var. zhanhua-dongzao[J]. Plant Physiology Communications, 2002, 38(6): 584.
[13] 胡桂兵, 陈大成, 郑启发, 等. 抗生素对台湾青枣茎段和愈伤组织生长的影响[J]. 华南农业大学学报, 2001, 22(2): 21−23. doi: 10.3969/j.issn.1001-411X.2001.02.007 Hu G B, Chen D C, Zheng Q F, et al. Effect of antibiotics on growth of stem segments and callus of ber (Ziziphus mauritiana Lam.)[J]. Journal of South China Agricultural University, 2001, 22(2): 21−23. doi: 10.3969/j.issn.1001-411X.2001.02.007
[14] 何振艳, 王玉国, 石武良, 等. 山西特有品种梨枣叶片的组织培养及植株再生[J]. 植物生理学通讯, 2002, 38(5): 457. He Z Y, Wang Y G, Shi W L, et al. Tissue culture and plant regeneration of leaves of Lizao endemic variety in Shanxi[J]. Plant Physiology Communications, 2002, 38(5): 457.
[15] 尹美强, 王玉国, 温银元, 等. 梨枣叶片和茎段再生体系的建立[J]. 西北植物学报, 2005, 25(10): 1954−1959. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2005.10.005 Yin M Q, Wang Y G, Wen Y Y, et al. The construction of the regeneration system for the Chinese date cultivar Lizao to regenerate from its leaves and stems[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2005, 25(10): 1954−1959. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2005.10.005
[16] 陈宗礼, 张向前, 齐向英, 等. 枣树叶片愈伤组织培养与再生植株的研究[J]. 福建林业科技, 2007, 34(3): 23−27. doi: 10.3969/j.issn.1002-7351.2007.03.006 Chen Z L, Zhang X Q, Qi X Y, et al. Callus culture from leaves and plant regeneration of jujube trees[J]. Journal of Fujian Forestry Science and Technology, 2007, 34(3): 23−27. doi: 10.3969/j.issn.1002-7351.2007.03.006
[17] 王国平, 李晓梅, 陈秋芳. 枣不定芽再生体系的研究[J]. 中国农学通报, 2006, 22(4): 281−283. doi: 10.3969/j.issn.1000-6850.2006.04.074 Wang G P, Li X M, Chen Q F. Study on jujube adventitious bud regeneration system[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2006, 22(4): 281−283. doi: 10.3969/j.issn.1000-6850.2006.04.074
[18] 黄健, 马锋旺, 樊军锋, 等. 枣树离体叶片不定芽再生体系建立的研究[J]. 西北植物学报, 2006, 26(5): 942−948. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2006.05.012 Huang J, Ma F W, Fan J F, et al. In vitro plant regeneration with adventitious buds of Zizyphus jujuba leaves[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2006, 26(5): 942−948. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2006.05.012
[19] Ma C H, Ye X, Chen Y H. Anatomical observations of adventitious bud regenetation from leaf explants of Ziziphus jujuba Mill. ‘Huizao’[J]. Horticulture Environment and Biotechnology, 2012, 53(4): 316−319. doi: 10.1007/s13580-012-0081-8
[20] 潘青华, 白金, 王保强. 枣鲜食优质新品种‘京枣39’[J]. 中国果树, 2003(4): 3−4. doi: 10.3969/j.issn.1000-8047.2003.04.002 Pan Q H, Bai J, Wang B Q. New high-quality jujube variety ‘Jingzao 39’[J]. China Fruits, 2003(4): 3−4. doi: 10.3969/j.issn.1000-8047.2003.04.002
[21] 程佑发, 安黎哲, 浦铜良, 等. 枣愈伤组织诱导和再生植株[J]. 西北植物学报, 2000, 20(3): 364−369. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2000.03.008 Cheng Y F, An L Z, Pu T L, et al. Induction of callus and plant regeneration of Zizyphus jujuba Mill.[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2000, 20(3): 364−369. doi: 10.3321/j.issn:1000-4025.2000.03.008
[22] 王慧瑜, 马锋旺, 张晓申, 等. 鸡心枣试管苗叶片再生植株的研究[J]. 中国南方果树, 2007, 36(4): 48−50. doi: 10.3969/j.issn.1007-1431.2007.04.024 Wang H Y, Ma F W, Zhang X S, et al. Study on leaf regeneration plants of Jixinzao test tube seedlings[J]. South China Fruits, 2007, 36(4): 48−50. doi: 10.3969/j.issn.1007-1431.2007.04.024
[23] 肖蓉, 王国平, 李春燕, 等. 辣椒枣试管苗叶片再生植株研究[J]. 山西农业科学, 2012, 40(3): 193−196, 216. doi: 10.3969/j.issn.1002-2481.2012.03.02 Xiao R, Wang G P, Li C Y, et al. Research of leaf regeneration plant in Ziziphus jujuba Mill. Lajiaozao test tube seedlings[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2012, 40(3): 193−196, 216. doi: 10.3969/j.issn.1002-2481.2012.03.02
[24] 周瑞金. 枣(Ziziphus jujuba Mill.)离体叶片高效再生体系的建立[D]. 保定: 河北农业大学, 2004. Zhou R J. Establishment of an efficient regeneration system for ex vivo leaves of Ziziphus jujuba Mill.[D]. Baoding: Agricultural University of Hebei, 2004.
[25] 宁强, 刘晓光, 刘孟军. 冬枣叶片愈伤组织诱导研究[J]. 河北林果研究, 2008, 23(4): 348−352. doi: 10.3969/j.issn.1007-4961.2008.04.002 Ning Q, Liu X G, Liu M J. Callus inducement in tissue culture of jujube[J]. Hebei Forest Fruit Research, 2008, 23(4): 348−352. doi: 10.3969/j.issn.1007-4961.2008.04.002
[26] 徐明, 代培红, 罗淑萍, 等. 哈密大枣叶片不定芽再生体系研究[J]. 新疆农业大学学报, 2014, 37(3): 185−190. doi: 10.3969/j.issn.1007-8614.2014.03.003 Xu M, Dai P H, Luo S P, et al. Study on adventitious bud regeneration system of Hami-Dazao leaves[J]. Journal of Xinjiang Agricultural University, 2014, 37(3): 185−190. doi: 10.3969/j.issn.1007-8614.2014.03.003
[27] 李静, 张景臣, 郭伟, 等. 毛白杨叶片愈伤组织的诱导、芽的分化及不定根的再生[J]. 山东林业科技, 2007, 168(1): 52−53. doi: 10.3969/j.issn.1002-2724.2007.01.020 Li J, Zhang J C, Guo W, et al. Callus induction, bud differentiation and adventitious root regeneration from leaves of Populus tomentosa[J]. Shandong Forestry Science and Technology, 2007, 168(1): 52−53. doi: 10.3969/j.issn.1002-2724.2007.01.020
[28] 刘晓光, 单梅华, 苏帅, 等. 山杏组培苗生根培养基优化及移栽[J]. 分子植物育种, 2020, 18(6): 1999−2005. doi: 10.13271/j.mpb.018.001999 Liu X G, Shan M H, Su S, et al. Transplanting and optimization of rooting medium for apricot tissue cultured seedlings[J]. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(6): 1999−2005. doi: 10.13271/j.mpb.018.001999
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