Screening and characteristics of phosphorus solubilizing bacteria in the rhizosphere of Parashorea chinensis plantation
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摘要:目的 望天树是我国特有的濒危一级保护树种，人工林栽培是扩大其种群数量的重要手段，磷素供应是林木生长发育的主要影响因子，而溶磷菌在磷转化中起到重要作用。本研究从不同林龄望天树人工林根际土壤中筛选高效溶磷细菌，探究其在不同培养条件下的溶磷特点，以期为望天树微生物肥料的开发与应用提供菌种资源和理论依据。方法 （1）利用无机磷固体培养基从不同林龄望天树林分根际土中分离筛选溶磷细菌，挑选4株高效溶磷菌，结合生理生化试验和16SrDNA基因序列对其进行鉴定。（2）通过检测溶磷动态，研究溶磷细菌溶磷量与菌液pH的相关关系。（3）采用单因素试验探究高效溶磷菌在不同环境因子和营养因子下的溶磷特性。结果 （1）共分离筛选出18株溶磷菌，其中溶磷能力较强菌株为P4、P8、P12和P30（溶磷量分别为552.87、559.78、548.53、598.89 mg/L）。（2）经过形态观察、生理生化鉴定及系统发育树分析，菌株P8鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌，P4和P12鉴定为洋葱伯克霍尔德菌，P30鉴定为蜡状芽孢杆菌。（3）P4、P8、P12和P30菌株的溶磷量与培养液pH值之间均存在极显著的负相关性（P < 0.01），相关系数分别为−0.995、−0.990、−0.985和−0.997。（4）单因素试验结果显示：各溶磷菌株在温度为30 ~ 35 ℃，pH为5.5 ~ 8.5，NaCl质量分数为0 ~ 2.5%，碳（C）源为蔗糖、乳糖和葡萄糖，氮（N）源为草酸铵和硫酸铵时，表现出较好的溶磷效果；菌株P30、P12和P4最适C∶N为20∶1，P8最适合C∶N为40∶1；菌株P12最佳磷源为FePO4，P30、P8和P4最佳磷源均为Ca3(PO4)2。结论 不同培养条件会显著影响溶磷细菌的溶磷能力，筛选得到的4株高效溶磷菌具有良好的溶磷能力，且能够溶解多种难溶性无机磷酸盐，可用于望天树专用微生物肥料的研发，具有良好的应用潜力。Abstract:Objective The Parashorea chinensis is an endemic and endangered species in China, and it is classified as a class Ⅰ protected wild plant. Plantation cultivation is an important means to expand its populations. Phosphorus (P) supply is a major influence on tree growth and development, and P dissolving bacteria plays an important role in P transformation. This research aimed to screen high-efficient phosphate-solubilizing bacteria (PSB) from the rhizosphere soil of P. chinensis plantations of different ages, and explore its P-solubilizing characteristics, so as to provide bacterial resources and culture conditions for the development of microbial fertilizer suitable of P. chinensis.Method (1) PSB was isolated and screened from the rhizosphere soil of P. chinensis in different ages by inorganic P solid medium. The physiological and biochemical tests and 16S rDNA gene sequence were used to further identify 4 strains of PSB. (2) The relationship between the amount of P dissolved by PSB and the pH of the bacterial solution was studied by detecting the dynamics of P solubilization. (3) A single factor experiment was conducted to investigate the P-solubilizing characteristics of high efficiency PSB under different environmental and nutritional factors.Result (1) A total of 18 strains of phosphorus solubilizing bacteria were isolated and screened, and the 4 strains with the strongest P-solubilizing capacity were P4, P8, P12 and P30 (P-solubilizing capacity was 552.87, 559.78, 548.53 and 598.89 mg/L, respectively). (2) Strain P8 was identified as Burkholderia gladioli, P4 and P12 as Burkholderia cepacia, and P30 as Bacillus cereus by physiological, biochemical identification and combined with phylogenetic tree analysis. (3) There was a highly significant (P < 0.01) negative correlation between the pH of the cultures and the amount of phosphorus dissolved by the P4, P8, P12 and P30 strains, with correlation coefficients of −0.995, −0.990, −0.985 and −0.997, respectively. (4) The results of single factor test showed that the PSBs had the preferable P-solubilizing effects at a temperature of 30−35 ℃, the pH of 5.5−8.5, the NaCl mass fraction was 0−2.5%, the carbon (C) sources were sucrose, lactose and glucose, and the nitrogen (N) sources were ammonium oxalate and ammonium sulfate. The optimal C∶N of strain P30, P12 and P4 was 20∶1, and that of P8 was 40∶1. The optimal P source for strain P12 was FePO4, and Ca3(PO4)2 for P30, P8 and P4.Conclusion The P-solubilizing ability of PSBs can be significantly affected under different culture conditions. The 4 strains of high efficiency PSB have preferable P-solubilizing ability, which can dissolve a variety of insoluble inorganic phosphates. Therefore, it is expected to provide germplasm resources for the development of high-efficiency microbial phosphate fertilizers with a good application potential.
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磷素是继氮素之外植物必需的第二大元素，在植物的光合作用和生理生化过程中发挥关键作用[1]。磷可以促进植物根系的发育，提高植物的水分利用效率和抗逆性[2]。缺磷会导致植物生长缓慢、产量降低和植株矮小。据报道，我国约2/3的耕地缺乏有效磷，土壤中95%的磷为无效态磷，难以被植物直接吸收利用[3]。人工施入土壤中的磷肥，大部分与Al3+、Ca2+、Fe3+等金属离子结合形成难溶性磷酸盐，导致当季作物磷肥利用率仅为5% ~ 25%[4]。在植物的根际土壤中，存在着大量不同种类的微生物，其中一类微生物可将难溶性磷酸盐中的磷释放出来，供植物吸收利用，这类微生物被称为解磷菌或溶磷菌[5]。目前已报道的溶磷菌主要包括细菌、放线菌和真菌。然而，不同溶磷菌由于自身遗传特性、生长环境等因素的影响，其溶磷能力差异较大[6-7]。溶磷菌的溶磷机制复杂多样，主要包括有机酸酸解作用、酶解作用和释放H+等，且不同菌株间存在区别[8]。部分溶磷菌还能分泌植物激素、铁载体等促生物质，使植物根际土壤环境得以改善，从而促进植物生长[9]。近年来，从林木根际筛选并利用溶磷菌提高其对磷素的吸收已有较多实践，国内外研究者们已从杉木（Cunninghaimia lanceolata）[10]、腺牧豆树（Prosopis glandulosa）[11]、马尾松（Pinus massoniana）[12]、巨尾桉（Eucalyptus grandis）[13]、红树林（Mangrove）[14]、降香黄檀（Dalbergia odorifera）[15]等林木根际土壤中筛选得到多种溶磷效果显著的高效菌株。Heredia-Acun等[16]对墨西哥特拉洛克山假球松（Pinus pseudostrobus）根际土进行促生菌的分离筛选，共获得10株能产植物生长激素且溶磷效果良好的细菌。刘辉等[17]采用从杨树（Populus deltoides）人工纯林中分离获得的根际高效解磷细菌JW-JS1接种杨树幼苗，表现出明显的促生效果。从林木根系土壤中获得解磷细菌是活化土壤难溶性磷、提高磷素利用率的有效途径之一。
望天树（Parashorea chinensis）是龙脑香科（Dipterocarpaceae）柳安属（Parashorea）植物，属于国家一级重点保护珍稀树种，同时也是热带雨林的标志性树种，主要产地位于云南南部和广西田阳、那坡和龙州等地[18-20]。望天树具有较高的研究价值和经济价值，可作为造船、建筑、乐器等制造的优质木材，具有广阔的应用前景。但其幼苗幼树根系发育缓慢，长势差、生长迟缓等问题未得到有效解决，这可能与磷素缺乏有关，而加大磷肥的施用又易引起环境污染、成本增加等问题。而溶磷菌肥可通过提高植物对磷素的吸收起到良好的促生作用，从而减少化学磷肥的施用，是一种绿色高效的新型微生物肥料[21-22]。高效溶磷菌是溶磷菌肥制备的重要前提，因此，筛选高效溶磷菌对提高土壤有效磷含量，改善植物根系磷素营养具有重大意义。通过优化菌株的培养条件，可提高菌株的溶磷量及对不同环境的适应能力。然而，溶磷菌将难溶性磷转化为可溶性磷是一个非常复杂的过程，菌株的溶磷能力除了受到其本身遗传特性的影响外，外界的营养物质如碳（C）源、氮（N）源等因素的变化，会改变溶磷菌的生长速度和代谢方式，进而影响其溶磷能力[23-24]。了解溶磷菌在不同营养环境下的溶磷性能是获取高效溶磷菌的基础，有利于加快菌肥的研制步伐。本研究以不同造林年份的望天树根际土壤为材料，拟分离筛选出具有高效溶磷能力的菌株，探究其在不同培养条件下的溶磷特性，旨在为望天树菌肥的开发利用提供菌株资源，同时为其进一步在望天树育苗及人工林栽培的田间应用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 研究区概况
土壤样品采自广西南宁树木园（22°40′N，108°21′E），海拔80 ~ 220 m。样地属于亚热带季风气候，土壤类型为赤红壤。全年平均气温21.6 ℃，年平均降水量1340 mm。于2019年9月分别采集3个不同林龄（1、2和41年）的望天树根际土壤，林下植被主要有五节芒（Miscanthus floridulus）、铁芒箕（Dicranopteris dichotoma）、棕叶狗尾巴草（Setaria palmifolia）、玉叶金花（Mussaenda pubescens）、悬钩子（Rubus corchorifolius）、牛白藤（Hedyotis hedyotidea）等，试验地的林分特征与理化性质见表1。
表 1 试验地林分特征与土壤理化性质Table 1. Stand characteristics and soil physicochemical properties of the experimental sites林龄/a
Stand age/year平均树高
Average tree height/m平均胸径（地径）
Average DBH
(ground diameter)/cmpH 含量 Content 全氮
Total N/(g·kg−1)全磷
Total P/(g·kg−1)全钾
Total K/(g·kg−1)氨态氮
Ammoniacal N/(mg·kg−1)有效磷
Available P/(mg·kg−1)速效钾
Available K/(mg·kg−1)1 1.72 2.28 4.53 1.52 0.32 9.44 6.66 3.58 40.47 2 2.20 3.16 3.49 2.06 0.23 6.60 6.12 5.10 72.74 41 40.60 48.70 3.69 2.04 0.78 11.90 3.13 2.63 61.19 1.2 土样采集
在1、2、41年生的望天树人工林内各设置3个标准地（20 m × 20 m），在各林龄的每个标准地内按照“Z”型曲线布点选择5株平均木。望天树幼树的根系多分布于5 ~ 20 cm的土层深度，而41年生望天树根系多分布于5 ~ 40 cm土层深度。此外，5 ~ 20 cm土层根际土壤微生物活性较高且种类丰富，故铲去表层土后，取5 ~ 20 cm望天树根系，用“抖落法”收集根际土壤。将各林龄不同标准地内的5个采样点的土壤样品分别混合均匀，装于无菌袋中，放入冰盒，带回实验室4 ℃保存，一周内完成溶磷菌的初步分离和筛选。
1.3 培养基
无机磷培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)SO4 0.5 g，酵母浸粉0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.022 g，Ca3(PO4)2 25.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0 ~ 7.5。
LB培养基：酵母浸粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0 ~ 7.5。在上述的2种液体培养基中添加15 g琼脂即可得到相应的固体培养基。
1.4 溶磷菌的分离筛选
1.4.1 溶磷菌株的分离、初筛
称取各样地的新鲜土壤10 g置于锥形瓶中，加入90 mL无菌水，摇床（28 ℃，180 r/min）振荡30 min，制成土壤悬液。采用稀释平板法将悬液逐级稀释至10−2、10−3、10−4、10−5，分别吸取10−3 ~ 10−5 3个梯度的稀释液100 μL涂布于无机磷固体培养基上，每个梯度3次重复，30 ℃培养3 ~ 7 d。挑取透明圈大、澄清且边缘整齐的菌落用连续划线法进一步分离纯化并观察记录菌落特征。采用点接法将纯化后的溶磷菌株接种到无机磷固体培养基平板上，每处理3次重复，30 ℃下培养5 d，测定溶磷圈直径（D）与菌落直径（d），根据D/d的比值大小初步定性判断菌株的溶磷效果。
1.4.2 摇瓶复筛
将待测溶磷菌接种到LB液体培养基中30 ℃振荡培养24 h制成种子液，按2%的接种量将菌悬液接入已灭菌（121 ℃，20 min）的无机磷液体培养基中，以不接菌作为对照，每处理3次重复。摇床培养（30 ℃，180 r/min）7 d，培养液10 000 r/min离心15 min以去除细菌菌体，采用钼锑抗比色法测定培养液中的可溶性磷含量[25]，接菌培养液中的有效磷含量与不接菌对照培养液中的有效磷含量的差值，即为菌株溶磷量，本文以质量浓度表示，并通过溶磷量计算溶磷率[26]。
1.5 菌种鉴定
1.5.1 细菌形态特征和生理生化特征鉴定
按照《微生物学实验》[27]中的方法对溶磷细菌的形态学特征进行鉴定，按照《常见细菌系统鉴定手册》[28]对溶磷细菌的生理生化特征进行鉴定。
1.5.2 分子生物学鉴定及系统发育分析
参考《精编分子生物学实验指南》[29]的方法提取菌株DNA并进行16S rDNA PCR扩增。PCR产物由华大基因科技股份有限公司进行测序。测序完成后，将各菌株的16S rDNA序列输入到Genbank中的核酸数据库，用Blast程序与数据库中的序列进行比对，下载同源性较高的模式菌株，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。
1.6 溶磷菌溶磷动态测定
将供试菌株种子液按2%的接种量将菌悬液接入已灭菌（121 ℃，20 min）的无机磷液体培养基中，以不接菌作为对照，各处理3个重复，摇床振荡培养（30 ℃，180 r/min）7 d。每天定时检测菌液中pH值和有效磷含量，并计算菌株溶磷量（方法同1.4.2）。
1.7 溶磷特性研究
对筛选出来的高效溶磷细菌采用单因素试验探究其在不同培养条件下的溶磷效果。以无机磷液体培养基为基础，分别设置不同pH（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5和8.5）、温度（10、15、20、25、30、35、40、45 ℃）、盐（NaCl）质量分数（0、0.5%、1.5%、2.5%、5.0%、10.0%）。各处理接种菌液后置于30 ℃摇床中培养，对照为未接菌的无机磷液体培养基，7 d后收集各处理的培养液进行离心并测定有效磷含量及菌体生长量（OD600）。在无机磷液体培养基中将相应营养因子用不同的碳源（乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇）、氮源（尿素、硝酸钾、硝酸钠、草酸铵）、C∶N（以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源，C∶N设置为40∶1、20∶1、8∶1）和磷源（Ca3（PO4）2、FePO4、AlPO4）进行等量替换。各处理接种菌液后置于30 ℃摇床中培养，对照为未接菌的无机磷液体培养基，7 d后收集各处理的培养液进行离心并测定有效磷含量，并计算菌株溶磷量（方法同1.4.2）。
1.8 数据处理
采用SPSS 24.0软件对菌株的溶磷量进行方差分析（ANOVA）和Pearson相关性分析，利用Origin 2018作图。系统发育树采用MEGA 7.0构建（bootstrap值为1 000）。图表中的数据为平均值 ± 标准差。
2. 结果与分析
2.1 溶磷菌的分离、初筛
初筛结果如表2所示，望天树根际土壤不同梯度土壤稀释液在无机磷固体培养基平板培养5 d时，共获得18株能产生明显溶磷圈的溶磷细菌。各菌株间D/d值存在显著差异（P < 0.05），D/d在1.02 ~ 2.18之间。其中，2.0 < D/d≤ 2.5的有7株，占菌株总数的38.9%；1.5 < D/d ≤ 2.0的菌株有3株，占总数的16.7%；D/d < 1.5的有8株，占菌株总数的44.4%。在18株溶磷菌株中，P12的溶磷圈最大，D/d值达2.18；P13的溶磷圈最小，D/d值为1.02。部分溶磷细菌溶磷圈结果如图1所示。
表 2 溶磷细菌的初筛结果Table 2. Preliminary screening results of phosphate solubilizing bacteria林龄/a
Stand age/year菌株编号
Strain No.D/d 林龄/a
Stand age/year菌株编号
Strain No.D/d 1 P1 1.28 ± 0.05f 2 P13 1.02 ± 0.03i 1 P2 1.55 ± 0.09d 2 P14 1.17 ± 0.05h 1 P3 1.62 ± 0.04c 2 P15 2.04 ± 0.03b 1 P4 2.03 ± 0.03b 41 P25 2.05 ± 0.02b 2 P8 2.12 ± 0.02a 41 P26 1.35 ± 0.07ef 2 P9 1.41 ± 0.02e 41 P27 1.20 ± 0.04gh 2 P10 2.01 ± 0.01b 41 P28 1.32 ± 0.02f 2 P11 1.52 ± 0.02d 41 P29 1.27 ± 0.02fg 2 P12 2.18 ± 0.01a 41 P30 2.04 ± 0.02b 注：D 表示溶磷圈直径，d表示菌落直径。同列数值后不同字母表示处理间差异显著（P < 0.05）。Notes: D means soluble phosphorus diameter, d means colony diameter. Different letters in the same column mean significant differences at P < 0.05 level. ![]()
图 1 部分溶磷细菌溶磷圈Figure 1. Phosphate solubilizing circle of partial phosphate solubilizing bacteria2.2 溶磷菌溶磷能力
由于溶磷圈法无法明确溶磷能力的大小，在初筛的基础上，选择菌落形态不同且溶磷圈直径较大的7株细菌进行摇瓶复筛，定量检测菌株的溶磷能力。由图2可知：菌株液体摇瓶培养7 d后，7株细菌的溶磷量范围为305.33 ~ 598.89 mg/L，溶磷率范围为5.68% ~ 11.55%，各菌株间的溶磷能力存在差异。P30、P8、P4和P12的溶磷量都达到了500 mg/L以上，溶磷能力较强。其中，以P30的溶磷量最高，达598.89 mg/L，溶磷率为11.55%。因此，在后续的研究中，挑选这4株高效溶磷菌株作为研究对象。
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图 2 溶磷细菌溶磷能力的测定图中不同小写字母表示不同菌株间溶磷量差异显著（P < 0.05）。Different lowercase letters in the figure indicate significant differences in phosphorus solubility between different strains (P < 0.05).Figure 2. Determination of phosphate solubilizing ability of phosphate solubilizing bacteria2.3 菌株的鉴定
2.3.1 形态特征及培养特征
在无机磷固体培养基上培养72 h后，菌株P4、P12、P8和P30生长良好。4株溶磷菌菌落均呈圆形，边缘整齐，极生鞭毛，运动型，菌体短杆状。P30革兰氏染色为阳性，P4、P12和P8革兰氏染色均为阴性。P4菌落表面润黏稠、呈乳白色；P8菌落表面光滑湿润、呈淡黄色；P12菌落边缘整齐，表面光滑湿润、呈浅白色；P30菌落表面干燥、无光泽、呈乳白色。
2.3.2 溶磷菌生理生化特征
对筛选出的溶磷菌进行生理生化鉴定，由表3可知：P30表现为能利用柠檬酸盐，V-P（Voges-Proskauer reaction）试验为阳性，能产生明胶酶，使明胶分解为氨基酸，能产生吲哚，可使淀粉水解和硝酸盐还原。菌株P8、P4和P12的特征相同，均表现为能利用柠檬酸盐，使明胶水解，V-P反应、吲哚试验均为阴性，能使硝酸盐还原，不可水解淀粉。
表 3 溶磷细菌的生理生化鉴定Table 3. Physiological and biochemical identification of phosphate solubilizing bacteria菌株编号
Strain No.V-P反应
Voges-Proskauer reaction明胶液化
Gelatin hydrolysis淀粉水解
Amylolysis柠檬酸盐
Citrate吲哚试验
Indole production反硝化
DenitrificationP4 − + − + − − P8 − + − + − − P12 − + − + − − P30 + + + + + − 注： + 表示阳性反应；−表示阴性反应。Notes: + indicates positive reaction; − indicates negative reaction. 2.4 16SrDNA基因序列比对分析及系统发育树的构建
将4株溶磷细菌的测序结果上传到GenBank数据库中，进行Blast比对，选取与各菌株同源性较高的菌株构建系统发育树。从序列比对分析（表4）和系统发育树（图3）中可看出：P30与蜡状芽孢杆菌聚类，与菌株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus，EU857430.1）的同源性最高，达99.72%。菌株P4、P8和P12与伯克霍尔德氏菌属聚类，P4与洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia，AY741348.1）的同源性达99.79%；P12与洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia，FJ907187.1）的同源性达99.79%；P8与唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli，MW320460.1）的同源性达99.65%。结合各菌株的菌落特征、生理生化特征、16S rDNA序列的比对结果和系统发育树的分析，P4菌株和P12菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德菌，P8菌株鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌，P30菌株鉴定为蜡状芽孢杆菌。
表 4 基于16S rDNA 序列鉴定结果Table 4. Identification based on 16S rDNA sequence菌株编号
Strain No.模式菌株
Type strain相似性
Identity/%登录号
Accession No.P4 洋葱伯克霍尔德菌 Burkholderia cepacia 99.79 AY741348.1 P8 唐菖蒲伯克霍尔德菌 Burkholderia gladioli 99.65 MW320460.1 P12 洋葱伯克霍尔德菌 Burkholderia cepacia 99.79 FJ907187.1 P30 蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 99.72 EU857430.1 ![]()
图 3 溶磷细菌系统发育树Figure 3. Construction of phylogenetic tree of phosphate solubilizing bacteria2.5 溶磷菌溶磷动态分析
2.5.1 溶磷量与pH值的动态变化
溶磷动态检测结果（图4）显示：随着接种时间的延长，4株溶磷菌的溶磷量均呈现先上升后下降的趋势，而培养液中pH的变化趋势则表现为先下降后上升。摇瓶培养2 d后，各菌液的溶磷量出现跃增，培养液pH骤降，第3天后溶磷量平缓上升，培养液pH平缓下降。P4、P8和P12在第5天时，溶磷量达到最大值，分别为552.87、579.01和529.31 mg/L，说明3株菌株在培养5 d时的溶磷效果最佳，此时各菌株的pH达到最小值，分别为4.95、4.37和5.33。P30在第6天时溶磷能力最强，溶磷量为636.30 mg/L，此时培养液pH达到最小值，为3.31。各菌株溶磷量达到最大值后，可能由于碳源等营养物质的耗竭，菌体消耗部分溶解的有效磷以维持自身生长，导致溶磷量下降。
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图 4 溶磷菌中溶磷量和pH的动态变化Figure 4. Dynamic changes of phosphorus dissolved amount and pH in phosphorus dissolving bacteria2.5.2 溶磷量与pH值的相关关系
4株菌的溶磷量与对应的pH值呈现出：随着培养时间的增加，pH值逐渐降低，溶磷量逐渐升高，到达一定时间后，pH值又逐渐升高，而溶磷量也随之降低（图4）。对P4、P12、P8和P30的溶磷量与pH值进行Pearson相关分析，结果表明：在磷酸钙培养液中，P30（r = −0.997，P < 0.01）、P12（r = −0.985，P < 0.01）、P8（r = −0.99，P < 0.01）和P4（r = −0.995，P < 0.01）菌株的溶磷量与pH变化之间均呈极显著负相关关系。这说明溶磷菌在代谢过程中可能产生了某些酸性物质，降低了环境中的pH值，从而达到溶解磷酸钙的效果。
2.6 影响溶磷菌溶磷特性的环境条件
2.6.1 pH 对溶磷菌溶磷能力的影响
4株溶磷菌株在pH为3.5 ~ 8.5范围内均能正常生长，表现出较广的pH适应范围（图5）。各菌株的生长量和溶磷量均随着pH的升高呈现出先升高后降低的趋势。各菌株的最适生长和溶磷的pH存在差异，当pH为6.5时，P4和P30生长和溶磷效果最好，溶磷量分别为551.84和577.37 mg/L；而P8和P12在pH为7.5时对应的OD600值和溶磷量最高。总体上来看：pH为5.5 ~ 8.5时，各菌株均表现出良好的溶磷效果。
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图 5 pH对溶磷菌溶磷能力的影响Figure 5. Effects of pH on the ability of phosphorus dissolving bacteria to dissolve phosphorus2.6.2 温度对溶磷菌溶磷能力的影响
由图6可知：不同温度对各菌株生长和溶磷量的影响差异显著。4株溶磷菌在15 ~ 40 ℃时均能生长，且P4和P12在25 ~ 35 ℃范围内表现出较高的溶磷量和生长量，P8和P30在30 ~ 35 ℃时生长和溶磷效果最好。P12、P4和P30在温度为30 ℃时生长最好，同时溶磷量最大，分别为548.53、552.87和598.89 mg/L，此后3株菌株随着温度的升高生长和溶磷能力逐渐减弱。P8的最佳生长和溶磷温度为35 ℃，此时溶磷量和OD600分别为623.71 mg/L和1.79，这表明P8对温度的耐受性较强，在高温条件下仍具有较强的溶磷能力。
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图 6 温度对溶磷菌溶磷能力的影响Figure 6. Effects of temperature on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria2.6.3 NaCl质量分数对溶磷菌溶磷能力的影响
不同NaCl质量分数对溶磷菌的生长和溶磷效果的影响如图7所示。NaCl质量分数在0 ~ 2.5%时，各菌株均能生长并发挥较好的溶磷作用。P12和P4在NaCl质量分数为0.5%时溶磷能力最强，溶磷量分别为323.35和349.15 mg/L；P8和P30在NaCl质量分数为1.5%时溶磷量最高，分别为400.70和450.33 mg/L。当NaCl质量分数大于2.5%时，P12、P4和P8菌液中有效磷含量均显著下降，生长和解磷活力受到明显的抑制。
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图 7 NaCl质量分数对溶磷菌溶磷能力的影响Figure 7. Effects of NaCl mass fraction on phosphorus solubilization ability of phosphorus solubilizing bacteria2.6.4 碳源对溶磷菌溶磷能力的影响
不同种类碳源培养下溶磷细菌的溶磷量存在显著差异（图8）。4株溶磷菌以葡萄糖、蔗糖和乳糖为碳源时溶磷量较高，而在以可溶性淀粉和甘露醇为碳源时溶磷效果较差。菌株P4和P12均在以乳糖为碳源时溶磷量最高，以甘露醇为碳源时溶磷能力最低。P8的最佳碳源为葡萄糖，其次是蔗糖和乳糖。P30以蔗糖为碳源时溶磷量最高，达651.10 mg/L，葡萄糖次之。总体上看，P30菌株在不同碳源培养条件下的溶磷量均高于其他菌株。
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图 8 不同碳源对溶磷菌溶磷能力的影响GL. 葡萄糖；SU. 蔗糖；L. 乳糖；SS. 可溶性淀粉；MAN. 甘露醇。不同小写字母表示同一菌株在不同条件下溶磷量差异显著（P < 0.05）。下同。GL, glucose; SU, sucrose; L, lactose; SS, soluble starch; MAN, mannitol. Different lowercase letters indicate that the phosphate solubilizing ability of the same strain under different treatments is significantly different (P < 0.05). The same below.Figure 8. Effects of different carbon sources on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria2.6.5 氮源对溶磷菌溶磷能力的影响
不同氮源对各菌株的溶磷能力影响效果如图9所示。菌株P12和P4均在以草酸铵为氮源时解磷量最高，分别为461.45和477.37 mg/L，而氮源为硝态氮时溶磷能力最低。P8的最佳氮源为硫酸铵，其次为草酸铵。P30在以硫酸铵为氮源时溶磷量最高，为598.89 mg/L，在尿素中溶磷量最低。整体上看：分别以5种氮源种类为唯一氮源时，各菌株溶磷量的大小排序为P30 > P8 > P12 > P4。
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图 9 不同氮源对溶磷菌溶磷能力的影响UR. 尿素；AS. 硫酸铵；AO. 草酸铵；PN. 硝酸钾；SO. 蛋白胨。UR, urea; AS, ammonium sulfate; AO, ammonium oxalate; PN, potassium nitrate; SO, peptone.Figure 9. Effects of different nitrogen sources on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria2.6.6 C∶N对溶磷菌溶磷能力的影响
4株溶磷菌在不同的C∶N条件下溶磷能力变化如图10所示，结果表明：P30、P12和P4均在C∶N为20∶1时溶磷量最高，分别为598.44、521.39和526.86 mg/L，且显著高于其他2组C∶N处理，C∶N为40∶1时次之，C∶N为8∶1时溶磷量均最低；P8在C∶N为40∶1时，其溶解量最高，为532.61 mg/L，在C∶N为8∶1时溶磷量最低。
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图 10 不同C∶N对溶磷菌溶磷能力的影响Figure 10. Effects of different C ∶ N on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria2.6.7 磷源对溶磷菌溶磷能力的影响
图11显示：各溶磷菌株对3种不同磷源溶解量的影响差异显著。相对其他3种菌株，P30在不同磷源中的溶磷效果均表现最佳，其中以Ca3（PO4）2为磷源时溶磷量最大，为597.76 mg/L，其次是FePO4，最低是AlPO4。P8和P4对Ca3（PO4）2的溶解能力显著高于AlPO4。P12在以FePO4为磷源时溶磷量最大，为405.84 mg/L。P30、P8和P4对不同磷源的溶解能力排序为Ca3（PO4）2 > FePO4 > AlPO4，而P12对不同磷源的溶解能力排序为FePO4 > AlPO4 > Ca3（PO4）2。
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图 11 不同磷源对溶磷菌溶磷能力的影响Figure 11. Effects of different phosphorus sources on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria3. 讨 论
3.1 溶磷菌的筛选与鉴定
我国南方土壤由于铁、铝等金属离子对有效磷的吸持固定，导致土壤磷肥的有效性低[30-31]，这已成为人工林培育提质和增产的限制因素。溶磷菌作为微生物肥料的重要成分，不仅能提高土壤中的有效磷含量，还可以改善根际土壤环境[32]。研究表明：施用溶磷菌肥料能明显地促进作物的生长，并对土壤退化、板结等问题起到了一定的改良作用[33]。因此，从望天树根际土壤中分离、筛选高效且亲和性较好的溶磷细菌，研究高效微生物菌肥，是调节土壤磷素的供需矛盾，促进望天树人工林生长的有效途径。
溶磷圈法只能初步判定菌株的溶磷效果，还应通过液体摇瓶复筛进行定量检测，结合培养基有效磷含量的变化综合分析其溶磷能力[34-35]。本试验采用溶磷圈法初筛，钼锑抗比色法复筛，明确了7株溶磷细菌的溶磷能力，溶磷量范围为305.33 ~ 598.89 mg/L。其中，P4、P8、P12和P30等4株菌溶磷量均达到了500 mg/L，表现出较好的溶解磷酸钙的能力。整体来看：从2年生望天树人工林中获得的溶磷菌株溶磷效果较好，这可能与植物所处的土壤肥力、年龄及长势等综合因素有关[15]。薛冬等[36]从牡丹（Paeonia suffruticosa）根际土壤中筛选得到的溶磷菌对磷酸钙的溶解量在96.9 ~ 148.1 mg/L之间，表明不同种类的溶磷微生物，其溶解难溶性磷酸盐的能力存在较大差异。
细菌菌种的鉴定通常采用生理生化鉴定和16S rDNA序列相结合的方法。由于16S rDNA序列的高变区中存在着细菌属或种的变异性，故16S rDNA序列测序已广泛应用于细菌的鉴定中[37]。本文通过形态学观察、生理生化鉴定、16S rDNA鉴定及系统发育树的构建，对分离筛选得到的4株溶磷菌株进行鉴定。大部分研究表明：芽孢杆菌属（Bacillus）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、假单胞菌属（Pseudomonas）等是多年生林木根际土壤中的优势溶磷细菌[38-40]。芽孢杆菌具有繁殖速度快、抗逆性强且耐存储等特点，不仅能溶解难溶性磷酸盐，而且在生物防治、降解重金属和环境污染物等方面都有应用[41-42]。伯克氏菌属细菌在植物根际土壤中广泛存在，可以通过固氮、溶磷和分泌植物激素等作用促进植物生长，是一种重要的微生物资源[43]。本试验筛选获得4株具有较强溶磷能力的溶磷菌株，P30为蜡状芽孢杆菌，菌株P8为唐菖蒲伯克霍尔德菌，菌株P4和P12为洋葱伯克霍尔德菌，在研制多功能高效微生物菌肥方面具有潜在价值。
溶磷菌通过分泌一些代谢物质使培养液pH降低，从而溶解难溶性矿物磷是一种常见的溶磷机制[44]。溶磷细菌因分泌有机酸而具备溶磷能力，同时降低了培养液的pH值[45-47]。望天树根际土壤中的4株高效溶磷菌株在培养过程中对磷酸钙的溶解量与培养液pH之间均呈极显著负相关，这与细菌分泌有机酸密切相关，但不同菌株产生的有机酸种类、含量及其对土壤pH值和溶磷效果的影响还有待于进一步研究。
3.2 溶磷菌的溶磷特性
对高效溶磷菌株进行培养条件优化，明晰菌株的最适生存和繁殖环境，才能发挥其最大功效。研究表明：pH和温度通过影响微生物体内酶的合成而改变代谢速率[48-49]。本研究中，4株溶磷菌株在初始pH为5.5 ~ 8.5时，都具有较好的溶磷能力，表明其对解磷环境的pH适应范围较宽，可在酸性及弱碱性土壤中应用，对开发微生物菌肥具有重要的应用价值。溶磷菌的功效与温度密切相关，温度过低时菌株活力下降且生长缓慢，温度过高则容易导致菌体自溶[48]。本试验条件下4株溶磷菌株在30 ~ 35 ℃间溶磷效果最好，生长量最大，适合南方春秋季施肥时的土壤温度，有利于菌肥的研发。韦宜慧等[50]从杉木人工林土壤中筛选到一株伯克氏属溶磷菌株P5（Burkhoderia ubonensis），其生长的最适温度范围为25 ~ 30 ℃。此外，有研究发现：过低或过高的盐浓度均会对溶磷菌的溶磷能力产生不利影响[51]。本研究中，4株溶磷菌的溶磷量随NaCl质量分数的升高呈现先上升后下降的趋势，这可能是因为高盐条件下培养基的渗透势升高，从而导致溶磷菌的结构受到破坏，溶磷能力急剧下降[52]。
不同种类的碳、氮源对溶磷菌的生长代谢影响较大，进而影响其溶解难溶性磷酸盐的效果[53]。某些溶磷菌回接到植物根际未能表现出促生效应，可能是土壤中的碳源、氮源种类不适合菌株的生长[54]。碳是构成微生物的基本骨架，溶磷菌能高效利用的碳源种类越多，则说明其适应环境的能力越强，溶磷效果也越好[49]。本试验条件下，P4和P12菌株在以乳糖为碳源时其溶磷效果最好，P8菌株在以葡萄糖为碳源时溶磷量最高，P30菌株则在以蔗糖为碳源时具有最强的溶磷能力，表明溶磷菌对单糖和双糖的利用率较高。铵态氮和硝态氮是目前研究溶磷微生物氮源利用的焦点。部分研究者认为，溶磷微生物主要利用铵态氮分泌出来的H+质子发挥溶磷作用[55]。但Reyes等[56]研究发现：溶磷菌IR94-MF1以硝态氮为唯一氮源时能促进柠檬酸的分泌，且溶磷量较以铵态氮为氮源时高。本研究中，菌株P30对氮源的利用以铵态氮和硝态氮为主，其余菌株则主要利用铵态氮。微生物的溶磷活性不仅受到供给C、N源物质种类的影响，而且还受到C∶N的影响。吕俊等[57]在探究不同C∶N对菌株WJ2溶磷效果的影响时发现：随着C∶N的升高，菌株的溶磷量随之减小。在本研究中，菌株P8的溶磷量随着C∶N的减小而减小，在C∶N为40∶1时溶磷量最大，其他菌株的溶磷量在C∶N为20和40时的溶磷量显著高于C∶N比为8时的溶磷量，说明不同种类菌株都有自身最适合的C∶N。在将来进行复合菌肥的研发时，可在无机肥或有机肥中以合适各菌株的C∶N分别添加4种菌株的最佳碳氮源形态，以满足不同菌株生长繁殖所需的营养物质，从而更好地发挥其溶磷效果。不同形态的磷酸盐结构和成分存在较大差异，导致溶磷菌株表现出不同的溶磷效果[58-59]。一般认为，溶磷微生物溶解难溶性磷酸盐种类的广度是表征其溶磷性能好坏的重要指标之一[60]。菌株P12在不同磷源培养液中溶磷量依次为FePO4 > AlPO4 > Ca3（PO4）2，菌株P30、P8和P4对不同磷酸盐的溶磷能力均表现为Ca3（PO4）2 > FePO4 > AlPO4。4株溶磷菌株对不同磷酸盐的溶解度均达到了300 mg/L以上，表现出较广的溶磷特性，具有一定的溶磷优势。南方酸性土壤中无机磷以铁磷、铝磷为主，如何高效利用积累于其中的难溶性磷源已引起广泛关注。4株溶磷菌株对磷酸铝和磷酸铁的有效溶磷量均达300 mg/L，这表明菌株在南方富铝化酸性土壤上具有较大的开发利用潜力。
4. 结 论
本研究从3个不同林龄（1、2和41年）的望天树根际土壤中分离获得4株高效溶解无机磷细菌，结合各菌株的菌落特征、生理生化特征、16S rDNA序列的比对结果和系统发育树的分析，将P4菌株和P12菌株鉴定为洋葱伯克霍尔德菌，P8菌株为唐菖蒲伯克霍尔德菌，P30菌株为蜡状芽孢杆菌。
4株溶磷菌株在30 ~ 35 ℃，pH为5.5 ~ 8.5，NaCl质量分数为0 ~ 2.5 %时均具有良好的溶磷能力，对磷酸铝和磷酸铁的溶磷量均达300 mg/L，可见菌株对温度和pH的耐受性较广，在南方酸性土壤上具有较大的应用潜力，有望作为望天树专用溶磷菌肥研制的优质菌株。但各菌株溶磷条件的最佳碳源和氮源不同，P4和P12菌株的最佳碳源和氮源均分别为乳糖、草酸铵，P8菌株分别为葡萄糖和硫酸铵，P30菌株分别为蔗糖和硫酸铵。P30、P12和P4的最适C∶N为20∶1，P8的最适C∶N为40∶1。了解菌株的溶磷的最佳碳氮源及C∶N，可为今后复合菌肥研制中化学肥料的添加提供参考。
由于植物根际环境复杂，还需进一步掌握溶磷菌在望天树根际土壤的定殖特点、促生效果及其影响因素等，为通过人为调控环境因子以满足接种溶磷菌的生长与繁殖需求提供科学依据。
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图 1 部分溶磷细菌溶磷圈
Figure 1. Phosphate solubilizing circle of partial phosphate solubilizing bacteria
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图 2 溶磷细菌溶磷能力的测定
图中不同小写字母表示不同菌株间溶磷量差异显著（P < 0.05）。Different lowercase letters in the figure indicate significant differences in phosphorus solubility between different strains (P < 0.05).
Figure 2. Determination of phosphate solubilizing ability of phosphate solubilizing bacteria
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图 3 溶磷细菌系统发育树
Figure 3. Construction of phylogenetic tree of phosphate solubilizing bacteria
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图 4 溶磷菌中溶磷量和pH的动态变化
Figure 4. Dynamic changes of phosphorus dissolved amount and pH in phosphorus dissolving bacteria
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图 5 pH对溶磷菌溶磷能力的影响
Figure 5. Effects of pH on the ability of phosphorus dissolving bacteria to dissolve phosphorus
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图 6 温度对溶磷菌溶磷能力的影响
Figure 6. Effects of temperature on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria
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图 7 NaCl质量分数对溶磷菌溶磷能力的影响
Figure 7. Effects of NaCl mass fraction on phosphorus solubilization ability of phosphorus solubilizing bacteria
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图 8 不同碳源对溶磷菌溶磷能力的影响
GL. 葡萄糖；SU. 蔗糖；L. 乳糖；SS. 可溶性淀粉；MAN. 甘露醇。不同小写字母表示同一菌株在不同条件下溶磷量差异显著（P < 0.05）。下同。GL, glucose; SU, sucrose; L, lactose; SS, soluble starch; MAN, mannitol. Different lowercase letters indicate that the phosphate solubilizing ability of the same strain under different treatments is significantly different (P < 0.05). The same below.
Figure 8. Effects of different carbon sources on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria
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图 9 不同氮源对溶磷菌溶磷能力的影响
UR. 尿素；AS. 硫酸铵；AO. 草酸铵；PN. 硝酸钾；SO. 蛋白胨。UR, urea; AS, ammonium sulfate; AO, ammonium oxalate; PN, potassium nitrate; SO, peptone.
Figure 9. Effects of different nitrogen sources on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria
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图 10 不同C∶N对溶磷菌溶磷能力的影响
Figure 10. Effects of different C ∶ N on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria
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图 11 不同磷源对溶磷菌溶磷能力的影响
Figure 11. Effects of different phosphorus sources on phosphorus dissolving ability of phosphorus dissolving bacteria
表 1 试验地林分特征与土壤理化性质
Table 1 Stand characteristics and soil physicochemical properties of the experimental sites
林龄/a
Stand age/year平均树高
Average tree height/m平均胸径（地径）
Average DBH
(ground diameter)/cmpH 含量 Content 全氮
Total N/(g·kg−1)全磷
Total P/(g·kg−1)全钾
Total K/(g·kg−1)氨态氮
Ammoniacal N/(mg·kg−1)有效磷
Available P/(mg·kg−1)速效钾
Available K/(mg·kg−1)1 1.72 2.28 4.53 1.52 0.32 9.44 6.66 3.58 40.47 2 2.20 3.16 3.49 2.06 0.23 6.60 6.12 5.10 72.74 41 40.60 48.70 3.69 2.04 0.78 11.90 3.13 2.63 61.19 
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表 2 溶磷细菌的初筛结果
Table 2 Preliminary screening results of phosphate solubilizing bacteria
林龄/a
Stand age/year菌株编号
Strain No.D/d 林龄/a
Stand age/year菌株编号
Strain No.D/d 1 P1 1.28 ± 0.05f 2 P13 1.02 ± 0.03i 1 P2 1.55 ± 0.09d 2 P14 1.17 ± 0.05h 1 P3 1.62 ± 0.04c 2 P15 2.04 ± 0.03b 1 P4 2.03 ± 0.03b 41 P25 2.05 ± 0.02b 2 P8 2.12 ± 0.02a 41 P26 1.35 ± 0.07ef 2 P9 1.41 ± 0.02e 41 P27 1.20 ± 0.04gh 2 P10 2.01 ± 0.01b 41 P28 1.32 ± 0.02f 2 P11 1.52 ± 0.02d 41 P29 1.27 ± 0.02fg 2 P12 2.18 ± 0.01a 41 P30 2.04 ± 0.02b 注：D 表示溶磷圈直径，d表示菌落直径。同列数值后不同字母表示处理间差异显著（P < 0.05）。Notes: D means soluble phosphorus diameter, d means colony diameter. Different letters in the same column mean significant differences at P < 0.05 level.
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表 3 溶磷细菌的生理生化鉴定
Table 3 Physiological and biochemical identification of phosphate solubilizing bacteria
菌株编号
Strain No.V-P反应
Voges-Proskauer reaction明胶液化
Gelatin hydrolysis淀粉水解
Amylolysis柠檬酸盐
Citrate吲哚试验
Indole production反硝化
DenitrificationP4 − + − + − − P8 − + − + − − P12 − + − + − − P30 + + + + + − 注： + 表示阳性反应；−表示阴性反应。Notes: + indicates positive reaction; − indicates negative reaction.
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表 4 基于16S rDNA 序列鉴定结果
Table 4 Identification based on 16S rDNA sequence
菌株编号
Strain No.模式菌株
Type strain相似性
Identity/%登录号
Accession No.P4 洋葱伯克霍尔德菌 Burkholderia cepacia 99.79 AY741348.1 P8 唐菖蒲伯克霍尔德菌 Burkholderia gladioli 99.65 MW320460.1 P12 洋葱伯克霍尔德菌 Burkholderia cepacia 99.79 FJ907187.1 P30 蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 99.72 EU857430.1
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