Genetic identification and evaluation of cold-resistant germplasm resources in Populus tomentosa
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摘要:目的
鉴定山西省朔州市保存的毛白杨种质资源，与山东省冠县保存的毛白杨种质资源的群体遗传结构和遗传多样性进行对比分析，并对朔州市现存毛白杨种质资源进行耐寒性评价。
方法以山西省朔州市种质资源库现存370株毛白杨，以及山东省冠县保存的441个毛白杨无性系为对象，采用SSR分子标记开展毛白杨种质资源鉴定、群体遗传结构和遗传多样性分析，基于生长和冻害表型进行评价。
结果利用13对引物将山西省朔州市种质资源库370株毛白杨分为183个无性系，共检测出等位变异位点67个，平均1个位点存在5个等位基因变异，位点的多态性信息变异幅度在0.306 ~ 0.735之间。与山东省冠县保存的毛白杨种质资源库指纹图谱进行对比，发现两地现存的毛白杨并无重复基因型，但遗传多样性差异并不显著。两地保存的624个毛白杨无性系可分为7个类群，通过耐寒性评价将朔州市现存183个无性系划分为5级，其中Ⅰ级的耐寒无性系47个，具有较高的树高和材积生长量。
结论自然选择使毛白杨南北种质资源库淘汰了偏离保存地环境的部分种质，而保留了适合保存地环境的种质资源，导致两地现存种质资源群体遗传结构差异较大，说明林木种质资源分区域收集、保存和利用的必要性。而山西省朔州市种质资源库内现存雌性无性系是珍贵的耐寒育种资源，对于毛白杨北方适生育种群体构建和高轮次遗传改良具有重要的价值。
Abstract:ObjectiveThis paper identifies the resources of Populus tomentosa in Shuozhou City, Shanxi Province of northern China, compares and analyzes the genetic structure and genetic diversity differences of the populations of poplar in Guanxian County, Shandong Province of eastern China, and evaluates the cold resistance of the existing poplar in Shuozhou City.
MethodUsing 370 individuals in Shuozhou City and 441 clones in Guanxian County, SSR molecular markers were used to carry out the identification of poplar resources, population genetic structure and genetic diversity analysis, and to evaluate the growth index and low temperature tolerance.
ResultUsing 13 pairs of primers, 370 individuals of P. tomentosa were divided into 183 clones. A total of 67 allelic variations were detected, with an average of 5 allelic variations per locus, and the polymorphism information content ranged from 0.306 to 0.735. Compared with the Guanxian County Germplasm Resource Bank in Shandong Province, it was found that the same clone resources were not preserved during the ex-situ preservation of P. tomentosa. The difference in genetic diversity was not significant. The 624 clones preserved in the two sites can be divided into seven clusters. The 183 extant clones in Shuozhou City were classified into five classes by cold tolerance evaluation, including 47 cold hardy clones in classⅠ, and the cold hardy poplars also had higher tree height and wood volume growth.
ConclusionNatural selection has caused the north and south germplasm repository of P. tomentosa to eliminate part of the germplasm that deviates from the environment of the preservation site, and to retain the germplasm resources that are suitable for the environment of the preservation site. The genetic structure of two populations differs considerably, indicating the need to collect, conserve and use forest germplasm resources in different regions. The existing female asexual lines in the germplasm repository of Shuozhou City, Shanxi Province, are valuable cold-tolerant breeding resources, which are of great value for the construction of a suitable population of northern poplar and the genetic improvement of high rotation.
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毛白杨（Populus tomentosa）是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus）白杨派树种，是我国特有的乡土树种，具有长势突出、干型通直、材性优异、适生区域广泛等优点，是重要的用材和城乡绿化树种[1−2]。在1983—1986年间，毛白杨的良种选育工作首次列入国家科技攻关计划后，朱之悌等[3]主要采取优树多部位取样、多部位保存的异地保存方式，在山东省冠县收集保存了来自北京、河北、山东、河南、山西、陕西、甘肃、宁夏、安徽、江苏等省共100个县的1 047个毛白杨优树，建立了毛白杨基因库。在保存了遗传多样性日渐降低的毛白杨种质资源的同时，选育出一系列速生、材性优良、无飞絮的雄株新品种，有利推动了毛白杨良种选育进展[3]。经过多年自然选择，适应性较强的种质被保留下来，现存469个无性系，其中二倍体无性系441个。
1988年，将全套1 047株毛白杨优树扩繁为无性系，引入到山西省太原市进行基因资源保存和耐寒性试验。3年苗期试验结果表明：北京、河北两省的种源抗寒性较强，其次是河南、山西的毛白杨[4]。1993年，初选出232个无性系于朔州市进行造林对比试验，以进一步考察这些优良无性系的耐寒能力。朔州市地处山西北部，属晋北温带寒冷半干旱气候区，年平均气温3.6 ~ 7.3 ℃，冬季平均气温−14.9 ~ −9.4 ℃。对232个无性系生长观测发现，一些无性系受到不同程度的冻害，出现冻梢或树干纵向冻裂现象，部分无性系因冻害而死亡[5]。后期又陆续从太原、大同等地收集了一批耐寒无性系，补充至朔州市植物园毛白杨种质资源库。在一个树种分布区内，不同地理种源表现出对其分布区内环境选择压力的适应性。当将收集于不同地点的优树集中于同一环境下保存时，因不同基因型的适合度差异，必然会有一定的株系因适合度较低而被淘汰。由于毛白杨自然分布区内不同种源地的光、温、水、土等条件存在明显差异，在长期的自然选择与生态适应过程中，不同毛白杨群体间在各种性状上发生了遗传分化[6]。因此，在我国北部城市朔州所保存的370株毛白杨植株是具有耐寒潜力的珍贵种质。
现代分子生物学技术的发展为解决仅凭表型难以鉴别基因型的问题提供了有效技术手段[7−9]。简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）分子标记为共显性标记，具有简便、快捷、重复性好、多态性高等优点，广泛应用于植物领域的种质资源鉴别、群体遗传多样性和遗传结构分析等[10−12]。Du和Bai等[13−14]分别使用SSR分子标记分析了山东冠县毛白杨种质资源库优树的群体遗传结构，结果表明其群体遗传多样性处于中等水平。韩志强等[15]建立了山东冠县的毛白杨种质资源库SSR指纹图谱，实现了对库内现存469个毛白杨无性系的分子鉴别。相关研究为山西省朔州市毛白杨种质资源鉴定和遗传结构分析等奠定了重要基础。构建种植群体的指纹图谱，对于在长期的自然选择与生态适应过程中形成的毛白杨种质资源评价、耐寒新品种选育乃至林木种质资源保存等具有重要意义。
本研究以山西省朔州市现存的370个毛白杨植株，以及山东冠县毛白杨种质资源库现存的441个二倍体毛白杨无性系为对象，选择高多态性SSR引物进行无性系分子鉴定以及遗传多样性分析，在此基础上对山西省朔州市现存毛白杨种质资源数量、生长性状及耐寒性进行分析评价，为我国北方毛白杨种质资源保存和耐寒良种选育打下一定的基础。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
1988年，全国毛白杨良种选育协作组将定植于山东省冠县的全套1 047株毛白杨种质资源经过无性繁殖后，引入到山西省太原市进行苗期对比试验和种质资源保存。1991年春，经过3年苗期对比试验，选择其中232个无性系于朔州市进行造林试验，包括北京37个、河北89个、山东10个、河南27个、山西21个、陕西9个、甘肃4个、安徽1个、江苏3个（表1），以及三倍体及杂交品系31个。1996年将所有无性系统一编号，建立朔州市毛白杨种质资源库。后期又陆续从太原、大同等地收集了一批耐寒无性系。2011年，因城市建设征地需要，保留下来的毛白杨无性系被移植到朔州市植物园和万亩苗圃进行保存，但移植时没有标明系号，造成了系号混乱，需要对迄今保存下来的370株毛白杨进行无性系鉴定。此外，为了研究北部与南部不同保存地点的现存种质资源差异，还与山东冠县毛白杨种质资源库现存的441个毛白杨无性系进行了对比，其中北京21个、河北131个、山东20个、河南117个、山西90个、陕西65个、甘肃6个、江苏10个毛白杨优树个体（表1）。
表 1 山东、山西毛白杨种质资源库保存优树情况一览表Table 1. List of preserved excellent trees in Shandong and Shanxi P. tomentosa germplasm resource banks保存地点
Preserving location种源 Provenance 北京
Beijing河北
Hebei山东
Shandong河南
Henan山西
Shanxi陕西
Shaanxi甘肃
Gansu安徽
Anhui江苏
Jiangsu山东冠县
Guanxian County, Shandong初期保存
Initial storage98 242 164 241 136 97 37 10 22 现存雌株
Existing female plant2 16 3 28 2 19 0 0 4 现存雄株
Present male plant19 115 17 89 88 46 6 5 6 现存总计
Existing total21 131 20 117 90 65 6 5 10 山西朔州
Shuozhou City, Shanxi初期保存
Initial storage37 89 10 27 21 9 4 1 3 1.2 研究方法
1.2.1 植物基因组DNA提取与分子标记分析
利用天根植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co. Ltd，Beijing，China）提取毛白杨总DNA。利用韩志强等[15]建立的山东冠县毛白杨指纹图谱库中25对核心引物进行引物筛选，以山西朔州市金沙植物园保存的370个毛白杨无性系DNA为模板进行荧光PCR，筛选出不同无性系中位点有显著差异的13对SSR引物，引物序列见表2。PCR过程中各引物所用荧光标签与韩志强等[15]建立的指纹图谱所用荧光标签保持一致。在5′端加上M13序列（5′TGTAAAACGACGGCCAGT3′）作为上游引物，下游引物添加带有荧光标签的M13序列（TAMRA、HEX、ROX、FAM）[16]。
表 2 朔州市毛白杨种质资源库13对SSR标记信息表Table 2. Information of 13 pairs of SSR markers in Shuozhou City P. tomentosa germplasm bank引物
Primer引物序列（5′—3′）
Primer sequence (5′−3′)Na MAF GD He PIC H I 1 F: GTCAGTTTGCCCTCTTCGTC 3 0.493 0.588 0.116 0.503 0.523 2.028 R: TGAGGGCGTCTCCTCTTTTA 2 F: TCAACGACTTTTTCATTGTG 5 0.518 0.620 0.941 0.553 0.581 2.219 R: CGAGTATGTTAGGAGGTTGG 3 F: ATCCGACTTCGATATCTTCA 3 0.508 0.518 0.022 0.402 0.431 1.497 R: CTACCTGAAACACAGGAAGC 4 F: GCTGTCAGAATCAAACACTTC 2 0.749 0.376 0.503 0.306 0.324 1.176 R: AAGCAGATAACTAAGACATGCC 5 F: CGATGAGGTTGAAGAAGTCG 3 0.751 0.375 0.492 0.307 0.334 1.267 R: ATATATGTACCGGCACGCCAC 6 F: AACCCACTTCCTCTCTCTGT 6 0.596 0.563 0.776 0.501 0.573 2.136 R: GTGAGACTTCCGACTCGTAG 7 F: ATTGATTATATTTGCCGCAT 6 0.357 0.733 0.765 0.686 0.706 2.611 R: TGGACATCTCACTACCTTCC 8 F: TTAGAGGAGAGAACTGCTGC 7 0.385 0.735 0.695 0.693 0.642 2.584 R: TGGTCTGCAACACAAGATT 9 F: TTCCTTTCACACAATGACAA 11 0.278 0.773 0.970 0.735 0.711 2.669 R: TTTAAAAACTGGGTCCGTAA 10 F: ATAGCGATCATCAAAGGAAA 4 0.631 0.540 0.657 0.490 0.526 1.955 R: AAATATTCATGTGGAGGCAC 11 F: AAGCTTCATCGTCCTGCTTG 3 0.526 0.500 0.946 0.376 0.361 0.755 R: CGTATCAATTCACGACTCTCG 12 F: ACAAATCAAAGTCACAGCCT 5 0.739 0.390 0.514 0.320 0.335 0.842 R: ATAGTGTTCAATCGGACCTG 13 F: TTACTTGCTAGCTGCCAATC 9 0.738 0.440 0.197 0.424 0.473 1.213 R: CCTAAAAGTTTGTCTATGCGA 平均值 Mean 5 0.559 0.550 0.584 0.484 0.502 1.766 注：Na. 等位基因数量；MAF. 主要等位基因频率；GD. 基因多样性；He. 期望杂合度；PIC. 多态性信息含量；H. Nei’s遗传多样性指数；I. Shannon’s信息指数。Notes: Na, number of alleles; MAF, major allele frequency; GD, genetic diversity; He, expected heterozygosity; PIC, polymorphism information content; H, Nei’s gene diversity; I, Shannon’s information index. 1.2.2 毛细管电泳检测及结果分析
具体PCR程序：93 ℃ 5 min；93 ℃ 30 s，退火52 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，运行25个循环；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，运行8个循环；70 ℃ 8 min；4 ℃ 5 min。PCR产物交由擎科测序公司通过ABI-3730XL基因分析仪读取分析，使用GeneMarker 1.75等软件进行SSR分型分析[17]。通过CERVUS软件鉴定个体，依此判断该个体所属的基因型在山西朔州群体中是否为单一存在[18]。
1.2.3 山西现存种质资源群体遗传多样性分析
以山西朔州市鉴定出的毛白杨无性系为对象，计算所有毛白杨无性系的群体遗传参数，利用Powermarker 3.25软件分析位点多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）、等位基因数量（Na）、主要等位基因频率（MAF）、期望杂合度（He）、Shannon’s信息指数（I）等[19]。
1.2.4 山东和山西现存的种质资源群体遗传结构分析
以山西朔州市鉴定出的毛白杨无性系以及山东冠县保存的除三倍体之外的441个无性系为对象，利用NTSYS 2.10软件计算所有无性系间的遗传相似系数（genetic similarity，GS）[20]。山东省冠县保存的毛白杨SSR位点信息源于课题组前期研究报道的指纹图谱数据[15]。利用Structure 2.3.3分析群体遗传结构，根据10省毛白杨来源将最佳群体数目（K）设置2 ~ 15之间，对每个群体数目各进行10次的模拟运算，参数迭代次数（length of burnin period）设置为10 000，蒙特卡洛迭代次数（Marko chain Monte Carlo iterations replications，MCMC）设为50 000次 [21]。当似然值和K值同时增加，则计算ΔK，以确定最适K值[22]。
1.2.5 生长性状调查
使用测高仪测量山西省朔州市现存树龄相同的毛白杨无性系的树高（h），利用围尺测量胸径（D）。侧枝等级估计标准：侧枝其基部直径小于10 cm标记为1级，10 ~ 20 cm标记为2级，20 ~ 30 cm标记为3级，30 ~ 40 cm标记为4级，40 ~ 50 cm标记为5级，大于50 cm标记为6级。耐寒等级按：无冻痕为Ⅰ级，冻裂痕小于10 cm为Ⅱ级，冻裂痕小于50 cm大于10 cm为Ⅲ级，冻裂痕大于50 cm为Ⅳ级，主干有顶端冻干、抽条现象为Ⅴ级。毛白杨的材积生长量（V）计算公式[23]如下所示。
V=0.5134h0.828956D1.995375 最终按耐寒等级群体计算各生长指标平均值，利用Excel和SPSS对生长数据进行分析。
2. 结果与分析
2.1 山西省朔州市毛白杨种质资源无性系鉴定
在课题组前期研究筛选出的25对SSR核心引物基础上[15]，对朔州市保存的370株毛白杨进行SSR分子鉴定分析，这370株毛白杨分别归属于183个无性系，其中138个无性系，仅分别保存1个单株；最多的1个无性系保存了40个单株（图1）。进一步对SSR多态性位点进行分析（表2），发现仅采用25对SSR引物中的13对SSR引物就可以将这183个毛白杨无性系完全区分开来。根据这13对扩增稳定、条带清晰的SSR引物，可检测到67个等位基因，变异幅度在2 ~ 11之间，每个位点平均检测到5个等位基因。其中引物扩增等位基因点数最多的引物是Primer 9，最少的引物是Primer 4（表2）。进一步比对两地现存毛白杨种质资源的指纹图谱发现，朔州市种质资源库现存183个无性系与冠县种质资源库441个毛白杨无性系指纹图谱均存在一定差异，表明两地现存的种质资源并无重复的无性系。进一步采用流式细胞仪对朔州市种质资源库现存183个无性系进行倍性分析，没有发现其中有天然三倍体等多倍体无性系存在。通过花果观察确定朔州市现存183个无性系中只有3个无性系为雄株，其余均为雌株。
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图 1 山西朔州毛白杨无性系分株数分布图Figure 1. Distribution of the number of Populus tomentosa clones in Shuozhou City, Shanxi Province![]()
图 2 毛白杨SSR电泳分析及无性系间遗传相似性频次分布图A. SSR毛细管电泳峰图；B. 无性系间遗传相似性频次分布图。A, plot of SSR capillary electrophoresis peak; B, frequency distribution of genetic similarity among clones.Figure 2. Allelic configurations of P. tomentosa and distribution of genetic similarity coefficient2.2 山西省朔州市毛白杨种质资源遗传多样性分析
对基因型不同的183个毛白杨无性系进行遗传多样性分析，引物3和引物5的毛细管电泳结果如图2A所示。
遗传多样性分析结果（表2）表明：平均基因多样性0.550，变异幅度为0.375 ~ 0.773；13对标记的PIC的变异幅度为0.306 ~ 0.735，平均为0.484；其中，高度多态性位点6个，PIC大于0.50（46%）；中度多态性位点7个，PIC在0.3 ~ 0.5之间（54%）。Nei’s遗传多样性系数在0.324 ~ 0.711之间，并且Shannon’s多态性指数在0.755 ~ 2.669之间，表明朔州市现存毛白杨优树的群体遗传多样性位于中等水平。对183个毛白杨无性系两两成对计算无性系间遗传相似系数，共获得16 745个遗传相似系数，变幅为0.53 ~ 0.93，平均为0.73（图2B）。由图2B可见，183个无性系间的遗传相似系数整体分布基本呈正态趋势，80.9%的无性系间遗传相似系数在0.60 ~ 0.90之间，说明183个毛白杨无性系具有较丰富的遗传多样性。
2.3 南北两地毛白杨种质资源遗传结构分析
将山东省冠县毛白杨种质资源库现存的441个二倍体毛白杨无性系与朔州市现存的183个毛白杨无性系进行遗传结构分析（图3），在3 ~ 12范围内，当K为7时，ΔK表现为明显峰值，据此将624个毛白杨无性系划分为7个类群。其中标记为红色和绿色模块包含的个体总计179个毛白杨无性系。其中156个毛白杨无性系来自朔州市现存无性系，剩余23个毛白杨无性系则是来自河北、北京两种源地的无性系。其他模块包含的无性系则主要是山东现存资源，判断两地现存群体间遗传变异较大，遗传距离相对较远。而朔州剩余27个无性系分属于蓝色和棕色聚类模块，这2个模块主要是由山东冠县现存的河北、山西、陕西种源无性系构成。
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图 3 现存183个杨树无性系的群体遗传结构分析A. 基于SSR标记的毛白杨系统进化树；B. ΔK随K值的变化趋势，K为最佳群体数；C. K = 7时，以Structure运算获得的群体遗传结构，Q值为遗传变异系数。A, SSR marker-based phylogenetic tree of Populus tomentosa; B, trend of ΔK with K value, K represents best group number; C, population genetic structure obtained by structure operation at K = 7, Q value represents coefficient of genetic variation.Figure 3. Population genetic structure analysis of 183 existing poplar clones2.4 山西省朔州市毛白杨种质资源生长和耐寒性评价
按耐寒性将朔州市现存183个毛白杨无性系分为5个等级（表3），其中耐寒性Ⅰ级包括47个无性系，Ⅱ级包括56个无性系，Ⅲ级包括30个无性系，Ⅳ级包括24个无性系，Ⅴ级包括26个无性系。统计分析每个等级中所有毛白杨的树高、胸径、材积、侧枝粗度等形状指标（表3）。结果表明：不同耐寒性群体之间毛白杨的平均胸径、树高、冠幅存在极显著差异，而材积和侧枝评估值的差异达到显著性水平，其中材积性状差异最为显著。就胸径而言，平均值最大值达到了29.51 cm，而最低仅为26.70 cm；树高和材积平均值则分别在14.63~ 15.94 m和0.336 ~ 0.426 m3之间变化。树高和材积等生长指标的最高值都出现在耐寒性较强的Ⅰ、Ⅱ级群体，极低值都出现在耐寒性较差的Ⅳ、Ⅴ级群体。所以耐寒性强的群体相对生长量更大，耐寒性较差的群体则因冻害影响，相对生长量较小。
表 3 耐寒性等级不同的毛白杨群体生长情况分析Table 3. Analysis of the growth of populations of woolly poplar with different cold hardiness classes抗寒等级
Cold tolerance level无性系数
Clone coefficient平均胸径
Mean DBH/cm平均树高
Mean tree height/m平均材积
Mean volume of timber/m3冠幅
Crown diameter/m侧枝评估值
Lateral branch evaluation valueⅠ 47 28.31 ± 5.00 b 15.94 ± 5.23 a 0.426 ± 0.175 a 3.59 ± 0.71 b 56.80 ± 23.20 b Ⅱ 56 29.51 ± 4.99 a 15.51 ± 4.83 a 0.412 ± 0.180 a 3.99 ± 0.51 a 61.40 ± 27.10 a Ⅲ 30 27.13 ± 2.67 c 15.30 ± 6.05 ab 0.368 ± 0.213 b 3.05 ± 0.34 c 51.40 ± 27.10 c Ⅳ 24 26.70 ± 6.51 d 14.63 ± 2.83 ab 0.361 ± 0.195 b 3.83 ± 0.67 a 45.80 ± 23.30 d Ⅴ 26 27.31 ± 5.00 c 14.79 ± 4.43 b 0.336 ± 0.087 c 3.56 ± 0.31 b 44.90 ± 26.10 d 平均值 Mean 27.79 ± 5.23 15.23 ± 4.67 0.380 ± 0.170 3.60 ± 0.50 54.06 ± 25.36 F 3.91** 2.99** 1.93* 2.73** 1.66* 注：*表示显著差异（P < 0.05），**表示极显著差异（P < 0.01）。不同字母表示同一性状在不同群体间存在显著差异（P < 0.05）。Notes: * indicates a significant difference at the P < 0.05 level, ** indicates a highly significant difference at the P < 0.01 level. Different letters indicate a significant difference at the P < 0.05 level among different groups of the same trait. 3. 讨 论
森林种质资源的保存，是目前全球生物多样性保护的重点问题之一。从1983年起，毛白杨良种选育课题组从全国10省市收集优树1 047株，并于山东冠县建立了毛白杨种质资源库[3]。1988年，又将全套1 047株毛白杨引入到山西省太原市进行种质资源保存和耐寒对比试验，后期又引入到朔州[4−5]。对毛白杨全分布区100个县内16个反映热、光、水的气象因子进行主分量分析和ISODATA的模糊聚类，可将整个分布分为南部气候区、东北部气候区和西北部气候区3个气候区。其中，山东冠县位于南部气候区，而山西省太原市和朔州市位于西北部气候区[24]。目前，位于山东省冠县的毛白杨种质资源库现存469个优良无性系，其中三倍体无性系28个，而山西朔州经本次SSR分子标记鉴定，发现仅保留毛白杨种质资源183个无性系，且与山东省冠县所保存的469个毛白杨无性系并无重复基因型。从分布看，冠县毛白杨种质资源保存库现存无性系多为南部气候区种源、东北部气候区的南部种源以及西北气候区纬度偏中部和南部种源，其中现存的90个山西来源的无性系多属于晋南和晋中种源。因此推测在朔州市现存183份毛白杨种质资源中，大部分来源于1993年经过太原栽培试验初选出的较为耐寒的232个无性系，是冠县毛白杨种质资源库中被选择淘汰的属于河北、北京、山西、陕西等纬度偏北分布区内的种源。此外，现存种质还包括20世纪六七十年代收集于大同的毛白杨无性系，以及朔州市植物园后期在山西境内收集的部分毛白杨无性系。从南北两地现存毛白杨种质资源的遗传结构对比看，朔州市现存无性系和冠县所保存的山西无性系的遗传距离较近，其中大部分与河北、北京部分无性系共同聚为2类，这也佐证了上述推测的合理性。由于种质资源保存地的气候条件对一些不适应的基因型具有选择作用，因此，对于分布区较大或分布区生态条件变化较大的树木种质资源收集保存而言，至少应做到按气候区划保存，最好按气候区划的亚区保存，以保证所收集的大多数林木种质资源的安全性[6]。
毛白杨自然群体存在丰富的遗传变异，不同地理种源差异显著[2,25]。通过AFLP分子标记对9个省份来源的211份毛白杨无性系材料进行系统分析，共75.23%的遗传多样性源于种源内，各个种源之间的遗传变异差异显著[26]。对冠县种质资源库内保存的9个种源共计469个毛白杨无性系进行群体遗传分化及遗传多样性分析，不同地理来源群体间的遗传分化系数较小，这些种源内无性系间的变异是群体的遗传变异主要来源[27]。就两地现存种质资源的遗传多样性水平看，山东省现存441个毛白杨二倍体无性系Nei’s遗传多样性指数在0.091 ~ 0.689之间，Shannon’s多态性指数在0.191 ~ 1.575之间[28]。朔州市现存183个毛白杨无性系13对引物中共扩增出67个等位基因，遗传多样性系数分布在0.55以上，并且80%以上的材料遗传相似系数分布在0.60 ~ 0.90之间；Nei’s遗传多样性系数在0.324 ~ 0.711之间，Shannon’s多态性指数在0.755 ~ 2.669之间，说明朔州市现存毛白杨无性系具有较为丰富的遗传多样性。虽然两地现存种质资源数量和无性系不同，但遗传多样性差异并不显著。朔州市现存优树群体Shannon’s多态性指数平均值为1.776，高于冠县群体平均值，可能是朔州市现存无性系数量相对较少导致。基于遗传结构分析，可将两地保存的624个毛白杨二倍体无性系划分为7个类群，其中朔州市现存种质资源中的156个毛白杨无性系主要归于2个类群，属于这2个类群的另外23个毛白杨无性系则为冠县种质资源库内选自河北、北京两地的种源；朔州种质库余下的27个无性系所属类群则主要由冠县现存的河北、山西、陕西种源构成。显然，经过30多年自然选择，山东冠县种质资源库淘汰了毛白杨分布区偏北部的部分种质，而山西朔州市种质资源库则淘汰了毛白杨分布区偏南部的部分种质，导致两地现存毛白杨种质资源产生了显著的遗传分化。两地现存种质资源群体遗传结构差异较大，遗传距离相对较远，这为育种工作中杂交亲本选配提供了更多的选择，从两地现存种质中选择亲本杂交有利于获得较高遗传增益。
毛白杨广泛分布于黄淮海流域的10省范围，选育耐寒抗旱品种，拓展毛白杨栽培范围是毛白杨育种目标之一[2]。因毛白杨雌配子败育严重[29]，朱之悌等[2,30]采用毛白杨杂种毛新杨（Populus tomentosa × P. bolleana）与分布区偏北的银灰杨（Populus canescens）、大齿杨（Populus grandidentata）杂交，成功获得了一批毛新杨 × 银灰杨双杂交种（（Populus tomentosa × P. bolleana） × （P. alba × P. tremula）），以及毛大杨（（Populus tomentosa × P. bolleana） × P. grandidentata）耐寒品种。山西朔州地处毛白杨分布北界，年极端最低温−27.8 ℃，极值−32.4 ℃。现存于朔州的183个无性系，尤其是耐寒性突出的Ⅰ级毛白杨优株，无任何冻害现象，且保持较高的生长量，是毛白杨耐寒育种的珍贵种质资源。从朔州市现存毛白杨的表现看，冻害越严重的生长越差，表明冻害损伤对毛白杨生长有较大的影响。需要特别指出的是，山东冠县现存种质资源中大多为雄株无性系。而山西朔州保存的183个毛白杨无性系中只有3个雄株，另180个均为雌株。这些雌株对于毛白杨高轮次遗传改良的育种群体构建以及抗寒育种具有重要价值。至于山东冠县和山西朔州市两地现存毛白杨种质资源雌，雄株数量为何存在如此之大差异，毛白杨雌株耐旱性是否更强等问题，有待进一步研究。
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图 1 山西朔州毛白杨无性系分株数分布图
Figure 1. Distribution of the number of Populus tomentosa clones in Shuozhou City, Shanxi Province
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图 2 毛白杨SSR电泳分析及无性系间遗传相似性频次分布图
A. SSR毛细管电泳峰图；B. 无性系间遗传相似性频次分布图。A, plot of SSR capillary electrophoresis peak; B, frequency distribution of genetic similarity among clones.
Figure 2. Allelic configurations of P. tomentosa and distribution of genetic similarity coefficient
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图 3 现存183个杨树无性系的群体遗传结构分析
A. 基于SSR标记的毛白杨系统进化树；B. ΔK随K值的变化趋势，K为最佳群体数；C. K = 7时，以Structure运算获得的群体遗传结构，Q值为遗传变异系数。A, SSR marker-based phylogenetic tree of Populus tomentosa; B, trend of ΔK with K value, K represents best group number; C, population genetic structure obtained by structure operation at K = 7, Q value represents coefficient of genetic variation.
Figure 3. Population genetic structure analysis of 183 existing poplar clones
表 1 山东、山西毛白杨种质资源库保存优树情况一览表
Table 1 List of preserved excellent trees in Shandong and Shanxi P. tomentosa germplasm resource banks
保存地点
Preserving location种源 Provenance 北京
Beijing河北
Hebei山东
Shandong河南
Henan山西
Shanxi陕西
Shaanxi甘肃
Gansu安徽
Anhui江苏
Jiangsu山东冠县
Guanxian County, Shandong初期保存
Initial storage98 242 164 241 136 97 37 10 22 现存雌株
Existing female plant2 16 3 28 2 19 0 0 4 现存雄株
Present male plant19 115 17 89 88 46 6 5 6 现存总计
Existing total21 131 20 117 90 65 6 5 10 山西朔州
Shuozhou City, Shanxi初期保存
Initial storage37 89 10 27 21 9 4 1 3 
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表 2 朔州市毛白杨种质资源库13对SSR标记信息表
Table 2 Information of 13 pairs of SSR markers in Shuozhou City P. tomentosa germplasm bank
引物
Primer引物序列（5′—3′）
Primer sequence (5′−3′)Na MAF GD He PIC H I 1 F: GTCAGTTTGCCCTCTTCGTC 3 0.493 0.588 0.116 0.503 0.523 2.028 R: TGAGGGCGTCTCCTCTTTTA 2 F: TCAACGACTTTTTCATTGTG 5 0.518 0.620 0.941 0.553 0.581 2.219 R: CGAGTATGTTAGGAGGTTGG 3 F: ATCCGACTTCGATATCTTCA 3 0.508 0.518 0.022 0.402 0.431 1.497 R: CTACCTGAAACACAGGAAGC 4 F: GCTGTCAGAATCAAACACTTC 2 0.749 0.376 0.503 0.306 0.324 1.176 R: AAGCAGATAACTAAGACATGCC 5 F: CGATGAGGTTGAAGAAGTCG 3 0.751 0.375 0.492 0.307 0.334 1.267 R: ATATATGTACCGGCACGCCAC 6 F: AACCCACTTCCTCTCTCTGT 6 0.596 0.563 0.776 0.501 0.573 2.136 R: GTGAGACTTCCGACTCGTAG 7 F: ATTGATTATATTTGCCGCAT 6 0.357 0.733 0.765 0.686 0.706 2.611 R: TGGACATCTCACTACCTTCC 8 F: TTAGAGGAGAGAACTGCTGC 7 0.385 0.735 0.695 0.693 0.642 2.584 R: TGGTCTGCAACACAAGATT 9 F: TTCCTTTCACACAATGACAA 11 0.278 0.773 0.970 0.735 0.711 2.669 R: TTTAAAAACTGGGTCCGTAA 10 F: ATAGCGATCATCAAAGGAAA 4 0.631 0.540 0.657 0.490 0.526 1.955 R: AAATATTCATGTGGAGGCAC 11 F: AAGCTTCATCGTCCTGCTTG 3 0.526 0.500 0.946 0.376 0.361 0.755 R: CGTATCAATTCACGACTCTCG 12 F: ACAAATCAAAGTCACAGCCT 5 0.739 0.390 0.514 0.320 0.335 0.842 R: ATAGTGTTCAATCGGACCTG 13 F: TTACTTGCTAGCTGCCAATC 9 0.738 0.440 0.197 0.424 0.473 1.213 R: CCTAAAAGTTTGTCTATGCGA 平均值 Mean 5 0.559 0.550 0.584 0.484 0.502 1.766 注：Na. 等位基因数量；MAF. 主要等位基因频率；GD. 基因多样性；He. 期望杂合度；PIC. 多态性信息含量；H. Nei’s遗传多样性指数；I. Shannon’s信息指数。Notes: Na, number of alleles; MAF, major allele frequency; GD, genetic diversity; He, expected heterozygosity; PIC, polymorphism information content; H, Nei’s gene diversity; I, Shannon’s information index.
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表 3 耐寒性等级不同的毛白杨群体生长情况分析
Table 3 Analysis of the growth of populations of woolly poplar with different cold hardiness classes
抗寒等级
Cold tolerance level无性系数
Clone coefficient平均胸径
Mean DBH/cm平均树高
Mean tree height/m平均材积
Mean volume of timber/m3冠幅
Crown diameter/m侧枝评估值
Lateral branch evaluation valueⅠ 47 28.31 ± 5.00 b 15.94 ± 5.23 a 0.426 ± 0.175 a 3.59 ± 0.71 b 56.80 ± 23.20 b Ⅱ 56 29.51 ± 4.99 a 15.51 ± 4.83 a 0.412 ± 0.180 a 3.99 ± 0.51 a 61.40 ± 27.10 a Ⅲ 30 27.13 ± 2.67 c 15.30 ± 6.05 ab 0.368 ± 0.213 b 3.05 ± 0.34 c 51.40 ± 27.10 c Ⅳ 24 26.70 ± 6.51 d 14.63 ± 2.83 ab 0.361 ± 0.195 b 3.83 ± 0.67 a 45.80 ± 23.30 d Ⅴ 26 27.31 ± 5.00 c 14.79 ± 4.43 b 0.336 ± 0.087 c 3.56 ± 0.31 b 44.90 ± 26.10 d 平均值 Mean 27.79 ± 5.23 15.23 ± 4.67 0.380 ± 0.170 3.60 ± 0.50 54.06 ± 25.36 F 3.91** 2.99** 1.93* 2.73** 1.66* 注：*表示显著差异（P < 0.05），**表示极显著差异（P < 0.01）。不同字母表示同一性状在不同群体间存在显著差异（P < 0.05）。Notes: * indicates a significant difference at the P < 0.05 level, ** indicates a highly significant difference at the P < 0.01 level. Different letters indicate a significant difference at the P < 0.05 level among different groups of the same trait.
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