Stress response and molecular docking analysis of ryanodine receptor (RyR) in Hyphantria cunea to chlorantraniliprole
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摘要:目的
阐明美国白蛾鱼尼丁受体（RyR）如何参与氯虫苯甲酰胺对美国白蛾的毒杀作用，并探究RyR与氯虫苯甲酰胺的分子对接模式，以期揭示美国白蛾RyR基因响应氯虫苯甲酰胺胁迫的分子机制。
方法克隆获得美国白蛾RyR基因的完整cDNA序列，采用实时荧光定量RT-PCR技术分析RyR基因的时空表达模式以及在亚致死质量浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下美国白蛾RyR基因的表达水平。通过RNAi技术沉默美国白蛾RyR基因，进而测定沉默体在氯虫苯甲酰胺胁迫下的存活率，探讨美国白蛾RyR基因对氯虫苯甲酰胺抗性的调控作用。利用Discovery Studio 2019 Client软件对氯虫苯甲酰胺与RyR受体进行分子对接，并通过结合能和可视化分析对接情况。
结果（1）氯虫苯甲酰胺对美国白蛾3龄幼虫72 h的致死中质量浓度（LC50）和亚致死质量浓度（LC30）分别为21.40、11.13 μg/L，显示出较高的生物活性。（2）在氯虫苯甲酰胺LC30质量浓度（11.13 μg/L）处理下，美国白蛾3龄幼虫RyR基因的相对表达量随处理时间的延长表现为先升高后降低，处理48和72 h分别为对照组的2.6倍和1.5倍。（3）HcRyR基因沉默体在氯虫苯甲酰胺LC30胁迫下72 h时存活率为73.33%，显著高于对照组的46.66%，表明沉默RyR基因显著降低了美国白蛾3龄幼虫对氯虫苯甲酰胺的敏感性。（4）分子对接结果表明RyR与氯虫苯甲酰胺的结合能为−31.35 kJ/mol，两者间存在氢键与范德华力使其稳定结合。
结论明确美国白蛾RyR基因对氯虫苯甲酰胺胁迫响应分子机制，为进一步认识美国白蛾RyR结构，并为靶向杀虫剂开发提供理论依据。
Abstract:ObjectiveThe ryanodine receptor (RyR) of Hyphantria cunea was involved in the toxic mechanism of chlorantraniliprole to Hyphantria cunea, and the molecular docking mode of RyR and chlorantraniliprole was explored. The study provided a theoretical basis for analyzing the molecular mechanism of RyR gene of Hyphantria cunea in response to chlorantraniliprole stress.
MethodThe full-length cDNA of RyR gene was cloned from Hyphantria cunea. The temporal and spatial expression patterns of RyR gene and the expression level of RyR gene in Hyphantria cunea under sublethal concentration of chlorantraniliprole stress were analyzed by real-time fluorescence quantitative RT-PCR. The RyR gene of Hyphantria cunea was silenced by RNAi technology, and the survival rate of silencer under chlorantraniliprole stress was determined to explore the regulation of RyR gene of Hyphantria cunea on chlorantraniliprole resistance. The molecular docking of chlorantraniliprole and RyR was analyzed by Discovery Studio 2019 Client software. The docking situation was analyzed by binding energy and visualization.
Result(1) The median lethal concentration (LC50) and sub-lethal concentration (LC30) of chlorantraniliprole were 21.40 μg/L and 11.13 μg/L for 72 h, respectively, indicating that chlorantraniliprole had high biological activity against the 3rd instar Hyphantria cunea larvae. (2) The relative expression of RyR gene in the 3rd instar Hyphantria cunea larvae increased firstly and then decreased with time under the treatment of chlorantraniliprole LC30 concentration (11.13 μg/L). The relative expression of RyR gene in 48 h and 72 h was 2.6- and 1.5-fold of that in control group, respectively. (3) The survival rate of Hyphantria cunea with RyR gene silencing was 73.33%, while that of control group with GFP gene silencing was 46.66% under LC30 stress of chlorantraniliprole at 72 h. Silencing RyR gene significantly reduced the sensitivity of 3rd instar Hyphantria cunea larvae to chlorantraniliprole. (4) Molecular docking showed that the binding energy of RyR and chlorantraniliprole was −31.35 kJ/mol, and there were hydrogen bonds and van der Waals force between them to make them stable.
ConclusionThese results clarify the molecular mechanism of RyR gene in response to chlorantraniliprole stress, and further understand the structure of RyR in Hyphantria cunea and provide a theoretical basis for the development of targeted insecticides.
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Keywords:
- Hyphantria cunea /
- ryanodine receptor (RyR) /
- chlorantraniliprole /
- gene expression /
- RNAi /
- molecular docking
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美国白蛾（Hyphantria cunea）是一种世界性检疫害虫，近年来对农林牧业造成了严重危害[1]。化学防治作为控制美国白蛾的主要手段，具有操作简便、防治迅速、效果显著等特点，是快速抑制其种群数量、减轻危害的重要方法，极大地减少了美国白蛾的扩散[2−3]。氯虫苯甲酰胺属于邻甲酰胺基苯甲酰胺类杀虫剂，它不仅对幼虫有持久的作用效果，而且具有杀卵活性，是用于鳞翅目（Lepidoptera）害虫防治的常用且效果显著的杀虫剂之一[4−7]。该杀虫剂以昆虫体内鱼尼丁受体（ryanodine receptor，RyR）为作用靶标，引起昆虫体内钙离子大量释放，导致昆虫肌肉非正常收缩、抽搐以及死亡[8]。RyR是目前已知最大的离子通道蛋白之一，由4个相同亚基组成的钙离子通道蛋白，每个亚基约由5 000个氨基酸组成，主要分布于细胞的内质网和肌肉的肌质网表面，属于一类配体门控的钙离子释放通道，控制细胞内钙离子的释放[9−13]。鱼尼丁受体作为新型作用靶标的研究受到了广泛关注[14−16]。李康等[17]研究发现，双酰胺类杀虫剂通过作用于草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）机体中的RyR，当杀虫剂进入昆虫体内并刺激RyR时，昆虫体腔中的钙离子被无限释放，细胞内外钙离子浓度失衡，引起神经肌肉调节功能衰弱，致使昆虫不自主地抽搐进而死亡。王少丽等[18]研究发现，甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）对氯虫苯甲酰胺的抗药性表现在幼虫阶段，且RyR基因的表达量变化与氯虫苯甲酰胺诱导有关。孙丽娜等[19]在对比氯虫苯甲酰胺抗性和敏感品系小菜蛾（Plutella xylostella）的研究中发现，抗性品系体内RyR基因表达量为敏感品系的5.79倍。刘亚萍[20]通过RNAi沉默赤拟谷盗（Tribolium castaneum）体内RyR基因，发现其在后翅折叠及行动能力中发挥重要的调控作用。这些研究表明，RyR基因已被证实是鳞翅目、双翅目等代表性昆虫中二酰胺类杀虫剂的作用靶标[8]，在昆虫的生长发育与对双酰胺类杀虫剂抗性调控中发挥重要作用。
分子对接是一种模拟蛋白质及配体间相互作用模式的方法，基于化合物几何结构匹配的锁钥学说和蛋白–配体识别过程的诱导契合学说，具有快速且成本低廉的优势[21]。具体内容包括蛋白质3D建模、配体小分子构象搜寻、二者结合位点的识别及对接结果的评估，它能够准确模拟蛋白质与小分子复合物的空间构型，常用于模拟昆虫蛋白与小分子化合物的结合，在昆虫代谢杀虫剂分子机制研究中发挥着重要作用[22−25]。然而，体外检测法、荧光竞争法等方法过于耗时且价格高昂，不能在短时间内分析大量蛋白与小分子对接结果[26−27]。杨耀[28]通过分析3种昆虫RyR的3个结合位点及结合自由能，发现白背飞虱（Sogatella furcifera）和马铃薯甲虫（Leptinrotarsa decemlineata）RyR的结合能力低于靶标昆虫烟青虫（Helicoverpa assulta）。高晓进等[29]通过分子对接发现花椒窄吉丁（Agrilus zanthoxylumi）感受蛋白AzanCSP7与其寄主挥发物可巴烯有较好的亲和力，表明AzanCSP7参与识别寄主挥发物的过程。分子对接技术已在多种昆虫中进行了分析研究，对筛选与验证新型绿色杀虫剂具有重要功能[23]。
研究表明氯虫苯甲酰胺对鳞翅目害虫具有显著的防治效果。此外，许多昆虫的RyR基因已被成功克隆[30]。然而，目前尚未有关于美国白蛾RyR基因在胁迫条件下表达情况及其分子功能的研究报道。因此，探讨美国白蛾的内在暴发灾变机制，寻找新的分子靶标，对于开发绿色防治技术具有重要意义。本研究旨在明确美国白蛾RyR基因对氯虫苯甲酰胺胁迫响应分子机制，并探究RyR与氯虫苯甲酰胺的分子对接模式。这将有助于深入理解美国白蛾RyR的结构，指导科学用药，并为靶向杀虫剂的研发提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 研究材料
美国白蛾卵块与人工饲料购自中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所。使用10%甲醛溶液对卵块进行熏蒸消毒，然后在温度为（25 ± 1） ℃、湿度60% ~ 70%、光周期为16L∶8D（光照∶黑暗）的培养箱中孵化。幼虫用人工饲料饲喂，并每日更换新鲜干净的饲料。
1.2 研究方法
1.2.1 HcRyR基因克隆与分析
选取美国白蛾的卵、幼虫（1至7龄）、蛹（雌性和雄性）、成虫（雌性和雄性）进行发育阶段的表达分析，选取美国白蛾7龄第1 天幼虫的头、表皮、前肠、中肠、后肠、卵巢、精巢、脂肪体、丝腺和马氏管进行组织表达分析。采用RNeasy Mini动物组织总RNA提取试剂盒（Qiagen）提取总RNA，并以总RNA为模板，使用TaKara公司反转录试剂盒合成第一链cDNA。接着，以合成的cDNA为模板，使用含有T7启动子的引物（表1）进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用Omega E.Z.N.A. Gel Extraction Kit试剂盒回收条带，然后将其连接到pMD18-T载体。将连接产物命名为RyR/pMD18-T，并转化至大肠杆菌中。培养后，筛选阳性克隆，并送至上海生工有限公司进行RyR基因序列的测序验证。
表 1 本文引物序列Table 1. List of primers used in this study基因
Gene正向引物序列（5′—3′）
Forward primer sequence (5′−3′)反向引物序列（5′—3′）
Reverse primer sequence (5′−3′)引物用途
Primer usageHcRyR TGGTCTTGAAACTCTTCAAGAG CGTTGATCTTGTCTATGGCTTC 目的基因扩增
Amplification of
target geneHcRyR TGGTCTTGAAACTCTTCAAGAG CGTTGATCTTGTCTATGGCTTC RT-qPCR EF1α ATGAAATCTCTGTGACCGGGG GCGGTGGTATCGACAAACGT RPL13 GTTAGCTACACAGCTCCGTGG GCAGCAGTTGGGGCTTTAGT dsHcRyR taatacgactcactatagggGCCTTTGGTCCAAGATGATACT taatacgactcactatagggATCCATAAGTCCATCCTTGCTG 合成dsRNA
Synthesis of dsRNAdsGFP taatacgactcactatagggAGAAGAACTTTTCACTGG taatacgactcactatagggTGAACGGATCCATCTTC 注：小写字母表示T7启动子。Note: the lowercase letters indicate T7 promoters. 使用NCBI-ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）获取HcRYR的开放阅读框。使用在线工具ProtParam（http://au.expasy.org/tools/protparam.html）预测蛋白分子量和等电点。使用NCBI-BlastP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTP/）进行同源性分析。使用TMHMM2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行跨膜结构域分析。使用BioEdit软件进行多序列比对。使用MEGA 7软件的Neighbor-Joining（N-J）程序构建系统发育树。
1.2.2 HcRyR基因发育阶段与组织表达分析
使用SYBR SuperMix试剂盒检测不同发育阶段和组织中HcRyR基因的表达量。使用Primer 5.0软件设计HcRyR基因定量引物，以及EF1α、RPL13内参引物（表1）。实时荧光定量RT-PCR反应体系（总体积20 μL），包含10 μL 2 × SYBR premix Ex Taq酶、2 μL cDNA、1 μL Primer mix和7 μL ddH2O。使用荧光定量仪器配备的Opticon Monitor3软件处理数据。
1.2.3 氯虫苯甲酰胺对美国白蛾毒力测定
采用饲料混药法进行毒性处理。选择健康、大小一致的美国白蛾3龄幼虫为试虫。将96%的氯虫苯甲酰胺原药均匀混入人工饲料中，配制成所需浓度的饲料饲喂美国白蛾3龄幼虫。每天更换新鲜的药液饲料。以含有等量丙酮的人工饲料为对照组。每个处理10头幼虫，每组试验重复3次，分别于24、48、72 h统计死亡率。用毛刷轻轻触碰虫体尾部，30 s内不动视为死亡。
1.2.4 氯虫苯甲酰胺胁迫下HcRyR基因表达分析
根据氯虫苯甲酰胺对美国白蛾3龄幼虫72 h的毒力测定结果，采用亚致死质量浓度（LC30）的氯虫苯甲酰胺对美国白蛾3龄幼虫进行处理。选择健康、活泼且大小一致的美国白蛾3龄幼虫，饥饿3 h后，分别放入含有丙酮和氯虫苯甲酰胺的人工饲料中。每个处理30头幼虫，重复3次。在处理24、48、72 h分别挑选活泼的幼虫，用液氮快速冷冻后保存于−80 ℃冰箱内，用于后续检测RyR基因的表达量。提取对照（丙酮处理）和亚致死质量浓度（LC30）氯虫苯甲酰胺分别处理24、48和72 h的美国白蛾3龄幼虫的总RNA，并定量0.5 μg RNA反转录合成cDNA。将合成的cDNA稀释至100 μL，用作实时荧光定量RT-PCR模板。
1.2.5 RyR基因沉默分析
根据已获得的HcRyR基因序列，设计并合成dsHcRyR与dsGFP引物（表1）。选择健康、活泼、同一天进入3龄的美国白蛾幼虫，并将其置于冰上。使用显微注射器（HAMILTON#489323）将1.0 μL dsHcRyR注射至幼虫腹部倒数第2节足间部位。每个处理注射10头幼虫，重复3次，对照组注射dsGFP。在处理24、48和72 h后，分别挑取活泼的3龄幼虫，经液氮速冻后，保存于−80 ℃冰箱，用以检测RNAi基因的沉默效率。
1.2.6 HcRyR基因沉默对氯虫苯甲酰胺胁迫下存活率的影响
选择健康、活泼且大小一致的美国白蛾3龄幼虫，并对它们进行3 h的饥饿处理，然后分别注射dsHcRyR与dsGFP。注射后，饲喂混有LC30氯虫苯甲酰胺的人工饲料，并测定注射dsHcRyR处理组与注射dsGFP对照组在氯虫苯甲酰胺胁迫下24、48、72 h的存活率。每个处理10头幼虫，重复3次，每24 h统计幼虫存活数。以毛笔轻触美国白蛾幼虫腹部无应激反应作为死亡标准。
1.2.7 美国白蛾RyR受体与氯虫苯甲酰胺分子对接
从PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取氯虫苯甲酰胺配体小分子模型，编号为No.11271640，并使用Pymol 2.2.0软件模拟其三维结构。利用Swiss-Model在线网站（https://www.swissmodel.expasy.org/）的模板搜索功能，搜索与美国白蛾RyR氨基酸序列一致性 ≥ 30%，且模板覆盖率超过95%的模板。然后选择排名第一的蛋白晶体结构作为建模模板，并使用Bioedit 7.2.6软件对美国白蛾RyR氨基酸序列进行多序列比对，分析RyR氨基酸序列的相似性，最后对美国白蛾RyR分子进行三维结构建模。蛋白同源建模的评价参照郭冰等[21]的分析方法，使用Discovery Studio 2019 Client（DS 2019）软件中Ramachandran Plot程序对美国白蛾RyR蛋白同源建模进行评估。采用Discovery Studio 2019 Client（DS 2019）软件的精准对接功能（CDOCK）将RyR受体模型和氯虫苯甲酰胺进行分子对接。
1.2.8 数据处理与分析
使用Excel整理数据，利用Probit and Logit Analysis软件计算致死中质量浓度（LC50）和亚致死质量浓度（LC30）及其95%置信区间。基因相对表达量通过2−ΔΔCt方法进行分析[31]，使用SPSS Statistics 24.0 （IBM）软件的Duncan法进行显著性差异分析（P < 0.05），并使用GraphPad Prism软件进行绘图。
2. 结果与分析
2.1 HcRyR基因特性分析
美国白蛾RyR基因的开放阅读框（ORF）长度为15 481 bp，编码5 160个氨基酸。预测的蛋白分子量为583.37 kDa，理论等电点为5.41。跨膜结构域分析显示，HcRyR蛋白含有6个跨膜结构域（图1）。通过NCBI数据库，查找到8种与HcRyR蛋白同源性高（94.84% ~ 95.75%）的昆虫，并进行了进化分析。结果表明，美国白蛾HcRyR蛋白与烟草天蛾（Manduca sexta）的亲缘关系较近，聚为一支，但与谷实夜蛾（Helicoverpa zea）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）的亲缘关系较远（图2）。
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图 1 9种昆虫RyR蛋白多序列比对H. cunea.美国白蛾；H. zea.谷实夜蛾；S. frugiperda.草地贪夜蛾；H. armigera.棉铃虫；S. littoralis.海灰翅夜蛾；S. exigua.甜菜夜蛾；T. ni.粉纹夜蛾；M. sexta.烟草天蛾；C. includens.黄豆银纹夜蛾。红色框线表示跨膜结构域。H. cunea, Hyphantria cunea; H. zea, Helicoverpa zea; S. frugiperda, Spodoptera frugiperda; H. armigera, Helicoverpa armigera; S. littoralis, Spodoptera littoralis; S. exigua, Spodoptera exigua; T. ni, Trichoplusia ni; M. sexta, Manduca sexta; C. includens, Chrysodeixis includens. Red box lines represent transmembrane domains.Figure 1. Multiple sequence alignment of RyR proteins in nine insect species美国白蛾4龄和7龄幼虫阶段HcRyR基因相对表达量高，分别是1龄幼虫的6.57倍与3.50倍，其他幼虫阶段的表达水平范围为对照的0.30 ~ 1.86倍。在卵期、蛹期和成虫期的表达量较低，为对照的0.01 ~ 0.04倍（图3A）。HcRyR基因在各个组织的表达量均高于头部对照组，在中肠的表达量最高，为对照的1 749.47倍；其次为后肠与前肠，分别为对照的1 371.98倍与1 343.95倍。其他组织的表达水平范围为对照的1.53 ~ 11.44倍（图3B）。
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图 3 美国白蛾不同发育阶段（A）和组织（B）HcRyR基因表达1L ~ 7L.1 ~ 7龄幼虫。用Duncan方法分析差异显著性，不同小写字母表示不同处理组间差异显著性（P < 0.05）。1L−7L, 1st−7th instar larvae. Duncan’s method is used to analyze the difference significance, and different lowercase letters indicate difference significance between different treatment groups (P < 0.05).Figure 3. HcRyR gene expression in different development stages (A) and tissues (B) of H. cunea2.2 氯虫苯甲酰胺对美国白蛾毒力
氯虫苯甲酰胺对美国白蛾3龄幼虫的72 h LC30和LC50分别为11.13 μg/L和21.40 μg/L，表现出较高的杀虫活性（表2）。
表 2 氯虫苯甲酰胺对美国白蛾3龄幼虫72 h毒力Table 2. Toxicity of chlorantraniliprole on the 3rd instar H. cunea larvae treated for 72 h毒力回归方程
Toxicity regression equationLC30(95% CI)/(μg·L−1) LC50(95% CI)/(μg·L−1) R2 χ2 df Y = 1.85x + 8.09 11.13 (7.90 ~ 15.68) 21.40 (16.28 ~ 28.12) 0.98 11.12 13 注：LC30和LC50分别为30%和50%死亡率时亚致死质量浓度；95% CI为95%置信区间；R2为相关系数；χ2为卡方值；df为自由度；卡方值小于χ2（13,0.05） = 22.36，故毒力回归方程与实际相符。Notes: LC30 and LC50 are sublethal concentration when mortality rates are 30% and 50% , respectively; 95% CI is 95% confidence interval; R2 is the correlation coefficient; χ2 is the chi-square value; df is degree of freedom; the chi-square value is less than χ2（13,0.05） = 22.36, toxicity regression equation is consistent with the reality. 2.3 氯虫苯甲酰胺胁迫下HcRyR基因表达水平
通过实时荧光定量RT-PCR技术分析LC30亚致死质量浓度的氯虫苯甲酰胺处理美国白蛾3龄幼虫72 h后，RyR基因的表达水平随时间增加表现为先上升后下降。氯虫苯甲酰胺处理24 h后，RyR基因的相对表达量最低，为对照组相对表达量的95%；氯虫苯甲酰胺处理48 h和72 h后，RyR基因的相对表达量均表现为诱导上调，显著高于对照组，分别为对照组的2.6倍和1.5倍（图4）。
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图 4 氯虫苯甲酰胺胁迫下HcRyR基因表达水平ns表示差异不显著（P > 0.05）；***表示在P < 0.001水平上差异极显著。下同。ns indicates difference is not significant (P > 0.05); *** indicates diference is extremely significant at P < 0.001 level. The same below.Figure 4. Expression levels of RyR gene in H. cunea under chlorantraniliprole stress2.4 HcRyR基因沉默对氯虫苯甲酰胺胁迫的影响
与对照组dsGFP相比，注射dsHcRyR后 24、48和72 h，HcRyR基因沉默效率分别为29.71%、72.43%和61.98%（图5）。
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图 5 美国白蛾RyR基因沉默效率*表示在P < 0.05水平上差异显著；****表示在P < 0.000 1水平上差异极显著。* indicates significant difference at P < 0.05 level; **** indicates extremely significant difference at P < 0.000 1 level.Figure 5. RyR gene silencing efficiency of H. cunea测定氯虫苯甲酰胺胁迫对HcRyR基因沉默美国白蛾3龄幼虫存活率的影响。结果表明：24 h时对照组dsGFP的存活率为73.33%，dsHcRyR处理组存活率为93.33%；48 h时对照组dsGFP的存活率为53.33%，dsHcRyR处理组存活率为83.33%；72 h时对照组dsGFP的存活率为46.66%，dsHcRyR处理组存活率为73.33%；3个时间点dsHcRyR处理组存活率均高于对照组dsGFP。HcRyR沉默降低了美国白蛾3龄幼虫对氯虫苯甲酰胺的敏感性（图6）。
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图 6 氯虫苯甲酰胺胁迫下HcRyR基因沉默对美国白蛾幼虫存活率影响Figure 6. Effects of chlorantraniliprole stress on survival rate of H. cunea with HcRyR gene silencing2.5 HcRyR同源建模结果评价及其与氯虫苯甲酰胺的分子对接分析
2.5.1 RyR模型的Ramachandran plot评估
美国白蛾RyR与穴兔（Oryctolagus cuniculus）RyR（模板编号：4uw.1.C）氨基酸序列一致性最高，相似度为51%。该模板符合Swiss-model同源模建序列一致性及模板覆盖率条件，基于该模板构建了美国白蛾RyR同源蛋白三维结构模型，并通过Ramachandran plot对模型进行评估：最优区域占比84.3%，额外允许区域占比10.2%，勉强允许区域占比3.2%，不允许区域仅占比2.2%，HcRyR的全部氨基酸均位于合理区域，满足Ramachandran plot评估中合理区域占比（97.8%） > 90%的条件，表明所构建美国白蛾RyR模型的氨基酸残基构象是合理的，可用于分子对接及分析预测。
2.5.2 RyR与氯虫苯甲酰胺的分子对接分析
分子对接结果显示RyR与氯虫苯甲酰胺的结合特性良好，结合能为−31.35 kJ/mol，表明两者间存在氢键与范德华力使其稳定结合。HcRyR中的缬氨酸（VAL）786、丝氨酸（SER）788、VAL655、半胱氨酸（CYS）789、谷氨酸（GLU）659、精氨酸（ARG）553、天冬酰胺（ASN）652、异亮氨酸（ILE）653和VAL649与氯虫苯甲酰胺通过范德华力结合。亮氨酸（LEU）554通过π-烷基作用与氯虫苯甲酰胺结合。脯氨酸（PRO）785和LEU799通过烷基作用与氯虫苯甲酰胺结合。苯丙氨酸（PHE）797和ARG657通过酰胺-π堆叠作用与氯虫苯甲酰胺结合。VAL658通过不利键与氯虫苯甲酰胺结合。甘氨酸（GLY）656通过氢键与氯虫苯甲酰胺结合。ILE787、PHE654和氯虫苯甲酰胺通过碳氢键结合。这些疏水性残基与氯虫苯甲酰胺的分子间作用力和氢键作用力是促进蛋白–配体结合的主要作用力（图7）。
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图 7 美国白蛾RyR与氯虫苯甲酰胺的结合分析Figure 7. Binding patterns of RyR in H. cunea with chlorantraniliprole3. 讨 论
美国白蛾因其食性杂、繁殖迅速、适应性强，已对我国农林业造成巨大的经济损失。此外，该物种已逐步产生抗药性。因此，寻找新的分子靶标，并开发绿色防治技术，对保护农林业具有重要意义[32]。通过对比美国白蛾与其他8种昆虫物种的RyR蛋白序列，并构建RyR蛋白系统进化树，可以为HcRyR的功能研究提供有效信息。
鱼尼丁受体基因已被证实是双酰胺类药剂的靶标[33]。双酰胺类药剂因其对鳞翅目昆虫的高效性，例如氯虫苯甲酰胺已被逐步推广应用于玉米螟（Pyrausta nubilalis）的田间防治[34]。美国白蛾RyR基因表达水平表现出明显的发育阶段特异性与组织特异性。同时，HcRyR基因参与氯虫苯甲酰胺胁迫响应，表明该基因可作为氯虫苯甲酰胺的关键靶标基因。邓放等[35]发现，在氯虫苯甲酰胺抗性种群的菜青虫（Pieris rapae）中，RyR基因的表达量是敏感种群的6.32倍。孙丽娜等[36]应用qRT-PCR技术证明，桃小食心虫（Carposina sasakii）RyR基因在不同发育阶段表达存在差异。曹晓炜[37]研究发现，与WH-S敏感品系相比，小菜蛾鱼尼丁受体I4790M基因编辑品系对双酰胺类杀虫剂的敏感性下降。Troczka等[38]比较了氯虫苯甲酰胺抗性小菜蛾田间种群与敏感品系的鱼尼丁受体 cDNA 序列，推测基因突变是导致小菜蛾对氯虫苯甲酰胺产生高水平抗性的原因。孙丽娜等[39]采用Illumina HiSeqTM 2000高通量测序技术对苹小卷叶蛾（Adoxophyes orana）进行转录组测序，发现RyR基因在不同发育阶段的表达存在差异，并与有毒物质代谢相关通路有关。杨耀[28]通过RNAi技术明晰白背飞虱和马铃薯甲虫鱼尼丁受体是氯虫苯甲酰胺的作用靶标。本文结果表明，氯虫苯甲酰胺对美国白蛾RyR基因有显著诱导效应，但诱导水平存受时间的显著影响，这与邓放等[35]对菜青虫及孙丽娜等[36,39]对桃小食心虫和苹小卷叶蛾的研究结果一致。沉默HcRyR基因显著降低美国白蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性，这与杨耀[28]对白背飞虱、马铃薯甲虫和烟青虫的研究结果一致。鉴于昆虫鱼尼丁受体的重要作用，其表达基因的下调可能会影响昆虫的蜕皮、交配等行为[28]。因此，利用RNAi技术深入探究RyR基因在美国白蛾生长发育过程中的调控机制是有必要的。
美国白蛾RyR受体与氯虫苯甲酰胺具有较好的结合能力。结合自由能是评估配体与受体间相互作用强度与结合稳定性的关键指标。分子对接技术能够快速且直观地分析美国白蛾RyR与氯虫苯甲酰胺的结合情况，从而提高研究的针对性和准确性[40]。崔琳琳等[41]研究表明：当蛋白质与小分子结合能 < 0 kJ/mol时，它们能够自发结合；当蛋白质与小分子结合能 ≤ −5 kJ/mol时，则表明它们具有较好的结合能力。Gawande等[42]通过分子对接技术分析了棉蚜（Aphis gossypii）GST蛋白与单宁酸的结合能，证明了它们之间具有较强的结合能力。分子模拟技术，尽管在药物开发领域应用最为广泛，但随着计算机科学、统计力学等多种学科的发展，已成为研究昆虫代谢杀虫剂分子机制的重要工具[26]。氢键与范德华力是美国白蛾RyR受体与氯虫苯甲酰胺结合的关键作用力，该结果将为美国白蛾杀虫剂抗性机制的阐释与基于RyR受体结构的新型杀虫剂设计等方面发挥作用。然而，由于本研究采用的是计算机模拟预测的分子对接技术，其预测结果可能与基于RyR受体结构的新型杀虫剂设计试验结果存在差异，因此需要进一步验证。综上所述，本研究阐明了美国白蛾RyR受体对氯虫苯甲酰胺胁迫响应的分子机制，通过分子对接模拟两者间的作用模式，为后续科学用药、高效防治美国白蛾提供理论依据。
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图 1 9种昆虫RyR蛋白多序列比对
H. cunea.美国白蛾；H. zea.谷实夜蛾；S. frugiperda.草地贪夜蛾；H. armigera.棉铃虫；S. littoralis.海灰翅夜蛾；S. exigua.甜菜夜蛾；T. ni.粉纹夜蛾；M. sexta.烟草天蛾；C. includens.黄豆银纹夜蛾。红色框线表示跨膜结构域。H. cunea, Hyphantria cunea; H. zea, Helicoverpa zea; S. frugiperda, Spodoptera frugiperda; H. armigera, Helicoverpa armigera; S. littoralis, Spodoptera littoralis; S. exigua, Spodoptera exigua; T. ni, Trichoplusia ni; M. sexta, Manduca sexta; C. includens, Chrysodeixis includens. Red box lines represent transmembrane domains.
Figure 1. Multiple sequence alignment of RyR proteins in nine insect species
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图 3 美国白蛾不同发育阶段（A）和组织（B）HcRyR基因表达
1L ~ 7L.1 ~ 7龄幼虫。用Duncan方法分析差异显著性，不同小写字母表示不同处理组间差异显著性（P < 0.05）。1L−7L, 1st−7th instar larvae. Duncan’s method is used to analyze the difference significance, and different lowercase letters indicate difference significance between different treatment groups (P < 0.05).
Figure 3. HcRyR gene expression in different development stages (A) and tissues (B) of H. cunea
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图 4 氯虫苯甲酰胺胁迫下HcRyR基因表达水平
ns表示差异不显著（P > 0.05）；***表示在P < 0.001水平上差异极显著。下同。ns indicates difference is not significant (P > 0.05); *** indicates diference is extremely significant at P < 0.001 level. The same below.
Figure 4. Expression levels of RyR gene in H. cunea under chlorantraniliprole stress
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图 5 美国白蛾RyR基因沉默效率
*表示在P < 0.05水平上差异显著；****表示在P < 0.000 1水平上差异极显著。* indicates significant difference at P < 0.05 level; **** indicates extremely significant difference at P < 0.000 1 level.
Figure 5. RyR gene silencing efficiency of H. cunea
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图 6 氯虫苯甲酰胺胁迫下HcRyR基因沉默对美国白蛾幼虫存活率影响
Figure 6. Effects of chlorantraniliprole stress on survival rate of H. cunea with HcRyR gene silencing
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图 7 美国白蛾RyR与氯虫苯甲酰胺的结合分析
Figure 7. Binding patterns of RyR in H. cunea with chlorantraniliprole
表 1 本文引物序列
Table 1 List of primers used in this study
基因
Gene正向引物序列（5′—3′）
Forward primer sequence (5′−3′)反向引物序列（5′—3′）
Reverse primer sequence (5′−3′)引物用途
Primer usageHcRyR TGGTCTTGAAACTCTTCAAGAG CGTTGATCTTGTCTATGGCTTC 目的基因扩增
Amplification of
target geneHcRyR TGGTCTTGAAACTCTTCAAGAG CGTTGATCTTGTCTATGGCTTC RT-qPCR EF1α ATGAAATCTCTGTGACCGGGG GCGGTGGTATCGACAAACGT RPL13 GTTAGCTACACAGCTCCGTGG GCAGCAGTTGGGGCTTTAGT dsHcRyR taatacgactcactatagggGCCTTTGGTCCAAGATGATACT taatacgactcactatagggATCCATAAGTCCATCCTTGCTG 合成dsRNA
Synthesis of dsRNAdsGFP taatacgactcactatagggAGAAGAACTTTTCACTGG taatacgactcactatagggTGAACGGATCCATCTTC 注：小写字母表示T7启动子。Note: the lowercase letters indicate T7 promoters. 
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表 2 氯虫苯甲酰胺对美国白蛾3龄幼虫72 h毒力
Table 2 Toxicity of chlorantraniliprole on the 3rd instar H. cunea larvae treated for 72 h
毒力回归方程
Toxicity regression equationLC30(95% CI)/(μg·L−1) LC50(95% CI)/(μg·L−1) R2 χ2 df Y = 1.85x + 8.09 11.13 (7.90 ~ 15.68) 21.40 (16.28 ~ 28.12) 0.98 11.12 13 注：LC30和LC50分别为30%和50%死亡率时亚致死质量浓度；95% CI为95%置信区间；R2为相关系数；χ2为卡方值；df为自由度；卡方值小于χ2（13,0.05） = 22.36，故毒力回归方程与实际相符。Notes: LC30 and LC50 are sublethal concentration when mortality rates are 30% and 50% , respectively; 95% CI is 95% confidence interval; R2 is the correlation coefficient; χ2 is the chi-square value; df is degree of freedom; the chi-square value is less than χ2（13,0.05） = 22.36, toxicity regression equation is consistent with the reality.
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