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受枯梢病侵染的有症状和无症状樟子松的内生真菌群落结构

刘玉祥, 王磊, 任宁红, 游崇娟

刘玉祥, 王磊, 任宁红, 游崇娟. 受枯梢病侵染的有症状和无症状樟子松的内生真菌群落结构[J]. 北京林业大学学报, 2024, 46(9): 119-131. DOI: 10.12171/j.1000-1522.20230350
引用本文: 刘玉祥, 王磊, 任宁红, 游崇娟. 受枯梢病侵染的有症状和无症状樟子松的内生真菌群落结构[J]. 北京林业大学学报, 2024, 46(9): 119-131. DOI: 10.12171/j.1000-1522.20230350
Liu Yuxiang, Wang Lei, Ren Ninghong, You Chongjuan. Community structure of endophytic fungi in asymptomatic and symptomatic Pinus sylvestris var. mongolica infected by diplodia tip blight[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2024, 46(9): 119-131. DOI: 10.12171/j.1000-1522.20230350
Citation: Liu Yuxiang, Wang Lei, Ren Ninghong, You Chongjuan. Community structure of endophytic fungi in asymptomatic and symptomatic Pinus sylvestris var. mongolica infected by diplodia tip blight[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2024, 46(9): 119-131. DOI: 10.12171/j.1000-1522.20230350

受枯梢病侵染的有症状和无症状樟子松的内生真菌群落结构

基金项目: 国家重点研发计划项目(2021YFC2600400),政府间国际科技创新合作(2023YFE0116200)。
详细信息
    作者简介:

    刘玉祥。主要研究方向:林木病理学。Email:1113845284@qq.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学林学院

    责任作者:

    游崇娟,副教授。主要研究方向:林木病理学。Email:chongjuan_you@126.com 地址:同上。

  • 中图分类号: S718.5

Community structure of endophytic fungi in asymptomatic and symptomatic Pinus sylvestris var. mongolica infected by diplodia tip blight

  • 摘要:
    目的 

    分析受樟子松枯梢病侵染的无症状和有症状樟子松不同部位的内生真菌多样性和群落结构,以期为筛选有效的内生拮抗菌并防治樟子松枯梢病提供科学依据。

    方法 

    利用分离培养和高通量测序技术,对无症状和有症状樟子松的针叶、嫩梢、韧皮部(胸径处)3个部位内生真菌群落的多样性和结构进行了比较和分析,并筛选了嫩梢处丰度有显著差异的内生菌。

    结果 

    (1)分别在无症状和有症状樟子松中分离到233株和360株内生真菌,分离率最高的均是Diplodia sapinea。此外,Hormonema sp.在无症状樟子松上分离率较高,但在有症状樟子松上分离率较低,且仅在有症状樟子松的嫩梢处分离到。(2)扩增子测序结果显示:无症状和有症状樟子松中内生真菌的α多样性无显著差异,但无症状和有症状樟子松的不同部位内生真菌群落结构存在差异。(3)对扩增子数据进行线性判别分析发现:Hormonema 属真菌在无症状樟子松嫩梢中丰度最高,而Diplodia 属真菌在有症状樟子松的嫩梢中丰度最高。(4)真菌营养型分类也证实无症状樟子松的3个部位中均是腐生菌的相对丰度最高,而有症状樟子松的韧皮部的植物病原菌的相对丰度较无症状显著增多。

    结论 

    无症状和有症状樟子松中内生真菌的多样性无显著差异,但其不同部位内生真菌群落结构存在显著差异。下一步将进行拮抗试验以评估无症状樟子松嫩梢部位中显著富集的真菌Hormonema属真菌作为生防菌的潜力。

    Abstract:
    Objective 

    Diplodia tip blight of Mongolian pine is widely distributed in Honghuaerji, Inner Mongolia of northern China, causing severe damage on natural Mongolian pine (Pinus sylvestris var. mongolica). Our study analyzed the diversity and community structure of endophytic fungi in different parts of asymptomatic and symptomatic Mongolian pine infected by Diplodia sapinea, laying a research foundation for the subsequent screening of effective endophytic antagonistic strains and the control of diplodia tip blight.

    Method 

    Using culture-based and high-throughput sequencing techniques, the diversity and structure of endophytic fungal communities in different tissues (needles, twigs and phloem) of asymptomatic and symptomatic Mongolian pine were compared and analyzed, and endophytic fungi with significant differences in abundance at twigs were screened.

    Result 

    (1) 360 and 233 taxa of endophytic fungi were isolated from symptomatic and asymptomatic Mongolian pine, respectively. D. sapinea was isolated from both asymptomatic and symptomatic Mongolian pine, with the highest isolation rate. In addition, Hormonema sp. had a higher isolation rate on asymptomatic Mongolian pine, but a lower isolation rate on symptomatic Mongolian pine, and it was only isolated from the diseased twigs. (2) The amplicon sequencing results showed that there were no significant differences of α diversity of endophytic fungi between symptomatic and asymptomatic Mongolian pine, but beta diversity, community composition and structure of endophytic fungi were various according to different tissues from symptomatic and asymptomatic Mongolian pine. (3) Linear discriminant analysis effect size (LEfSe) analysis of amplicon revealed that the fungus Diplodia sp. was significantly enriched in the twigs of symptomatic Mongolian pine, while Hormonema sp. was significantly enriched in the twigs of asymptomatic Mongolian pine. (4) Fungal trophic classification confirmed that the relative abundance of saprophytic fungi was highest in all three parts of asymptomatic Mongolian pine, while the relative abundance of plant pathogens in the phloem of symptomatic Mongolian pine was significantly increased.

    Conclusion 

    There are no significant differences in the diversity of endophytic fungi between symptomatic and asymptomatic Mongolian pine, but there are significant differences in the community structure of endophytic fungi in different tissues. In the future study, antagonistic experiments will be conducted to evaluate the potential of fungi Hormonema sp. from asymptomatic Mongolian pine as biocontrol agents.

  • 樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)隶属于松科(Pinaceae)松属(Pinus),是欧洲赤松(Pinus sylvestris)的一个地理变种。因其具有耐寒、耐旱、防风固沙等优良特性,被作为治沙造林的首选树种,已在我国三北地区的辽宁、内蒙古、陕西、甘肃和新疆等13个省(自治区)300多个县(旗)先后被成功引种[1]。内蒙古红花尔基,作为樟子松良种基地,分布着亚洲最大,我国唯一集中连片的沙地樟子松林带。但是,近年来,樟子松枯梢病(diplodia tip blight)在红花尔基发生严重,造成大面积天然樟子松死亡。该病害是一种寄主主导性病害,典型症状是新发嫩梢萎蔫弯曲,针叶褪色变黄,枝干出现溃疡、溢脂,最终引起枯梢[2]。引起该病的病原菌是Diplodia sapinea(异名:Sphaeropsis sapinea),其隶属于子囊菌门(Ascomycota)葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)色二孢属(Diplodia)。关于该菌无性型的正确名字尚存在争议,在Index Fungorum上推荐使用S. sapinea,而EPPO则推荐使用D. sapinea[35]。但是Phillips等[6]分别观察了D. sapineaS. sapinea的模式标本,认为二者的分生孢子等形态特征存在显著差异。因此,认为引起松枯梢病的病原菌为D. sapinea。该病菌主要从伤口侵入寄主,也可以从针叶的气孔侵入或直接侵染嫩梢、嫩叶,以菌丝体和分生孢子器在病梢、病叶、茎部溃疡斑和球果等病组织中越冬。翌年春夏季释放出的分生孢子成为初次侵染来源。分生孢子借风雨传播[2,79]

    D. sapinea被认为是松树的内生真菌被广泛报道[5]。1996年,该菌作为内生真菌首次从健康欧洲赤松上分离到[10]。之后,Flowers等[11]和Terhonen等[12]陆续在美国和芬兰的健康欧洲赤松上也分离到该菌。研究表明,当寄主松树受到干旱、冰雹、极端温度、昆虫或机械损伤等生物或非生物胁迫时,树势下降,该菌转变为机会病原菌引起枯梢病的发生[3,13]。近年来,全球气候变化包括干旱、气温升高、冰雹等大大加剧了松枯梢病的爆发[1314]。因此,理解气候变化下植物内生菌在病害表达过程中(潜伏或拮抗)的机制是非常必要的。但是,D. sapinea转变为致病菌并引起病害的分子机理尚不明确[14],尤其内生真菌群落在松枯梢病发生过程中发挥的作用仍不清楚。

    Bußkamp等[15]对有枯梢病症状和无明显病害症状的欧洲赤松进行了内生真菌的分离和鉴定,探究了有/无症状松树的内生真菌群落组成。结果发现有症状和无症状松树枝条的内生真菌群落组成无显著差异,且超过80%的树木中都有D. sapinea的存在。Blumenstein等[5]研究表明不同生长年份和不同采样时间的松树的内生真菌群落结构存在显著差异,但健康松树和患病松树内生真菌群落结构无差异。D. sapinea在健康树木中丰度较高,证实了该菌以内生菌的方式在健康树木中积累,并在多年后造成病害突然爆发和迅速扩散流行。基于内生菌分离结果,Blumenstein等[13]筛选了对松杉球壳孢具有拮抗效应的多种内生真菌,包括Sydowia polysporaAlternaria alternata等,并探究了在不同程度的干旱胁迫条件下,单独接种D. sapinea和联合接种多个内生真菌对枯梢病病害症状的影响。但是D. sapinea与其他内生菌的互作关系,仍不清楚。

    近年来,我国东北地区樟子松枯梢病的研究,多集中于病原菌的生物学特性、病害发生流行规律、化学防治及生态控制技术等。常忠连[16]研究证实D. sapinea在樟子松的病健组织中都可分离到,其在针叶中分离率最高,其次为枯枝部位。杨传波等[17]、周秀华[18-19]和鞠洪波[20]分别对樟子松树栖真菌群落物种多样性及其与病害的关系进行了分析,结果表明:芽栖、叶栖、枝栖和果栖真菌的组成和数量与樟子松树龄、叶龄、枝龄、树冠层次等关系密切,发病林分中病原菌的数量激增。谢宪等[21]研究认为赤松(Pinus densiflora)纯林无病斑针叶与染病针叶内生真菌群落结构差异显著,在染病较轻的针叶中以病理营养型真菌为主。此外,我国学者开展了樟子松枯梢病的生物防治技术研究,筛选出多种木霉菌、螺卷毛壳菌等具有较好防效的生防菌剂[2224]。这些菌剂均是自然界中常见的生防菌,并不是从樟子松相关生态环境中分离到的,缺乏具有拮抗作用的樟子松内生真菌。

    为了探究内生菌在无症状和有症状樟子松中的差异和功能作用,本研究对受枯梢病侵染的无症状和有症状樟子松的不同部位的内生真菌进行了分离培养和鉴定,同时,利用Pacbio Sequel Ⅱ 高通量测序技术对其针叶、嫩梢、韧皮部(胸径处)等不同部位的内生真菌群落结构和多样性进行比较和分析。通过探究无症状和有症状樟子松不同部位的内生真菌的群落差异,为后续筛选有效的内生拮抗菌、防治樟子松枯梢病奠定研究基础。

    无症状樟子松(无症状: < 10%的树冠出现枯梢症状)样地,位于内蒙古自治区呼伦贝尔市红花尔基的宝根图林场(119°55′57″E,48°24′12″N)。发病樟子松(有症状: > 30%的树冠出现枯梢症状)样地,位于头道桥林场(120°13′39″E,48°16′47″N)(图1)。两个样地之间相距75 km,气候、土壤等条件相似。在2021年7月,分别在两个样地中选取30棵相同林龄(40年生)且长势相似的樟子松,采集每棵树的当年生针叶、当年生嫩梢和胸径处韧皮部等3个部位的样品,共计180份(H、D分别表示无症状樟子松和有症状樟子松,其中无症状樟子松的针叶、嫩梢、韧皮部样品分别被标记为HA、HB、HC,有症状樟子松针叶、嫩梢、韧皮部分别被标记为DA、DB、DC)。取样后将样品迅速装入冻存管中进行液氮冷冻保存,并尽快带回实验室进行内生菌的分离和鉴定。

    图  1  无症状(a)和有症状(b)樟子松样地
    Figure  1.  Asymptomatic Mongolian pine sample plot (a) and symptomatic Mongolian pine sample plot (b)

    内生菌的分离参照Oliva等[4]的方法。首先,对所采集的样品进行表面消毒:在75%酒精中浸泡1 min,后放入2%次氯酸钠1 min,随后在75%酒精中浸泡30 s,最后用无菌水冲洗3次。将消毒后不同部位的样品切成4个约5 mm × 5 mm大小的组织块,放入0.3%MEA培养基中[25],在25 ℃黑暗条件下培养3 ~ 4 d。之后,挑取不同形态的菌落并转移到2%MEA培养基上,进行纯化培养,分别在3、7、10 d观察和记录菌落形态等特征。同时,选择形态特征相同的菌株放入0.3%MEA培养基中,25 ℃黑暗条件下培养1周,用于分子鉴定。轻轻刮取菌丝,经液氮研磨后,采用CTAB法[26]进行DNA提取。利用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[27]对内生真菌的ITS区进行PCR扩增。PCR反应体系(20 μL)为: 2× Es Taq MasterMix 10 μL,超纯水7 μL,模板DNA 1 μL,引物(10 μmol/L)1 μL。反应程序为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min,共35个循环;72 ℃ 5 min。反应结束后,送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。将序列进行BLAST比对[4],结合菌落、菌丝、孢子等形态特征,对分离到的内生真菌进行鉴定。分离所获得的菌株均保存在北京林业大学林学院省部共建森林培育与保护教育部重点实验室。

    在2个样地中选择4棵无症状樟子松和4棵有症状樟子松,分别对其针叶、嫩梢和韧皮部3个部位进行扩增子测序。样品处理参照内生真菌分离方法,采用CTAB法提取内生真菌DNA[27]。使用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增ITS片段。30 µL PCR反应体系为DNA 1.5 µL,无核酸酶水11.7 µL,KOD One DNA聚合酶15 µL, barcode引物对1.8 µL。反应条件为95 ℃预变性5 min,8 个循环(95 ℃变性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 45 s),24个循环(95 ℃变性 30 s,60 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 45 s),最后 72 ℃延伸 5 min。利用DNA凝胶回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司)进行PCR产物纯化,将纯化后的扩增产物送交至北京百迈客生物科技有限公司,在Pacbio Sequel Ⅱ平台上构建文库并测序。

    根据内生真菌的分离情况,通过香农−威纳多样性指数(Shannon-Weiner diversity index,H′)、辛普森指数(Simpson index,D')、均匀度指数(evenness index,E)分析内生真菌的群落组成和多样性。在Excel中使用T-test进行差异显著性分析。在Anosim分析中,R值表示组间与组内的差异程度。R的范围是−1到1。R < 0表示组间差异小于组内差异;R > 0表示组间差异大于组内差异;R = 0组间差异等于组内差异。

    在扩增子测序中,利用Flash软件拼接序列,使用 Trimmomatic 软件进行质控过滤。利用Usearch软件根据97%序列相似性进行OUT划分[28],使用UCHIME 软件剔除嵌合体。选取OUT的代表性序列进行物种注释,采用UNITE数据库,将获得的分类学信息分别在门、纲、目、科、属水平上统计各样本的群落组成。使用QIIME2(https://qiime2.org/)计算α多样性指数和β多样性指数[29]。其中,Chao1 指数和ACE 指数代表群落丰度,香农−威纳多样性指数和辛普森指数代表群落物种的丰富度和多样性[30]。采用LEfSe(linear discriminant analysis effect size)(http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)估算每个物种丰度对差异效果的影响,找到不同组织间在丰度上有显著差异的物种。线性判别分析(linear discriminant analysis,LDA)阈值设为4,LDA绝对值大于4,表示差异显著。采用FUNGuild对内生真菌进行功能预测[31]。使用R语言Vegan包进行主坐标分析和非度量多维排列,并用R语言作图。

    分别从无症状和有症状樟子松的3个不同部位分离到233株和360株内生真菌(表12图2)。结合形态特征和ITS序列,明确各菌株的分类地位。在无症状樟子松上分离率最高的内生真菌是D. sapinea(18.89%),其次是Hormonema sp.(15.02%)和Sydowia polyspora(12.02%)。这3类内生真菌均可在无症状樟子松的3个不同部位上分离得到,且在针叶上的分离率最高,韧皮部的分离率最低。有症状樟子松上分离率最高的内生真菌是D. sapinea,达20%。除了尚未鉴定到种属的other fungi(14.44%),分离率较高的是Alternaria alternata(12.78%)和Sydowia polyspora(12.22%)。这3种菌在有症状樟子松的3个不同部位上均可分离到,但在不同部位的分离率不同。D. sapinea在有症状樟子松的针叶上分离率最高,在韧皮部分离率最低。

    表  1  无症状樟子松的不同部位内生真菌的分离结果
    Table  1.  Isolation results of endophytic fungi from different parts of asymptomatic Mongolian pine
    类群
    Taxa
    分离部位 Isolation part 菌株数
    Strain number
    分离率
    Isolation rate/%
    针叶
    Needle
    嫩梢
    Twig
    韧皮部
    Phloem
    Capturomyces luteus 0 0 10 10 4.29
    Alternaria alternata 10 6 7 23 9.87
    Irpex lacteus 5 0 0 5 2.15
    Diplodia sapinea 22 16 6 44 18.89
    Pezizomycetes sp. 0 5 5 10 4.29
    Trichoderma sp. 0 10 8 18 7.71
    Sydowia polyspora 12 10 6 28 12.02
    Fusarium sp. 4 4 0 8 3.43
    Cyclaneusma minus 8 5 0 13 5.58
    Coniochaeta sp. 0 0 6 6 2.58
    Aureobasidium pullulans 0 0 8 8 3.43
    Phanerochaete sp. 0 5 0 5 2.15
    Hormonema sp. 15 12 8 35 15.02
    其他真菌Other fungi 8 6 6 20 8.58
    合计Total 83 80 70 233 100.00
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    表  2  有症状樟子松的不同部位内生真菌分离结果
    Table  2.  Isolation results of endophytic fungi from different parts of symptomatic Mongolian pine
    类群
    Taxa
    分离部位 Isolation part 菌株数
    Strain number
    分离率
    Isolation rate/%
    针叶
    Needle
    嫩梢
    Twig
    韧皮部
    Phloem
    Asperillus sp. 0 5 6 11 3.06
    Epicoccum sp. 4 9 0 13 3.61
    Daldinia sp. 0 7 3 10 2.78
    Ophiostoma minus 0 0 10 10 2.78
    Diplodia sapinea 37 25 10 72 20.00
    Preussia minima 6 12 8 26 7.22
    Umbelopsis sp. 0 0 6 6 1.67
    Sydowia polyspora 22 14 8 44 12.22
    Kalmusia sp. 0 6 0 6 1.67
    Alternaria alternata 23 12 11 46 12.78
    Schizophyllum sp. 4 0 0 4 1.11
    Capturomyces luteus 0 0 5 5 1.39
    Coniochaeta sp. 0 4 0 4 1.11
    Fusarium sp. 12 6 6 24 6.67
    Hormonema macrosporum 0 8 0 8 2.22
    Therrya pini 5 9 0 14 3.89
    Hendersonia pinicola 0 6 0 6 1.67
    其他真菌Other fungi 22 17 13 52 14.44
    合计Total 135 139 86 360 100.00
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    图  2  部分内生真菌菌落形态照片
    25 ℃,黑暗条件下生长7 d。每个图片的左右两部分分别代表菌落的正面和反面,括号内信息为菌株编号。Growing at 25 ℃ under dark conditions for 7 d. The left and right parts of each picture represent front and back of the colony. Information in parentheses is the strain No.
    Figure  2.  Morphological photos of some endophytic fungal colonies

    多样性分析表明:无症状樟子松韧皮部的内生真菌的香农−威纳多样性指数最高,其次是嫩梢处;而辛普森指数从高到低依次为韧皮部 > 嫩梢> 针叶(表3)。有症状樟子松的嫩梢处的内生真菌的香农−威纳多样性指数最高,其次是韧皮部;辛普森指数从高到低依次为韧皮部 = 嫩梢 > 针叶(表4)。无、有症状樟子松3个部位的内生真菌群落均无显著差异(P > 0.05)

    表  3  无症状樟子松不同部位内生真菌多样性指数
    Table  3.  Diversity index of endophytic fungi in different parts of asymptomatic Mongolian pine
    分离部位
    Isolation part
    物种数
    Species number
    HDE
    针叶 Needle71.740.851.95
    嫩梢 Twig91.990.892.20
    韧皮部 Phloem92.070.902.20
    注:H′. 香农−威纳多样性指数;D′.辛普森指数;E.均匀度指数。下同。Notes: H′, Shannon-Weiner diversity index; D′, Simpson index; E, evenness index. The same below.
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    表  4  有症状樟子松不同部位内生真菌多样性指数
    Table  4.  Diversity index of endophytic fungi in different parts of symptomatic Mongolian pine
    分离部位
    Isolation part
    物种数
    Species number
    H D E
    针叶 Needle 8 1.63 0.86 2.08
    嫩梢 Twig 13 2.26 0.92 2.56
    韧皮部 Phloem 10 1.86 0.92 2.30
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    24个样本的扩增子测序共获得323 207条Raw CCS(circular consensus sequencing)序列,质控后平均每个样品产生13 467条CCS序列。有效序列平均长271.47 bp。在97%相似度下进行分类操作单元(operational taxonomic unit,OTU)聚类,共获得1 031个OTU。通过随机抽样方法从有效序列中生成稀释性曲线。各样品的稀释曲线大多趋向平缓,这表明各样品的取样和扩增子测序数量合理、数据有效,能真实反映无症状和有症状樟子松不同部位内生真菌的群落组成。

    在不同分类等级上分析无症状樟子松和有症状樟子松不同部位内生真菌的群落组成。在门分类水平上,无症状樟子松和有症状樟子松的不同部位的内生真菌群落,均主要由子囊菌门和担子菌门的真菌组成,分别占99.14%和98.66%(图3a3b3c)。

    图  3  不同分类水平上的内生真菌群落组成及相对丰度
    a、b、c为内生真菌在门分类水平上的相对丰度。d、e、f为内生真菌在属分类水平上的相对丰度。H和D分别表示无症状樟子松和有症状樟子松。HA、HB、HC分别表示无症状樟子松的针叶、嫩梢、韧皮部。DA、DB、DC分别表示有症状樟子松针叶、嫩梢、韧皮部。下同。a, b, c are relative abundance of endophytic fungi at the level of phylum. d, e, f are relative abundance of endophytic fungi at the level of genus. H and D represent asymptomatic and symptomatic pine tree, respectively. HA, HB, and HC represent the needle, twig, and phloem of asymptomatic trees, respectively. DA, DB, and DC represent the needle, twig, and phloem of symptomatic trees, respectively. The same as below.
    Figure  3.  Endophytic fungi composition and relative abundance at different taxonomic levels

    在属分类水平上,无症状樟子松和有症状樟子松的优势内生真菌类群不同(图3d)。其中,无症状樟子松中,Hormonema相对丰度最高,达56.99%,而Diplodia的相对丰度较低(0.88%)。有症状樟子松中unidentified fungi(未鉴定类群)的相对丰度最高,达27.67%,其次是Penicillium(16.66%)和Hormonema(7.77%),而Diplodia的相对丰度达3.74%。进一步比较分析,发现:无症状樟子松的3个部位中,相对丰度最高的内生真菌均是Hormonema,其在针叶、嫩梢和韧皮部中的相对丰度分别是26.34%、72.69%和69.69%(图3e)。在有症状樟子松针叶部位和嫩梢部位相对丰度最高的均为unidentified fungi(未鉴定类群),而在韧皮部中丰度最高的是Penicillium(48.98%)。此外,嫩梢部位Diplodia的相对丰度(11.19%)比在其他两个部位高(图3f)。

    无症状和有症状樟子松内生真菌的α多样性指数无显著差异。进一步对无症状和有症状樟子松不同部位内生真菌群落的α多样性进行比较分析,发现无症状樟子松针叶部位内生真菌的Chao1指数和ACE指数显著高于韧皮部(P < 0.05),但与嫩梢处无显著差异(P > 0.05)(图4a4b)。针叶部位内生真菌的物种丰富度最高,且与韧皮部差异显著(P < 0.05)。

    图  4  样品的ACE指数和Chao1指数柱状图
    *表示差异显著(P < 0.05);**表示差异极显著(P < 0.01)。下同。* means significant difference (P <0.05); ** means extremely significant difference (P < 0.01). Same as below.
    Figure  4.  Histogram of ACE index and Chao1 index of samples

    在有症状的樟子松中,针叶部位内生真菌的Chao1指数显著高于其他两个部位。嫩梢和韧皮部内生真菌也有显著差异(P < 0.05)(图4c4d)。有症状樟子松针叶部位的内生真菌的物种丰富度最高,且与其他两个部位差异明显。

    进一步比较分析辛普森指数和香农−威纳多样性指数(图5a5b),有症状樟子松的嫩梢部位均显著高于无症状樟子松的嫩梢部位(P < 0.05),即与无症状樟子松相比,有症状樟子松的嫩梢部位的内生真菌的物种多样性较高。

    图  5  样品的辛普森指数和香农−威纳多样性指数柱状图
    Figure  5.  Histogram of Simpson index and Shannon-Weiner diversity index of samples

    利用基于Bray-Curtis距离的PCoA分析,比较了不同症状樟子松的内生真菌群落的β多样性,结果显示:无症状和有症状樟子松的内生真菌的群落存在差异,Anosim分析表明二者内生真菌的群落差异极显著(R = 0.392,P < 0.001)。其中,有症状樟子松的韧皮部的内生真菌的物种组成,与其他两个部位内生真菌群落明显不同(R = 0.664,P < 0.001)。但是,无症状樟子松的3个部位的内生真菌群落组成差异不显著(图4c)。基于Bray-Curtis的NMDS分析结果得到相同的结论,无症状和有症状樟子松的内生真菌的群落组成差异极显著(Stress = 0.0928R = 0.39,P = 0.001)。有症状樟子松的针叶和嫩梢部位的内生真菌的物种组成显著聚集,且与韧皮部明显相分离(Stress = 0.0335R = 0.66,P = 0.001)。而无症状樟子松的3个部位内生真菌的群落组成差异不显著。

    图  6  基于LEfSe分析的组间差异性分类单元
    c_. 纲 Class;o_.目 Order;f_.科 Family;g_.属 Genus
    Figure  6.  Differentiated taxa between groups based on LEfSe analyses

    线性判别分析LEfSe结果显示,无症状和有症状樟子松不同部位的内生真菌在丰度上存在显著差异(图6)。

    以无症状和有症状樟子松的嫩梢的内生真菌群落为例,差异物种进化分支图揭示了显著富集的标志物种在分类学层次上的分布。在科分类水平上,畸球腔菌科(Teratosphaeriaceae)、圆盘菌科(Orbiliaceae)以及葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)的内生真菌在有症状樟子松的嫩梢处显著富集;而小穴壳菌科(Dothioraceae)和囊担子菌科(Cystobasidiaceae)真菌在无症状樟子松的嫩梢处显著富集。在属分类水平上,4个属的内生真菌,包括小葡萄煤炱属(Capnobotryella)、Cladophialophora、网膜壳属(Retiarius)、Diplodia,在有症状樟子松嫩梢处显著富集;而线链霉属(Hormonema)、翅枝孢菌属(Rachicladosporium)和囊担子菌属(Cystobasidium)真菌在无症状樟子松嫩梢处显著富集。

    差异物种的LDA值分布图(图6)揭示了无症状和有症状樟子松韧皮部中丰度有显著差异的内生菌(LDA绝对值大于4,P < 0.05)。无症状樟子松嫩梢中丰度显著较高的是Hormonema真菌,而有症状樟子松嫩梢中丰度显著较高的是Diplodia真菌。Diplodia真菌在无症状和有症状樟子松韧皮部中存在显著差异,且在有症状樟子松(红色条形图)中丰度最高;同时,Diplodia的LDA得分值大于其他分类单元,表明其对组间差异的影响较大。此外,Hormonema真菌在无症状和有症状樟子松韧皮部中存在显著差异,且在无症状樟子松(绿色条形图)中被显著富集,丰度最高。同时,Hormonema的LDA得分值大于其他分类单元,表明其对组间差异的影响最大。

    利用FunGuild,对无症状樟子松和有症状樟子松的内生真菌的营养模式进行比较分析。结果显示:在无症状樟子松上,腐生营养型真菌的比例最高,占85.67%,病理营养型真菌占11.66%,共生营养型真菌最少,占2.66%。同样地,在有症状的樟子松上的内生真菌的营养型以腐生营养型为主,占52.76%,病理营养型次之,占36.33%,共生营养型最少,占10.91%(图7a)。通过比较发现,有症状樟子松中的病理营养型内生真菌的相对丰度较无症状中显著增多(P < 0.05)。

    图  7  内生真菌群落FUNGuild真菌功能分类
    Figure  7.  FUNGuild functional classification of endophytic fungal communities

    进一步比较无症状樟子松和有症状樟子松的不同部位的内生真菌的营养模式(图7c),结果显示:无症状和有症状樟子松的针叶、嫩梢和韧皮部的病理营养型真菌和腐生营养型真菌的相对丰度均具有显著性差异(P < 0.05),同时,有症状樟子松的3个部位的病理营养型内生真菌的相对丰度均高于无症状樟子松。除了有症状樟子松的韧皮部,其他部位上的内生真菌均是腐生营养型为主,而有症状樟子松的韧皮部的病理营养型真菌的比例最高(占50.79%)。

    此外,对有症状和无症状樟子松的不同营养型真菌进行了功能注释(图7b7d),将其分为7个生态功能群。在无症状樟子松上,未定义腐生菌(Undefined_Saprotroph)的相对丰度最高,而在有症状樟子松上,植物病原菌(Plant_Pathogen)的相对丰度显著增加。进一步比较分析不同部位内生真菌的相对丰度,无症状樟子松的3个部位上均是未定义腐生菌(Undefined_Saprotroph)的相对丰度最高,而在有症状樟子松韧皮部的植物病原菌(Plant_Pathogen)的相对丰度显著增多,在有症状樟子松嫩梢处的植物病原菌(Plant_Pathogen)的相对丰度最少。

    本研究通过内生真菌的分离培养和Pacbio Sequel Ⅱ高通量测序技术,探究了无症状樟子松和有症状樟子松不同部位的内生真菌的群落组成、多样性和营养型功能的差异。内生真菌的分离鉴定结果显示:从无症状和有症状樟子松的3个部位均可分离到D. sapinea,且针叶部位的分离率最高,嫩梢次之,韧皮部最少。与庞丽杰[9]和常忠连[16]的研究结果相似。Blumenstein等[5]的研究结果也显示可从未表现出明显枯梢症状的欧洲赤松上分离出大量的D. sapinea。本研究进一步证实了D. sapinea的内生菌的特征,其可潜伏寄生于无症状寄主植物上,当受到逆境胁迫,如干旱、冰雹、极端温度或机械损失时,该菌可迅速变为致病菌,造成病害的爆发。

    扩增子测序结果显示:无症状樟子松和有症状樟子松中D. sapinea的相对丰度均较低(分别占0.88%和3.74%),而分离培养结果显示无症状和有症状樟子松的优势内生菌均是D. sapinea,其分离率最高。本研究中分离鉴定结果和扩增子测序的结果不相吻合。这可能是由于分离培养时D. sapinea生长速度较快,使其成为优势菌株,导致部分生长缓慢的或无法在MEA培养基上生长的代表性菌株分离率较低。此外,由于扩增子测序时引物选择或测序深度等问题,也会造成一些稀有的内生真菌物种没有被检测出[5,32], 从而导致二者结果不一致。

    扩增子测序结果表明D. sapinea在有症状樟子松的嫩梢处丰度最高。因此,对嫩梢处的内生真菌群落进行LEfSe分析发现,Diplodia真菌在无症状和有症状樟子松的嫩梢中存在显著差异,且在有症状樟子松的嫩梢中被显著富集,丰度最高。此外,扩增子测序结果显示在无症状樟子松的3个部位中Hormonema均是优势属,其相对丰度最高。该结果与本研究中的内生菌的分离结果相似,分离结果也显示该属真菌Hormonema sp.在无症状樟子松上的分离率较高(高达15.02%),但在有症状樟子松上分离率较低。LEfSe分析结果进一步表明Hormonema属真菌在无症状和有症状樟子松嫩梢中存在显著差异,且在无症状樟子松嫩梢中被显著富集,丰度最高。

    Hormonema sp.真菌广泛分布于全世界,被认为是针叶树的表生真菌或内生真菌[3233]。该属真菌主要以无性型存在,缺乏有性型。基于无性孢子等特征,该属内的Hormonema dematioides目前被更名为Sydowia polyspora。Blumenstein等[5,13]从健康和发病欧洲赤松上也分离到大量的Sydowia polyspora,并通过拮抗试验证实该菌具有抑制D. sapinea生长的能力。因此,认为该类真菌可能在樟子松内生真菌群落中扮演重要角色,在一定程度上减少樟子松受D. sapinea的影响,并作为潜在生防菌被广泛讨论,认为可用于防治松枯梢病的发生[4]。此外,Blumenstein等[13]认为Sydowia polyspora是真正的内生菌,在干旱等非生物胁迫条件下,不会使其转变成致病菌并引起病害发生。但是,Cleary等[34]认为该内生菌是机会病原菌,气候变化下将导致其致病性发生改变。Pan等[33]利用分离和接种试验证实,Sydowia polyspora 可定殖于云南松(Pinus yunnanensis)的枝干韧皮部和针叶处,并引起相关病害症状。此外,Sydowia polyspora还可造成北美和欧洲冷杉(Abies fabri)的当年生针叶坏死、意大利五针松(Lycopodium japonicum)的枝条坏死[35]Hormonema macrosporum被发现是花旗松(Pseudotsuga menziesii var. menziesii)种子阶段的核心菌群,认为该菌作为非致病菌,在花旗松的种子萌发、幼苗生长等阶段发挥重要作用[36]。同时,Peláez等[37]发现可从Hormonema真菌中提取一种抗真菌化合物三萜糖苷(Enfumafungin),表明其在生物防治方面具有良好潜力。因此,下一步将进行拮抗试验以评估Hormonema属真菌作为生防菌的潜力。

    无症状和有症状樟子松不同部位的内生真菌群落的多样性分析显示:其内生真菌的丰富度和多样性无明显差异,但群落构成差异显著。该结果与Bußkamp等[15]结果相似。谢宪等[21]认为无病斑针叶内生真菌的多样性高于染病后针叶的内生真菌多样性。推测原因是当针叶的防御体系被破坏后,单一的腐生营养型真菌相对丰度较高,造成其多样性下降。而在其他植物内生微生物的研究中,当植物受到病菌侵染后,其防御机制被破坏,内部平衡被打破,其他病原微生物及腐生微生物更易进入植物组织内,因此,病原菌的侵染提高了微生物的多样性[38]。本研究中,D. sapinea 作为内生菌,一直存在于松树体内。当在逆境胁迫下,宿主植物出现明显的病害症状,但在该病理过程中D. sapinea与其他内生菌群落的互作关系尚不明确,需结合转录组学、功能基因组学等进行深入分析。本研究进一步分析了不同部位的内生真菌的多样性指数,结果显示:无症状和有症状樟子松的针叶部位的内生真菌的丰度均最高。同时,有症状樟子松嫩梢处的内生真菌的群落多样性显著高于无症状樟子松的嫩梢处。因此,随着病害症状的出现,嫩梢处的内生真菌的丰富度和多样性呈上升趋势。此外,有症状樟子松的韧皮部内生真菌的群落构成,与其他两个部位有显著差异,而无症状樟子松的3个部位内生真菌的群落组成结构差异不显著。真菌营养型分类也证实无症状樟子松的3个部位中均是腐生菌的相对丰度最高,同时,病理营养型内生真菌在有症状樟子松的3个部位的相对丰度均高于无症状樟子松,尤其在有症状樟子松韧皮部的植物病原菌的相对丰度显著增多。该结果与谢宪等[21]的结果一致,说明病理营养型真菌通过伤害寄主细胞来获取自身所需的营养物质,而腐生营养型真菌通过分解死亡的寄主细胞来获取营养物质。

    虽然赤松等松属的内生菌已被广泛研究,但是内生菌群落与其宿主之间的互作机制仍不清楚[5,15]。尤其,D. sapinea 作为内生真菌,如何突破寄主防御体系并引起病害症状,在该病理过程中的分子机制尚不明确。本研究中,通过比较无症状和有症状樟子松不同部位的内生真菌的群落多样性和结构,探究了当病害症状出现时,定殖于樟子松不同部位的内生菌群落的作用,将为下一步明确内生真菌与潜伏病原菌之间的竞争互作关系,进一步筛选可能的拮抗内生菌奠定基础。

    本研究利用分离培养和高通量测序技术,对无症状和有症状樟子松的针叶、嫩梢、韧皮部(胸径处)的内生真菌群落的多样性和结构进行了比较和分析,研究发现无症状和有症状樟子松中内生真菌的多样性无显著差异,但其不同部位内生真菌群落结构存在显著差异。其中D. sapinea作为内生真菌在无症状和有症状樟子松中都可分离得到。下一步将进行拮抗试验以评估无症状樟子松嫩梢部位相对丰度最高的Hormonema属真菌作为生防菌的潜力,为樟子松枯梢病的防治提供扎实的理论基础。

  • 图  1   无症状(a)和有症状(b)樟子松样地

    Figure  1.   Asymptomatic Mongolian pine sample plot (a) and symptomatic Mongolian pine sample plot (b)

    图  2   部分内生真菌菌落形态照片

    25 ℃,黑暗条件下生长7 d。每个图片的左右两部分分别代表菌落的正面和反面,括号内信息为菌株编号。Growing at 25 ℃ under dark conditions for 7 d. The left and right parts of each picture represent front and back of the colony. Information in parentheses is the strain No.

    Figure  2.   Morphological photos of some endophytic fungal colonies

    图  3   不同分类水平上的内生真菌群落组成及相对丰度

    a、b、c为内生真菌在门分类水平上的相对丰度。d、e、f为内生真菌在属分类水平上的相对丰度。H和D分别表示无症状樟子松和有症状樟子松。HA、HB、HC分别表示无症状樟子松的针叶、嫩梢、韧皮部。DA、DB、DC分别表示有症状樟子松针叶、嫩梢、韧皮部。下同。a, b, c are relative abundance of endophytic fungi at the level of phylum. d, e, f are relative abundance of endophytic fungi at the level of genus. H and D represent asymptomatic and symptomatic pine tree, respectively. HA, HB, and HC represent the needle, twig, and phloem of asymptomatic trees, respectively. DA, DB, and DC represent the needle, twig, and phloem of symptomatic trees, respectively. The same as below.

    Figure  3.   Endophytic fungi composition and relative abundance at different taxonomic levels

    图  4   样品的ACE指数和Chao1指数柱状图

    *表示差异显著(P < 0.05);**表示差异极显著(P < 0.01)。下同。* means significant difference (P <0.05); ** means extremely significant difference (P < 0.01). Same as below.

    Figure  4.   Histogram of ACE index and Chao1 index of samples

    图  5   样品的辛普森指数和香农−威纳多样性指数柱状图

    Figure  5.   Histogram of Simpson index and Shannon-Weiner diversity index of samples

    图  6   基于LEfSe分析的组间差异性分类单元

    c_. 纲 Class;o_.目 Order;f_.科 Family;g_.属 Genus

    Figure  6.   Differentiated taxa between groups based on LEfSe analyses

    图  7   内生真菌群落FUNGuild真菌功能分类

    Figure  7.   FUNGuild functional classification of endophytic fungal communities

    表  1   无症状樟子松的不同部位内生真菌的分离结果

    Table  1   Isolation results of endophytic fungi from different parts of asymptomatic Mongolian pine

    类群
    Taxa
    分离部位 Isolation part 菌株数
    Strain number
    分离率
    Isolation rate/%
    针叶
    Needle
    嫩梢
    Twig
    韧皮部
    Phloem
    Capturomyces luteus 0 0 10 10 4.29
    Alternaria alternata 10 6 7 23 9.87
    Irpex lacteus 5 0 0 5 2.15
    Diplodia sapinea 22 16 6 44 18.89
    Pezizomycetes sp. 0 5 5 10 4.29
    Trichoderma sp. 0 10 8 18 7.71
    Sydowia polyspora 12 10 6 28 12.02
    Fusarium sp. 4 4 0 8 3.43
    Cyclaneusma minus 8 5 0 13 5.58
    Coniochaeta sp. 0 0 6 6 2.58
    Aureobasidium pullulans 0 0 8 8 3.43
    Phanerochaete sp. 0 5 0 5 2.15
    Hormonema sp. 15 12 8 35 15.02
    其他真菌Other fungi 8 6 6 20 8.58
    合计Total 83 80 70 233 100.00
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    表  2   有症状樟子松的不同部位内生真菌分离结果

    Table  2   Isolation results of endophytic fungi from different parts of symptomatic Mongolian pine

    类群
    Taxa
    分离部位 Isolation part 菌株数
    Strain number
    分离率
    Isolation rate/%
    针叶
    Needle
    嫩梢
    Twig
    韧皮部
    Phloem
    Asperillus sp. 0 5 6 11 3.06
    Epicoccum sp. 4 9 0 13 3.61
    Daldinia sp. 0 7 3 10 2.78
    Ophiostoma minus 0 0 10 10 2.78
    Diplodia sapinea 37 25 10 72 20.00
    Preussia minima 6 12 8 26 7.22
    Umbelopsis sp. 0 0 6 6 1.67
    Sydowia polyspora 22 14 8 44 12.22
    Kalmusia sp. 0 6 0 6 1.67
    Alternaria alternata 23 12 11 46 12.78
    Schizophyllum sp. 4 0 0 4 1.11
    Capturomyces luteus 0 0 5 5 1.39
    Coniochaeta sp. 0 4 0 4 1.11
    Fusarium sp. 12 6 6 24 6.67
    Hormonema macrosporum 0 8 0 8 2.22
    Therrya pini 5 9 0 14 3.89
    Hendersonia pinicola 0 6 0 6 1.67
    其他真菌Other fungi 22 17 13 52 14.44
    合计Total 135 139 86 360 100.00
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    表  3   无症状樟子松不同部位内生真菌多样性指数

    Table  3   Diversity index of endophytic fungi in different parts of asymptomatic Mongolian pine

    分离部位
    Isolation part
    物种数
    Species number
    HDE
    针叶 Needle71.740.851.95
    嫩梢 Twig91.990.892.20
    韧皮部 Phloem92.070.902.20
    注:H′. 香农−威纳多样性指数;D′.辛普森指数;E.均匀度指数。下同。Notes: H′, Shannon-Weiner diversity index; D′, Simpson index; E, evenness index. The same below.
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    表  4   有症状樟子松不同部位内生真菌多样性指数

    Table  4   Diversity index of endophytic fungi in different parts of symptomatic Mongolian pine

    分离部位
    Isolation part
    物种数
    Species number
    H D E
    针叶 Needle 8 1.63 0.86 2.08
    嫩梢 Twig 13 2.26 0.92 2.56
    韧皮部 Phloem 10 1.86 0.92 2.30
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出版历程
  • 收稿日期:  2023-11-30
  • 修回日期:  2024-05-02
  • 网络出版日期:  2024-08-08
  • 刊出日期:  2024-09-24

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