Identification and molecular docking of odorant-degrading enzyme genes in Hylurgus ligniperda
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摘要:目的
对长林小蠹的气味降解酶相关基因进行筛选、分类与组织表达分析，为后续利用分子生物学手段调控长林小蠹的行为提供理论依据。
方法在长林小蠹全基因组数据中筛选关键的气味降解酶基因，并进行基因的系统发育分析与成虫的组织表达分析。利用同源建模预测气味降解酶基因的三维结构，对模型结构进行合理性评估后，使用Autodock1.5.7软件进行分子对接的模拟。
结果在长林小蠹全基因组数据中共鉴定出65个候选的气味降解酶基因，其中谷胱甘肽-S-转移酶的数量为11个，细胞色素P450的数量为46个，羧酸酯酶的数量为8个。系统发育结果显示，长林小蠹的气味降解酶基因相对保守。成虫的组织表达分析结果显示，长林小蠹气味降解酶相关基因主要在触角中表达，且谷胱甘肽-S-转移酶与细胞色素P450两类基因家族的表达量较高。分子对接结果显示，长林小蠹气味降解酶和不同气味分子之间的结合能普遍较低且差异较小，形成的分子间作用力较为固定。
结论在长林小蠹的触角中显著表达的气味降解酶基因类型主要为谷胱甘肽-S-转移酶与细胞色素P450，分子对接的结果证明长林小蠹的气味降解酶基因具有普遍降解气味分子的能力，且分子间的结合方式相似。
Abstract:ObjectiveThis paper aims to screen, classify, and analyze the tissue expression of odor degradation enzyme-related genes in Hylurgus ligniperda. The results of this study will provide a theoretical foundation for utilizing molecular biology techniques to effectively regulate the behavior of Hylurgus ligniperda.
MethodKey odor-degrading enzyme genes were screened from the whole-genome data of Dendroctonus longipennis. Phylogenetic analysis of the genes and tissue expression analysis of the adults were conducted. Homology modeling was used to predict the three-dimensional structure of the odor-degrading enzyme genes. After the rationality of the model structure was evaluated, molecular docking simulation was performed using Autodock1.5.7 software.
ResultThe analysis revealed a total of 65 potential odor degradation enzyme genes within the complete genome data of Hylurgus ligniperda. Among them, 11 were identified as glutathione S-transferase genes, 46 as cytochrome P450 genes, and 8 as esterase genes. The phylogenetic analysis displayed a relatively conserved nature of odor degradation enzyme genes in Hylurgus ligniperda. Furthermore, the gene expression distribution in adult beetle tissues indicated that odor degradation enzyme-related genes were predominantly expressed in the antennae, with higher levels of expression observed in the glutathione S-transferase and cytochrome P450 gene families. Notably, the molecular docking results demonstrated that the binding energies between the odor degradation enzymes of Hylurgus ligniperda and various odor molecules were consistently low and exhibited minimal differences, indicating a stable intermolecular interaction force.
ConclusionThe significant expression of glutathione S-transferase and cytochrome P450 genes in antennae of Hylurgus ligniperda reinforces their vital role in odor degradation. Furthermore, the molecular docking results confirm the universal ability of odor degradation enzyme genes of Hylurgus ligniperda in breaking down odor molecules, with similar intermolecular binding modes observed.
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长林小蠹（Hylurgus ligniperda）隶属于鞘翅目（Coleoptera），象甲科（Curculionidae），小蠹亚科（Scolytinae），林小蠹属（Hylurgus），主要危害松属（Pinus）植物，已被列为世界各国进境植物检疫性有害生物的重要林业害虫之一[1−2]。长林小蠹属于次期性害虫，其寄主范围较广，主要危害新伐树与受损伤的树木，多见于采伐迹地与火灾迹地。该物种原产于欧洲南部、俄罗斯以及非洲北部的地中海沿岸地区，随后逐渐传播并定殖于美洲、澳大利亚、新西兰及亚洲等地区[3−6]。中国首次发现该物种是在2019年，于山东省泰安市发现并诱捕获得，之后在山东省烟台市、威海市、日照市等地区均有报告。长林小蠹具有较强的适生能力，已在中国及其他亚洲国家传播并定殖。小蠹等钻蛀性害虫的传播与定殖能力，与其复杂的嗅觉机制密切相关。因此，深入研究长林小蠹的嗅觉机制，对于理解其寄主选择行为以及开发有效的信息素监测于防控策略具有重要的意义。在昆虫嗅觉相关蛋白中，气味降解酶（odorant-degrading enzymes，ODEs）作为昆虫嗅觉感受器中参与嗅觉活动的一类蛋白质，在昆虫对外界环境中气味分子的识别过程发挥着重要的作用。当气味分子完成对昆虫气味受体的刺激后，气味降解酶会将多余的气味分子快速降解掉，维持嗅觉感受系统的灵敏性。否则多余的气味分子会对受体保持持续刺激，可能对昆虫的神经系统造成损害[7−8]。在昆虫触角淋巴液中的气味降解酶主要包括谷胱甘肽-S-转移酶（glutathiones-S-transferase，GSTs）、细胞色素P450氧化还原酶（cytochrome P450 reductase，CYPs）、羧酸酯酶（carboxylesterase，CXEs）和醛氧化酶（aldehydeoxidase，AOXs）等。在棉铃虫（Helicoverpa armigera）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）等研究中发现，特定的谷胱甘肽-S-转移酶基因能够降解性信息素以及其他挥发性有机化合物，在昆虫嗅觉信号的消除和嗅觉敏感性的恢复中起到关键作用[9−10]。近年来研究表明，昆虫体内的细胞色素P450能够催化多种底物的氧化反应，这一特性使其在昆虫对环境毒素的适应中发挥重要作用。研究发现，细胞色素P450在家蝇（Musca domestica）和异发丽金龟（Phyllopertha diversa）中也具有降解性信息素的能力[11−12]。对昆虫气味降解酶的研究，不仅有助于深入揭示昆虫的气味通讯分子机制，而且对于开发基于昆虫嗅觉相关蛋白的林业害虫防治调控技术具有重要的科学价值[13−14] 。
随着计算机生物技术的普及以及生物信息学的发展，分子对接技术从最初的医药领域逐渐拓展到其他领域。分子对接技术通过在蛋白质数据库中筛选与未知蛋白序列相似度高的蛋白模型，经过质量评价分析后，将这些蛋白模型与配体分子进行模拟对接。通过计算结合能，筛选出潜在的对生物行为活动起到调节作用的物质[15−16]。分子对接还可以探究蛋白与配体分子的结合模式，比较不同蛋白的结合方式，从而提高蛋白与配体的筛选效率。
本研究从长林小蠹全基因组中筛选出所有可能具有气味降解相关功能的基因，并进行系统发育分析与进化树的构建。利用实时荧光定量PCR法,分析气味降解酶基因在长林小蠹成虫不同组织中的表达。结合组织表达的结果，最终选择在触角中高度表达的基因进行同源建模，并与寄主黑松（Pinus thunbergii）的主要挥发物配体分子进行分子对接，探究气味降解酶与气味分子的结合情况，以期为今后利用化学生态手段调控长林小蠹的嗅觉行为提供理论基础。
1. 材料与方法
长林小蠹的成虫样品采集时间为2023年3—6月，采样于山东省烟台市牟平区沿海防护林带。通过挖取受长林小蠹侵害的寄主松树根部，挑选体态合适、无损伤的成虫，用新鲜树皮装盒饲养。饲养条件为室温25 ℃、无光照，用水浸湿新鲜树皮保证环境的湿润，并保持良好的通风。饲养一周后，将成虫浸泡于RNA Later溶液中，并置于−80 ℃冰箱保存，以备后续试验使用。
1.1 长林小蠹气味降解酶基因的筛选与系统发育分析
长林小蠹气味降解酶相关基因的筛选数据，来源于课题组已获得的长林小蠹全基因组数据。将获得的全基因序列在NR（non-redundant protein sequence database）数据库中筛选比对；进行GO分析，搜索KOG和KEGG数据库以分类长林小蠹基因片段的功能；最终获得全部基因序列的比对目标序列id、序列比对一致度、符合比对的区域长度、比对区域的错配数对比结果的期望值以及基因注释结果。
在全基因组的基因注释结果中，筛选注释结果为谷胱甘肽-S-转移酶、醛氧化酶、羧酸酯酶、细胞色素P450的相关基因，关键词为GST、CXE、AOX、CYP450。过滤掉序列长度过短（<50 bp），注释内容标注有fragment、isoform的序列。再运用NCBI的BLASTX在线工具进行比对，以NCBI数据库中其他昆虫的细胞色素P450、谷胱甘肽-S-转移酶、羧酸酯酶和醛氧化酶蛋白的可用序列作为查询序列，根据比对的分数确定候选气味降解酶基因，确定相似度最高的基因序列[17]。将筛选出的基因及序列整理归类，作为气味降解酶的相关基因用于后续研究。
搜索已有研究中其他物种的气味降解酶相关基因，获取基因名称与Genbank登录号。从GenBank数据库中下载各物种ODEs核苷酸序列，使用Clustal W软件进行比对，比对结果导入MEGAX软件（http://www.megasoftware.net），通过最大似然法构建系统发育树。对结果进行
1000 次分枝支持度的计算[18]，探究长林小蠹气味降解酶相关基因与其他物种之间的亲缘关系。使用iTOL（https://itol.embl.de/）在线网站对进化树进行美化。1.2 长林小蠹气味降解酶基因的组织表达分析
长林小蠹成虫由于虫体过小，因此使用体式显微镜与微型镊子、微型解剖针等工具。将成虫从−80 ℃冰箱中取出后立即放置于冰上进行解剖，以防RNA降解。分别取下长林小蠹的触角、头部、腹部、足4部分，提取不同组织的总RNA。每次提取一次RNA所需解剖的长林小蠹成虫数量为腹部10头、头部50头、足50头、触角120头。每个组织的RNA提取过程均进行了3次生物学重复和3次技术重复（所用试剂盒为Aidlab公司生产的组织RNA快速提取试剂盒）。气味降解酶相关基因的组织表达首先采用半定量RT-PCR法进行初步筛选，并验证设计引物的可行性。首先，进行cDNA扩增，将长林小蠹各组织提取出的RNA溶液作为模板，使用TAKARA公司生产的反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with DNA Eraser进行反转录，合成cDNA第一链。接着，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物，确定引物的特异性。RT-PCR反应和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应均需使用基因特异性引物。使用Primer Premier 6软件对筛选出的气味降解酶相关基因进行引物的设计。根据半定量RT-PCR试验结果，筛选出长林小蠹各组织中相对高度表达的基因。再通过qRT-PCR法进行筛选。使用2−ΔΔCt法计算每个基因相对于内参基因的表达水平，并采用单因素方差分析法检测分析基因表达水平的差异[19]。
1.3 建模模板与配体分子的选择
气味降解酶蛋白的建模模板：根据实时荧光定量PCR结果，筛选出在长林小蠹触角中高度表达的11个气味降解酶相关基因进行蛋白质三维模型的构建。其中包括4条谷胱甘肽-S-转移酶基因与7条细胞色素P450基因。
配体分子：选择长林小蠹寄主植物黑松的主要挥发物成分作为分子对接的配体。挥发物成分主要有β-月桂烯、松油烯、十一烷、壬醛、莰烯、3-蒈烯、磷酸三丁酯、α-松油醇、D-柠檬烯、a-蒎烯、β-蒎烯。气味分子的配体文件从Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获取。
气味降解酶相关蛋白的结构建模，利用swissmodle在线网站，将对应的氨基酸序列与数据库中的模板进行比对，搜索用于构建模型的最佳模板。所筛选的模板的氨基酸序列应与目标ODE氨基酸序列的一致性大于20%，且模板覆盖率达到85%以上[20]。筛选出最佳模板后使用Pymol4.6软件对蛋白结构可视化，用于后续分子对接使用。
为确保从同源建模中获得的模型的质量， 使用SAVES v6.0（https://saves.mbi.ucla.edu/）网站对筛选蛋白的三维蛋白模型进行评估。其中，Procheck法通过评估残基几何参数是否符合高分辨率结构的立体化学标准，检查蛋白质结构的立体化学质量，评价形式以拉氏构象图来显示[21]。拉式图中超过90%的残基位于红色的允许区域和黄色的额外允许区域内，则认为模型合格。VERIFY_3D是根据结构的原子坐标计算得出正确的蛋白质结构，比较氨基酸的三维结构与一级结构的兼容性。结果中超过80%的氨基酸残基得分大于0.2分则认为模型是合理的。
使用AutoDock-1.5.7软件对蛋白与气味分子进行对接。首先，对蛋白模型进行前处理，对蛋白结构去水、添加氢原子、进行电荷校正和化学键的修正，并将其保存为PDBQT格式的文件。其次，对配体小分子进行了加氢原子生成3D结构、加电荷和加Root的处理，将其保存为PDBQT格式的文件。接下来，设置对接网格的大小和空间位置，网格大小设置为x = 126，y = 126，z = 126。格点数、格点距离等参数采用系统默认值。运行AutoGrid4程序后，生成glg文件与针对不同原子探针的范德华作用力、静电力以及去溶剂化作用力的map文件。在Docking过程中，选择半柔性对接，并采用拉马克遗传算法作为对接算法，并将其保存为dpf文件。dpf文件中包含了分子对接的参数，默认对接的构象数为10个。AutoDock4程序运行完成后，生成dlg文件，其中包含了按照结合能排序的10个最佳构象。选择结合能最小的构象进行分析和评价[16]。最后，使用Pymol 4.6软件对分子对接的结果进行图像的可视化和美化。
2. 结果与分析
2.1 谷胱甘肽-S-转移酶的鉴定与系统进化发育树
共筛选出11条长林小蠹的谷胱甘肽S转移酶基因，基因的序列长度在264 ~ 696 bp之间，均具有完整的开放阅读框（open reading frame，ORF），编码的蛋白长度在87~231个氨基酸残基之间（表1）。预测的分子质量为10.1 ~ 27.1 kDa，等电点理论预测值为4.50 ~ 9.70。BLASTX比对结果显示，9个长林小蠹谷胱甘肽-S-转移酶基因与中欧山松大小蠹（Dendroctonus ponderosae）的基因具有较高的同源性，均在60%以上。HligGSTe1与稻水象甲（Lissorhoptrus oryzophilus）的同源性最高（82.2%），HligGSTe2与米象（Sitophilus oryzae）的同源性最高，为53.3%。
表 1 长林小蠹谷胱甘肽-S-转移酶基因最佳比对结果Table 1. Best comparison results of glutathione-S-transferase genes in Hylurgus ligniperda基因名称 长度/bp 开放阅读框/aa 分子量/kDa 等电点 Blastx最佳比对结果 比对物种 得分 期望值 相似度/% HligGSTu1 696 231 27.1 6.75 中欧山松大小蠹 Dendroctonus ponderosae 382 8.18−133 76.5 HligGSTu2 489 162 18.8 6.51 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 263 5.79−87 80.4 HligGSTu3 507 168 19.9 8.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 277 1.22−92 76.2 HligGSTs3 687 228 26.1 9.08 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 298 4.27−100 69.0 HligGSTs4 624 207 23.5 9.06 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 331 1.73−113 77.3 HligGSTs5 453 150 17.0 6.61 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 243 1.31−79 78.8 HligGSTs6 264 87 10.1 9.70 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 117 4.29−31 61.3 HligGSTs1 618 205 23.2 5.43 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 360 3.91−125 82.4 HligGSTs2 621 206 23.1 4.92 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 236 2.97−76 57.6 HligGSTe1 678 225 25.3 4.57 稻水象甲 Lissorhoptrus oryzophilus 390 3.28−136 82.2 HligGSTe2 672 223 25.6 4.50 米象 Sitophilus oryzae 227 3.78−72 53.3 使用软件MegaX构建长林小蠹HligGSTs和其他昆虫的谷胱甘肽-S-转移酶系统发育树[22−24]。结合系统发育进化树构建的结果（图1），长林小蠹的11条谷胱甘肽-S-转移酶基因片段分别位于GSTs的3个亚家族中。其中，2条在Epison亚家族，6条在Sigma亚家族，3条在Tau亚家族。分析表明，HligGSTs1与华山松大小蠹（Dendroctonus armandi）的DaGSTs4聚为一支，HligGSTs3与华山松大小蠹的DaGSTs7聚为一支，并与HligGSTs2同属相同的分支；HligGSTs4 ~ HligGSTs6同属于相同的分支，其中HligGSTs6与中欧山松大小蠹的DponGSTs1聚为一支，说明其遗传距离较近；HligGSTe1与华山松大小蠹的DaGSTe10聚为一支，HligGSTe2与华山松大小蠹的DaGSTe7聚为一支；HligGSTu1、HligGSTu2、HligGSTu3均聚在一小枝上，并与华山松大小蠹的DaGSTt2、DaGSTt3聚为一支。
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图 1 长林小蠹HligGSTs系统发育分析GSTs相关基因标记为红色。Tcas. 赤拟谷盗；Dpon. 中欧山松大小蠹；Da. 华山松大小蠹；Pxyl. 小菜蛾；Bmor. 家蚕；Dmel. 黑腹果蝇Figure 1. Phylogenetic analysis of HligGSTs in Hylurgus ligniperda2.2 细胞色素P450的鉴定与系统进化发育树
共筛选出46条长林小蠹的细胞色素P450（CYP450）基因，基因的序列长度总体在1 071 ~ 2 088 bp之间，均具有完整的ORF，编码的蛋白长度356 ~ 695个氨基酸残基。预测的分子质量为40.5 ~ 79.0 kDa，等电点理论预测为5.30 ~ 10.25（表2）。BLASTX比对结果显示，长林小蠹细胞色素P450基因中44条序列与同属鞘翅目的华山松大小蠹、中欧山松大小蠹高度同源。HligCYP4b6、HligCYPM2与米象序列的同源性最高。根据进化树（图2）可知，长林小蠹的44条CYP450基因分属于5个CYP亚家族，包括CYP4、CYP6、CYP9、CYP12和线粒体亚家族。由系统发育树可知，长林小蠹细胞色素P450蛋白多为自成一支，同其他已鉴定出气味降解功能的物种相比，多数长林小蠹的细胞色素P450蛋白与赤拟谷盗（Tribolium castaneum）聚为一支，遗传距离更近。HligCYP6DF1与HligCYP6n1不属于CYP亚家族的任何分支，且遗传距离较其他基因长，表明这两个蛋白功能不同于其他的细胞色素P450蛋白。
表 2 长林小蠹细胞色素P450基因最佳比对结果Table 2. Best comparison results of cytochrome P450 genes in Hylurgus ligniperda基因名称 长度/bp 开放阅读框/aa 分子量/kDa 等电点 Blastx最佳比对结果 比对物种 得分 期望值 相似度/% HligCYP6b3 1 587 528 61.1 9.16 华山松大小蠹 Dendroctonus armandi 881 0 81.7 HligCYP12a1 1 452 483 55.5 8.17 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 858 6.55−313 85.9 HligCYP12a2 1 557 518 58.9 8.34 华山松大小蠹 D. armandi 853 0 86.8 HligCYP12a3 1 578 525 60.5 8.98 华山松大小蠹 D. armandi 962 0 91.4 HligCYP12a4 1 536 511 58.6 8.64 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 863 1.77−313 86.3 HligCYP12a5 1 596 531 61.4 8.58 华山松大小蠹 D. armandi 922 0 84.9 HligCYP12a6 1 761 586 67.4 8.63 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 992 0 85.0 HligCYP4a1 1 545 514 58.4 6.30 华山松大小蠹 D. armandi 912 0 88.3 HligCYP4a2 1 182 393 45.3 6.53 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 605 2.11−214 77.7 HligCYP4a3 222 73 84.4 10.25 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 57 3.07−08 66.7 HligCYP4a4 1 515 504 58.2 8.54 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 335 1.07−106 36.4 HligCYP4a5 1 314 437 50.1 8.59 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 665 3.60−237 72.7 HligCYP4a6 1 692 563 64.8 7.02 华山松大小蠹 D. armandi 1 006 0 87.7 HligCYP4a7 1 692 563 64.5 7.64 华山松大小蠹 D. armandi 1 036 0 90.6 HligCYP4a8 1 485 494 57.2 9.04 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 743 7.94−267 74.6 HligCYP4a9 1 491 496 56.8 8.74 华山松大小蠹 D. armandi 701 9.40−251 76.5 HligCYP4b1 1 515 504 58.4 8.48 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 795 3.09−287 78.5 HligCYP4b2 1 548 515 59.2 7.54 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 828 6.63−300 79.0 HligCYP4b3 1 521 506 58.6 8.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 849 5.20−308 76.9 HligCYP4b4 1 467 488 56.3 8.70 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 730 2.99−262 73.0 HligCYP4b5 1 509 502 58.1 9.00 华山松大小蠹 D. armandi 774 4.84−279 74.1 HligCYP4b6 1 509 502 58.4 6.77 米象 Sitophilus oryzae 500 5.67−171 52.8 HligCYP4b7 1 491 496 56.8 9.06 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 742 1.86−266 74.6 HligCYP4b8 1 332 443 50.3 6.44 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 604 4.50−213 67.9 HligCYP4b9 1 491 496 57.2 7.62 华山松大小蠹 D. armandi 783 1.42−282 78.3 HligCYP6a1 1 551 516 59.7 8.57 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 700 3.19−249 67.5 HligCYP6a2 1 137 378 43.7 7.01 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 499 1.85−174 67.4 HligCYP6a3 1 518 505 58.6 9.16 华山松大小蠹 D. armandi 889 0 85.7 HligCYP6a4 1 071 356 40.5 8.78 华山松大小蠹 D. armandi 521 2.25−181 69.6 HligCYP6a5 1 533 510 58.1 9.10 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 893 0 85.6 HligCYP6a6 1 452 483 56.4 8.58 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 685 2.85−244 66.5 HligCYP6a7 1 524 507 58.1 9.17 华山松大小蠹 D. armandi 816 1.33−295 77.7 HligCYP6a8 1 569 522 60.3 9.08 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 772 1.45−277 71.8 HligCYP6D1 1 242 413 46.2 6.79 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 732 2.19−264 88.1 HligCYP6n1 2 088 695 79.0 5.30 华山松大小蠹 D. armandi 1 321 0 93.4 HligCYP6a9 1 503 500 58.3 8.65 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 863 2.04−314 81.0 HligCYP6b1 1 491 496 56.9 8.98 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 796 8.81−288 76.3 HligCYP6b2 1 503 500 57.3 9.01 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 855 3.23−311 81.2 HligCYP6b3 1 086 361 41.4 7.10 华山松大小蠹 D. armandi 602 1.85−213 80.6 HligCYP6a9 1 611 536 62.4 8.95 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 770 1.86−276 74.2 HligCYP6b1 1 572 523 60.5 8.84 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 802 2.74−289 74.9 HligCYP9a3 1 587 528 61.3 9.04 华山松大小蠹 D. armandi 930 0 83.1 HligCYP9a1 1 437 478 55.7 6.69 华山松大小蠹 D. armandi 689 1.74−245 74.8 HligCYPM1 1 224 407 47.3 6.67 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 560 9.05−197 68.5 HligCYPM2 1 584 527 60.3 6.73 米象 Sitophilus oryzae 942 0 86.9 HligCYPM3 1 470 489 55.2 8.79 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 738 5.77−265 72.5 ![]()
图 2 长林小蠹HligCYPs系统发育分析CYPs相关基因标记为红色。Tcas.赤拟谷盗；Dpon.中欧山松大小蠹；Da.华山松大小蠹；Pxyl.小菜蛾；Bmor.家蚕；Dmel.黑腹果蝇Figure 2. Phylogenetic analysis of HligCYPs in Hylurgus ligniperda2.3 羧酸酯酶的鉴定与系统进化发育树
共筛选出8条长林小蠹的羧酸酯酶（CXEs）基因，基因的序列长度
1296 ~ 2 031 bp，均具有完整的ORF，编码的蛋白长度在431 ~ 676个氨基酸残基之间。预测的分子质量为43.0 ~ 67.1 kDa，等电点理论预测为5.93 ~ 9.22（表3）。BLASTX比对结果显示，7个长林小蠹羧酸酯酶基因与中欧山松大小蠹的谷胱甘肽-S-转移酶基因具有较高的同源性，均在63%以上。HligCXE8与米象一致性最强，为68.4%。与其他已鉴定出具有气味降解功能的物种构建的系统发育树结果（图3）显示：HligCXE1 ~ HligCXE7与甜菜夜蛾（Spodoptera exigua的SexiCXE13聚在同一枝，表明其具有相似的功能，遗传距离更近；HligCXE8独自为一支，表明其与其他7个羧酸酯酶蛋白功能相似度不高。表 3 长林小蠹羧酸酯酶基因最佳比对结果Table 3. Best comparison results of carboxylesterase genes in Hylurgus ligniperda基因名称 长度/bp 开放阅读框/aa 分子量/kDa 等电点 Blastx最佳比对结果 对比物种 得分 期望值 相似度/% HligCXE1 1 707 568 64.5 5.93 中欧山松大小蠹 Dendroctonus ponderosae 864 1.81−312 72.5 HligCXE2 1 707 568 57.4 6.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 766 1.57−273 65.3 HligCXE3 1 548 515 51.4 6.16 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 785 7.15−282 74.0 HligCXE4 1 515 504 43.0 8.53 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 785 4.65−282 74.0 HligCXE5 1 521 506 57.9 5.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 728 8.04−260 63.3 HligCXE6 1 296 431 49.1 7.20 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 665 2.60−236 73.7 HligCXE7 1 698 565 64.6 9.22 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 948 0 80.2 HligCXE8 2 031 676 67.1 8.66 米象 Sitophilus oryzae 863 0 68.4 ![]()
图 3 长林小蠹HligCXEs系统发育分析CXEs相关基因标记为红色。Tcas.赤拟谷盗；Pxyl.小菜蛾；Bmor.家蚕；Dmel.黑腹果蝇；Sexi.甜菜夜蛾Figure 3. Phylogenetic analysis of HligCXEs in Hylurgus ligniperda2.4 长林小蠹气味降解酶基因的组织表达分析
通过RT-PCR反应共筛选出长林小蠹的23个基因，其中包括19个细胞色素P450基因和4个谷胱甘肽-S-转移酶基因。利用qRT-PCR技术研究这23个基因在长林小蠹成虫的4种不同组织（触角、头部、腹部和腿部）的表达。将头部的表达量作为对照组，绘制气味降解酶相关基因的组织表达谱（图4）。结果显示：4个谷胱甘肽-S-转移酶基因中，HligGSTu1、HligGSTe1、HligGSTs3、HligGSTs6在触角中的表达量均高于头部，其中HligGSTs3也在腹部和足部表达，HligGSTs6在腹部有表达，HligGSTu1、HligGSTe1在腹部和足部表达量较低；19个CYP450基因中，HligCYP6a8、HligCYP12a4、HligCYP4b1、HligCYP6a6、HligCYP4a5、HligCYP9a2、HligCYP12a6在触角的表达量高于头部，其中HligCYP4a5、HligCYP6a6与HligCYP12a6在的触角表达尤其显著；HligCYP4b3、HligCYP4a7在腹部的表达显著，HligCYP4a5、HligCYP12a6、HligCYP9a2在足部的表达显著。相对非嗅觉器官，长林小蠹的GST基因与CYP450基因多在嗅觉器官中表达。
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图 4 长林小蠹HligGSTs（a~d）与HligCYPs（e~w）在成虫不同组织中的相对表达水平H.头部；B.身体；L.足；AN.触角Figure 4. Relative expression levels of HligGSTs (a−d) and HligCYPs (e−w) in different tissues of Hylurgus ligniperda2.5 模型模板的选择
与HligGSTu1氨基酸序列一致性最高的模板是中欧山松大小蠹的GST蛋白，模板编号J3JYS3.1.A，序列一致性为77.83%，模板覆盖率100%；与HligGSTs3氨基酸序列一致性最高的是褐飞虱（Nilaparvata lugens）的GSTS2蛋白，模板编号5h5l.1.A，序列一致性为48%，模板覆盖率88%；与HligGSTs6氨基酸序列一致性最高的是血矛线虫（Haemonchus contortus）的GST蛋白，模板编号2ws2.1.A，序列一致性为44.74%，模板覆盖率87%；与HligGSTe1氨基酸序列一致性最高的是稻水象甲的GSTe1蛋白，模板编号A0A2R4FXD5.1.A，序列一致性为82.22%，模板覆盖率100%；与HligCYP6a8氨基酸序列一致性最高的是中欧山松大小蠹的CYP6BX1蛋白，模板编号I1VJ44.1.A，序列一致性为72.66%，模板覆盖率98%；与HligCYP12a4氨基酸序列一致性最高的是华山松大小蠹的CYP450蛋白，模板编号A0A0M4H594.1.A，序列一致性83.6%，模板覆盖率98%；与HligCYP4b1氨基酸序列一致性最高的是中欧山松大小蠹的CYP411a1蛋白，模板编号I1VJ30.1.A，序列一致性为78.82%，模板覆盖率97%；与HligCYP6a6氨基酸序列一致性最高的是人类的CYP3a4蛋白，模板编号8so1.1.B，序列一致性为29.07%，模板覆盖率94%；与HligCYP4a5氨基酸序列一致性最高的模板编号为6c93.1.A，序列一致性为21.67%，模板覆盖率96%；与HligCYP9a2氨基酸序列一致性最高的是中欧山松大小蠹的CYP450蛋白，模板编号U4UD90.1.A，序列一致性为76.20%，模板覆盖率100%；与HligCYP12a6氨基酸序列一致性最高的是中欧山松大小蠹的CYP49a1蛋白，模板编号I1VJ31.1.A，序列一致性为88.68%，模板覆盖率98%（表4）。11个蛋白的结构建模如图5所示。
表 4 长林小蠹气味降解酶基因三维建模信息Table 4. Modeling information of odor degrading enzyme genes in Hylurgus ligniperda基因名称 模版编号 类别 模型质
量估计一致性/% 方法 蛋白状态 质量评估 相似度 覆盖率/% HligGSTu1 J3JYS3.1.A Glutathione S-transferase 0.96 77.83 AlphaFold v2 Monomer 0.55 100 HligGSTs3 5h5l.1.A Glutathione S-transferase S2 0.76 48.00 X-ray, 2.00 Å Homo-dimer −0.82 0.44 88 HligGSTs6 2ws2.1.A Glutathione S-transferase 0.72 44.74 X-ray, 2.01 Å Homo-dimer −0.74 0.42 87 HligGSTe1 A0A2R4FXD5.A Glutathione S-transferase e1 0.93 82.22 AlphaFold v2 Monomer 0.57 100 HligCYP6a8 I1VJ44.1.A Cytochrome P450 CYP6BX1 0.85 72.66 AlphaFold v2 Monomer 0.53 98 HligCYP12a4 A0A0M4H594.A Cytochrome P450 0.86 83.60 AlphaFold v2 Monomer 0.56 98 HligCYP4b1 I1VJ30.1.A Cytochrome P450 CYP411a1 0.89 78.82 AlphaFold v2 Monomer 0.55 97 HligCYP6a6 8so1.1.B Cytochrome P450 3A4 0.61 29.07 X-ray, 2.05 Å Homo-dimer −3.20 0.34 94 HligCYP4a5 6c93.1.A Cytochrome P450 4B1 0.57 21.67 X-ray, 2.67 Å Monomer −3.78 0.32 96 HligCYP9a2 U4UD90.1.A Cytochrome P450 0.88 76.20 AlphaFold v2 Monomer 0.54 100 HligCYP12a6 I1VJ31.1.A Cytochrome P450 CYP49a1 0.81 88.68 AlphaFold v2 Monomer 0.58 98 ![]()
图 5 长林小蠹对接蛋白的三维结构模型A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1； E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6Figure 5. Three-dimensional structure model of docking protein in Hylurgus ligniperda2.6 模型评价结果
对Procheck法得到的拉氏构象图（图6）进行分析发现：HligGSTu1的氨基酸残基中，93.8%位于理想区域，5.7%处于较好区域，0.5%在允许区域，没有残基在不允许区域；HligGSTs3的残基中，92.6%位于理想区域，6.8%在较好区域，0.6%在不允许区域；HligGSTs6的残基中，91.9%位于理想区域，6.5%在较好区域，1.6%在不允许区域；HligGSTe1的残基中，有94%位于理想区域，6%在较好区域；HligCYP6a8的残基中，91.6%位于理想区域，7.6%在较好区域，0.4%在允许区域，0.4%在不允许区域；HligCYP12a4的残基中，89.9%位于理想区域，8.3%在较好区域，1.1%在允许区域，0.7%在不允许区域；HligCYP4b1的残基中，92.4%位于理想区域，6.5%在较好区域，0.4%在允许区域，0.7%在不允许区域；HligCYP6a6的残基中，91%位于理想区域，8%在较好区域，0.2%在允许区域，0.7%在不允许区域；HligCYP4a5的残基中，89.2%位于理想区域，8.7%在较好区域，0.5%在允许区域，1.6%在不允许区域；HligCYP9a2的残基中，90.1%位于理想区域，9.5%在较好区域，0.2%在允许区域，0.2%在不允许区域；HligCYP12a6的残基中，84.9%位于理想区域，12.6%在较好区域，1.7%在允许区域，0.8%在不允许区域。综合上述数据，除了HligCYP12a4、HligCYP4a5和HligCYP12a6之外，其他蛋白序列的拉氏构象图均满足理想区域超过90%的要求，这表明构建的蛋白模型结构是合理的。
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图 6 长林小蠹蛋白模型拉氏构象图A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1；E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6Figure 6. Ramachandran plots of protein models in Hylurgus ligniperda利用Verify_3D法评估蛋白质的三维结构与其氨基酸序列的一致性（图7）。一般认为超过80%的残基拥有大于0.2的3D/1D值，则模型的质量合格。4条GST蛋白中，HligGSTu1大于0.2的氨基酸有79.57%，HligGSTs3大于0.2的氨基酸有63.98%，HligGSTs6得分大于0.2的氨基酸有74.34%，HligGSTe1大于0.2的氨基酸有58.22%。7条细胞色素450蛋白中，HligCYP6a8大于0.2的氨基酸有85.24%，HligCYP12a4大于0.2的氨基酸有61.60%；HligCYP4b1、HligCYP6a6、HligCYP4a5、HligCYP9a2和HligCYP12a6大于0.2的氨基酸分别有77.08%、80.54%、73.87%、73.18%、76.24%。综上，HligCYP6a8与HligCYP6a6的氨基酸残基与其一级结构较为符合。
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图 7 长林小蠹蛋白模型Verify_3D结果A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1；E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6。3D.蛋白质的三维结构，即蛋白质在空间中的实际构象；1D.蛋白质的一维序列，即氨基酸序列。通常用3D/1D值来表示该残基在三维结构中所处的环境与一维序列信息的匹配程度。Figure 7. Verify_3D results of protein models in Hylurgus ligniperdaErrat法通过评估在0.35 nm距离内不同原子类型间的非键合相互作用数量，判断其是否处在合理界限内，以此计算模型的准确度误差值。一般认为得分大于85分则表示分子结构较好。结果（图8）显示，除HligCYP6a6得分略小于85外，其余10个蛋白均高于85，表明其蛋白建模的非键相互作用是合理的。
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图 8 长林小蠹蛋白模型Errat评估结果A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1；E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6。**表示在P < 0.01的显著性水平下拒绝零假设。Figure 8. Errat assessment results of protein models in Hylurgus ligniperda2.7 分子对接结果
通过分子对接，分析了长林小蠹11个气味降解酶与寄主植物11种主要挥发物的结合能（表5）。分子对接主要包含了分子之间的空间识别和能量识别两个方面，其中分子之间保持稳定结合的基础是能量匹配。结合能的大小显示了蛋白模型与配体气味分子结合的能力大小，结合能数值越低表明二者的结合能力越强。
表 5 长林小蠹气味降解酶与气味化合物对接的结合能Table 5. Binding energy of odor compounds and odorant degrading enzymes in Hylurgus ligniperdakJ/mol 气味
化合物HligGSTu1 HligGSTs3 HligGSTs6 HligGSTe1 HligCYP6a8 HligCYP12a4 HligCYP4b1 HligCYP6a6 HligCYP4a5 HligCYP9a2 HligCYP12a6 β-月桂烯 −4.31 −4.62 −3.45 −3.50 −4.96 −4.89 −4.55 −3.89 −4.12 −4.04 −4.65 松油烯 −5.07 −6.14 −4.23 −4.23 −5.72 −5.85 −5.58 −5.13 −4.9 −4.78 −5.73 十一烷 −3.92 −4.17 −2.85 −3.31 −4.67 −4.50 −4.28 −2.86 −3.33 −3.62 −4.34 壬醛 −3.52 −4.46 −2.86 −3.50 −4.40 −4.54 −4.10 −3.05 −3.44 −3.47 −4.22 莰烯 −5.45 −5.16 −4.42 −4.57 −5.85 −5.86 −5.23 −4.61 −5.84 −4.79 −6.31 3-蒈烯 −4.75 −4.19 −3.90 −4.19 −5.22 −5.53 −5.19 −4.39 −4.81 −4.57 −5.47 磷酸三
丁酯−3.86 −3.15 −2.08 −2.88 −4.71 −3.13 −3.85 −2.63 −3.04 −3.91 −3.70 α-松油醇 −5.39 −5.26 −4.54 −4.61 −6.00 −5.67 −5.69 −4.64 −5.13 −5.70 −5.74 D-柠檬烯 −5.10 −5.92 −4.00 −4.48 −5.65 −5.85 −5.54 −4.51 −4.6 −5.31 −5.72 α-蒎烯 −5.13 −5.07 −4.22 −4.45 −4.92 −5.58 −5.11 −5.17 −5.77 −5.96 −5.98 β-蒎烯 −5.07 −4.86 −3.87 −4.17 −4.91 −5.52 −5.12 −5.23 −5.92 −5.05 −6.05 11个气味分子中，与长林小蠹气味降解酶结合能较高的为十一烷、磷酸三丁酯、壬醛，表明其结合特性较差。松油烯、α-蒎烯、β-蒎烯和莰烯的结合能普遍较低，结合特性较好，其中HligGSTs3与松油烯的结合能最低，为−6.14 kJ/mol。根据表5中结合能数据，选择HligGSTu1与HligGSTs3做进一步的分子对接分析。
HligGSTu1与莰烯和α-蒎烯的对接结果如图9所示。莰烯位于长林小蠹HligGSTu1的α-螺旋形成的结合腔内，二者之间主要形成Alkyl键、Pi-Alkyl键，其作用位点的疏水性氨基酸残基有LEU（A：143） 、LEU（A：182）、TRP（A：186）和LYS（A：185）。α-蒎烯位于长林小蠹HligGSTu1的β-螺旋形成的结合腔内，二者之间主要形成Alkyl键、Pi-Alkyl键作用，其作用位点的疏水性氨基酸残基有LEU（A：115）、CYS（A：111）、PRO（A：12）、PHE（A：119）、PHE（A：120）和ALA（A：10）。
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图 9 HligGSTu1与莰烯（A ~ C）和α-蒎烯（D ~ F）的对接情况A、D.结合模式的三维结构显示；B、E.莰烯和α-蒎烯与蛋白口袋的详细结合模式；C、F.蛋白分子间作用力Figure 9. Docking situation of HligGSTu1 with camphene (A−C) and α-pinene (D−F)HligGSTs3与莰烯和α-蒎烯的对接结果如图10所示。莰烯位于长林小蠹HligGSTs3的α-螺旋形成的结合腔内，二者之间主要形成Alkyl键、Pi-Alkyl键，其作用位点的疏水性氨基酸残基有LEU（B：39）、LEU（B：184）、LEU（B：188）、ARG（B：124）和PHE（B：127）。α-蒎烯位于长林小蠹HligGSTs3的α-螺旋形成的结合腔内，二者之间主要形成Alkyl键、Pi-Alkyl键作用，其作用位点的疏水性氨基酸残基有LEU（B：39）、LEU（B：184）、LEU（B：188）、PHE（B：127）和ARG（B：124）。
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图 10 HligGSTs3与莰烯（A ~ C）和α-蒎烯（D ~ F）的对接情况A、D.结合模式的三维结构显示；B、E.莰烯和α-蒎烯与蛋白口袋的详细结合模式；C、F.蛋白分子间作用力Figure 10. Docking situation of HligGSTs3 with camphene (A−C) and α-pinene (D−F)3. 讨 论
昆虫气味降解酶研究领域与其他嗅觉相关蛋白领域（如气味结合蛋白、化学感受蛋白、气味受体等）相比，文章发文量较少，研究者数量也十分有限。已有的研究结果显示，气味降解酶会单独或与其他分子结合完成信号的失活化过程[25]。本研究在长林小蠹全基因组数据中共鉴定出65个候选的气味降解酶基因，其中GSTs 基因11个，CYP450基因46个，CXEs基因8个。相较于家蚕（Bombyx mori）、小菜蛾、赤拟谷盗、中欧山松大小蠹等已鉴定出气味降解相关功能基因的物种[26−30]，长林小蠹的气味降解酶基因数量偏少。原因可能是，基因组数据中长林小蠹序列片段的分析不全，并未将许多fragment片段与isoform片段包含在基因检测的范围内；此外也可能与长林小蠹的生存环境和生物学习性相关[31]。
从长林小蠹与其他物种的系统发育进化树中，发现大多数气味降解酶相关基因在不同物种间聚在同一枝上，基因相对保守。而同一物种内的气味降解酶基因表现出一定的分化，这可能与长林小蠹长期的进化过程中基因适应环境的变化而快速功能分化有关[32−33]。在筛选的3类基因中，GST中Epison亚家族在触角部位展现出较高的扩散能力和适应性，并且与有害物质的代谢过程密切相关。例如：赤拟谷盗的GST基因在接触到荼这种物质后，其表达水平显著增加，显示出其在有毒物质代谢中的关键作用；TcasGSTd2基因在有杀虫剂的环境中显著上调表达，敲除掉同一家族的TcasGSTd1则表现为生殖能力的丧失与发育上的缺陷。CYP450参与昆虫的内源化合物的生成降解和外源有毒化学物质的解毒过程，在终止化学信号过程中发挥作用。其中CYP6和CYP9同属于CYP3的分支，主要参与外源性代谢与解毒的过程[8]。昆虫CXE基因的功能包括性信息素的传递、毒性物质的解毒，已有研究表明斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的SlitCXE基因在乙酸酯信息素和植物挥发酯的降解中起重要作用[34−35]。组织表达的结果分析发现，长林小蠹气味降解酶相关基因主要在触角中富集表达，且GSTs与CYP450两类基因家族的表达量较高，这表明气味降解酶基因的表达多集中于触角的淋巴液中，且类型较为统一[36]。
选取在触角中显著表达的气味降解酶基因进行三维建模与分子对接，结果显示，气味降解酶和不同气味分子的之间的结合能差异较小，结合能数值在−6 ~ −3之间。同一气味分子与不同气味降解酶结合时，结合位点与结合能相似，且气味降解酶对于同一气味分子特异性不高。在OBPs、ORs和ODEs 3种蛋白质类别中，ODEs可能是特异性最低的，因此是更具针对性的行为抑制蛋白[37]。本研究选取了触角中表达量较高的GST基因进行具体的分子对接结合过程，在对候选气味降解酶与配体相互作用的研究中发现，这些酶的专一性相对较弱。不同种类的气味降解酶在与相同气味分子结合时，其结合模式的变化不大，这与其他特异性的嗅觉相关蛋白明显不同。进一步分析表明，气味降解酶与气味结合蛋白在与配体结合的机制上存在本质差异。通过分子对接研究，我们了解到蛋白质内部的结合腔和蛋白质表面形成的结合位点，并不能直接反映其结合的紧密程度；实际上，结合能的大小主要受到化学键的形成和分子构型的影响。就本研究中的气味降解酶而言，结构相似的气味分子与蛋白质结合位点的相互作用主要由Alkyl作用力所决定。从气味降解的功能角度来看，ODEs 对气味分子的特异性较低，这表明它们具有广泛降解大部分气味分子的特点。结合能的数值也表明ODEs确实对气味分子具有一定的降解能力。
通过本次研究，可以证实气味降解酶具备分解气味分子的有效性，并筛选出了潜在的具有较强气味降解能力的长林小蠹气味降解酶基因，但对ODE具体的的功能研究还需要进行实际的分子试验与行为试验。在本研究在认知其功能的基础上，应当深入研究气味降解酶基因调控机制，为能开发基于ODEs的害虫行为调控技术提供理论支持。
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图 1 长林小蠹HligGSTs系统发育分析
GSTs相关基因标记为红色。Tcas. 赤拟谷盗；Dpon. 中欧山松大小蠹；Da. 华山松大小蠹；Pxyl. 小菜蛾；Bmor. 家蚕；Dmel. 黑腹果蝇
Figure 1. Phylogenetic analysis of HligGSTs in Hylurgus ligniperda
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图 2 长林小蠹HligCYPs系统发育分析
CYPs相关基因标记为红色。Tcas.赤拟谷盗；Dpon.中欧山松大小蠹；Da.华山松大小蠹；Pxyl.小菜蛾；Bmor.家蚕；Dmel.黑腹果蝇
Figure 2. Phylogenetic analysis of HligCYPs in Hylurgus ligniperda
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图 3 长林小蠹HligCXEs系统发育分析
CXEs相关基因标记为红色。Tcas.赤拟谷盗；Pxyl.小菜蛾；Bmor.家蚕；Dmel.黑腹果蝇；Sexi.甜菜夜蛾
Figure 3. Phylogenetic analysis of HligCXEs in Hylurgus ligniperda
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图 4 长林小蠹HligGSTs（a~d）与HligCYPs（e~w）在成虫不同组织中的相对表达水平
H.头部；B.身体；L.足；AN.触角
Figure 4. Relative expression levels of HligGSTs (a−d) and HligCYPs (e−w) in different tissues of Hylurgus ligniperda
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图 5 长林小蠹对接蛋白的三维结构模型
A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1； E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6
Figure 5. Three-dimensional structure model of docking protein in Hylurgus ligniperda
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图 6 长林小蠹蛋白模型拉氏构象图
A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1；E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6
Figure 6. Ramachandran plots of protein models in Hylurgus ligniperda
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图 7 长林小蠹蛋白模型Verify_3D结果
A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1；E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6。3D.蛋白质的三维结构，即蛋白质在空间中的实际构象；1D.蛋白质的一维序列，即氨基酸序列。通常用3D/1D值来表示该残基在三维结构中所处的环境与一维序列信息的匹配程度。
Figure 7. Verify_3D results of protein models in Hylurgus ligniperda
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图 8 长林小蠹蛋白模型Errat评估结果
A. HligGSTu1；B. HligGSTs3；C. HligGSTs6；D. HligGSTe1；E. HligCYP6a8；F. HligCYP12a4；G. HligCYP4b1；H. HligCYP6a6；I. HligCYP4a5；J. HligCYP9a2；K. HligCYP12a6。**表示在P < 0.01的显著性水平下拒绝零假设。
Figure 8. Errat assessment results of protein models in Hylurgus ligniperda
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图 9 HligGSTu1与莰烯（A ~ C）和α-蒎烯（D ~ F）的对接情况
A、D.结合模式的三维结构显示；B、E.莰烯和α-蒎烯与蛋白口袋的详细结合模式；C、F.蛋白分子间作用力
Figure 9. Docking situation of HligGSTu1 with camphene (A−C) and α-pinene (D−F)
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图 10 HligGSTs3与莰烯（A ~ C）和α-蒎烯（D ~ F）的对接情况
A、D.结合模式的三维结构显示；B、E.莰烯和α-蒎烯与蛋白口袋的详细结合模式；C、F.蛋白分子间作用力
Figure 10. Docking situation of HligGSTs3 with camphene (A−C) and α-pinene (D−F)
表 1 长林小蠹谷胱甘肽-S-转移酶基因最佳比对结果
Table 1 Best comparison results of glutathione-S-transferase genes in Hylurgus ligniperda
基因名称 长度/bp 开放阅读框/aa 分子量/kDa 等电点 Blastx最佳比对结果 比对物种 得分 期望值 相似度/% HligGSTu1 696 231 27.1 6.75 中欧山松大小蠹 Dendroctonus ponderosae 382 8.18−133 76.5 HligGSTu2 489 162 18.8 6.51 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 263 5.79−87 80.4 HligGSTu3 507 168 19.9 8.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 277 1.22−92 76.2 HligGSTs3 687 228 26.1 9.08 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 298 4.27−100 69.0 HligGSTs4 624 207 23.5 9.06 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 331 1.73−113 77.3 HligGSTs5 453 150 17.0 6.61 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 243 1.31−79 78.8 HligGSTs6 264 87 10.1 9.70 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 117 4.29−31 61.3 HligGSTs1 618 205 23.2 5.43 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 360 3.91−125 82.4 HligGSTs2 621 206 23.1 4.92 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 236 2.97−76 57.6 HligGSTe1 678 225 25.3 4.57 稻水象甲 Lissorhoptrus oryzophilus 390 3.28−136 82.2 HligGSTe2 672 223 25.6 4.50 米象 Sitophilus oryzae 227 3.78−72 53.3 
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表 2 长林小蠹细胞色素P450基因最佳比对结果
Table 2 Best comparison results of cytochrome P450 genes in Hylurgus ligniperda
基因名称 长度/bp 开放阅读框/aa 分子量/kDa 等电点 Blastx最佳比对结果 比对物种 得分 期望值 相似度/% HligCYP6b3 1 587 528 61.1 9.16 华山松大小蠹 Dendroctonus armandi 881 0 81.7 HligCYP12a1 1 452 483 55.5 8.17 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 858 6.55−313 85.9 HligCYP12a2 1 557 518 58.9 8.34 华山松大小蠹 D. armandi 853 0 86.8 HligCYP12a3 1 578 525 60.5 8.98 华山松大小蠹 D. armandi 962 0 91.4 HligCYP12a4 1 536 511 58.6 8.64 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 863 1.77−313 86.3 HligCYP12a5 1 596 531 61.4 8.58 华山松大小蠹 D. armandi 922 0 84.9 HligCYP12a6 1 761 586 67.4 8.63 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 992 0 85.0 HligCYP4a1 1 545 514 58.4 6.30 华山松大小蠹 D. armandi 912 0 88.3 HligCYP4a2 1 182 393 45.3 6.53 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 605 2.11−214 77.7 HligCYP4a3 222 73 84.4 10.25 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 57 3.07−08 66.7 HligCYP4a4 1 515 504 58.2 8.54 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 335 1.07−106 36.4 HligCYP4a5 1 314 437 50.1 8.59 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 665 3.60−237 72.7 HligCYP4a6 1 692 563 64.8 7.02 华山松大小蠹 D. armandi 1 006 0 87.7 HligCYP4a7 1 692 563 64.5 7.64 华山松大小蠹 D. armandi 1 036 0 90.6 HligCYP4a8 1 485 494 57.2 9.04 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 743 7.94−267 74.6 HligCYP4a9 1 491 496 56.8 8.74 华山松大小蠹 D. armandi 701 9.40−251 76.5 HligCYP4b1 1 515 504 58.4 8.48 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 795 3.09−287 78.5 HligCYP4b2 1 548 515 59.2 7.54 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 828 6.63−300 79.0 HligCYP4b3 1 521 506 58.6 8.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 849 5.20−308 76.9 HligCYP4b4 1 467 488 56.3 8.70 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 730 2.99−262 73.0 HligCYP4b5 1 509 502 58.1 9.00 华山松大小蠹 D. armandi 774 4.84−279 74.1 HligCYP4b6 1 509 502 58.4 6.77 米象 Sitophilus oryzae 500 5.67−171 52.8 HligCYP4b7 1 491 496 56.8 9.06 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 742 1.86−266 74.6 HligCYP4b8 1 332 443 50.3 6.44 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 604 4.50−213 67.9 HligCYP4b9 1 491 496 57.2 7.62 华山松大小蠹 D. armandi 783 1.42−282 78.3 HligCYP6a1 1 551 516 59.7 8.57 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 700 3.19−249 67.5 HligCYP6a2 1 137 378 43.7 7.01 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 499 1.85−174 67.4 HligCYP6a3 1 518 505 58.6 9.16 华山松大小蠹 D. armandi 889 0 85.7 HligCYP6a4 1 071 356 40.5 8.78 华山松大小蠹 D. armandi 521 2.25−181 69.6 HligCYP6a5 1 533 510 58.1 9.10 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 893 0 85.6 HligCYP6a6 1 452 483 56.4 8.58 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 685 2.85−244 66.5 HligCYP6a7 1 524 507 58.1 9.17 华山松大小蠹 D. armandi 816 1.33−295 77.7 HligCYP6a8 1 569 522 60.3 9.08 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 772 1.45−277 71.8 HligCYP6D1 1 242 413 46.2 6.79 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 732 2.19−264 88.1 HligCYP6n1 2 088 695 79.0 5.30 华山松大小蠹 D. armandi 1 321 0 93.4 HligCYP6a9 1 503 500 58.3 8.65 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 863 2.04−314 81.0 HligCYP6b1 1 491 496 56.9 8.98 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 796 8.81−288 76.3 HligCYP6b2 1 503 500 57.3 9.01 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 855 3.23−311 81.2 HligCYP6b3 1 086 361 41.4 7.10 华山松大小蠹 D. armandi 602 1.85−213 80.6 HligCYP6a9 1 611 536 62.4 8.95 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 770 1.86−276 74.2 HligCYP6b1 1 572 523 60.5 8.84 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 802 2.74−289 74.9 HligCYP9a3 1 587 528 61.3 9.04 华山松大小蠹 D. armandi 930 0 83.1 HligCYP9a1 1 437 478 55.7 6.69 华山松大小蠹 D. armandi 689 1.74−245 74.8 HligCYPM1 1 224 407 47.3 6.67 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 560 9.05−197 68.5 HligCYPM2 1 584 527 60.3 6.73 米象 Sitophilus oryzae 942 0 86.9 HligCYPM3 1 470 489 55.2 8.79 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 738 5.77−265 72.5
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表 3 长林小蠹羧酸酯酶基因最佳比对结果
Table 3 Best comparison results of carboxylesterase genes in Hylurgus ligniperda
基因名称 长度/bp 开放阅读框/aa 分子量/kDa 等电点 Blastx最佳比对结果 对比物种 得分 期望值 相似度/% HligCXE1 1 707 568 64.5 5.93 中欧山松大小蠹 Dendroctonus ponderosae 864 1.81−312 72.5 HligCXE2 1 707 568 57.4 6.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 766 1.57−273 65.3 HligCXE3 1 548 515 51.4 6.16 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 785 7.15−282 74.0 HligCXE4 1 515 504 43.0 8.53 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 785 4.65−282 74.0 HligCXE5 1 521 506 57.9 5.74 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 728 8.04−260 63.3 HligCXE6 1 296 431 49.1 7.20 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 665 2.60−236 73.7 HligCXE7 1 698 565 64.6 9.22 中欧山松大小蠹 D. ponderosae 948 0 80.2 HligCXE8 2 031 676 67.1 8.66 米象 Sitophilus oryzae 863 0 68.4
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表 4 长林小蠹气味降解酶基因三维建模信息
Table 4 Modeling information of odor degrading enzyme genes in Hylurgus ligniperda
基因名称 模版编号 类别 模型质
量估计一致性/% 方法 蛋白状态 质量评估 相似度 覆盖率/% HligGSTu1 J3JYS3.1.A Glutathione S-transferase 0.96 77.83 AlphaFold v2 Monomer 0.55 100 HligGSTs3 5h5l.1.A Glutathione S-transferase S2 0.76 48.00 X-ray, 2.00 Å Homo-dimer −0.82 0.44 88 HligGSTs6 2ws2.1.A Glutathione S-transferase 0.72 44.74 X-ray, 2.01 Å Homo-dimer −0.74 0.42 87 HligGSTe1 A0A2R4FXD5.A Glutathione S-transferase e1 0.93 82.22 AlphaFold v2 Monomer 0.57 100 HligCYP6a8 I1VJ44.1.A Cytochrome P450 CYP6BX1 0.85 72.66 AlphaFold v2 Monomer 0.53 98 HligCYP12a4 A0A0M4H594.A Cytochrome P450 0.86 83.60 AlphaFold v2 Monomer 0.56 98 HligCYP4b1 I1VJ30.1.A Cytochrome P450 CYP411a1 0.89 78.82 AlphaFold v2 Monomer 0.55 97 HligCYP6a6 8so1.1.B Cytochrome P450 3A4 0.61 29.07 X-ray, 2.05 Å Homo-dimer −3.20 0.34 94 HligCYP4a5 6c93.1.A Cytochrome P450 4B1 0.57 21.67 X-ray, 2.67 Å Monomer −3.78 0.32 96 HligCYP9a2 U4UD90.1.A Cytochrome P450 0.88 76.20 AlphaFold v2 Monomer 0.54 100 HligCYP12a6 I1VJ31.1.A Cytochrome P450 CYP49a1 0.81 88.68 AlphaFold v2 Monomer 0.58 98
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表 5 长林小蠹气味降解酶与气味化合物对接的结合能
Table 5 Binding energy of odor compounds and odorant degrading enzymes in Hylurgus ligniperda
kJ/mol 气味
化合物HligGSTu1 HligGSTs3 HligGSTs6 HligGSTe1 HligCYP6a8 HligCYP12a4 HligCYP4b1 HligCYP6a6 HligCYP4a5 HligCYP9a2 HligCYP12a6 β-月桂烯 −4.31 −4.62 −3.45 −3.50 −4.96 −4.89 −4.55 −3.89 −4.12 −4.04 −4.65 松油烯 −5.07 −6.14 −4.23 −4.23 −5.72 −5.85 −5.58 −5.13 −4.9 −4.78 −5.73 十一烷 −3.92 −4.17 −2.85 −3.31 −4.67 −4.50 −4.28 −2.86 −3.33 −3.62 −4.34 壬醛 −3.52 −4.46 −2.86 −3.50 −4.40 −4.54 −4.10 −3.05 −3.44 −3.47 −4.22 莰烯 −5.45 −5.16 −4.42 −4.57 −5.85 −5.86 −5.23 −4.61 −5.84 −4.79 −6.31 3-蒈烯 −4.75 −4.19 −3.90 −4.19 −5.22 −5.53 −5.19 −4.39 −4.81 −4.57 −5.47 磷酸三
丁酯−3.86 −3.15 −2.08 −2.88 −4.71 −3.13 −3.85 −2.63 −3.04 −3.91 −3.70 α-松油醇 −5.39 −5.26 −4.54 −4.61 −6.00 −5.67 −5.69 −4.64 −5.13 −5.70 −5.74 D-柠檬烯 −5.10 −5.92 −4.00 −4.48 −5.65 −5.85 −5.54 −4.51 −4.6 −5.31 −5.72 α-蒎烯 −5.13 −5.07 −4.22 −4.45 −4.92 −5.58 −5.11 −5.17 −5.77 −5.96 −5.98 β-蒎烯 −5.07 −4.86 −3.87 −4.17 −4.91 −5.52 −5.12 −5.23 −5.92 −5.05 −6.05
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