Establishment of RAA-CRISPR/Cas12a-LFD-based visual detection technology of Pseudocryphonectria elaeocarpicola
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摘要:目的
杜英疫病是由杜英生假隐丛赤壳菌引起的一种杜英属植物上新发的枝干病害，目前该病的研究仍处于起步阶段，且缺乏有效的防控措施。本文旨在建立一种快速、可视化的杜英疫病菌检测方法，为该病害的早期监测和预警提供重要技术支持。
方法以杜英疫病菌PsGti1基因为靶标，采用重组酶辅助扩增（RAA）反应特异性扩增靶标基因，并利用CRISPR/Cas12a体系切割靶标和荧光探针，最后利用侧向流试纸条（LFD）实现杜英疫病菌的可视化检测。
结果（1）筛选获得针对杜英疫病菌PsGti1基因RAA扩增反应的最优引物对。（2）当Cas12a与CrRNA浓度配比分别为1 μmol/L和 0.125 μmol/L时CRISPR/Cas12a切割反应体系的效果最好。（3）建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a-LFD的可视化检测体系，在37℃恒温反应条件下可快速检测杜英疫病菌，检测灵敏度为50 fg/μL（以gDNA为模板）和20 pg/μL（以PsGti1_T-vector为模板）。
结论本研究建立的杜英疫病菌RAA-CRISPR/Cas12a-LFD检测体系具有反应温度易达到、高特异性、高灵敏度和易操作等优点，适合在野外或缺乏实验室检测设备的场景下进行杜英疫病菌的检测。
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关键词:
- 杜英疫病菌 /
- 重组酶辅助扩增（RAA） /
- CRISPR/Cas12a /
- 侧向流试纸条（LFD） /
- 可视化检测
Abstract:ObjectiveElaeocarpus spp. stem blight is a new branching disease on Elaeocarpus spp. caused by Pseudocryphonectria elaeocarpicola, for which research is still in its infancy and lacks effective prevention and control measures. This paper aims to establish a rapid and visualized method for the detection of P. elaeocarpicola, which provides an important technical support for the early monitoring and early warning of the disease.
MethodIn this study, we utilized PsGti1 gene of P. elaeocarpicola as a target, specifically amplified the target gene by recombinase aided amplification (RAA) reaction, and cut the target and fluorescent probe by CRISPR/Cas12a system, and finally visualized the detection of P. elaeocarpicola by lateral flow dipstick (LFD).
Result(1) In this study, the optimal primer pairs for the RAA amplification reaction of the PsGti1 gene of P. elaeocarpicola were screened and obtained. (2) The CRISPR/Cas12a reaction system worked best when Cas12a and CrRNA concentration ratios were 1 and 0.125 μmol/L, respectively. (3) A RAA-CRISPR/Cas12a-LFD visualization detection system was established, which can realize the rapid detection of P. elaeocarpicola under the reaction condition of constant temperature at 37 ℃, and the sensitivity of detection was 50 fg/μL (gDNA as template) and 20 pg/μL (PsGti1_T-vector as template), respectively.
ConclusionThe RAA-CRISPR/Cas12a-LFD detection system for P. elaeocarpicola established in this study has the advantages of easy-to-reach reaction temperature, high specificity, high sensitivity and ease of operation, which makes it suitable for carrying out the detection of P. elaeocarpicola in the field or in scenarios lacking laboratory testing equipment.
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自工业革命以来，由于人类活动（化石燃料燃烧和农业活动等）导致的大气沉降，已经显著改变陆地生态系统土壤氮和磷有效性[1-2]。同时伴随着全球极端气候频发，降水量格局也发生很大变化，目前干旱已经成为世界性的重大环境问题[3]。上述全球变化因子共同作用会导致土壤氮磷养分和含水量的变化。研究认为土壤氮磷养分输入会缓解植物养分限制[4-6]，促进植物生长，同时也会增加植物体内养分含量，从而改变元素之间的化学计量平衡 [[7-8]。氮和磷是植物生长的重要营养元素，在植物能量代谢和新陈代谢等生理过程中起着重要的调节作用[9]。干旱会显著降低土壤水分，而土壤含水量通过影响参与土壤氮磷元素循环转化的酶活性、植物凋落物的分解速率和养分矿化来改变土壤中氮和磷有效性，进而影响植物对土壤养分的吸收[10]。大部分研究表明随着土壤含水量的增加，有利于植物对土壤营养元素的吸收和利用。但也有研究发现，在降水量较多区域，适当的干旱反而增加植物对营养元素的吸收[11-14]。因此，研究植物生长和养分性状对养分富集和土壤水分变化的响应，有利于了解植物对外界环境变化的适应策略和生理过程机理[15-19]。但是，目前同时考虑土壤氮、磷有效性和水分变化对植物生长和养分的研究还很少，特别对于高寒草原植物的研究更少。
全球变化背景下，前人在模拟氮添加、氮磷不同比例添加、增减雨对高寒草甸植物养分含量和化学计量方面进行了大量研究。例如，宾振钧等[20]在青藏高原高寒草甸进行不同梯度氮肥添加实验发现，植物生物量和叶片养分性状受外源氮的输入影响显著，不同物种对氮添加响应的差异导致物种丰富度发生变化，最终影响高寒草甸生态系统植物群落结构[21]。Dong等[22]在青藏高原进行氮磷不同比例添加实验发现，氮磷添加对不同植物功能群影响不同，氮添加显著增加禾本科植物的叶片氮含量，磷添加显著增加杂类草叶片磷含量，而氮磷同时添加对大多数植物叶片的氮磷含量没有显著影响[23-25]。并且，前人在研究植物叶片氮、磷含量及化学计量比对水分变化的响应发现，随着土壤水分减少，植物叶片氮含量有增加[26]、减小[27]和没有变化[28]的不同结果，而植物叶片磷含量均呈现显著降低趋势[26]。因此，土壤水分对植物养分吸收和利用策略影响比较复杂，植物会因不同环境条件产生不同的响应[29-30]。
青藏高原是我国重要生态安全屏障，高寒草甸约占青藏高原草地面积的50%左右。高寒草甸生态系统通常受到土壤氮和磷的限制作用，并对降水变化很敏感。全球变化背景下土壤氮和磷养分、极端干旱以及它们之间复杂的交互作用均可能对高寒草甸植物的生长和化学计量产生显著影响。因此，本研究以青藏高原高寒草甸为研究对象，基于氮添加、磷添加和减雨50%三因素控制实验，选取3种优势植物，通过测定植物生物量和养分，旨在解析养分富集、干旱及其交互作用对高寒草甸植物生长和养分性状的影响机理。
1. 研究区概况
试验样地位于四川省阿坝藏族羌族自治州红原县邛溪镇西南民族大学青藏高原研究基地（32°49′59″N，102°34′53″E，海拔3 490 m）。该地区属于大陆性高原寒温带半湿润季风气候，四季气候分明，春秋季节短暂，冬季漫长寒冷，无夏季。年平均气温1.4 ℃，日温差大。干湿季节分明，年平均降水量650 ~ 800 mm，5—8月降水占全年80%[29]。地带性植被类型为高寒草甸。实验样地是2017年围封的天然草地。植被以禾本科（Gramineae）、莎草科（Cyperaceae）、毛茛科（Ranunculaceae）、菊科（Asteraceae）和豆科（Leguminosae）植物为主，优势植物包括禾本科垂穗披碱草（Elymus nutans）和发草（Deschampsia caespitosa），莎草科薹草（Carex spp.）以及毛茛科草玉梅（Anemone rivularis）等。土壤0 ~ 10 cm有效氮含量为215 mg/kg，有效磷含量为2.875 mg/kg，pH 值5.25。
2. 研究方法
2.1 试验设计
2017年5月，在围栏内选择地势平坦，植被相对均匀的区域，设置包含24个小区的实验样地。每个小区的面积为4 m × 4 m，间隔距离2 m（图1）。实验平台于2018年加入全球大型标准化联网实验Nutrient Network[30]和Drought Network[31]，本实验设计与两大全球联网实验设计相同，但同时考虑了养分与干旱之间的交互作用。具体设计为氮添加（10 g/（m2·a））、磷添加（10 g/（m2·a））、减雨50%（干旱）三因子交互控制实验，采取随机区组试验设计。本研究涉及到的实验处理共6个，分别为对照（Control），氮添加（+ N），磷添加（+ P），干旱（D），氮磷同时添加（N + P），氮添加和减雨50%（N + D），每个处理4个重复。氮养分采用树脂包膜尿素（纯N量为46.6%），磷养分采用重过磷酸钙（含P2O5量为12%），减雨50%采用遮雨棚（长3 m × 宽6 m × 高3 m），同时上面搭建树脂透光板实现（透光率大于99%）。施肥时间为每年5月中旬阴雨天，将氮肥和磷肥均匀撒在指定的实验小区内。
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图 1 研究样地位置与小区布置示意图CK. 对照；+N. 氮添加；+P. 磷添加；D. 干旱（减雨50%）；N + P. 氮磷同时添加；N + D. 氮添加和减雨50%。下同。CK, control; +N, nitrogen addition; +P, phosphorus addition; D, drought (50% rainfall reduction); N + P, nitrogen and phosphorus adding simultaneously; N + D, nitrogen addition and drought treatment. The same below.Figure 1. Sketch map of the location of research sample plots and layout of experimental plots2.2 样品采集、处理与室内测定
本实验选取3种高寒草甸优势植物，分别是垂穗披碱草、发草和草玉梅，其生物量之和占总生物量的50%左右。植物采样时间为2018年8月2日至12日，在每个小区内用两个0.1 m × 1 m样方框剪取所有植物的地上生物量，室内分种并分别装入信封，在65 ℃烘箱中烘48 h（恒质量）后称植物干质量。烘干样品采用球磨仪（NM200，Retsch，Haan，Germany）粉碎，用于测定植物叶片全氮和全磷。全氮含量采用元素分析仪（vario E1 III, Elementar Analysensysteme GmbH, Hanau，Germany）测定，全磷含量测定采用全自动间断化学分析仪（Cleverchem Cleverchem200+，DeChem-Tech GmbH，Germany）测定。同时，我们对每个小区随机选取5个位置，对0 ~ 10 cm土壤进行取样。混匀之后的新鲜土样过2 mm筛并将细根挑干净。土壤样品分成2份，一份在室内风干, 使用球磨仪粉碎，并采用连续流动分析仪（SAN Plus，Skalar，Netherlands）测定土壤可利用氮（SAN），同时使用NaHCO3浸提−钼锑抗比色法测定土壤速效磷（SAP）含量。另外一份土壤样品在冰箱冷冻保存。土壤含水量采用TDR水分仪（TDR350，Aurora，lllinois，USA）测定。
2.3 数据分析
统计分析首先采用三因素方差分析方法（three-way ANOVA）分析各处理及其交互作用对植物地上生物量、叶片氮含量、磷含量及N:P比例的影响。第二，进一步利用T检验比较N + P和N + D处理与对照之间的差异。第三，采用简单线性回归, 分别分析土壤含水量、土壤氮或磷有效性与植物叶片氮、磷含量或叶片N:P比例之间的定量关系。上述统计分析均使用SPSS软件（SPSS 19.0 for windows，SPSS Inc. Chicago，IL，USA）完成, 制图使用Sigma Plot 12.5软件完成。
3. 结果与分析
3.1 不同处理对植物地上生物量的影响
实验结果显示，氮添加显著增加垂穗披碱草、发草和草玉梅的地上生物量，而磷添加、干旱处理对3种植物的生物量影响不显著。与氮添加类似，氮磷同时添加、氮和干旱同时处理均显著增加垂穗披碱草和发草的生物量，但是对草玉梅的影响不显著（图2）。此外，我们没有发现氮添加、磷添加、干旱不同处理之间交互作用对3种植物生物量的显著影响。
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图 2 3种植物地上生物量对氮添加（+ N）、磷添加（+ P）、干旱（D）、氮磷同时添加（N + P）、氮和干旱同时处理（N + D）的响应*表示处理与对照差异显著（P < 0.05）。* indicates a significant difference between treatment and control (P < 0.05).Figure 2. Responses of aboveground biomass in three species to nitrogen addition (+ N), phosphorus addition (+ P), drought (D) , nitrogen and phosphorus adding simultaneously (N + P), and nitrogen addition and drought simultaneously (N + D)3.2 不同处理对植物叶片氮含量、磷含量和N:P比例的影响
实验结果显示，氮添加显著提高垂穗披碱草、发草和草玉梅的叶片氮含量和N:P比例（图3）。类似地，磷添加均增加3种植物叶片磷含量，但降低叶片N:P比例。干旱显著促进垂穗披碱草和发草的叶片氮含量，而对草玉梅叶片氮含量不影响。此外，干旱对3种植物的叶片磷含量和N:P比例都没有处理效应。与氮添加类似，氮磷同时添加、氮与干旱同时处理都显著增加垂穗披碱草和发草的叶片氮含量，而对草玉梅没有影响。对处理间交互作用进一步分析，发现氮添加和干旱对垂穗披碱草和发草的叶片氮含量及N:P比例有正的交互效应，但是对草玉梅没有影响（表1）。氮添加和磷添加对3种植物叶片氮含量，磷含量及N:P值均没有交互影响。
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图 3 3种植物叶片氮、磷含量及N:P比例对氮添加（+ N）、磷添加（+ P）、干旱（D）、氮磷同时添加（N + P）、氮和干旱同时处理（N + D）的响应*表示处理与对照相比差异显著（P < 0.05），黑色柱子表示交互作用显著，虚线表示与交互项比较的2个处理的平均值。* indicates a significant difference between treatment and control (P < 0.05). Black bar indicates a significant interaction effect, and the dashed line indicates the average of the two treatments compared with the interaction item.Figure 3. Responses of leaf nitrogen, phosphorus concentration and N:P ratio in three plant species to nitrogen addition (+ N), phosphorus addition (+ P), drought (D), nitrogen and phosphorus adding simultaneously (N + P), and nitrogen addition and drought simultaneously (N + D)表 1 氮添加（+ N）、磷添加（+ P）、干旱（D）及其交互作用（N × P，N × D）对植物生物量、叶片氮含量、磷含量和N:P比例影响的三因素方差分析Table 1. Three-way ANOVA on the effects of nitrogen addition (+ N), phosphorus addition (+ P), drought (D) and their interactions (N × P, N × D) on plant biomass, leaf nitrogen concentration, phosphorus concentration and N:P ratios物种 Species 指标 Index df + N + P D N × P N × D 垂穗披碱草
Elymus nutans生物量 Biomass 1 14.501 1** 1.059 4 0.068 4 0.765 8 0.151 0 氮含量 Nitrogen content 1 17.853 8*** 1.166 6 9.793 2** 1.511 7 4.198 7* 磷含量 Phosphorus content 1 3.550 0 93.236 8*** 0.279 5 0.152 9 1.117 3 N:P 1 31.713 9*** 85.326 3*** 3.112 7 3.829 9 9.121 1** 发草
Deschampsia caespitosa生物量 Biomass 1 54.514 0*** 0.550 5 3.326 9 0.307 1 0.410 3 氮含量 Nitrogen content 1 17.213 7*** 0.037 2 12.443 2** 0.990 2 5.689 5* 磷 含量Phosphorus content 1 0.293 0 26.904 9*** 0.273 2 0.107 6 1.845 0 N:P 1 5.572 1* 69.735 5*** 0.001 9 0.245 9 6.550 4* 草玉梅
Anemone rivularis生物量 Biomass 1 10.190 5* 0.688 7 0.238 8 0.074 9 0.060 0 氮含量 Nitrogen content 1 4.584 5* 2.286 1 1.747 6 0.099 6 0.106 8 磷含量 Phosphorus content 1 2.995 6 9.581 3** 0.268 8 0.053 9 3.304 0 N:P 1 15.580 5*** 24.599 6*** 4.304 1 0.140 3 1.695 2 注：*表示在P < 0.05水平上差异显著；**表示在P < 0.01水平上差异显著；***表示在P < 0.001水平上差异显著。Notes: *, **, *** represent significant difference at P < 0.05, P < 0.01 and P < 0.001 level, respectively. 3.3 水分含量与土壤或植物养分之间关系
实验结果显示，随土壤含水量的减少，土壤有效氮呈显著增加趋势（图4），但是土壤有效磷呈降低趋势。类似地，我们发现随土壤含水量的降低，垂穗披碱草和发草的叶片氮含量显著升高，而对草玉梅影响不显著。此外，草玉梅叶片磷含量随土壤含水量的降低呈显著降低趋势，而垂穗披碱草叶片N:P比例随土壤含水量的降低显著升高（图5）。
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图 4 土壤含水量与速效氮或速效磷之间的关系Figure 4. Relationship between soil available nitrogen or phosphorus and soil moisture![]()
图 5 土壤含水量与3种植物叶片氮含量、磷含量或N:P比例之间关系Figure 5. Relationship between leaf nitrogen, phosphorus concentrations or their ratios in three species and soil moisture4. 结论与讨论
4.1 讨 论
本研究发现，氮添加增加高寒草甸禾本科植物垂穗披碱草和发草以及杂类草草玉梅的地上生物量，而磷添加和干旱对3种植物的生长影响很小。该结果表明高寒草甸植物生长主要受氮限制，而非磷和水分限制。类似地，传统研究发现在氮限制的生态系统中，氮输入会促进植物地上生物量[32]。此外，宾振钧等[20]在青藏高寒草甸研究6个植物优势种对氮添加的响应，发现该地区的植物生长更易受氮限制。并且我们发现氮添加、磷添加或干旱处理对3种植物生物量的影响不存在交互作用，这说明该区域植物生长的氮限制不受土壤磷有效性和水分的调控。氮磷同时添加、氮和干旱同时处理对2种禾本科植物的生物量呈正效应，但对杂类草不影响，可能是因为高寒草甸氮限制得到缓解后，禾本植物较杂类草冠层更高，不易受到光限制[33-35]，导致禾本科植物对包含氮的处理的响应幅度更大[36]。总体上来说，造成氮效应大于磷和水分效应的差异可能有以下几方面原因。第一、氮元素通常被认为是限制高寒生态系统植物生长的主要限制元素[37-39]，当有外源氮输入时，会缓解高寒草甸的氮限制作用，有利于植物生长。第二、研究区域年降雨量超过700 mm，且80%都集中在生长季（5—8月），因而水分可能不是限制该生态系统植物生长的主要因子[40-42]。第三、传统研究认为当植物叶片N:P值小于14表示该生态系统植物生长可能受到氮限制，而非磷限制[38,43]。本研究3种植物叶片N:P比值介于7.8 ~ 13.6，表明该高寒草甸植物生长可能不受磷限制。
此外，本研究发现氮添加显著提高3种植物叶片氮含量和N:P比例，磷添加增加植物叶片磷含量同时相应降低N:P比例，这与前人研究结果一致[44-45]。但我们发现干旱处理明显促进禾本科植物叶片氮含量，与传统研究结果相反[46]，可能是因为该研究区域的环境特殊性导致的。传统研究通常在干旱和半干旱草原生态系统，干旱会抑制微生物对凋落物和土壤有机氮的分解，进而降低土壤有效氮含量以及植物的吸收和利用[47-48]。而本实验的环境特殊性在于研究区域年降雨量大且集中在生长季，因而水分不是主要限制因子[40-42]。恰恰相反，高寒草甸生长季降雨量大且密集，这会明显促进土壤有效氮（NO3−）的淋溶，相反干旱处理减弱了雨水对土壤有效氮的淋溶作用[49]。同时干旱处理会降低土壤反硝化微生物活性[50-51]，减少土壤有效氮因反硝化作用产生的损失。这支持了我们实验得出的干旱促进土壤氮有效性的结果。
同时，我们发现氮添加与干旱处理之间对禾本科植物叶片氮含量和N:P比例有正的交互作用，但是对杂类草草玉梅没有交互影响，可能存在以下几方面原因。第一、氮添加在增加土壤有效氮的同时，干旱通过减少土壤有效氮的淋溶，进而间接地增加土壤有效氮含量，两者共同作用放大了对土壤有效氮的影响效应，最终也有利于植物的氮吸收。第二、禾本科植物根系呈伞形细根分布，而杂类草植物根系以主根为主，两类功能群植物根系形态的特异性可能决定了禾本科植物对土壤有效氮更敏感[52]。第三，高寒草甸杂类草植物一般低于禾本科植物，更容易受到光限制，而光限制作用可能会抑制植物生长对土壤有效氮的响应[33]。此外，尽管氮或磷添加分别提高3种植物的叶片氮或磷含量，但是氮添加和磷添加对它们的叶片养分含量没有交互影响，指示出高寒草甸植物养分吸收主要受氮和磷限制[53]，但不受氮磷共同限制[54-56]。
4.2 结 论
本实验充分考虑土壤氮和磷养分与干旱交互作用对高寒草甸植物生长和养分性状的影响。我们发现高寒草甸优势植物叶片养分及其平衡对短期养分添加和干旱比植物生长更敏感。氮添加主要刺激了优势植物生物量，而土壤氮、磷有效性和水分均改变了植物叶片氮和磷含量及N:P比例。同时，氮添加和干旱对植物叶片氮含量存在正的交互作用，而对植物生长不影响。本研究意义在于揭示土壤氮、磷与干旱对高寒草甸植物养分复杂的交互影响，有助于我们理解高寒草甸植物生理过程对全球变化交互作用的响应机理，并为草地生态系统管理提供科学依据。
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图 1 PsGti1基因RAA扩增引物的筛选
a利用Taq酶对RAA1-3引物对的PCR扩增电泳结果，1-CK，2-CK和3-CK分别表示RAA1-3的无模板阴性对照；b利用RAA核酸扩增试剂盒对RAA1~3引物扩增电泳结果。
Figure 1. Screening of primers for RAA amplification of PsGti1 gene
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图 2 CRISPR/Cas12a切割体系验证及CrRNA的筛选
a紫外照射下荧光信号的可视化检测；b荧光强度的实时定量检测，除Ps-CrRNA2的3个组别均无荧光且不随时间变化。
Figure 2. Validation of CRISPR/Cas12a cleavage system and screening of CrRNA
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图 3 CRISPR/Cas12a反应体系中Cas12a与CrRNA的浓度配比筛选
a. Cas12a与CrRNA各浓度配比条件下，紫外照射荧光强度的可视化检测；b. Cas12a与CrRNA各浓度配比条件下，荧光强度的热图
Figure 3. Screening of concentration ratio of Cas12a to CrRNA in CRISPR/Cas12a reaction system
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图 4 RAA-CRISPR/Cas12a-LFD检测体系的特异性分析
a. RAA-CRISPR/Cas12a检测体系的特异性分析，除杜英疫病菌外均无荧光信号被检测到；b. RAA-CRISPR/Cas12a-LFD检测体系的特异性分析。Ps. 杜英疫病菌；Cg. 胶孢炭疽菌；Cp. 板栗疫病菌；Gy. 山田胶锈菌；Vd. 大丽轮枝菌；Cc. 杨树腐烂病菌
Figure 4. Specificity analysis of RAA-CRISPR/Cas12a-LFD detection system
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图 5 基于杜英疫病菌PsGti1基因的RAA-CRISPR/Cas12a-LFD检测体系的灵敏性分析
Figure 5. Sensitivity analysis of RAA-CRISPR/Cas12a-LFD detection system based on PsGti1 gene of P. elaeocarpicola
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图 6 杜英疫病菌RAA-CRISPR/Cas12a-LFD检测体系可行性分析
Figure 6. Feasibility analysis of RAA-CRISPR/Cas12a-LFD detection system for P. elaeocarpicola
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图 7 杜英疫病菌RAA-CRISPR/Cas12a-LFD检测体系的应用检测
Figure 7. Application of RAA-CRISPR/Cas12a-LFD detection system for detection of P. elaeocarpicola
表 1 本研究使用的引物或探针序列信息
Table 1 Sequence information of primers or probes used in this study
名称 序列 用途 PsGti1-5F CACCAGCACCACTACCAT 扩增PsGti1全长
1 575 bpPsGti1-5F CCGTTCGTGGATCTTCCT PsRAA5F ACACCCTCCTCCTATGCGATGGCTCCTCTG PsRAA1引物对
415 bpPsRAA3F CCGTTCGTGGATCTTCCTGGTCCCGACAAGTA PsRAA5F-2 CCTCGCTGACTTCCGCACCGTCTATGAATG PsRAA2引物对，下游与PsRAA3F配对
163 bpPsRAA5F-3 ACGACACCCTCCTCCTATGCGATGGCTCCT PsRAA3引物对
295 bpPsRAA3F-2 GATCGTGCTGGCATTCATAGACGGTGCGGAAGT Ps-CrRNA1 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCGAGCUCGCGGGCAGCUCG CrRNA1序列 Ps-CrRNA2 UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGCGCAACAGGCUGGGGCGGC CrRNA2序列 ssDNA1 5′-FAM-TTATT-BHQ I-3′ 荧光探针 ssDNA2 5′-FAM--TTTTTTTATTTTTTT-Biotin-3′ 侧向流试纸条法探针 注：下划线部分为本研究中筛选得到的最优RAA扩增引物对及CrRNA。 
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表 2 PsGti1基因的RAA扩增反应体系
Table 2 RAA amplification reaction system for PsGti1 gene
组分 体积/μL 缓冲液V 25 引物F (PsRAA5F/PsRAA5F-2/PsRAA5F-3) 2 引物R (PsRAA3F/ PsRAA3F-2) 2 纯化水 14.5 总体积 43.5
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表 3 CRISPR/Cas12a的反应体系
Table 3 CRISPR/Cas12a reaction system
组分 体积/μL NEBuffer 2.1 5 Cas12a protein (100 μmol/L) 0.5 CrRNA1/CrRNA2 (50 μmol/L) 1 ssDNA 1 (100 μmol/L) 0.25 PsGti1 RAA fragment 2 dd H20 41.25
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表 4 Cas12a和 CrRNA 最优浓度探索的CRISPR/Cas12a反应体系
Table 4 CRISPR/Cas12a reaction system for optimal concentration exploration on Cas12a and CrRNA
组分 体积/μL NEBuffer 2.1 5 Cas12a protein (100 μmol/L) X CrRNA (50 μmol/L) Y ssDNA 1 (100 μmol/L) 0.25 PsGti1 RAA fragment 2 dd H20 补足至50 注：X、Y分别为CRISPR/Cas12a体系中Cas12a和 CrRNA的浓度配比对应的体积。下同。
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表 5 RAA-CRISPR/Cas12a检测体系特异性分析的反应体系
Table 5 Reaction system of RAA-CRISPR/Cas12a detection system used for specific analysis
组分 体积/μL NEBuffer 2.1 5 Cas12a protein (100 μmol/L) X CrRNA (50 μmol/L) Y ssDNA 1 (100 μmol/L) 0.25 RAA fragment of each strain 2 dd H20 补足至50
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表 6 CRISPR/Cas12a-LFD检测体系有效性和特异性分析的反应体系
Table 6 Reaction system of the CRISPR/Cas12a-LFD system used for available and specific analysis
组分 体积/μL NEBuffer 2.1 5 Cas12a protein (100 μmol/L) X CrRNA (50 μmol/L) Y ssDNA 2 (10 μmol/L) 0.5 RAA fragment of each strain 2 dd H20 补足至50
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