Isolation, purification technique and antioxidant capacities of polysaccharides from bamboo leaves
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摘要: 对超临界CO2流体萃取技术提取的竹叶粗多糖采用分级醇沉、脱蛋白质及纤维素柱层析等技术分离纯化,研究分离纯化后的竹叶多糖产物的物化指标。研究结果表明:经超临界CO2流体萃取技术提取得到的毛竹叶粗多糖,采用体积分数为70%的乙醇沉淀,得到预纯化产物,预纯化产物得率17.75%,多糖含量9.586 mgg,总抗氧化能力2.556 mgg VC;预纯化产物再经Sevag法脱蛋白质及DEAE-52纤维素层析柱层析,获得一种中性竹叶多糖,其平均分子量为5.051×104,IC50值为0.178 mgg竹叶多糖,与VC(IC50值为0.158 mgg)相比,具有较好的DPPH清除能力。Abstract: We extracted crude polysaccharide (BPS) from bamboo leaves by the method of supercritical CO2 extraction. The BPS was fractionated and precipitated by ethanol, and then protein was removed and further separated and purified by cellulose column. Physical and chemical indicators of the purified BPS were investigated. Results showed that: the crude polysaccharide extracted with supercritical CO2 technique was precipitated by ethanol at the volume concentration of 70%, obtaining a yield of pre-purified product 17.75%, the content of polysaccharide in it was 9.586 mg/g, and its total antioxidant capacity was 2.556 mg/g VC. Protein in the pre-purified product was removed by Sevag. Then neutral polysaccharide was obtained through DEAE-52 cellulose column, with an average molecular weight of 5.051×104. Its IC50 value was 0.178 mg/g BPS, showing a better DPPH scavenging ability than VC (IC50 value 0.158 mg/g).
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Keywords:
- Phyllostachys heterocycla /
- bamboo leaves polysaccharide /
- isolation /
- purification
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类毒过敏原蛋白（venom-allergen proteins，VAPs）是一种富含半胱氨酸的分泌蛋白（cysteine-rich secretory protein，CRISP），属于精子包被蛋白（sperm coating protein）的Tpx-1 / Ag-5 / Pr-1 / Sc-7（SCP / TAPS）超家族[1]。动植物寄生线虫的栖息地不同，但它们的分泌物共享一组结构保守的蛋白质—VAPs。这些蛋白在线虫生命周期的寄生阶段上调表达，而且对线虫在植物和动物体内的持续侵染至关重要[2-3]。寄生线虫在侵染植物过程中使用口针刺穿植物细胞壁，将分泌的VAPs传递到细胞中，并从活植物细胞中获取低分子量化合物。目前，编码VAP蛋白的基因在许多植物寄生线虫中已被分离鉴定，如南方根结线虫（Meloidogyne incognita）[4-5]、大豆孢囊线虫（Heterodera glycines）[6]、马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）[7]、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）[8]、马铃薯金线虫（Globodera rostochiensi）[9]、禾谷胞囊线虫（Heterodera avenae）[10]和香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）[11]。目前的研究主要集中在VAPs作为宿主免疫反应的激活剂和抑制剂的作用上。例如，马铃薯金线虫的Gr-VAP-1蛋白与番茄细胞外半胱氨酸蛋白酶Rcr3pim的结合会触发由表面定位受体Cf-2介导的防御相关超敏反应。另外，Gr-VAP-1基因在番茄（Solanum lycopersicum）中还可以抑制细胞外受体蛋白Cf-4及其同源诱导子Avr-4引起的细胞死亡。在转基因植物的细胞外基质中，异位表达的线虫基因VALs（Gr-VAP-1、Hs-VAP-1和Hs-VAP-2）的表达显著提高了其对植物寄生线虫的敏感性[9]。在植物寄生线虫中，VAPs基因的表达与入侵宿主及随后在宿主组织的迁移有关[2,6,12-13]。VAPs基因的RNA干扰（RNA interference，RNAi）会降低植物寄生线虫在宿主植物内迁移并成功建立永久性觅食位点的能力[9,13-14]。禾谷胞囊线虫的2个类毒素过敏原蛋白新基因HaVAP1和HaVAP2均参与了该线虫的寄生，但它们具有不同的功能。RNAi沉默HaVAP1基因增强了禾谷胞囊线虫的毒力，RNAi沉默HaVAP2基因阻碍了禾谷胞囊线虫的寄生[10]。这些研究表明，植物寄生线虫在宿主组织的迁移以及感染的早期阶段，口针分泌的VALs可能通过抑制表面定位受体介导的植物固有免疫力，从而增强宿主植物对线虫感染的总体敏感性，这对于调节宿主反应非常重要。根结线虫的Mi-VAP-1作为已知的效应子，对其沉默后的表达进行转录组分析，得出该基因的沉默对其他效应子表达产生干扰。这种对其他基因的级联效应也可有助于降低线虫的寄生能力[15]。香蕉穿孔线虫的类毒素过敏原蛋白RsVAP可能与LeRabA1d（Ras-related protein）相互作用以影响宿主防御反应，进而促进线虫感染[11]。因此，明确类毒素过敏原蛋白VAPs的结构与功能，有助于了解植物寄生线虫的致病机理，从而设计针对植物寄生线虫寄主的新型保护策略。
松材线虫病（pine wilt disease）即松树（Pinus spp.）萎蔫病，是一种以松材线虫为病原的国际检疫性林业病害[16]，已造成我国生态与林业经济的巨大损失。全国大面积的健康松林均面临着松材线虫入侵扩张的高风险和大流行的威胁[17-18]。2011年首次在松材线虫中发现一个VAP基因家族，包括3个以基因簇形式存在的功能性类毒过敏原蛋白基因（Bx-vap-1、Bx-vap-2、Bx-vap-3）和一个不表达的假基因（Bx-vap-P）[8]。Bx-vap-1与Bx-vap-2基因核苷酸序列不同，但蛋白序列相同。原位杂交显示这3个基因均在松材线虫的食道腺特异表达。免疫组化分析显示Bx-VAP1 蛋白特异存在于松材线虫的中食道球和食道腺中，该基因和蛋白的表达水平均于松材线虫在松树体内生长繁殖阶段达到最高，RNAi 沉默该基因会显著降低松材线虫的迁移率，但对繁殖率没有影响[14]。这些结果表明Bx-VAP1 蛋白可能经口针分泌至体外抑制松树的防卫反应，参与松材线虫的迁移过程。转录组分析发现松材线虫6个类毒过敏原蛋白[19]，为研究松材线虫 VAP 的多态性和功能提供了新的线索。后来，采用重叠延伸PCR 基因合成法人工合成松材线虫Bxvap2基因序列在大肠杆菌（Escherichia coli）内表达，获得原核表达的VAP2蛋白，纯化后注入新西兰白兔体内制备多克隆抗体[20]。利用杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中表达Bx-vap-1基因[14,21]，获得VAP1蛋白接种的3年生马尾松（Pinus massoniana）后，寄主马尾松细胞发生质壁分离、细胞核降解等现象，表现出典型的细胞程序性死亡[22]。由此，本研究推测松材线虫VAPs作为关键的致病基因之一，在该线虫与寄主植物互作过程中发挥着至关重要的作用。
类毒素过敏原蛋白VAPs可能作为效应子或者病程相关蛋白参与松材线虫致病过程。虽然这类功能蛋白已被筛选出，但是其结构及具体功能尚不明确。因此，本文以松材线虫的4个VAPs 基因为例，检测不同发育阶段的基因表达量，构建原核表达载体，使其在大肠杆菌中得到快速高效表达，并以纯化的原核表达产物为抗原制备相应的多克隆抗体，分析此类蛋白的生物信息学，为进一步研究这类蛋白的组织定位及功能提供实验材料，为明确该基因在松材线虫与寄主植物互作中的作用机理奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 供试虫源的准备
供试松材线虫虫株来自于本实验所保存的Nxy61 虫株，该虫株分离于浙江宁波2012 年 10 月当年发病的马尾松枝条，通过贝尔曼漏斗法分离后长期保存于长满灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的玉米培养基中。试验接种线虫为混合虫态松材线虫（包括虫卵、2 ~ 4 龄幼虫以及成虫），在灰葡萄孢 PDA 培养基上25 ℃黑暗培养5 d后，贝尔曼漏斗法收集分离线虫，无菌水冲洗3 次后，再用0.5% 的硫酸链霉素溶液处理2 min 后，无菌水冲洗3 次，调整线虫悬浮液浓度为30 头/μL后，备用。
之后，获取不同发育阶段的松材线虫。收集松材线虫的卵，加入10 mL ddH2O于25 ℃处理24 h后，卵孵化为繁殖型2龄线虫（L2），收集L2接种在长满灰葡萄孢的PDA培养基上，24 h后获得繁殖型3龄线虫（L3）；L2培养52 h后获得繁殖型4龄线虫（L4），L2培养72 h后获得成虫。
将收集到的卵、L2、L3、L4、成虫经无菌水冲洗后13 000 rpm离心5 min，充分去除上清液，收集混合虫态松材线虫，液氮速冻后保存于−80 ℃冰箱，用于线虫RNA的提取。
1.2 松材线虫RNA的提取及cDNA的合成
利用RNA提取试剂盒RNeasy Plus Mini Kit（No. 74134；Qiagen，Hilden，Germany）提取松材线虫不同发育阶段卵、L2、L3、L4、成虫的RNA，通过NanoDrop 8000（Thermo，Waltham，MA，USA）检测其纯度和浓度。之后使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（No. RR047Q，TaKaRa，Shiga，Japan）试剂盒进行松材线虫cDNA第一链合成，作为实时荧光定量PCR的模板。
1.3 不同发育阶段松材线虫Bx-VAPs基因的表达量
根据NCBI上松材线虫的VAPs基因的mRNA完整编码序列，利用Primer Premier 6.0软件设计实时荧光定量PCR引物（表1），以不同龄期的松材线虫cDNA 为模板，松材线虫β-actin 基因为内参（表1），根据KAPA Roche480 SYBRFast（北京，普凯瑞）操作步骤，使用Roche480 Real-time PCR 扩增仪进行实时荧光定量PCR分析，检测不同发育阶段的松材线虫Bx-VAP1、Bx-VAP2、Bx-VAP3和Bx-VAP4基因表达量。每个样品设3 个重复，以卵作为对照，采用2–ΔΔCt 法计算目的基因的相对表达量，采用SPSS软件进行单因素方差分析。
表 1 引物信息Table 1. Primer information引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence引物用途
Primer usageBx-VAP1-F ATGTTCGGTCTACTGTTAGT 全长克隆
Full-length gene cloneBx-VAP1-R TCAGGCGCTACACAGACTGT Bx-VAP2-F ATGGTTCGAGTATTAGTTCT Bx-VAP2-R TCAGGCACTGCACAAACTGT Bx-VAP3-F ATGTTCCGAGTTCTCCTGAC Bx-VAP3-R CTATTCGGCACTGCAGAGTG Bx-VAP4-F ATGATAACTAAATTCCTGTG Bx-VAP4-R TTAAGCGACGCACAATCCCT EX-VAP1-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCGACAGGTTCAGCAACAGCCAA 添加双酶切位点
Addition of double cleavage sitesEX-VAP1-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGCGCTACACAGACTGT EX-VAP2-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCACCAAATTCAGCGAAAGCCAA EX-VAP2-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGCGCTACACAGACTGT EX-VAP3-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCGCCAGGTTAAGCGACGATGAG EX-VAP3-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTATTCGGCACTGCAGAGTG EX-VAP4-F GTATTTTCAGGGATCCGAATTCGAAAAGTTGAATAGCGCTGAG EX-VAP4-R GGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGCGACGCACAATCCCT RT-VAP1-F AATGTGATGGAGGCTGAC 实时荧光定量PCR
Real-time quantitative polymerase chain reactionRT-VAP1-R GCTACACAGACTGTCACT RT-VAP2-F GCTGTGCCATTCAGAACT RT-VAP2-R GCTCCCATCATGTTTCCA RT-VAP3-F TTGGACCTTCACCGTCTG RT-VAP3-R CTTCTTCTTCCTCGCACTG RT-VAP4-F CTCCGACCTGGAAGACAA RT-VAP4-R CGCTCTCATGGCAATGTT β-actin -F TCCGTACCCTGAAGTTGGCTAACC β-actin -R AAGTGGAGACGAGGGAATGGAACC 1.4 松材线虫Bx-VAPs基因的克隆
根据NCBI上松材线虫的VAPs基因的mRNA完整编码序列，利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物，由华大蛋白（Beijing，China）合成（表1），使用PrimeSTAR HS（TaKaRa，日本）目的基因全长PCR扩增体系：cDNA模板1 μL，2 × PrimeSTAR Max Premix12.5 μL，正反向引物各1 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；35个循环的94 ℃变性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min；72 ℃再延伸10 min，保存温度为4 ℃。使用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-Blunt Simple Cloning Kit （No. CB111-01；TransGen Biotech，Beijing，China）试剂盒进行连接并转化，将得到的阳性克隆菌液，送至北京六合华大基因科技有限公司进行质粒提取和双向测序，获得测序正确的Bx-VAPs基因全长质粒。
1.5 重组质粒pET-32b-VAPs的构建
将pET-32b空载体分别经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切，37 ℃处理3 h，回收相应目的片段。利用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物（表1），添加双酶切位点EcoRⅠ（GAATTC）和XhoI（CTCGAG），引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。以克隆的VAPs全长质粒为模板、EX-VAPn-F/ EX-VAPn-R为引物分别进行VAPs的扩增。25 µL PCR扩增体系和反应条件同1.4。产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，在−20 ℃条件下保存。使用PCR 产物纯化试剂盒（EZNA cycle pure，kit vacuum protocal，OMEGA公司）纯化并回收目的片段。使用一步法克隆试剂盒（ClonExpress® II One Step Cloning Kit，Vazyme）将回收目的片段产物与线性化pET-32b载体进行同源重组，并将其转化至DH5α感受态细胞中，次日挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，测序正确的菌液扩大培养并提取重组质粒，命名为pET-32b-VAPn。
1.6 重组Bx-VAPs蛋白的诱导表达与纯化
将测序正确的重组质粒pET-32b-VAPn分别转化大肠杆菌 BL21DE3感受态细胞，并涂布于相应LB平板，37 ℃倒置培养16 h。次日挑单菌落进行PCR鉴定正确后，送至六合华大基因科技有限公司测序，并将测序正确的目的菌株Bx-VAPn用15%甘油保存，用于目的蛋白表达。将验证正确的目的菌株接种至Amp+（100 μg/mL）抗性LB液体培养基中37 ℃ 220 rpm振荡培养至对数生长期（OD600介于0.4 ~ 0.6）。加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃ 180 rpm振荡培养5 h后，于 50 ml离心管中4000 rpm离心15 min，收集诱导前和诱导后菌体，与1 × SDS混合煮沸，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测。诱导后的菌液以0.1 mmol/L PBS洗涤沉淀后再次重悬，冰浴条件下超声波破碎后，4 ℃ 12 000 rpm 离心 15 min，使上清和菌体碎片完全分离，至溶液澄清。收集上清液，经Ni亲和层析预装柱纯化后，分别用含10 mmol/L和250 mmol/L咪唑的缓冲液分别洗脱杂质蛋白和目的蛋白。使用 Ni2+-NTA 琼脂糖凝胶预装柱（全式金）对 VAPs蛋白进行纯化。纯化后的蛋白进行SDS-PAGE分析以判断其纯化效果。
1.7 重组Bx-VAPs蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
1.7.1 动物免疫
将纯化后的Bx-VAPn蛋白分别作为免疫原与弗氏完全佐剂，取200 µL 1∶1混匀液（含100 µg的Bx-VAPn重组蛋白）在每只Balb/c小鼠进行背部皮下脊柱两侧均匀免疫（8 ~ 10个点）。初免14 d或21 d后，分别将Bx-VAPn蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混匀后进行二次免疫。二免14 d后，进行三免，方法同二免。三免7 d后，尾静脉采血，3000 ~ 10 000 rpm离心5 min，分离血清（10 ~ 20 µL）。
1.7.2 抗体效价
按《SOP-抗体鉴定》方法进行效价检测：
包被：用 pH9.6 CB的1 × 包被液，按1 ug/mL的抗原质量浓度，4 ℃包被过夜（100 µL/孔），洗板1次，用封闭液200 µL /孔37 ℃封闭2 h，拍干备用；
加样：将多抗血清（1 mg/mL）用样稀液依次稀释100、200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800倍，以阴性血清1 000倍稀释液做阴性对照，100 µL/孔37 ℃孵育30 min，洗板3次拍干；
二抗：取适当稀释的酶标二抗（羊抗鼠IgG-HRP），100 µL /孔37 ℃孵育30 min，洗板5次拍干；
显色：取显色液按100 µL /孔 加入酶标板，37 ℃避光显色15 min；
终止：各反应孔加入终止液 50 µL终止反应；
读值：酶标仪设定450 nm和630 nm双波长读值，采用OD450 ~ OD630 的值为1为抗体；记录并分析数据，1/2最大吸光度对应的稀释倍数为多抗血清效价。
1.8 Bx-VAPs蛋白的蛋白免疫印迹
纯化血清抗体anti-VAPs分别稀释至1 mg/mL后，留存备用。取50 µg 经过蛋白定量处理的松材线虫蛋白液（Bx）和原核表达的蛋白（Bx-VAPn），检测抗体的特异性，进行15% SDS-PAGE电泳，转膜、封闭后以1∶10 000的稀释比孵育对应的多克隆抗体，二抗采用羊抗鼠IgG-HRP（1∶4 000稀释），进行DAB显色压片曝光并拍照保存。
1.9 Bx-VAPs蛋白的生物信息学在线分析
利用ExPASyProtparam在线程序（https://web.expasy.org/protparam/）分析Bx-VAPs蛋白的理化性质，利用SOPMA在线程序预测Bx-VAPs蛋白的二级结构，利用SWISS-MODEL在线程序（https://swissmodel.expasy.org/）预测Bx-VAPs蛋白的三级结构，利用SingalP5.0在线程序（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测Bx-VAPs蛋白是否存在信号肽，利用DNAStar软件中Protean软件对Bx-VAPs进行B细胞抗原表位预测与分析。
2. 结果与分析
2.1 松材线虫Bx-VAPs的基因全长克隆
扩增松材线虫的Bx-VAPs基因全长并进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带单一。测序分析结果显示克隆所得的基因序列与NCBI和Wormbase上所提交的基因序列（表2）大小一致。Bx-VAP1基因编码区长度为615 bp，Bx-VAP2基因编码区长度为621 bp，Bx-VAP3基因编码区长度为612 bp，Bx-VAP4基因编码区长度为606 bp（图1）。
表 2 松材线虫的Bx-VAPs蛋白序列及理化性质Table 2. Protein sequence and physicochemical properties of Bx-VAPs in B. xylophilus蛋白名称
Protein name基因库登录号
GenBank ID氨基酸数
Number of
amino acid分子量
Molecular
mass/Da理论等电点
Theoretical pI信号肽的位置
Signal peptide
location/aa跨膜结构域
Transmembrane
domain磷酸化位点数量
Number of phosphorylation site丝氨酸
Serine苏氨酸
Threonine络氨酸
ComplexinBx-VAP1 ADG86237.1 204 22 434.86 4.93 17 ~ 18 无 No 12 17 4 Bx-VAP2 ADG86238.1 206 22 418.83 4.68 17 ~ 18 无 No 15 15 4 Bx-VAP3 ADG86239.1 202 22 446.27 4.31 18 ~ 19 无 No 16 11 8 Bx-VAP4 CAD5147609.1 201 22 038.58 5.19 17 ~ 18 无 No 14 17 7 ![]()
图 1 Bx-VAPs基因PCR扩增的电泳图Figure 1. Electrophoresis map of PCR amplification of Bx-VAPs gene2.2 不同发育阶段松材线虫Bx-VAPs基因的表达量
收集各个龄期松材线虫的cDNA，分析Bx-VAPs基因的表达量（图2），结果表明在成虫时期，松材线虫的Bx-VAP1、Bx-VAP2基因相对表达量达到150和120倍。Bx-VAP3的基因表达量在L2和L3时期略有升高，Bx-VAP4基因表达量在不同龄期变化不超过3倍。
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图 2 不同发育阶段松材线虫Bx-VAPs的相对表达量E代表卵，L2 ~ L4 代表繁殖型2 ~ 4龄幼虫，A代表成虫。不同小写字母表示不同发育阶段基因表达量差异显著性(P < 0.05)。下同。E indicates egg stage, L2 − L4 indicate propagative 2nd to 4th instar larvae, A indicates adult. Different lowercase letters indicate significant differences in gene expression at different developmental stages (P < 0.05). The same below.Figure 2. Relative expression level of Bx-VAPs in B. ylophilus at various developmental stages2.3 松材线虫Bx-VAPs蛋白的原核表达
构建pET-32b-VAPn重组表达载体，并转化至DH5α宿主菌中，获得重组蛋白pET-32b-VAPs菌液，添加IPTG诱导后，分别在37 ℃条件下诱导表达重组蛋白5 h。经SDS-PAGE分析显示，pET-32b-VAP1和pET-32b-VAP2在22.0 kDa左右显示条带，pET-32b-VAP3和pET-32b-VAP4在22 ~ 31 kDa间显示条带，且重组蛋白大多以包涵体形式存在于沉淀中；约1 L菌液经诱导后，菌体经亲和层析纯化后蛋白质量浓度可达到 0.6 mg/mL，获得8 mg蛋白，经考马斯亮蓝染色，TBST脱色后，利用软件Image J对其进行灰度分析，纯度达90 %以上，可作为免疫抗原（图3）。
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图 3 重组蛋白在大肠杆菌BL21DE3中表达的SDS-PAGE分析1. 无IPTG诱导的BL21DE3-BxVAPn全菌；2. IPTG诱导的BL21DE3-BxVAPn 全菌；3. 上清液；4. 包涵体；5. 纯化的BxVAPn蛋白；6. 低分子量蛋白标记。1, BL21DE3–BxVAP1 without IPTG; 2, BL21DE3- BxVAP1 induced with IPTG; 3, supernatant; 4, inclusion body; 5, purified BXVAP1 protein; 6, low molecular mass protein marker.Figure 3. SDS-PAGE analysis of the expression of recombinant protein in E. coli BL21DE32.4 anti-VAPs抗体的效价及蛋白免疫印记结果
间接ELISA法测定结果发现：anti-VAP1多抗血清效价达到1∶12 800，anti-VAP2多抗血清效价达到1∶51 200，anti-VAP3多抗血清效价达到1∶25 600，anti-VAP4多抗血清效价达到1∶51 200（图4）。
免疫印迹法Western blot验证抗体特异性结果如图5所示，Bx-VAP1、Bx-VAP2、Bx-VAP3的抗体分别与对应的原核表达的VAP1、VAP2、VAP3反应，同时均与Bx蛋白液产生反应；Bx-VAP4的抗体与原核表达的VAP4产生反应，但并未与Bx蛋白液发生反应。结果表明所制备的Bx-VAP1、Bx-VAP2、Bx-VAP3多克隆抗体特异性好，灵敏度高，具有与松材线虫的蛋白提取液结合的能力。
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图 5 Western blot验证抗体的特异性M. 低分子量蛋白质标记物；Bx. 松材线虫蛋白液。M, low molecular mass protein marker; Bx, protein solution of B. xylophilus.Figure 5. Western blot verifying antibody specificity2.5 松材线虫Bx-VAPs蛋白的功能和结构预测
利用ExPASy Protparam在线程序分析Bx-VAPs蛋白的理化性质，结果显示：Bx-VAP1编码204个氨基酸，Bx-VAP2编码206个氨基酸，Bx-VAP3编码202个氨基酸；Bx-VAP4编码201个氨基酸（图6A），均为疏水性蛋白（图6B）。为进一步研究Bx-VAPs蛋白的进化关系，根据Bioedit多序列比对结果，应用MEGA 6.0软件和N–J邻接法构建Bx-VAPs蛋白的系统进化树。系统进化树（图6C）显示：松材线虫Bx-VAPs蛋白与拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）、豆伞滑刃线虫（Bursaphelenchus doui）、马铃薯腐烂茎线虫、南方根结线虫聚为同一小分支，遗传距离较小，亲缘关系较近。
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图 6 Bx-VAPs蛋白生物信息学分析A. Bx-VAPs的氨基酸序列；B. Bx-VAPs蛋白的亲水/疏水性；C. Bx-VAPs蛋白系统发育树。A, amino acid sequence of Bx-VAPs; B, predicted hydrophilicity/ hydrophobicity of Bx-VAPs; C, phylogenetic tree analysis of Bx-VAPs protein.Figure 6. Bioinformatics information analysis of the Bx-VAPs protein利用SingalP5.0在线程序预测Bx-VAPs蛋白均存在信号肽（表2），其中Bx-VAP1的信号肽位置为1 ~ 18号的氨基酸，Bx-VAP2的位置为1 ~ 18号的氨基酸；Bx-VAP3的位置为1 ~ 19号的氨基酸；Bx-VAP4的位置为1 ~ 18号的氨基酸。通过TMHMM2.0在线程序预测跨膜结构域，结果显示（表2），Bx-VAP1、Bx-VAP2、Bx-VAP3、Bx-VAP4蛋白均无跨膜结构域。利用NetPhos3.1Server在线程序预测Bx-VAPs蛋白的磷酸化位点，结果显示（表2），Bx-VAP1蛋白共有33个磷酸化位点，其中丝氨酸位点12个，苏氨酸位点17个，酪氨酸位点4个；Bx-VAP2蛋白共有34个磷酸化位点，其中丝氨酸位点15个，苏氨酸位点15个，酪氨酸位点4个；Bx-VAP3蛋白共有35个磷酸化位点，其中丝氨酸位点16个，苏氨酸位点11个，酪氨酸位点8个；Bx-VAP4蛋白共有38个磷酸化位点，其中丝氨酸位点14个，苏氨酸位点17个，酪氨酸位点7个。
采用SMART软件进行松材线虫Bx-VAPs蛋白的功能结构域分析可知（图7），Bx-VAP1、Bx-VAP2、Bx-VAP3、Bx-VAP4均具有保守的SCP结构域，分别在各自的第23 ~ 180位氨基酸、第23 ~ 180位氨基酸、第23 ~ 176位氨基酸、第23 ~ 175位氨基酸。此外，Bx-VAP2具有一个低复杂性区域，在第190 ~ 205位氨基酸。
利用SWISS-MODEL在线程序对Bx-VAP1蛋白的三级结构进行预测（图8A），结果显示，所得结构有较多的α螺旋和无规则卷曲，与利用SOPMA在线程序预测的Bx-VAPs蛋白的二级结构（图8B）结果一致。Bx-VAP1蛋白二级结构包括α螺旋（h，45.59%）、无规则卷曲（c，39.71%）、延伸链（e，13.24%）、β转角（t，1.47%）4种类型。Bx-VAP2蛋白二级结构包括α螺旋（h，42.72%）、无规则卷曲（c，42.23%）、延伸链（e，12.14%）、β转角（t，2.91%）4种类型。Bx-VAP3蛋白二级结构包括α螺旋（h，40.39%）、无规则卷曲（c，47.29%）、延伸链（e，10.84%）、β转角（t，1.48%）4种类型。Bx-VAP4蛋白二级结构包括α螺旋（h，37.31%）、无规则卷曲（c，43.28%）、延伸链（e，16.92%）、β转角（t，2.49%）4种类型。
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图 8 Bx-VAPs的三级结构（A）和二级结构（B）预测图h代表α-螺旋，c代表无规则卷曲，e代表延伸链，t代表β转角。h represents α-helix, c represents random coil, e represents extended strand, and t represents β turn.Figure 8. Secondary structure (B) and tertiary structure (A) prediction diagram of Bx-VAPs2.6 松材线虫Bx-VAPs蛋白的B细胞表位预测
利用Protean软件，对Bx-VAPs的二级结构、表面可及性、可塑性、B细胞抗原表位等进行了预测与分析（图9）。综合Gamier-Robson和Chou-Fasman 2种方法预测Bx-VAP1蛋白的二级结构（图9A）发现其主要以α螺旋为主，主要分布在24 ~ 31、36 ~ 45、50 ~ 53、58 ~ 80、92 ~ 96、122 ~ 127、135 ~ 139、178 ~ 185氨基酸残基；β转角主要形成于20 ~ 22、83 ~ 84、116 ~ 118、129 ~ 130、142 ~ 143、151 ~ 154、170 ~ 172、189 ~ 191、193 ~ 200氨基酸残基；无规则卷曲主要分布在80 ~ 83、88 ~ 90、103 ~ 111、118 ~ 199、131 ~ 135、155 ~ 158、173 ~ 177氨基酸残基，β折叠较少。利用Kyte-Doolittle方法对Bx-VAP1蛋白的亲水性进行分析（图9A），结果显示，Bx-VAP1亲水性区域主要分布在：17 ~ 31、32 ~ 53、55 ~ 88、104 ~ 145、151 ~ 166、172 ~ 179、196 ~ 197氨基酸残基。可及性较高区域位于Bx-VAP1蛋白分子表面，而可及性较低区域埋藏于分子内部的区域。Bx-VAP1蛋白的表面可及性较高区域是：17 ~ 26、33 ~ 36、42 ~ 47、65 ~ 73、106 ~ 112、114 ~ 131、161 ~ 164氨基酸残基。利用Karplus-Schulz方法对Bx-VAP1蛋白的可塑性进行分析（图9A），结果显示，柔韧性较高区域有14 ~ 27、34 ~ 50、54 ~ 58、66 ~ 72、100 ~ 112、114 ~ 124、127 ~ 131、140 ~ 143、151 ~ 165、186 ~ 200氨基酸残基。这些区域可能具有一定的柔韧性，形成表位的可能性较大，容易与抗体进行嵌合。利用Jameson-Wolf方法对Bx-VAP1蛋白的B细胞抗原表位进行预测（图9A），可看出Bx-VAP1存在10个潜在的B细胞抗原表位位点，预测的B细胞抗原表位区域为16 ~ 29、31 ~ 59、65 ~ 75、78 ~ 91、99 ~ 112、115 ~ 125、126 ~ 133、140 ~ 147、151 ~ 166、186 ~ 204氨基酸残基。结合该蛋白的二级结构、亲水性、可塑性、抗原性和表面可及性进行综合分析，Bx-VAP1蛋白的优势抗原表位可能存在于20 ~ 23、32 ~ 35、46 ~ 49、81 ~ 84、104 ~ 111、116 ~ 119、129 ~ 132、140 ~ 143氨基酸残基及其附近。
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图 9 Bx-VAPs蛋白的B细胞抗原表位预测A. Bx-VAP1蛋白的B细胞表位预测；B. Bx-VAP2蛋白的B细胞表位预测；C. Bx-VAP3蛋白的B细胞表位预测；D. Bx-VAP4蛋白的细胞表位预测。A, B cell epitope prediction of Bx-VAP1 protein; B, B cell epitope prediction of Bx-VAP2 protein; C, B cell epitope prediction of Bx-VAP3 protein; D, B cell epitope prediction of Bx-VAP4 protein.Figure 9. B cell antigenic epitope prediction of Bx-VAPs protein预测Bx-VAP2蛋白的二级结构（图9B），发现其主要以α螺旋为主，主要分布在25 ~ 31、50 ~ 53、58 ~ 77、92 ~ 94、108 ~ 115、122 ~ 126、135 ~ 142氨基酸残基；β转角主要形成于35 ~ 36、84 ~ 86、117 ~ 118、151 ~ 155、164 ~ 165、170 ~ 172、189 ~ 191、193 ~ 196、199 ~ 202氨基酸残基；无规则卷曲主要分布在32 ~ 34、38 ~ 41、80 ~ 82、87 ~ 90、102 ~ 108、119 ~ 121、129 ~ 134、156 ~ 160、173 ~ 175氨基酸残基；β折叠较少，主要形成于182 ~ 185氨基酸残基。利用Kyte-Doolittle方法对Bx-VAP2蛋白的亲水性进行分析（图9B），结果显示，Bx-VAP2亲水性区域主要分布在：20 ~ 54、64 ~ 94、109 ~ 133、151 ~ 166、173 ~ 179、188 ~ 201氨基酸残基。Bx-VAP2蛋白的表面可及性较高区域是：19 ~ 25、32 ~ 38、44 ~ 48、69 ~ 73、80 ~ 84、114 ~ 129、140 ~ 143、154 ~ 155、163 ~ 165氨基酸残基。利用Karplus-Schulz方法对Bx-VAP2蛋白的可塑性进行分析（图9B），结果显示，柔韧性较高区域有19 ~ 26、33 ~ 51、53 ~ 58、68 ~ 72、81 ~ 90、101 ~ 107、14 ~ 123、141 ~ 143、151 ~ 164、175 ~ 176、186 ~ 201氨基酸残基。利用Jameson-Wolf方法对Bx-VAP2蛋白的B细胞抗原表位进行预测（图9B），可看出Bx-VAP2存在10个潜在的B细胞抗原表位位点，预测的B细胞抗原表位区域：19 ~ 26、32 ~ 74、81 ~ 89、100 ~ 107、113 ~ 125、140 ~ 146、150 ~ 167、170 ~ 179、186 ~ 205氨基酸残基。综合分析Bx-VAP2蛋白的B细胞优势抗原表位可能存在于35 ~ 37、83 ~ 86、162 ~ 165氨基酸残基及其附近。
预测Bx-VAP3蛋白的二级结构（图9C），发现其主要以α螺旋为主，主要分布在35 ~ 37、151 ~ 166、189 ~ 193氨基酸残基；β转角主要形成于46 ~ 47、82 ~ 84、86 ~ 88、99 ~ 101、111 ~ 113、123 ~ 126、137 ~ 140、151 ~ 166、158 ~ 161、170 ~ 171、180 ~ 183氨基酸残基；无规则卷曲主要分布在31 ~ 33、39 ~ 44、48 ~ 58、80 ~ 81、90 ~ 91、95 ~ 96、102 ~ 103、117 ~ 121、128 ~ 129、152 ~ 153、156 ~ 157、172 ~ 176、187 ~ 188氨基酸残基；β折叠较少，主要形成于59 ~ 60、130 ~ 133氨基酸残基。利用Kyte-Doolittle方法对Bx-VAP3蛋白的亲水性进行分析（图9C），结果显示，Bx-VAP3亲水性区域主要分布在：16 ~ 69、76 ~ 127、136 ~ 142、150 ~ 166、168 ~ 199氨基酸残基。Bx-VAP3蛋白的表面可及性较高区域是：20 ~ 26、31 ~ 39、42 ~ 51、61 ~ 67、80 ~ 90、95 ~ 102、105 ~ 122、138 ~ 140、159 ~ 162氨基酸残基。利用Karplus-Schulz方法对Bx-VAP3蛋白的可塑性进行分析（图9C），结果显示，柔韧性较高区域有7 ~ 9、21 ~ 26、31 ~ 56、63 ~ 66、82 ~ 90、98 ~ 101、103 ~ 107、109 ~ 120、123 ~ 127、137 ~ 140、147 ~ 159、169 ~ 197氨基酸残基。利用Jameson-Wolf方法对Bx-VAP3蛋白的B细胞抗原表位进行预测（图9C），可看出Bx-VAP3存在10个潜在的B细胞抗原表位位点，预测的B细胞抗原表位区域：18 ~ 29、32 ~ 59、62 ~ 71、80 ~ 91、98 ~ 128、138 ~ 163、170 ~ 202氨基酸残基。综合分析Bx-VAP3蛋白的优势抗原表位可能存在于31 ~ 33、48 ~ 58、80 ~ 81、117 ~ 121、184氨基酸残基及其附近。
预测Bx-VAP4蛋白的二级结构（图9D），发现其主要以α螺旋为主，主要分布在16 ~ 26、67 ~ 78、120 ~ 122、135 ~ 141、189 ~ 193氨基酸残基；β转角主要形成于33 ~ 34、47 ~ 49、82 ~ 84、86 ~ 88、159 ~ 161、169 ~ 170、184 ~ 186、195 ~ 197氨基酸残基；无规则卷曲主要分布在41 ~ 46、54 ~ 56、80 ~ 81、99 ~ 101、108 ~ 110、129 ~ 131氨基酸残基；β折叠，主要形成于5 ~ 12、57 ~ 61、142 ~ 150、155 ~ 157、162 ~ 166、179 ~ 182、198 ~ 201氨基酸残基。利用Kyte-Doolittle方法对Bx-VAP4蛋白的亲水性进行分析（图9D），结果显示，Bx-VAP4亲水性区域主要分布在：17 ~ 53、58 ~ 88、90 ~ 93、102 ~ 143、183 ~ 195氨基酸残基。Bx-VAP4蛋白的表面可及性较高区域是：18 ~ 24、32 ~ 39、61 ~ 73、81 ~ 84、116 ~ 121、140 ~ 141、188 ~ 190氨基酸残基。利用Karplus-Schulz方法对Bx-VAP4蛋白的可塑性进行分析（图9D），结果显示，柔韧性较高区域有15 ~ 26、32 ~ 49、53 ~ 56、62 ~ 72、81 ~ 85、87 ~ 89、99 ~ 109、114 ~ 123、128 ~ 132、136 ~ 143、152 ~ 154、175 ~ 178、182 ~ 192氨基酸残基。利用Jameson-Wolf方法对Bx-VAP4蛋白的B细胞抗原表位进行预测（图9D），可看出Bx-VAP4存在10个潜在的B细胞抗原表位位点，预测的B细胞抗原表位区域：15 ~ 24、32 ~ 49、53 ~ 58、63 ~ 75、77 ~ 89、100 ~ 110、113 ~ 123、137 ~ 144、169 ~ 171、175 ~ 178、184 ~ 198氨基酸残基。结合该蛋白的二级结构、亲水性、可塑性、抗原性和表面可及性进行综合分析，Bx-VAP4蛋白的优势抗原表位可能存在于33 ~ 36、82 ~ 84氨基酸残基及其附近。
3. 结论与讨论
本研究成功构建4个不同的VAPs原核表达载体，并在大肠杆菌中获得分子量为22 ~ 31 kDa的VAPs蛋白，其中原核表达的Bx-VAP1蛋白与真核表达的VAP1蛋白分子量23.3 kDa[21]和22 kDa[14]相近，充分证明了VAP1蛋白原核表达成功。Bx-VAP2原核表达蛋白与人工合成的VAP2基因在大肠杆菌中原核表达获得的VAP2蛋白分子量（21.8 KDa）相似[20]。Bx-VAP3和Bx-VAP4蛋白首次在大肠杆菌中表达成功。同时，Bx-VAP1、Bx-VAP2、Bx-VAP3、Bx-VAP4基因在卵、L2、L3、L4、成虫中均有表达，其中Bx-VAP1、Bx-VAP2和Bx-VAP3基因的表达与前人研究类似[8]，未发表的转录组数据中显示VAP1基因和VAP2基因在成虫表达量最高，分别为对照组的419.18倍和18.03倍，VAP3和VAP4基因在L3中表达量较高，表达量分别为8.5和6.4倍。推测VAP1和VAP2可能与成虫的发育有关，VAP3和VAP4可能与L3的发育有关，这些基因的持续性表达模式与松材线虫这类迁移性内寄生线虫整个生活史过程中的侵染、迁徙和取食行为之间是否存在必然联系需要深入研究。考虑到mRNA与蛋白质表达水平存在不一致性，我们有必要针对已获得的松材线虫VAPs蛋白进行更加详尽的表达和定位分析，从而为进一步探讨该类基因的功能提供一定的依据。
大肠杆菌表达系统具有遗传背景清晰、操作过程简单、生长繁殖快、产物稳定性好、成本低、产量高、不易污染等优点，是基因表达技术中最早发展且应用最广的经典表达系统[21]。目前，已得到了广泛应用并取得了巨大的科研价值和经济效益。原核表达中信号肽序列的高疏水性会抑制大肠杆菌细胞的生长和目的蛋白的表达，但是不会对表达蛋白的生物学活性造成影响[23-24]，因此本研究设计了去信号肽的酶切引物，以满足松材线虫VAPs的免疫学检测的实验需求。同时，本研究利用纯化后的Bx-VAPs分别进行了Balb/c小鼠免疫，获取了高效价的抗体anti-VAP1、anti-VAP2和anti-VAP3，并通过蛋白免疫印迹成功检测松材线虫的蛋白液，但anti-VAP4抗体未能与松材线虫蛋白液结合反应，这可能是由于Bx-VAP4基因在扩散型4龄LⅣ中大量表达（未发表转录组数据），而本研究中的松材线虫蛋白液是室内培养的繁殖型不同虫态的松材线虫混合液。VAPs是松材线虫的分泌蛋白，该类蛋白在寄主体内的分布和流动是值得关注的问题。得到的重组VAPs分别作为抗原，获得了相应的抗体，使用这些相应的抗体结合ELISA 或免疫印迹等方法对相关病害木进行检测，结合免疫荧光及激光共聚焦对该蛋白在寄主中位置进行鉴定，为后续体外结合实验验证松材线虫的分泌蛋白-寄主植物蛋白相互作用、质谱分析深入研究 VAPs的作用机制及蛋白间的相互作用提供了有力的实验材料基础。
生物信息学分析结果显示，这4个Bx-VAPs蛋白均无跨膜结构域，蛋白质的二级结构有α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲4种，其中α螺旋和β折叠常位于蛋白质的内部，因此不易与抗体结合，β转角和无规则卷曲更容易突出在蛋白质的表面，与抗体嵌合可能性很大，成为候选抗原表位的可能性更大。运用DNAStar软件对Bx-VAPs蛋白的二级结构、亲水性、表面可及性、柔韧性、B细胞抗原表位等进行分析与预测，综合分析得出Bx-VAP1蛋白的优势B细胞抗原表位较多。该预测结果在后续研究中可通过人工合成表位多肽，或者将抗原表位多肽与其他抗原性较大的蛋白相偶联来增加其免疫原性，以进行免疫学验证。4个Bx-VAPs蛋白均具有SCP结构域，属于前人报道的SCP/TAPS家族蛋白，这类蛋白的功能各不相同，如免疫应答、生殖、病原体入侵等。松材线虫Bx-VAPs蛋白的功能还有待进一步研究。
综上所述，本研究首次通过原核表达体系，诱导表达和纯化多个Bx-VAPs蛋白，并对其基本理化性质、结构与功能特性、潜在B细胞抗原表位进行生物信息学分析，制备了多克隆抗体，对松材线虫蛋白也有一定的免疫反应，为进一步制备Bx-VAPs的单抗、开发松材线虫诊断试剂盒及深入认识 VAPs蛋白在松材线虫致病过程中的作用奠定了基础。
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