Screening of Populus simonii×Populus nigra WRKY70-interactive proteins by the yeast two-hybrid system
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摘要: 小黑杨PsnWRKY70是能够响应盐胁迫的转录因子。为了进一步探究该转录因子在参与盐胁迫应答途径中与哪些蛋白质之间存在相互作用关系,本研究以140 mmol/L NaCl溶液处理过的小黑杨叶片为材料,利用热稳定核酸酶(DSN)构建了均一化的pGADT7-DEST酵母双杂交cDNA文库,将PsnWRKY70基因亚克隆至pGBKT7载体,形成BD-WRKY重组质粒,并以之为诱饵蛋白表达载体筛选小黑杨酵母双杂交cDNA文库。经过2轮酵母双杂交筛选以及回转验证试验,初步选出了5种与PsnWRKY70相互作用的蛋白质。对所筛选出的5种蛋白质进行保守结构域分析发现:有2种预测蛋白(HP1和HP2,其中HP1包含ClpP结构域),1种环化酶相关蛋白(CAP1),1种包含RNA识别基序的蛋白(RRM)以及1种泛素样修饰蛋白酶(Ulp1);对CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因编码区上游2 000 bp范围内的顺式作用元件进行分析发现:CAP1、HP1、RRM、HP2和Ulp1的毛果杨同源基因上游启动子区均富含能够特异性结合WRKY转录因子的W-box。采用GST-pull down技术验证CAP1、HP1、RRM、HP2、Ulp1蛋白全长与PsnWRKY70转录因子之间是否存在直接的相互作用关系,将等量的His-X(X:CAP1、HP1、RRM、HP2或Ulp1)融合蛋白分别上样于正常谷胱甘肽琼脂糖树脂以及结合了GST或GST-WRKY蛋白的谷胱甘肽琼脂糖树脂中,SDS-PAGE电泳分离互作蛋白,最终Western blot结果显示:在体外状态下,HP1、RRM和Ulp1蛋白能够直接与PsnWRKY70相互作用,而CAP1和HP2则不能直接与PsnWRKY70相互作用。Abstract: Populus simonii×Populus nigra WRKY70 (PsnWRKY70) is a salt stress responsive transcription factor. In order to further identify the proteins that interact with PsnWRKY70 in salt stress response pathway, we used P. simonii×P. nigra leaves treated by 140 mmol/L NaCl solution as materials to construct a homogeneous pGADT7-DEST yeast two-hybrid cDNA library by DSN. PsnWRKY70 gene was subcloned to pGBKT7 vector to construct BD-WRKY recombinant plasmid, and then the BD-WRKY plasmid was used as a bait to screen the yeast two-hybrid cDNA library of P. simonii×P. nigra. After twice screening tests and a rotary experiment, five proteins that interact with PsnWRKY70 were detected. We analyzed the conserved domains of the five proteins and found that there were two hypothetical proteins (HP1 and HP2, HP1 contains a ClpP domain), one cyclase associated protein (CAP1), one RNA recognition motif-containing family protein (RRM) and one Ulp1 protease family protein (Ulp1) among them. The cis-elements that exist in 2 000 bp upstream of the orthologous Populus trichocarpa genes of CAP1, HP1, RRM, HP2 and Ulp1 were also analyzed, and the results suggest that the promoter regions of all the five orthologous P. trichocarpa genes contained plenty of W-box which can specifically bind to WRKY transcription factors. GST-pull down technology was utilized to validate the direct interaction between the complete CAP1/HP1/RRM/HP2/Ulp1 proteins and PsnWRKY70. An equal amount of His-X (X: CAP1/HP1/RRM/HP2/Ulp1) fusion proteins was dropped into normal glutathione agarose resin and GST or GST-WRKY protein-bound glutathione agarose resin respectively, then the interactive proteins were separated by SDS-PAGE. The final Western blot analysis indicated that HP1, RRM and Ulp1 can directly interact with PsnWRKY70 in vitro, while CAP1 or HP2 cannot.
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Keywords:
- Populus simonii×P. nigra /
- PsnWRKY70 /
- salt stress /
- cDNA library /
- yeast two hybrid /
- interaction
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森林植物种类多样性是群落组织水平、结构类型、稳定程度的外在体现，对表征生态系统生态功能具有重要意义[1-2]，也是维持生态系统稳定与持续生产力的基础[3]。森林群落结构主要表征为群落内部乔灌草个体大小（株高、直径、冠幅等）及相关群落特征（郁闭度、盖度和密度等），表现为群落垂直和水平方向上的外貌特征[4]。对群落结构和物种多样性的分析有助于揭示生态系统的更新、稳定性和演替规律[5-7]。国家保护区制度是国家种质资源保护的重要基础设施和基础本底，对其群落结构、物种多样性及二者耦合关系的分析具有重要的实践与科学意义。
东北地区的天然林资源曾十分丰富，但是在20世纪50至60年代为了给国家输送木材，对所有森林类型进行大面积皆伐、带状皆伐[8]。20世纪70年代开始，皆伐为主转变为择伐为主的粗犷林业经营模式，使大量的天然林退化为次生林[8]，对天然林生态系统的保护已迫在眉睫。作为我国唯一的寒温带地域的大兴安岭地区，拥有巨大的生态、经济、社会效益[9-10]，对该区域物种多样性的研究已涉及到物种的数量，物种多样性指数的描述，不同海拔梯度多样性以及重点区域等多方面[10-11]。基于典型国家级自然保护区，通过个体大小结构、建群种多度、植物种类多样性等多角度数据测定与分析，能够作为天然林保护的范例与基准，为天然林保护工程实施与后续生态服务功能评价提供有益借鉴与参考。
双河国家级自然保护区是我国位置最北的国家级自然保护区，本研究以此保护区为基地，主要目的包括：（1）揭示我国寒温带保护区植物多样性和群落结构特征；（2）探究群落结构特征与多样性分布的耦合关系。对比大兴安岭历史数据与区域其他研究结果，本研究将为保护区制定森林经营策略，提高林分组成多样性提供数据支撑。
1. 研究地概况与研究方法
1.1 研究地概况
黑龙江双河国家级自然保护区始建于2002年，地理坐标52°54′25″ ~ 53°12′08″N、124°52′48″ ~ 125°32′03″E[12]。其处于我国北方边境大兴安岭地区塔河县境内，北与俄罗斯隔江而望，属寒温带大陆性季风气候，极端最低气温−45.8 ℃，极端最高气温38 ℃，年平均气温为−4.3 ℃。冬季气温低，持续时间长，平均每年积雪期长达170 d，夏季多降雨，主要集中在7、8月，年平均降水量大约为460 mm。保护区内原始森林茂密，湿地面积巨大，野生动植物繁多，生物多样性较高。该区植物寒温带植被特征明显，森林类型多样且丰富，尤其是保留着大面积的原始樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）林和兴安落叶松（Larix gmelinii）林，典型代表了我国寒温带落叶针叶林区的植被类型。其优势种为兴安落叶松、白桦（Betula platyphylla）、樟子松等。研究区域位于我国大兴安岭的最北端，也是我国最靠北部边境的国家级自然保护区，开展相关研究对于北方针叶林保护具有科学意义。
1.2 研究方法
1.2.1 研究样地设置与调查方法
本研究于2016年8—9月在双河自然保护区内展开样地调查，在样地内按不同功能区（核心区、缓冲区和实验区），不同生境类型（干生生境、中生生境和湿生生境），不同林型（落叶松林、白桦落叶松林、桦树（Betula spp.)林和杂木林）分层随机选取33块面积为30 m × 30 m的样方样地调查乔木层，其中核心区、缓冲区和实验区分别设置样地数量为10、9和14块；干生生境、中生生境和湿生生境分别设置样地数量为12、13和8块；落叶松林、白桦落叶松林、桦树林和杂木林分别设置样地数量为5、11、5和12块。每个乔木样地内随机设置5块2 m × 2 m小样方调查灌木层、每个灌木样地内随机设置5块1 m × 1 m小样方用于调查草本层，合计调查165块灌木（灌木调查时同时调查更新层）和165块草本样地。
对样方内的乔木（胸径2.5 cm以上）每木检尺，调查项目包括乔木种类（科属种）、胸径、树高、枝下高、盖度。灌木样地调查灌木的种类（只涉及到种）、株数、株高、冠幅、盖度及地径；胸径介于1 ~ 2.5 cm且高于50 cm的乔木树种在灌木层样方中同步调查其种类、地径和树高，并记入更新层中。草本样地记录植物种类（只涉及到种）、盖度、高度和相对多度。
1.2.2 相关指标计算
样地水平植物多样性指标：包括乔、灌、草和更新层4层植物的Simpson指数、Alatalo均匀度指数和物种丰富度。上述相关参数计算详见参考文献[11]。本研究还计算了Shannon-Wiener指数、Pieolu均匀度指数，他们分别与我们选择的Simpson多样性指数及Alatalo均匀度指数具有高度相关（R2 > 0.9），本论文选择了以上3种指数来表征乔灌草多样性的大小。
整体数据植物种类相对多度与丰富度：为了确定研究区域优势植物种类，把乔、灌、草和更新层各层所有的植物种类数据放在一起进行统计，计算每一个种的相对数量百分比（即相对多度）；同时统计各层植物种类总数（即丰富度）。
样地水平群落结构特征指标：包括个体大小和群落特征，计算为所有指标均取平均值，先计算出各样方的平均值，再计算平行样方的平均值最终作为该样地的特征值。
1.2.3 数据分析与处理
为了表征选定区域植物多样性、群落特征和个体大小等特征，采用Excel 2016饼状图方法表示不同层植物优势种相对多度；运用JMP 11.0频率分布图法，确定平均值、中位数和分布范围等进行植物多样性、均匀度、个体大小和群落特征比较。频率分布图呈现的5个统计量：最小值、第一四分位数、中位数、第三四分位数与最大值，反映数据分布的中心位置和分布范围，相关图示可参考文献[13]，这种多参数表征可以帮助我们更形象地理解数据相关特征。我们还用单峰型和多峰型表征频率分布图，其中单峰型为正态分布或偏正态分布；多峰型为波动变化，有多峰值出现。
为了解析群落结构特征与植物多样性复杂耦合关系，采用Canoco 5.0软件冗余分析（redundancy analysis，RDA）中的方差分解分析方法，分别进行群落特征和个体大小两者及乔木、灌木和草本层三者的方差分解分析。具体分析过程中，对所有林分特征因子进行了前项选择，每个因子重要性和显著性采用Monta-Carlo假设检验，以P < 0.05作为显著性检验，排除贡献较小的因子。一般来讲，箭头越长，而夹角的余弦值越小，说明两个变量越具有紧密相关关系，也就是解释变量对响应标量变化的解释能力越强。此外，为了判断林型间、生境间耦合关系是否发生分化，RDA排序分析中按照林型（落叶松林、白桦落叶松林、桦树林和杂木林）和水分生境（干生、中生和湿生生境）进行样地排序。当林型或生境类型混合在一起分布时，说明耦合关系没有明显分异，否则，相应的林型和生境在这些关系上存在显著分异。
2. 结果与分析
2.1 乔、灌、草及更新层主要种相对多度
本次调查研究统计了保护区样地内记录的全部物种及其数量。乔木层包括白桦、兴安落叶松、山杨（Populus davidiana）、樟子松、黑桦（Betula dahurica）、红皮云杉（Picea koraiensis）、辽东桤木（Alnus sibirica）、蒙古栎（Quercus mongolica）、兴安柳（Salix hsinganica）9个树种，其中白桦和兴安落叶松的数量占全部树种的80%以上，为乔木层的优势树种（图1A）。灌木层包括越桔（Vaccinium vitis-idaea）、笃斯越桔（Vaccinium uliginosum）、杜香（Ledum palustre）、兴安杜鹃（Rhododendron dauricum）、石生悬钩子（Rubus saxatilis）、山刺玫（Rosa davurica）、东北桤木（Alnus mandshurica）、欧亚绣线菊（Spiraea media）、柴桦（Betula fruticosa）、黑茶藨子（Ribes nigrum）等19种，其中越桔单种数量所占比例高达93%，处于绝对优势（图1B）。草本层植物种类较多，优势现象不明显，数量占到4%以上的有小叶章（Deyeuxia angustifolia）、羊须草（Carex callitrichos）、二叶舞鹤草（Maianthemum bifolium）、铃兰（Convallaria majalis）、圆叶鹿蹄草（Pyrola rotundifolia）、地榆（Sanguisorba officinalis）、裂叶蒿（Artemisia tanacetifolia）、北野豌豆（Vicia ramuliflora）、蕨（Pteridium aquilinum）9种，数量最多的是占到15%的小叶章。其他种类的草本植物数量较少，包括凤毛菊（Saussurea japonica）、林问荆（Eguisetum sylvalicum）、七瓣莲（Trientalis europaea）、大白花地榆（Sanguisorba sitchensis）等65种（图1C）；更新层只有白桦、兴安落叶松、蒙古栎、兴安柳、樟子松、黑桦、红皮云杉、山杨8种，其中先锋树种白桦数量最多，比例高达60%（图1D）。
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图 1 乔木层、灌木层、草本层和更新层主要种相对多度Figure 1. Relative abundance of main species in arbor layer, shrub layer, herb layer and regeneration layer2.2 植物多样性特征分布
从均值来看，双河自然保护区分布2 ~ 6种乔木/样地，乔木层丰富度指数频率分布呈单峰型，多数在3 ~ 4种之间（占36%），最小50%集中区域为2 ~ 3。乔木层Simpson指数频率分布也呈单峰型，分布范围介于0.07 ~ 0.74，最小50%集中区域为0.46 ~ 0.65，大部分在0.50 ~ 0.60之间（高达27%）。乔木层均匀度指数频率分布呈多峰型，分布区间在0.38 ~ 0.99，均匀度指数为0.60 ~ 0.70的样地占1/3（34%），最小50%集中区域为0.67 ~ 0.88（表1）。
表 1 个体大小、群落特征和植物多样性的统计表Table 1. Statistics of individual size, community characteristics and species diversity indices项目
Item均值
Mean中位数
Median标准误差
Standard
error25%
中位数
25%
median75%
中位数
75%
median最小50%区间
Min. 50%
range最大分布区间
Max.
distribution
interval分布区间
Distribution
interval类型
Type乔木丰富度
Arbor richness (T-R)3.61 3.00 0.23 3.00 5.00 2.00 ~ 3.00 3.00 ~ 4.00 2.00 ~ 6.00 单峰 Single peak 乔木 Simpson 指数
Arbor Simpson index (T-D)0.43 0.49 0.03 0.28 0.57 0.46 ~ 0.65 0.50 ~ 0.60 0.07 ~ 0.74 单峰 Single peak 乔木 Alatalo 指数
Arbor Alatalo index (T-Ea)0.71 0.68 0.03 0.59 0.85 0.67 ~ 0.88 0.60 ~ 0.70 0.38 ~ 0.99 多峰 Multi peak 灌木丰富度
Shrub richness (S-R)3.09 3.00 0.19 2.00 4.00 2.00 ~ 3.00 3.00 ~ 4.00 1.00 ~ 6.00 多峰 Multi peak 灌木 Simpson 指数
Shrub Simpson index (S-D)0.21 0.11 0.04 0.02 0.43 0 ~ 0.10 0 ~ 0.11 0 ~ 0.71 多峰 Multi peak 灌木 Alatalo 指数
Shrub Alatalo index (S-Ea)0.53 0.44 0.04 0.36 0.67 0.27 ~ 0.46 0.30 ~ 0.40 0.26 ~ 1.00 单峰 Single peak 草木丰富度
Herb richness (H-R)9.39 10.00 0.64 7.00 12.50 6.00 ~ 11.00 10.00 ~ 12.50 2.00 ~ 18.00 多峰 Multi peak 草木 Simpson 指数
Herb Simpson index (H-D)0.75 0.81 0.04 0.67 0.85 0.83 ~ 0.88 0.80 ~ 0.90 0.28 ~ 0.91 单峰 Single peak 草木 Alatalo 指数
Herb Alatalo index (H-Ea)0.73 0.74 0.02 0.63 0.84 0.75 ~ 0.85 0.70 ~ 0.80 0.42 ~ 1.00 单峰 Single peak 更新丰富度
Regenerated richness (R-R)2.33 2.00 0.15 2.00 3.00 2.00 ~ 3.00 1.00 ~ 5.00 单峰 Single peak 更新 Simpson 指数
Regenerated Simpson index (R-D)0.34 0.38 0.04 0.15 0.53 0.25 ~ 0.55 0 ~ 0.10 0 ~ 0.75 多峰 Multi peak 更新 Alatalo 指数
Regenerated Alatalo index (R-Ea)0.78 0.82 0.03 0.62 0.98 0.82 ~ 1.00 0.90 ~ 1.00 0.46 ~ 1.00 多峰 Multi peak 乔木株高
Arbor height (TH)/m12.82 12.00 0.36 10.99 13.36 10.30 ~ 12.20 10.00 ~ 12.00 7.74 ~ 19.14 单峰 Single peak 乔木胸径
Arbor DBH (TDBH)/cm13.99 13.53 0.75 11.10 16.59 11.10 ~ 14.80 12.50 ~ 15.00 7.21 ~ 13.53 单峰 Single peak 乔木枝下高
Arbor underbranch height (TCBH)/m6.96 6.95 0.26 5.91 8.00 6.30 ~ 8.20 6.00 ~ 8.00 3.57 ~ 9.69 单峰 Single peak 灌木高度
Shrub height (SH)/m0.36 0.19 0.07 0.11 0.50 0.10 ~ 0.21 0 ~ 0.25 0.10 ~ 1.93 单峰 Single peak 灌木地径
Shrub ground diameter (SGD)/cm1.03 0.95 0.07 0.80 1.10 0.80 ~ 1.11 0.75 ~ 1.00 0.48 ~ 2.18 单峰 Single peak 灌木冠幅
Shrub canopy width (SCD)/cm65.82 62.75 4.36 48.60 83.65 35.50 ~ 66.30 60.00 ~ 70.00 27.50 ~ 113.60 单峰 Single peak 草本高度
Herb height (HH)/cm29.04 28.83 1.03 25.11 32.77 27.10 ~ 34.00 25.00 ~ 30.00 16.20 ~ 41.00 单峰 Single peak 更新株高
Regenerated tree height (RH)/m1.66 1.60 0.03 1.40 2.11 1.60 ~ 2.00 1.50 ~ 1.75 0.50 ~ 3.10 多峰 Multi peak 更新地径
Regenerated ground diameter (RGD)/cm1.08 1.00 0.03 0.52 1.50 0.40 ~ 1.00 1.00 ~ 1.25 0.31 ~ 2.40 多峰 Multi peak 乔木郁闭度
Arbor canopy density (TC)0.73 0.80 0.02 0.65 0.80 0.71 ~ 0.80 0.80 ~ 0.85 0.50 ~ 0.90 单峰 Single peak 灌木盖度
Shrub coverage (SC)/%29.30 19.33 4.41 8.00 17.10 10.20 ~ 27.30 15.00 ~ 17.50 3.20 ~ 100.00 多峰 Multi peak 草本盖度
Herb coverage (HC)/%38.40 38.33 2.78 12.30 48.30 38.40 ~ 54.30 40.00 ~ 50.00 0.03 ~ 0.98 单峰 Single peak 乔木密度/(株·m−2)
Arbor density (TD)/(plant·m−2)0.13 0.13 0.01 0.08 0.16 0.11 ~ 0.17 0.15 ~ 0.175 0.04 ~ 0.28 多峰 Multi peak 灌木密度/(株·m−2)
Shrub density (SD)/(plant·m−2)22.70 14.08 4.00 2.33 36.17 0.25 ~ 14.08 0 ~ 10.00 0.25 ~ 84.08 单峰 Single peak 更新密度/(株·m−2)
Regenerated density (RD)/(plant·m−2)0.19 0.14 0.02 0.07 0.32 0.05 ~ 0.19 0.05 ~ 0.10 0.05 ~ 0.46 多峰 Multi peak 灌木层丰富度最大值为6种/样地，最小50%集中区域为2 ~ 3。灌木层Simpson指数大部分集中分布在0 ~ 0.11的较小范围内，所占比例为48%。灌木层均匀度指数的频率分布呈现先增加后降低的变化趋势，在0.30 ~ 0.40之间分布比例达到最大（占34%），最小50%集中区域为0.27 ~ 0.46。
草本层的丰富度指数较乔木层和灌木层明显高出许多，最多可达18种/样地，在10.00 ~ 12.50所占比例最大，占比可达27%，最小50%集中区域为6 ~ 11。草本多样性指数大部分分布在0.80 ~ 0.90，所占比例高达52%，最小50%集中区域为0.83 ~ 0.88。草本均匀度度指数的频率分布同多样性指数一样也呈现为单峰型，在0.70 ~ 0.80之间分布所占比例最大（占36%），最小50%集中区域为0.75 ~ 0.85。
更新层的丰富度频率分布呈单峰型，大多数分布在2 ~ 3种之间，占所有样地的52%。更新层多样性Simpson指数在0 ~ 0.1所占比例最高（为21%），最小50%集中区域为0.25 ~ 0.55。更新层有近60%样方均匀度指数在0.80以上，这表明均匀度大（R-Ea > 0.60）的样方比均匀度小的样方多，均匀度最小值为0.46。
由表1中数据可得知，各样方间多样性指数并无明显差异（除草本丰富度外），标准误差为在0.02 ~ 0.23之间。灌木层的丰富度最低，其次为乔木层，两者均为草本层的1/3左右。草本层的Simpson多样性指数也是最高的，是乔木层的1倍多、灌木层的3倍多；就均匀度而言，乔木层和草本层大致相同，是灌木层的1.3倍；更新层的丰富度比灌木层还要低，但均匀度较高，基本确定主要树种就在2 ~ 3种之间（表1）。
2.3 林分个体大小特征分布
由表1可知，乔木株高、胸径和枝下高频率分布均呈现单峰型。树高分布范围在7.74 ~ 19.14 m之间，绝大部分集中在10 ~ 12 m，比例高达42%，最小50%集中区域为10.30 ~ 12.20 m。乔木胸径分布在12.5 ~ 15 cm之间所占比例最大（30%），最小50%集中区域为11.1 ~ 14.8 cm。乔木枝下高的分布范围在3.57 ~ 9.69 m之间，枝下高在6 ~ 8 m所占比例最高，占比高达48%，最小50%集中区域为6.30 ~ 8.20 m。
灌木高、地径和冠幅频率分布均呈单峰型。灌木高度主要分布区域在0 ~ 0.25 cm之间（占比高达58%），最小50%集中区域为0.10 ~ 0.21 m。灌木地径最大可达2.18 cm，其中53%在0.75 ~ 1 cm之间，最小50%集中区域为0.80 ~ 1.11 m。灌木冠幅分布范围在27.50 ~ 113.60 cm范围内，分布在60 ~ 70 cm之间所占比例最大（19%），最小50%集中区域为35.5 ~ 66.3 cm。
草本层的高度分布范围在16 ~ 41 cm之间，其中分布在25 ~ 30 cm之间的样地所占比例最大，占比为33%，最小50%集中区域为27.1 ~ 34.0 cm。
更新层的高度在0.50 ~ 3.10 m范围内，多数在1.50 ~ 1.75 m之间，其占全部样地的50%以上。更新层地径比例最高的在1.00 ~ 1.25 cm之间，最小50%集中区域为0.4 ~ 1.0 cm。
对保护区林分个体大小的均值、中位数等指标比较分析可得出（表1），各林分特征指标的中位数均在平均值以下。保护区乔木平均树高为12.82 m，平均枝下高为6.96 m，平均胸径为13.99 cm；灌木平均树高为0.36 m，其地径和高度在样方间差异明显（标准误差为0.07）；草本平均高为29.04 cm；更新层平均高1.66 m，基本都在3 m以下，平均胸径1.08 cm，大部分都在1 cm左右。
2.4 林分群落特征分析
由表1可知，盖度和密度可以反映群落的结构特征。乔木层郁闭度频率分布呈单峰型，分布范围在0.5 ~ 0.9之间，主要集中在0.80 ~ 0.85之间（占比高达42%），最小50%集中区域为0.71 ~ 0.80。灌木盖度主要分布集中15.0 %~ 17.5%，占所有样地的36%，最小50%集中区域为10.2% ~ 27.3%。草本层盖度频率分布与乔木层相似也呈单峰型，比例最大部分集中在40% ~ 50%之间，占比高达30%，最小50%集中区域为38.4% ~ 54.3%。
密度方面对群落特征的反映同样重要，根据表1的结果可知，乔木密度每平米不足1株。换算成每公顷密度，占比最大（24%）分布在1 500 ~ 1 750株/hm2之间，最小半数集中区域为1 100 ~ 1 700株/hm2。灌木层密度占比最大（36%）分布0 ~ 10株/m2，最小50%集中区域为0.25 ~ 14.08。更新层密度和乔木层一样数量较少，每平米不足1株。
从平均值和中位数来看，各群落指标的中位数都低于平均水平（除乔木密度）。该地区平均郁闭度为0.73，草本平均盖度为38%，灌木覆盖率最低（29%）。其中乔木郁闭度、乔木密度和更新层密度离散程度最小，在样方间差异不大（标准误差分别为0.02、0.01和0.02），灌木的盖度和密度分布的最离散（表1）。
2.5 植物多样性变化的方差分解分析
基于RDA排序进行方差分解分析（2组）发现，群落结构特征对多样性变化解释能力最大，解释量为81.7%，个体大小特征的解释量是群落结构特征的21.6%，而二者的交互作用对多样性解释量为−3.3%（图2A）。分为乔木层、灌木层和草本层3组时，如图2B所示，草木层特征的单独作用对多样性变化贡献最大，解释量为52.8%，分别是乔木层、灌木层的2.5和1.6倍；乔草、灌草的交互作用的解释量较小，分别为5.1%、2.0%。
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图 2 区分个体大小(A)与群落特征和乔灌草的方差分解分析(B)Figure 2. Variation partition between individual sizes and community characteristics (A) and among arbor layer, shrub layer and herb layer (B)2.6 群落结构特征值与植物多样性的RDA排序
综合乔灌草的个体大小指标和群落特征（解释变量）与整体多样性（响应变量）的排序结果来看，图3A中空心箭头表示个体大小指标和群落特征指标，实心箭头表示多样性指标。RDA分析表明，个体大小和群落特征对植物多样性的总解释量为53.8%，第1轴解释了多样性变化的16.86%，第2轴解释了14.32%。简单效应结果表明，更新层株高对多样性变化解释能力最大，解释量为12.8%，P < 0.01；灌木高的解释能力次之，解释量为8.1%，P < 0.05，剩余指标对多样性变化的解释意义不大（解释量在1.6% ~ 6.8%之间，P > 0.05）。条件效应结果表明，综合了其他指标后仍然是更新层株高对多样性变化解释能力最大，并且解释量和显著性没有发生变化。其次是草本盖度，解释量为6.2%，P < 0.05（表2）。
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图 3 群落结构特征与植物多样性的RDA排序(A)、不同林型样地分布图(B)和不同生境分布图(C)Figure 3. RDA ordinations between species diversity and various factors as well as their statistics (A), non-differentiation of sampling sites of 4 different forest types (B), and distribution of sample plots in different environments (C)表 2 简单效应与条件效应统计表Table 2. Statistics of simple-term effects and conditional term effects简单效应 Simple term effect 条件效应 Conditional term effect 项目 Item 解释量 Explanatory quantity/% F P 项目 Item 解释量 Explanatory quantity/% F P RH 12.8 3.9 0.002 RH 12.8 3.9 0.002 SH 8.1 2.4 0.010 HC 6.2 2.0 0.048 HC 6.8 2.0 0.050 TDBH 5.0 1.6 0.106 HH 6.4 1.8 0.082 TD 5.0 1.7 0.108 SCD 6.2 1.8 0.068 SD 4.8 1.7 0.096 TDBH 5.0 1.4 0.174 RGD 5.0 1.8 0.088 SD 4.5 1.3 0.264 HH 4.1 1.5 0.154 TC 4.5 1.3 0.250 SH 3.1 1.2 0.344 RD 4.5 1.3 0.246 RD 2.4 0.9 0.530 TCBH 4.5 1.3 0.246 TC 2.3 0.9 0.584 TH 4.1 1.1 0.348 TCBH 2.2 0.8 0.608 TD 3.7 1.0 0.426 SCD 1.9 0.7 0.678 SC 3.3 0.9 0.512 SGD 2.6 0.9 0.476 RGD 3.2 0.9 0.542 SC 1.7 0.6 0.768 SGD 1.6 0.4 0.920 TH 1.2 0.4 0.882 图3B和3C为不同林型和生境类型样地分异散点图，我们发现物种构成是连续变化的，我们没有办法找到特定的植被类型和生境类型界限。在两个轴的方向上，该保护区不同林分间和不同生境间并没有发生明显的分异。说明这4种林分和3种生境类型具有相类似的多样性特征，在耦合关系方面并没有产生差异。
3. 讨 论
3.1 植物多样性特征
与本课题组调查大兴安岭呼中保护区结果相比，双河保护区样地乔木丰富度（3.61）、草本丰富度（9.39）分别是大兴安岭核心区域、国家建立最早的呼中国家级自然保护区保护区的1.6和1.2倍；而灌木丰富度（3.09）相当于呼中60%[11]。与方精云等人[10]研究结果（乔木丰富度、草本丰富度分别为2.43和6.69）相比，双河保护区样地乔木、草本丰富度是呼中的1.5和1.4倍。同时，本次调查中，保护区内落叶松和樟子松的相对多度达到乔木层的47%，这为研究寒温带森林生态系统提供了良好的科研基地[14]。本次双河国家级自然保护区内更新层调查中，白桦占比高达为60%，这反映出该保护区气候顶级−落叶松更新较差。考虑到主林层以落叶松为主，而且本地区的顶级群落为兴安落叶松林，如果不采取人为干预措施，不利于该保护区自然演替到气候顶级。
3.2 森林植物个体大小与群落结构
根据大兴安岭林区第七次森林资源清查数据显示，乔木林占大兴安岭林木资源近90%，是林区的主体[15]。本次调查结果显示，双河国家级自然保护区乔木个体整体较小，平均树高仅为12.8 m，平均胸径仅为14.0 cm。这与呼中自然保护区乔木大小基本一致：呼中保护区树高平均值为13.8 m左右，平均胸径为13.5 cm[11]。1978年大兴安岭林区过成熟落叶松林各样地树高平均23.6 m，直径平均26.3 cm，说明近40年来森林资源的质量下降近一半[15]。尽管理论上，保护区能导致植物种类、数量增多，个体大小增大尚需要各种保护措施[16]。从我们的研究结果来看，双河保护区主林层乔木个体还很小，尚需要更长的时间才能够使得森林资源得到充分恢复。
双河保护区郁闭度平均值为0.73，高于整个十八站林业局的森林郁闭度，2005年和2016年十八站林业局的二类清查数据显示该地区平均郁闭度分别为0.48和0.58[17]。双河自然保护区在2008年就已划入国家级自然保护区，在当地应该是资源比较丰富的区域，郁闭度的数据可以看到这一点。
3.3 植物多样性影响途径
首先，草本层的多样性往往最能影响整体的植物多样性[18]，本研究发现草本层的单独作用对多样性变化具有最大的解释功能，而草本层盖度是对多样性变化比较敏感的因子。以前研究显示林区道路[19]、火干扰[20]对不同区域内灌木及草本植物多样性影响显著，结合我们的发现，今后要加强林分管理、建设等多因素影响草本的规律总结，提升多样性保护效果。其次，群落特征对植物多样性的影响要远大于个体大小指标。未来林分管理与保护中，应该着重通过草本群落盖度来调整增加乔木、草本多样性，而适当增加灌木的密度也会提升整体多样性。最后，更新层大小，主要是株高对植物多样性变化具有明显指示作用。森林的更新对未来森林群落结构起到重要的作用，更新层的大小、密度和灌木植物多样性具有负相关，灌木多样性过高，伴随着更新层大小变低。促进乔木的天然更新，需要管理灌木盖度与种类。这些关系的揭示，为后期天然林保护工程实施区域通过林分结构调整提升植物多样性提供了数据支撑。
4. 结 论
本文从乔灌草和更新层等多角度分析了大兴安岭双河自然保护区的植物多样性和群落结构特征，发现树木胸径和树高仅相当于20世纪70年代的一半，尚需要更长的保护时间来恢复森林资源；乔木和草本多样性较大兴安岭核心地区（呼中）更高。群落结构特征差异能够解释超过80%的多样性变化，而乔、灌、草中，草木层特征具有52.8%的解释功能。更新层高度对多样性变化具有最大的指示作用。这种复杂的跨层和层内关系是实现植物多样性保护管理的基础。相关研究结果为北方寒温带天然林保护及国家级自然保护区科学管理提供了基础数据。
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