Carbon storage of poplar plantations in Songnen Plain, northeastern China
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摘要: 利用设置在松嫩平原典型地区的6块杨树人工林样地和36株人工杨树解析木数据,建立了人工杨树相容性生物量方程,实测并分析了杨树人工林各个组成部分含碳率,估算并分析了人工杨树各个器官含碳量和杨树人工林生态系统碳储量密度特征。结果表明:胸径和年龄是影响人工杨树各个器官含碳率的主要因素,本研究中人工杨树各器官含碳率介于0.4427~0.4848之间。林下各层含碳率差异显著,枯枝层介于0.4568~0.4711之间,枯叶层介于0.3683~0.4454之间,半分解层介于0.4184~0.4600之间,草本层介于0.3506~0.3729之间。14~28年生人工杨树生物量和碳储量都随着林龄增长,树干生物量和碳储量所占整体比例稳定在0.60,树冠生物量和碳储量保持在0.17。14、21和28年生杨树人工林生态系统碳储量分别为230.6449、280.9064、和356.4973t/hm2,各部分碳储量大小排序为土壤层>植被层>凋落物层,该地区林下植被主要以草本为主,乔木层碳储量占植被层碳储量的比例超过了99%。由于该地区土壤层深厚,生态系统碳储量主要以土壤层为主,并且随着林龄增大而增加,14、21和28年生杨树人工林生态系统土壤层碳储量分别为216.5626、262.3598和335.3581t/hm2,所占生态系统比重都超过了93%。Abstract: Using data from 6 sample plots and 36 sample trees in the Songnen Plain, northeastern China, we established a compatible biomass model of poplar, measured carbon content rate of each component of the plantations, estimated carbon content in each organ of poplar, and analyzed the characteristics of carbon content density of the ecological system of poplar. The results were as follows. Diameter at breast height (DBH) and forest age were the main factors that affect carbon content in various organs of poplar. Carbon content rate of each organ ranged between 0.4427 and 0.4848. Difference in carbon content rate of each layer of understory species was significant, with that in deadwood layer between 0.4568-0.4711, 0.3683-0.4454 in litter layer, 0.4184-0.4600 in half-decomposition layer, and 0.3506-0.3729 in herb layer. Biomass and carbon storage rate of 14-28-year-old poplars grew with forest age; the proportion of biomass and carbon storage of stem kept around 0.60, while those of canopy at 0.17. Carbon storages of 14-, 21- and 28-year-old poplar ecology systems were 230.3449,280.9064 and 356.4973t/ha, respectively, and carbon storage of each component in this ecology system was in the order as soil layer > vegetation layer > litter layer. Since the understory vegetation layer in this region consisted mainly of herbs, the proportion of carbon storage of tree layer was more than 99%. The soil layer was very thick, so the carbon storages of the 14-, 21- and 28-year-old poplar ecological system depended mainly on soil and grew with forest age, which were 216.5626, 262.3598 and 335.3581t/ha, and the proportion was all over 93%.
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Keywords:
- poplar plantation /
- biomass /
- compatible biomass mode /
- carbon storage density
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杨树腐烂病普遍发生于我国东北、西北、华北等地区，尤其以华北地区发病较为严重，在杨(Populus spp.)、柳(Salix spp.)、榆(Ulmus spp.)、桦(Betula spp.)、苹果(Malus spp.)、梨(Pyrus spp.)、胡桃(Juglans spp.)，甚至沙生植物上都造成了严重的危害[1-5]。我国从20世纪60年代至今就杨树腐烂病的病原真菌系统学[6-7]，生理特征[8]、生态地理分布[9]、寄主抗病性[10]、病原致病性及危害性[11]、发病规律和防治方法[12-14]以及相关基因的分析[15-16]等进行了大量的研究，取得了显著的成果。张星耀等对来自我国9个省份的12个杨树品种上的30株金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)进行了培养性状的观察，表明该菌培养性状有明显的分化[8]。之后Abbasi等[17]、杨明秀等[16]都做了相关研究，说明了该类真菌培养形态具有丰富的多样性，极易造成种类鉴定等观念上的混淆[18]。这种多样性可能是由于培养环境的变化而引起，可能与其寄主杨树类别和菌株的地理来源相关联，也有可能来源于菌种自身的遗传特性差异。同时，该菌是一种弱寄生性真菌，其地理分布和寄主范围均较为广泛[19-20]，与活体营养型真菌相比[21-22]，遗传背景差异较大，来自寄主方面的选择压力较小，但是目前对于弱寄生真菌的遗传多样性的研究相对较少[23]。因此，本文采用形态学观察并将各指标量化进行聚类分析的方法，研究该病原菌的培养形态差异。同时，利用SRAP(sequence-related amplified)和ISSR(inter-simple sequence repeat)两种分子标记方法[24-25]，从相关序列多态性以及微卫星位点的角度，探究杨树腐烂病菌的遗传多样性，最终从形态和分子两方面阐述杨树腐烂病菌在性状分化、群体遗传等方面的相关科学问题，以期能为生产中出现的各地区关于形态多样性的识别，病害的合理防治等实际问题提供理论支持和科学依据。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
用于表观特征分析的杨树腐烂病菌株共106株，分离于采自全国14个省的新鲜标本，经形态学和分子系统学鉴定均为金黄壳囊孢菌，并保存于北京林业大学森林病理实验室(表 1)。从以上菌株中选取采集地经纬度，寄主种类等背景信息差异较大，且寄主杨树派系不同的菌株共34份用于分子标记(表 1中标*的菌株)，其中以菌株的地理来源分析：北京8份、甘肃6份、江苏1份、辽宁2份、内蒙古1份、宁夏5份、青海8份、陕西3份；若以寄主杨树派别分析：白杨派15份、黑杨派7份、青杨派5份、小叶杨派7份。
表 1 菌株信息Table 1. Information of strains菌株Strain 寄主Host 采集地Source C6941* 箭杆杨Populus nigra var. thevestina 北京海淀Haidian, Beijing C80322* 毛白杨P. tomentosa 北京海淀Haidian, Beijing C80323* 毛白杨P. tomentosa 北京海淀Haidian, Beijing C80327* 北京杨P.× beijingensis 北京海淀Haidian, Beijing C81310* 欧美杨P.× canadensis 陕西杨凌Yangling, Shaanxi C81311* 毛白杨P. tomentosa 陕西武功Wugong, Shaanxi C81312 陕林3号杨P. deltides cv.‘Lux’ × P. deltoides 陕西杨凌Yangling, Shaanxi C81313 陕林3号杨P. deltides cv.‘Lux’ × P. deltoides 陕西杨凌Yangling, Shaanxi C83121* 小叶杨P. simonii 内蒙古呼和浩特Hohhot, Inner Mongolia C83601 毛白杨P. tomentosa 四川汶川Wenchuan, Sichuan C83604 杨树Populus sp. 四川泸定Luding, Sichuan C85442* Ⅰ-69杨P. deltides cv.‘Lux’Ⅰ-69 陕西榆林Yulin, Shaanxi C85447 青杨P. cathayana 陕西眉县Meixian County, Shaanxi C87640* Ⅰ-72杨P.× euramericana cv. ‘San Martino’ 江苏句容Jurong, Jiangsu G-YS-13* 青杨P. cathayana 甘肃临潭Lintan, Gansu G-YS-14* 新疆杨P. alba. var. pyramidalis 甘肃漳县Zhangxian County, Gansu G-YS-5-C 杨树Populus sp. 甘肃甘南Gannan, Gansu G-YS-3* 青杨P. cathayana 甘肃甘南Gannan, Gansu G-YS-9-1* 小叶杨P. simonii 甘肃甘南Gannan, Gansu JT-YS-2 杨树Populus sp. 吉林通化Tonghua, Jilin NW-1 杨树Populus sp. 内蒙古乌兰浩特Ulanhot, Inner Mongolia N-YS-10* 小叶杨P. simonii 宁夏永宁Yongning, Ningxia N-YS-11 杨树Populus sp. 宁夏永宁Yongning, Ningxia N-YS-13* 小叶杨P. simonii 宁夏永宁Yongning, Ningxia N-YS-14* 小叶杨P. simonii 宁夏永宁Yongning, Ningxia N-YS-15* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 宁夏吴忠Wuzhong, Ningxia N-YS-4 小叶杨P. simonii 宁夏青铜峡Qingtongxia, Ningxia N-YS-7 小叶杨P. simonii 宁夏青铜峡Qingtongxia, Ningxia N-YS-8* 小叶杨P. simonii 宁夏中卫Zhongwei, Ningxia Q-YS-12 新疆杨P. alba var. pyramidalis 青海平安Ping'an, Qinghai Q-YS-13* 青杨P. cathayana 青海平安Ping'an, Qinghai Q-YS-14* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 青海平安Ping'an, Qinghai Q-YS-16* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 青海平安Ping'an, Qinghai Q-YS-19 新疆杨P. alba var. pyramidalis 青海互助Huzhu, Qinghai Q-YS-20* 青杨P. cathayana 青海互助Huzhu, Qinghai Q-YS-21* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 青海互助Huzhu, Qinghai Q-YS-22* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 青海互助Huzhu, Qinghai Q-YS-5* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 青海乐都Ledu, Qinghai Q-YS-8* 青杨P. cathayana 青海乐都Ledu, Qinghai Q-YS-9 青杨P. cathayana 青海乐都Ledu, Qinghai XZ-YS-3 杨树Populus sp. 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-4 杨树Populus sp. 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-5 杨树Populus sp. 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-6 杨树Populus sp. 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-7 银白杨P. alba 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-8 银白杨P. alba 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-9 银白杨P. alba 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-9-V 银白杨P. alba 西藏乃东Naidong, Tibet ZK-110-1* 杨树Populus sp. 甘肃会宁Huining, Gansu ZK-148 杨树Populus sp. 北京通州Tongzhou, Beijing ZK-149* 毛白杨P. tomentosa 北京大兴Daxing, Beijing ZK-153-2 杨树Populus sp. 北京大兴Daxing, Beijing ZK-154 杨树Populus sp. 北京大兴Daxing, Beijing G-YS-9-2* 小叶杨P. simonii 甘肃甘南Gannan, Gansu HBPQ-1 杨树Populus sp. 河北平泉Pingquan, Hebei HBPQ-2 杨树Populus sp. 河北平泉Pingquan, Hebei HQ-15 杨树Populus sp. 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HQ-18 毛白杨P. tomentosa 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HQ-24 杨树Populus sp. 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HQ-27 杨树Populus sp. 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HQ-31 杨树Populus sp. 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HQ-33 杨树Populus sp. 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HQ-34 大青杨P. ussuriensis 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HQ-35 大青杨P. ussuriensis 黑龙江齐齐哈尔Qiqihar, Heilongjiang HT-10 大青杨P. ussuriensis 黑龙江通北Tongbei, Heilongjiang HT-6 大青杨P. ussuriensis 黑龙江通北Tongbei, Heilongjiang HT-7 大青杨P. ussuriensis 黑龙江通北Tongbei, Heilongjiang HT-9 杨树Populus sp. 黑龙江通北Tongbei, Heilongjiang JA-5 杨树Populus sp. 西藏加查Gyaca, Tibet JAA-6 杨树Populus sp. 西藏加查Gyaca, Tibet JC-8 杨树Populus sp. 西藏加查Gyaca, Tibet JT-YS-1 杨树Populus sp. 吉林通化Tonghua, Jilin S-YS-3 杨树Populus sp. 陕西华县Huaxian County, Shaanxi S-YS-7 毛白杨P. tomentosa 陕西华县Huaxian County, Shaanxi S-YS-8 毛白杨P. tomentosa 陕西周至Zhouzhi, Shaanxi S-YS-9 杨树Populus sp. 陕西周至Zhouzhi, Shaanxi X-YS-14 银灰杨P. canescens 新疆轮台Luntai, Xinjiang X-YS-154 银灰杨P. canescens 新疆和田Hetian, Xinjiang X-YS-20 毛白杨P. tomentosa 新疆轮台Luntai, Xinjiang X-YS-294 新疆杨P. alba var. pyramidalis 新疆伊犁Ili, Xinjiang X-YS-383 新疆杨P. alba var. pyramidalis 新疆喀什Kashgar, Xinjiang X-YS-409 新疆杨P. alba var. pyramidalis 新疆阿克苏Aksu, Xinjiang X-YS-413 银灰杨P. canescens 新疆阿克苏Aksu, Xinjiang X-YS-419 新疆杨P. alba var. pyramidalis 新疆阿克苏Aksu, Xinjiang X-YS-433 新疆杨P. alba var. pyramidalis 新疆阿克苏Aksu, Xinjiang X-YS-78 新疆杨P. alba var. pyramidalis. 新疆和静Hejing, Xinjiang XZ-YS-1 杨树Populus sp. 西藏乃东Naidong, Tibet XZ-YS-10 杨树Populus sp. 西藏加查Gyaca, Tibet XZ-YS-11 杨树Populus sp. 西藏加查Gyaca, Tibet XZ-YS-12 银白杨P. alba 西藏加查Gyaca, Tibet XZ-YS-13 银白杨P. alba 西藏加查Gyaca, Tibet XZ-YS-14 银白杨P. alba 西藏加查Gyaca, Tibet XZ-YS-2 杨树Populus sp. 西藏乃东Naidong, Tibet ZK-157* 毛白杨P. tomentosa 北京大兴Daxing, Beijing ZK-158* 欧美杨P.×canadensis 北京大兴Daxing, Beijing ZK-163 杨树Populus sp. 北京大兴Daxing, Beijing ZK-182 毛白杨P. tomentosa 北京通州Tongzhou, Beijing ZK-183白 杨树Populus sp. 北京朝阳Chaoyang, Beijing ZK-188 杨树Populus sp. 北京通州Tongzhou, Beijing ZK-190 欧美杨P.×canadensis 北京通州Tongzhou, Beijing ZK-192 欧美杨P.×canadensis 北京通州Tongzhou, Beijing ZK-201 杨树Populus sp. 北京大兴Daxing, Beijing ZK-203 杨树Populus sp. 北京大兴Daxing, Beijing ZK-26-2* 山杨P. davidiana 北京门头沟Mentougou, Beijing ZK-59* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 辽宁沈阳Shenyang, Liaoning ZK-60* 新疆杨P. alba var. pyramidalis 辽宁沈阳Shenyang, Liaoning 注：*表示用于遗传多样性分析的菌株。Note: * means strain for genetic diversity analysis. 1.2 培养性状稳定性试验
随机挑选7株来自不同杨树品种、不同地理位置的菌株(C80322、C85442、G-YS-9-1、HQ-15、HQ-31、HQ-35、XZ-YS-13)，测定人工培养条件下病菌培养性状的稳定性。采用控制变量的方法(每个变量3个重复)，设置A(变量为PDA培养基的土豆类型)、B(变量为PDA培养基的厚度：10、15和20 mL/皿)、C(将每一菌株连续培养观察4代)3组试验，定期(3、7、10、13和50 d)观察每组中菌落的培养性状(菌落色素、生长速率、菌落质地、表面形态、是否产生黏液、子实体数量和子实体形态)，从而判断试验中培养基的酸碱度、淀粉含量(A)，培养基厚度(B)，继代培养(C)对菌株培养性状的稳定性的影响。将各变量下所观察到的培养形状指标赋值后(表 2)，分别用t检验及方差分析对培养过程中环境条件的变化对菌株培养性状稳定性的影响进行分析。其中试验中所用到的土豆是有可能造成性状差异的市面上仅有的两种不同类型的土豆，一种形状较长直，另一种较为圆钝。
表 2 培养特征量化描述Table 2. Quantitative description of culture characteristics特征赋值
Assignment培养特征Culture characteristics 色素
Pigment生长速率
Growth rate菌落质地
Colony texture表面形态
Surface morphology黏液
Mucus子实体数量
Fruiting quantity子实体形态
Fruiting morphology1 淡黄色
Canary yellow慢
Slow紧致
Compact辐射
Radiation无
No无
No无
No2 黄棕色
Yellow brown中等
Medium疏松
Loose非辐射
Non radiation有
Yes少
Less小
Small3 黑绿色
Blackish green快
Fast极疏松
Very loose同心圆
Concentric circle多
More中等
Medium4 大
Big1.3 菌落纯培养及培养特征观察
用打孔器(ϕ=5 mm)在新活化菌落边缘处打孔，挑取菌饼于PDA平板，置于28 ℃培养箱中黑暗培养，每天观察记录培养皿内菌落的生长状况，包括菌落的形状、颜色、子实体的分布和数量等，然后划分其形态类型。同时将培养形态各指标量化为矩阵。其中色素和子实体数量依据50 d时培养形态，生长速率依据3 d时培养形态。同时将生长过程中所观察到的菌落性状赋值量化(表 2)，通过SPSS18.0进行系统聚类，划分培养形态类型，并分析每一类的特征以及杨树腐烂病菌不同培养特征与寄主类型及地理来源的关系[8, 30]。
1.4 分子标记
菌株DNA提取采用Promega试剂盒(普洛麦格生物技术有限公司)。引物的筛选以5个DNA样品作为模板，用2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。SRAP标记引物的设计在Li等[26]报道的SRAP-PCR原始引物序列的基础上，改变引物3′端的3个选择性碱基得到具有相同核心序列的SRAP引物。根据镰刀菌(Fusarium spp.)和茶树内生芒果球座菌(Guignardia mangiferae)等的相关报导[27-28]设计ISSR引物。
选取扩增效果较好的引物对供试菌株进行扩增，统计每对引物扩增两次以上重复出现且清晰的条带。在同一迁移位点，有条带记1，没有记0。建立0、1数据矩阵。用NTSYSpc Version 2.1中的DICE法计算相似系数，并用SHAN Clustering中的UPGMA法进行聚类分析，绘制聚类分析图。用Popgene分析菌株群体遗传多样性(H)，群体间基因交流数值(Nm)等[24-25]。
2. 结果与分析
2.1 培养性状稳定性比较
来自不同地区、不同杨树上的7个菌株的培养性状稳定性测定结果显示，继代培养(连续培养4代)、培养基营养丰富程度、淀粉含量、pH值(土豆种类)和培养基厚度(10、15、20 mL)等对菌株培养性状的稳定性没有显著影响(图 1)。
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图 1 不同培养条件下菌株性状稳定性比较Figure 1. Stability comparison of strain characters under different culture conditions2.2 培养形态多样性分析
根据106个供试菌株在生长速率、菌落质地、产色素类型、子实体的形态和数量等方面的特征差异，将供试菌株分为4类(图 2)：类型Ⅰ：菌落质地疏松，生长速度快，多呈非辐射状，分泌黄至红色色素，子实体小，数量多；类型Ⅱ：菌落紧致，表面为非辐射状，生长速度多较快，多分泌浅白至淡黄色色素，子实体大，数量少；类型Ⅲ：菌落质地多紧致，生长速度慢，表面形态一般为非辐射状，色素颜色不一，多为淡黄色色素，子实体数量多且小；类型Ⅳ：菌落质地紧致；生长速度较快，表面形态全部为辐射状，多分泌墨绿色色素，子实体数量多。同时通过表观特征赋值(表 2)量化后聚类分析，发现当类间距离为19时将供试菌株分为4类(图 3)，显示与培养性状观察得出的结果类似。各类群内的菌株来自不同的地理位置和寄主种类。如类型Ⅰ中，C80323与C81311的寄主都是毛白杨，前者来自北京海淀，后者来自陕西武功；而ZK-26-2与C80323均采自北京，前者寄主是山杨，后者寄主是毛白杨。但是来自同一地区的菌株却经常以较小的类间距聚为一簇。如来自新疆的X-YS-409、X-YS-433、X-YS-294，以及来自西藏地区的XZ-YS-10、XZ-YS-9、XZ-YS-1、XZ-YS-5都分别聚在一起。
2.3 遗传多样性分析
2.3.1 SRAP及ISSR扩增引物及反应体系
获得SRAP标记引物12对(表 3)：1b、1d、2b、2c、2d、2f、3c、3d、4c、4d、4f、5f，反应体系为：25 μL的混合物中10×Buffer 2.5 μL、dNTP 6.25 μmol、引物各0.4 mol/L、DNA模板20~100 ng、Ex Taq酶(宝生物工程(大连)有限公司)0.4 U/μL，以水补齐。扩增程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min、35 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循环5次；然后94 ℃ 1 min、50 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，循环35~38次，72 ℃ 8 min。扩增产物4 ℃保存。
表 3 SRAP标记引物序列Table 3. Primer sequences of SRAP正向引物(5′-3′)
Forward primer(5′-3′)反向引物(5′-3′)
Reversed primer(5′-3′)1 5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′ a 5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′ 2 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′ b 5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′ 3 5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ c 5′-GACTGCGTACGAATTGAC-3′ 4 5′-TGAGTCCAAACCGGACC-3′ d 5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′ 5 5′-TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ e 5′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′ f 5′-GACTGCGTACGAATTGCA-3′ 获得ISSR标记引物20条(表 4)。反应体系为：25 μL的体系中2×Taq Master Mix(北京康为世纪生物科技有限公司)12.5 μL、引物0.8 mol/L、DNA模板20~100 ng。扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，循环35次；72 ℃ 10 min。扩增产物4 ℃保存。
表 4 ISSR标记引物序列Table 4. Primer sequences of ISSR编号
No.引物序列(5′-3′)
Primer sequence(5′-3′)IQ-1 CGAATTCGACGACGACGA IQ-2 CCAAACCACCACCACCACCA IJ-1 AGAGAGAGAGAGAGAGG IJ-3 AGAGAGAGAGAGAGAGTC IJ-4 GAGAGAGAGAGAGAGATC IJ-5 GAGAGAGAGAGAGAGATG IJ-7 GGGTGGGGTGGGGTG IJ-8 ATAAGAGAGAGAGAGAG IJ-9 AGATGTGTGTGTGTGTG IL-1 GGAGAGGAGAGGAGA IL-3 CACGAGAGAGAGAGAGA IL-5 CTCTCTCTCTCTCTCTT IL-7 ACAACACACACACACAC ID-1 AAAGTGTGTGTGTGTGT ID-2 ATGATGATGATGATG ID-3 ATGATGATGATGATGATG ID-6 AGAAGAAGAAGAAGAAGAAGA ID-7 GTCGTCGTCGTCGTCGTC ID-8 GTGCGTGCGTGCGTGC ID-9 CTCTCTCTCTCTCTCTG 用SRAP标记扩增供试菌株，所得多态性条带比率为95.24%，平均每对引物组合扩增出10.5条，而ISSR分子标记扩增所得多态性条带比率为96.15%，平均每对引物组合扩增出26条。
2.3.2 杨树腐烂病菌群体遗传多样性水平分析
SRAP标记表明，供试菌株的有效等位基因数1.53，Nei's遗传多样性指数0.31，Shannon's多样性指数0.47，而ISSR标记的结果说明其有效等位基因数为1.46，Nei's遗传多样性指数0.28，Shannon's多样性指数0.44。同时结合两种标记所得矩阵结果进行数据分析，得出其有效等位基因数为1.49，Nei's遗传多样性指数0.29，Shannon's多样性指数0.45。两种标记方法都扩增出了丰富的多态性条带，且ISSR标记的条带亮度及有效等位基因数均高于SRAP标记。根据多态性条带的聚类分析得出，SRAP标记的遗传相似系数变化范围为0.41~1.00，ISSR标记的遗传相似系数范围为0.49~0.97，显示出杨树腐烂病菌各菌株间有较大的相似性，但是各菌株间相似系数最小从0.41开始且变化范围较大，表明菌株间存在较大的遗传差异。
2.3.3 杨树腐烂病菌群体遗传结构与分化
群体的遗传多样性变化主要是因为群体内的基因漂变等和群体间的迁移与交流等，即HT=HS+DST(HT表示总体的遗传多样性，HS表示群体内遗传多样性，DST表示群体间遗传多样性)。相对总体的基因迁移率(GST)=DST/HT，群体间基因流的数值(Nm)=0.5[(1/GST)-1]，若Nm≥1，则本地种群趋向于不同，基因漂变占主体位置，Nm＜1，则迁移比基因漂变的影响相对较大[29-30]。
从寄主角度分析，将供试菌株分为白杨派群体、黑杨派群体和青杨派群体，结合ISSR和SRAP两种标记方法分析，结果表明，群体总的遗传多样性为0.27(HT=0.27)，群体内的遗传多样性为0.23(HS=0.23)，可以解释总体多样性的87%，遗传分化系数(GST)为0.13，遗传变异主要存在于群体内。基因流的数值(Nm)为3.34(表 5)。各群体的遗传多样性水平从高到低依次为白杨派群体(h=0.268)，青杨派群体(h=0.267)，黑杨派群体(h=0.169)。
表 5 杨树腐烂病菌群体遗传结构分布Table 5. Population genetic structure of C. chrysosperma项目Item 方法Method HT HS GST Nm 寄主角度Host aspect ISSR 0.253 4 0.216 2 0.147 1 2.899 0 SRAP 0.296 3 0.264 7 0.106 5 4.196 0 ISSR & SRAP 0.269 8 0.234 7 0.130 1 3.344 2 地理Geography aspect ISSR 0.260 8 0.125 1 0.520 5 0.460 7 SRAP 0.309 4 0.147 8 0.522 4 0.457 1 ISSR & SRAP 0.279 4 0.133 7 0.521 3 0.459 1 从地理来源的角度分析，将供试菌株分为北京地区、甘肃地区、宁夏地区、青海地区、陕西地区、辽宁地区、江苏地区、内蒙地区各群体。结合ISSR和SRAP两种标记方法分析，总的群体遗传多样性为0.28(HT=0.28)，群体内的遗传多样性为0.13(HS=0.13)，可以解释总体多样性的48%，遗传分化系数(GST)为0.52，来自群体内和群体间的多样性差异相当(表 5)，来自群体间的差异占比稍大。基因流的数值(Nm)为0.46，群体间的迁移影响较大。各群体的遗传多样性水平从高到低依次为青海群体(h=0.287)，宁夏群体(h=0.224)，甘肃群体(h=0.200)，北京群体(h=0.169)，陕西群体(h=0.115)，辽宁群体(h=0.075)，总体表现为从西到东依次降低的趋势。
2.3.4 聚类结果分析
SRAP和ISSR标记聚类分析结果(图 4)表明，白杨派和青杨派群体遗传距离较小，首先聚集在一起，二者与黑杨派群体差异较大，最后聚类在一起。以地理来源分析来看，所有菌株分为两大组，其中一组由北京、甘肃、青海、宁夏、陕西、辽宁群体组成，另一组由陕西和辽宁地区群体组成，并且第一组中北京地区为一个亚组，而甘肃、青海、宁夏的遗传距离较小，聚集为另一个亚组，这一组的聚类情况说明，地理距离相近的群体间遗传距离较小，但是第二组中陕西地区群体的聚类情况又显示出该地区菌株遗传背景的特殊性。
2.4 形态和分子相关性分析
通过表型性状的欧式距离矩阵和两种标记方法所得的遗传距离矩阵的相关性分析[31-32]发现，二者并不存在明显的相关性。其中表型距离矩阵与SRAP标记所得遗传距离矩阵的相关系数为0.08(P=0.90)，同时表型距离矩阵与ISSR标记所得遗传距离矩阵的相关系数为-0.001(P=0.49)，即表观性状的多样性并不能通过目前所得的遗传距离信息得到充分的解释。
3. 结论与讨论
3.1 形态特征水平的多样性分析
培养性状稳定性试验表明，杨树腐烂病菌同一菌株在不同条件下的培养性状稳定，并且单个菌株培养性状的稳定性为进一步分析群体表观变异和遗传多样多样性提供了基础。菌株的培养形态多样性结果说明，不同菌株的培养形态差异明显，且各类别间菌株的培养性状与寄主植物、地理来源没有明显相关性，其聚类分析结果与张星耀等[8]关于该菌的营养体亲和性的研究得出的亲和性与地理来源没有关系的结果具有一定的一致性。根据菌株培养形态和致病力之间的相关性[33]，在防治的过程中应结合当地菌株特性选取合适的药剂种类和浓度，避免采取统一的措施大面积均一化的防治。
3.2 分子水平的多样性分析
相较于形态标记、细胞标记和生化标记，分子标记得到了广泛的应用[8, 20]。本研究采用ISSR和SRAP所分析出的两组数据说明，ISSR标记多态性条带更丰富，所得观察等位基因数更高，可能比SRAP标记更适合于揭示该类真菌的遗传多样性。另外，两种标记方法对菌株基因组的覆盖率较高，可以更全面的说明其多样性。
腐烂病菌菌株的遗传变异主要存在与群体内，菌株在寄主水平的遗传分化程度较低。来源于不用杨树派系的群体内和群体间的多样性差异相当，并且迁移对总体的遗传分化产生了较大的影响。根据Nybom[34]对307份植物分子标记的相关研究，r对策的群体遗传多样有其自身的特点：1年生(HS=0.13)、广泛分布(HS=0.22)、混交(HS=0.18)，而k对策的为：多年生(HS=0.20~0.25)、局域性分布(HS=0.20~0.21)、杂交(HS=0.27)，本文中地理组的HS=0.13，符合真菌的生命周期类似于植物中的r对策者的遗传特征。
同时比照影响种群遗传结构与分化的因素分析即：突变、基因流、遗传漂变、繁殖特征、自然和人为干扰[34-35]。漂变对数量较小的种群的影响较大，但金黄壳囊孢菌分布广泛，并且一旦定殖扩展迅速，数量庞大，故漂变对该菌的影响较小。该菌地域分布广泛，可能造成群体遗传分化的增加，但其孢子主要靠风雨传播，导致群体分化减小，而本文对于群体结构分析的结果得出Nm值小于1，加之来自群体间的变异占比较大，说明群体间的交流较多，基因流较大，地域隔离对基因流造成了主要的影响。造成该菌遗传特征的最主要的因素还应该是其本身的繁殖扩展策略，金黄壳囊孢菌是一种弱寄生菌，主要通过各种伤口侵染树势衰弱的植株，对寄主的选择性不强，寄主范围广，增加了各群体间遗传多样性的丰富程度；同时，病原菌的繁殖以无性为主，减少了多样性大量丧失的可能，且该菌存在有性生殖的过程，经过遗传物质的重组又提高了群体的遗传分化；另外半个多世纪以来，随着交通的便利和贸易的频繁，病原菌随寄主的迁移及人为的传播可能极大的促进了菌株本身的传播和菌株间基因的交流，也可能增强了遗传多样性的丰富程度。
与此类真菌遗传特征形成对比的是许多专性寄生菌，由于寄主的限制，专性寄生菌表现为群体内遗传多样性大于群体间[22]。如，Chen等[35]关于中国小麦条锈菌分子群体遗传结构的研究表明，遗传分化主要来自于群体内，且西北-川西北越夏区是中国小麦条锈菌遗传多样性最为丰富的地区，即为病原菌遗传多样性的中心区域，东部地区最低。金黄壳囊孢菌主要营弱寄生生活，两类真菌从生活策略上存在着很大的差异，专性寄生菌对寄主变化的响应更大一些，而金黄壳囊孢菌更注重种群的扩张，因此地理跨度对其影响可能更大。
然而在培养形态多样性的研究中采用赋值聚类的方法，可能使某些本身不同类的性质，如色素、子实体数量等以简单的数字量化后直接运算造成结果产生一定的偏差，但这并不影响试验结果的趋势以及后续分析。
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