Characteristics of pollen germination and pollen tube growth in Salix viminalis in vitro
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摘要: 为明确蒿柳的花粉萌发特征，采用花粉离体培养法，研究了不同温度、光照和培养基对蒿柳花粉萌发的影响。结果表明：培养温度和光照强度均影响蒿柳花粉萌发率和花粉管长度，20~25 ℃是蒿柳花粉萌发的最适温度区间，1 500和2 000 lx是蒿柳花粉萌发的最佳光照强度。正交试验中，一定质量浓度的蔗糖、H3BO3及pH值均可显著影响蒿柳花粉萌发，3个因子最佳组合为蔗糖100 g/L、H3BO3 200 mg/L，pH5.0，在光照强度为1 000 lx，温度为25 ℃时，萌发率高于48.8%。利用试验筛选出的蒿柳花粉最佳离体培养组合培养花粉，并与花粉在柱头上活体萌发相比较，二者花粉管长度无显著差异。Abstract: In this study, effects of temperature, light intensity and culture medium on the pollen germination were investigated through in vitro culture in Salix viminalis. The results showed that the pollen germination and pollen tube growth of S. viminalis could be affected by culture temperature and light intensity. The optimum temperature range for pollen germination was 15-25 ℃, and the highest germination rates were obtained under the light intensity of 1 500 and 2 000 lx. The concentration of sucrose, H3BO3 and the pH value of culture medium could remarkably promote pollen germination at a certain range based on orthogonal design. The optimal culture condition was: basal medium supplemented with 100 g/L sucrose and 200 mg/L H3BO3 with a pH value of 5.0. The rate of pollen germination reached 48.8% under the conditions of 1 000 lx and 25 ℃. There were no significant differences in the pollen germination between in vitro which used basal medium supplemented with 100 g/L sucrose and 200 mg/L H3BO3 with a pH value of 5.0 and pollen germination on stigma.
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Keywords:
- Salix viminalis /
- pollen /
- in vitro germination /
- germination rate /
- pollen tube
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蒿柳(Salix viminalis)为柳属蒿柳组灌木，主要分布在北半球高纬度地区，是重要的能源、蜜源树种及沼泽地带的先锋树种[1]。目前，关于蒿柳的研究主要集中在群体遗传多样性、污染治理和能源林建设等方面[2-5]，且研究材料多以自然群体或无性繁殖的扦插材料为主。为解决能源短缺问题，瑞典等国家很早就开展了以蒿柳为主要树种的能源柳育种工作，虽然获得了一些优良的能源柳品种，但由于大部分蒿柳品系都是瑞典起源的，杂交后代已出现衰退现象[1-6]。我国地域广阔，具有丰富野生蒿柳资源，但由于蒿柳为雌雄异株植物，雌、雄花开放时间不同步，且不同地理居群的蒿柳间的杂交亲和性有差异[2]。目前，我国蒿柳资源多处于野生状态，利用天然优株进行杂交育种的工作亟待开展。花粉是植物的雄配子体，在有性生殖中具有重要作用[7]，研究花粉萌发特性是了解植物有性生殖，进行杂交育种的前提。因此，进行蒿柳花粉离体萌发特性研究，对深入开展能源柳育种工作具有重要意义。
培养条件(温度、光照、pH值等)和培养基组分(蔗糖、H3BO3、激素、Ca2+ 等)对花粉离体萌发均有影响，但不同植物花粉所需的最佳培养条件及浓度范围存在一定差异。如黄连木(Pistacia chinensis)花粉生长的最适温度为25 ℃，最适蔗糖浓度为15%[8]；枣(Ziziphus jujuba)花粉在15.0 mg/L H3BO4+5.0 mg/L IAA+10.0 mg/L GA3的培养基上萌发率达到了90.23%[9]；小黑杨(Populus simonii×P. nigra)花粉萌发最适培养基为150 g/L蔗糖+20 mg/LH 3BO3+40 mg/LCaCl2[10]；梨(Pyrus pyrifolia)花粉在30 mmol/L MES缓冲液中添加0. 01%硼酸，0.03% CaCl 2·2H2O，15% PEG-4000，10%蔗糖，pH值在6.5左右的条件下的萌发率为59.2%，花粉管长度为966.3 μm[11]；核桃(Juglans regia)花粉萌发和花粉管生长的最适培养基为20%蔗糖+0.02%~0.03%的硼酸+0.05%Ca(NO3)2，最佳培养条件为25 ℃，24 h后花粉萌发率达74.46%[12]；月季(Rosa chinensis)花粉萌发的适宜条件为20%蔗糖+50~100 mg/L硼酸+100~200 mg/L Ca(NO3)2[13]。适宜的萌发条件可以提高花粉的萌发率和花粉管的伸长速度，显著增加授粉效率和座果率，加快育种进程[14]，Stanley等[15]认为离体萌发与在柱头萌发时的花粉活力是否接近，是判断花粉离体萌发条件及培养基成分最为可靠的方法。本实验研究蒿柳花粉离体萌发的培养条件及培养基组分对花粉萌发率和花粉管生长的影响，并与花粉在柱头萌发情况相对比，获得蒿柳花粉萌发的最佳培养条件和培养基组分，可为蒿柳的科学授粉和杂交育种奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
中国林业科学研究院玉泉山苗圃栽种的蒿柳，在雄花序处于半开或全开状态时采集花粉带回实验室立即培养。
1.2 方法
1.2.1 温度和光照对蒿柳花粉萌发的影响
采用单因子实验设计，采集成熟蒿柳花粉，用仅含有2%琼脂粉的固体培养基培养花粉，温度处理设5、10、15、20、25、30和35 ℃共7个梯度，光照强度均为1 500 lx；光照强度处理设0、300、600、900、1 200、1 500和2 000 lx共7个梯度，培养温度均为20 ℃。
1.2.2 培养基成分对蒿柳花粉萌发的影响
采用正交实验设计，2%琼脂粉的固体培养基中添加不同质量浓度的蔗糖、H3BO3并调整培养基的pH值，光照强度1 000 lx，培养温度25 ℃，设计3因素3水平L9(34)正交试验，共9个组合。
1.2.3 花粉萌发率统计及花粉管长度测量
所有处理的花粉培养时间均为4 h，然后在ZEISS Axio lmager A1光学显微镜下统计花粉萌发率，测量花粉管长度。萌发率=(萌发的花粉数/总的花粉数)×100%，花粉管长度用软件自带标尺测量。每处理重复3次，每次观察1个载玻片，每个载玻片观察3个视野，每个视野花粉粒不少于30粒。
1.2.4 花粉在柱头上萌发
选取处于全开状态的雌花序进行人工授粉，于授粉后1、2、3和4 h取整个雌花序在FAA固定液中固定24 h，50 mmol/L的偏磷酸钾溶液冲洗3次，然后用4 mol/L的NaOH透明和软化24 h，蒸馏水多次换水浸泡除净NaOH，转移到0.1%水溶性苯胺蓝染液中染色4 h。用镊子从花序上取小花(子房)，放在载玻片上，用滤纸吸出染液，滴一滴甘油，盖上盖玻片，轻轻敲压盖玻片，使花柱展开，最后在荧光显微镜观察，拍照。
1.3 数据统计及处理
采用SPSS19.0对数据进行处理并进行LSD显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 温度对蒿柳花粉萌发的影响
表 1显示，在5~35 ℃范围内，随着培养温度的升高，花粉萌发率先上升后下降。培养温度为5和35 ℃时，花粉萌发率均低于10%，与其他培养温度下的差异显著(P＜0.05)；培养温度为20和25 ℃时的蒿柳花粉萌发率分别为72%和64.9%，与其他培养温度下的萌发率相比差异显著(P＜0.05)。蒿柳花粉管长度的变化与萌发率变化一致，随着培养温度的升高，花粉管长度先上升后下降。培养温度为20和25 ℃时，花粉管长度分别为306.32和301.18 μm，伸长速度均大于75 μm/h，与其他温度下的长度和伸长速度差异显著(P＜0.05)。结果表明，温度影响蒿柳花粉萌发及花粉管伸长，15~25 ℃时，蒿柳花粉萌发率较高，而20~25 ℃为蒿柳花粉萌发的最适温度区间，培养温度过高或过低，均不利于蒿柳花粉萌发。
表 1 温度对蒿柳花粉萌发的影响Table 1. Effects of different temperatures on the pollen germination of S. viminalis温度
Temperature/℃萌发率
Germination rate/%花粉管长度
Pollen tube length/μm5 4.8±2.25d 19.76±1.94d 10 20.2±8.11c 44.92±4.80c 15 42.1±5.85b 160.64±13.28b 20 72.0±4.90a 306.32±12.82a 25 64.9±1.64a 301.18±25.62a 30 22.9±2.05c 53.68±7.36c 35 8.3±1.65d 29.46±7.16d 2.2 光照强度对蒿柳花粉萌发的影响
表 2显示，在黑暗和300 lx光照强度时，蒿柳花粉萌发率分别为15.16%和11.27%，显著低于其他光照强度下的萌发率；光照强度为1 500 lx时，蒿柳花粉萌发率最高为64.14%，与2 000 lx的萌发率差异不显著，与其他光照强度下的萌发率差异显著(P＜0.05)。光照强度低于1 200 lx时，蒿柳花粉管平均长度为182.07~227.31 μm，各处理间无显著差异；光照强度为1 500和2 000 lx时的花粉管长度分别为325.95和320.77 μm，伸长速度均大于75 μm/h，显著大于其他处理的长度和伸长速度(P＜0.05)。结果表明，光照强度影响蒿柳花粉萌发率和花粉管伸长速度，低于1 200 lx不利于花粉萌发，1 500和2 000 lx是蒿柳花粉萌发的最佳光照强度。
表 2 光照强度对蒿柳花粉萌发的影响Table 2. Effects of light intensity on the pollen germination of S. viminalis光照强度
Light intensity/lx萌发率
Germination rate/%花粉管长度
Pollen tube length/μm0 15.16±2.01e 198.70±15.66b 300 11.27±3.91e 182.41±12.83b 600 36.63±4.35d 182.07±16.90b 900 43.07±2.50c 199.45±16.39b 1 200 52.00±6.14b 227.31±17.71b 1 500 64.14±0.84a 325.95±15.30a 2 000 59.85±2.26a 320.77±15.58a 2.3 培养基成分对蒿柳花粉萌发的影响
将蔗糖、硼酸及pH值3个因素进行L 9(34)正交实验(表 3)。对表 3中数据进行方差分析。结果表明，3个因子均对蒿柳花粉萌发具有显著的影响：蔗糖F=3.268，P＜0.05，H3BO3的F=37.368，P＜0.05，pH值的F=91.427，P＜0.05。极差分析显示，3因素对蒿柳花粉萌发的影响为：pH>H3BO3>蔗糖。正交实验平方和比较分析的结果表明：蔗糖各种质量浓度下的花粉萌发率以100 g/L最高，H3BO3以200 mg/L最高，pH值以5.0最高，由此推论3个因子最佳组合为蔗糖100 g/L、H3BO3 200 mg/L和pH 5.0。
表 3 正交实验组合对蒿柳花粉的萌发率及花粉管长度的影响Table 3. Pollen germination rate and tube length of S. viminalis in orthogonal design experiment处理编号
Treatment No.蔗糖
Sucrose/(g·L-1)H3BO3/(mg·L-1) pH 萌发率
Germination rate/%花粉管长度
Pollen tube length/μm1 50 100 5.0 40.70±5.86b 257.25±15.27b 2 50 200 7.0 17.64±3.77d 57.75±12.36e 3 50 500 9.0 3.63±0.72e 41.00±9.43f 4 100 100 7.0 22.18±0.69cd 102.44±8.64d 5 100 200 9.0 29.29±4.02c 142.32±17.10c 6 100 500 5.0 26.66±3.14c 146.20±9.93c 7 150 100 9.0 3.33±2.18e 28.66±4.90f 8 150 200 5.0 48.80±4.20a 288.50±13.50a 9 150 500 7.0 7.39±0.52de 59.85±7.18e 2.4 蒿柳花粉离体萌发与柱头萌发比较
利用单因素和正交实验筛选的最佳培养组合，培养蒿柳花粉，分别在培养1、2、3和4 h时取样，测量花粉管长度。由图 1、2结果所示，蒿柳花粉在适宜条件下可迅速萌发，柱头授粉1 h时，已有大量花粉黏附在柱头上(图 2A)，表明花粉已经开始萌发，花粉管平均长度为48.07 μm；而离体培养1 h时，花粉吸水膨胀，部分花粉已伸出花粉管，花粉管平均长度45.83 μm(图 2E)，与柱头萌发相比无显著差异。柱头授粉2、3和4 h时，花粉管不断生长，长度分别为85.42、224.46和320.19 μm，而同时期离体培养的花粉管长度分别达到了90.34、202.65和314.88 μm，相同时间的离体与柱头萌发差异不显著。结果表明，本实验筛选的蒿柳花粉萌发培养条件接近于在柱头萌发的活体状态，适合蒿柳花粉的萌发。
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图 1 蒿柳花粉离体萌发与柱头萌发的花粉管长度比较Figure 1. Pollen germination length of S. viminalis both in vitro and in vivo![]()
图 2 蒿柳花粉离体萌发与柱头萌发过程A~D分别为花粉在柱头萌发1、2、3、4 h的状态和过程，40×；E~H分别为花粉离体萌发1、2、3、4 h的状态和过程，E、H为100×，F、G为200×。Figure 2. Pollen germination process and stigma germination of S. viminalis both in vitro and in vivoA-D, Pollen germination state and process in vivo at 1, 2, 3, 4 hours respectively, 40×; E-H, Pollen germination state and process in vitro at 1, 2, 3, 4 hours respectively, E and H, 100×, F and G 200×.3. 讨论与结论
温度是影响花粉萌发率的重要因素，许多研究指出[16-18]，25 ℃是大多植物花粉萌发的最适温度，但分布于不同地区的植物，其花粉最适萌发温度差异明显。油橄榄(Olea europaea)花粉萌发的适宜温度范围为25~30 ℃，低于10 ℃不萌发，而高于35 ℃萌发率下降[19]；董易等[20]报道，荷兰水仙(Narcissus pseudonarcissus)花粉的最适萌发温度为20 ℃；而与蒿柳同属杨柳科(Salicaceae)的小黑杨花粉萌发的最适温度为21 ℃[10]；由于不同地域的菊花(Chrysanthemum morifolium)长期适应各自区域的气候特点，导致花粉对温度的响应不同。低温或高温下花粉的萌发率均下降，低温下花粉代谢过程中酶活力下降，膜流动性下降，代谢速率降低，抑制了花粉的萌发[21]；而高温下，花粉失水速度加快，含水量降低，花粉代谢过程中一些对温度敏感的酶活性受高温钝化失活，膜完整性被破坏，代谢速率下降，抑制花粉萌发[22]。蒿柳多分布在北半球高纬度地区，花期在4—5月，此时该区域的最高温度一般在15~25 ℃，本实验也表明，温度区间为15~25 ℃时蒿柳花粉萌发率较高，这是蒿柳长期适应分布区的气候特点的结果。
关于光照与花粉萌发的关系至今尚无一致结论。杨中汉等[23]认为，照光不仅能促进兰州百合(Lilium davidii)花粉的萌发也促进花粉管的伸长。郭思佳等[24]也发现，各居群有斑百合(L. concolor var. ulchellum)在太阳光下散粉萌发率最高，在日光灯下散粉萌发率降低近一半，在室内散射光散粉花粉的萌发率最低。与此相反，徐进等[25]报道，在黑暗条件下，马尾松(Pinus massoniana)花粉发芽率较其他光照条件下高，但它们的差异未达到显著水平。许珂等[26]也发现，在弱光(0.562 5 μmol/(s·m2))与黑暗下培养，金银忍冬(Lonicera maackii)花粉的萌发率无明显变化，但黑暗条件更利于花粉管的生长。光照能为植物提供更多的能量，提高植株温度，使一些酶的活性(比如G蛋白)升高，调节细胞外钙调素启动花粉萌发和花粉管伸长，促进花粉管伸长[27]。本研究发现，蒿柳花粉萌发率及花粉管长度均受到光照强度的影响，且在一定范围内，光照强度越大，花粉萌发率越高，花粉管伸长速度越快，低于1 200 lx不利于花粉萌发，1 500~2 000 lx是蒿柳花粉萌发的最佳光照强度，本实验未就高于2 000 lx的光照强度对蒿柳花粉萌发情况进行研究。
花粉离体培养一般在培养基上进行，培养基组分如蔗糖、硼酸及pH值等均影响花粉萌发。蔗糖作为植物生长的重要的能源物质和渗透调节物质，在花粉萌发和生长过程中具有重要作用，15%的蔗糖利于黄连木花粉的萌发和生长[8]；10%的蔗糖或葡萄糖适宜梨花粉萌发，蔗糖浓度过低或过高对花粉的萌发和花粉管生长不利[11]。蔗糖浓度过低时，花粉细胞破裂，细胞内容物散出，浓度过高会造成花粉细胞的质壁分离，抑制花粉萌发生长。本实验中蔗糖浓度为10%时，蒿柳花粉萌发率显著高于其他浓度，与上述研究结果一致。
培养基中添加一定浓度硼酸有利于花粉萌发和花粉管的生长。尚宏芹[28]研究发现，20 mg/L的硼酸对两种芍药花粉萌发具有显著促进作用。李旭新等[8]报道，硼酸处理浓度为100 mg/L 时，黄连木花粉萌发率和花粉管生长均达最大值，硼酸浓度继续升高，花粉萌发率和花粉管生长反而显著下降。韩志强等[29]对不同营养元素及其配比对枣花粉萌发与花粉管生长的影响进行研究后得出，20 mg/L的硼酸是促进花粉管生长最适宜质量浓度，本实验在硼酸对蒿柳花粉萌发的研究中也得出了相似的结论。
培养基pH值影响花粉萌发，适合的花粉离体培养基多为弱酸性，果梅花粉离体萌发培养基的适宜pH值为6.5[30]；芍药(Peaonia lactiflora)花粉生长的最适pH值为6~7[28]；培养基pH值为6.5时，促进梨花粉萌发及花粉管生长[11]。本实验结果表明，在pH值为5.0时，蒿柳花粉的萌发率和花粉管长度最高，虽略低于上述研究结果，但在实验筛选的培养条件下，蒿柳花粉离体萌发与柱头萌发无显著差异。提高培养基的pH值是否会进一步促进蒿柳花粉萌发率和花粉管伸长，由于本实验设置的pH值间隔偏大，无法更加精确地判断影响蒿柳花粉萌发的最适pH值，这还需要进一步细化研究。
综上所述，蒿柳花粉离体萌发受到光照、温度等环境因素及培养基的影响。利用筛选出的蒿柳花粉最佳离体培养组合，即利用pH值为5.0的含有蔗糖100 g/L和H3BO3 200 mg/L的培养基，在培养温度为20 ℃，光照强度为1 500 lx的培养条件下培养花粉，并与花粉在柱头上活体萌发相比较，二者花粉管的伸长无显著差异。
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图 1 蒿柳花粉离体萌发与柱头萌发的花粉管长度比较
Figure 1. Pollen germination length of S. viminalis both in vitro and in vivo
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图 2 蒿柳花粉离体萌发与柱头萌发过程
A~D分别为花粉在柱头萌发1、2、3、4 h的状态和过程，40×；E~H分别为花粉离体萌发1、2、3、4 h的状态和过程，E、H为100×，F、G为200×。
Figure 2. Pollen germination process and stigma germination of S. viminalis both in vitro and in vivo
A-D, Pollen germination state and process in vivo at 1, 2, 3, 4 hours respectively, 40×; E-H, Pollen germination state and process in vitro at 1, 2, 3, 4 hours respectively, E and H, 100×, F and G 200×.
表 1 温度对蒿柳花粉萌发的影响
Table 1 Effects of different temperatures on the pollen germination of S. viminalis
温度
Temperature/℃萌发率
Germination rate/%花粉管长度
Pollen tube length/μm5 4.8±2.25d 19.76±1.94d 10 20.2±8.11c 44.92±4.80c 15 42.1±5.85b 160.64±13.28b 20 72.0±4.90a 306.32±12.82a 25 64.9±1.64a 301.18±25.62a 30 22.9±2.05c 53.68±7.36c 35 8.3±1.65d 29.46±7.16d 
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表 2 光照强度对蒿柳花粉萌发的影响
Table 2 Effects of light intensity on the pollen germination of S. viminalis
光照强度
Light intensity/lx萌发率
Germination rate/%花粉管长度
Pollen tube length/μm0 15.16±2.01e 198.70±15.66b 300 11.27±3.91e 182.41±12.83b 600 36.63±4.35d 182.07±16.90b 900 43.07±2.50c 199.45±16.39b 1 200 52.00±6.14b 227.31±17.71b 1 500 64.14±0.84a 325.95±15.30a 2 000 59.85±2.26a 320.77±15.58a
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表 3 正交实验组合对蒿柳花粉的萌发率及花粉管长度的影响
Table 3 Pollen germination rate and tube length of S. viminalis in orthogonal design experiment
处理编号
Treatment No.蔗糖
Sucrose/(g·L-1)H3BO3/(mg·L-1) pH 萌发率
Germination rate/%花粉管长度
Pollen tube length/μm1 50 100 5.0 40.70±5.86b 257.25±15.27b 2 50 200 7.0 17.64±3.77d 57.75±12.36e 3 50 500 9.0 3.63±0.72e 41.00±9.43f 4 100 100 7.0 22.18±0.69cd 102.44±8.64d 5 100 200 9.0 29.29±4.02c 142.32±17.10c 6 100 500 5.0 26.66±3.14c 146.20±9.93c 7 150 100 9.0 3.33±2.18e 28.66±4.90f 8 150 200 5.0 48.80±4.20a 288.50±13.50a 9 150 500 7.0 7.39±0.52de 59.85±7.18e
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