Field control efficiencies of three systemic insecticides on Anoplophora glabripennis larvae
-
摘要: 为了筛选高效低毒杀虫药剂，防治光肩星天牛幼虫，本次试验选用的被害树种为馒头柳，采用树干输液法，选用氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和吡虫啉3种内吸性杀虫剂进行林间防治试验。3种杀虫剂的质量浓度分别设为：氯虫苯甲酰胺2、4、8 g/L，氟虫双酰胺0.6、1.2、2.4 g/L，吡虫啉2.8、5.6、11.2 g/L。结果发现，氯虫苯甲酰胺、氟虫双酰胺和吡虫啉对幼虫的防治效果分别为37.7%~54.5%、41.9%~66.0%和59.1%~86.4%。防治后，氯虫苯甲酰胺和氟虫双酰胺处理组的树干上无新产卵刻痕，吡虫啉处理组的树干上，有新产卵刻痕的株数占总株数的1/7，产卵刻痕密度为0.57个/株；对照组树干中，有新产卵刻痕的株数占总株数的50%~60%，产卵刻痕密度为2.0~2.2个/株。说明这3种杀虫剂对光肩星天成虫产卵行为具有不同程度的驱避作用。因此，这3种内吸性杀虫剂对光肩星天牛虫口密度的有效控制及降低其对林木的危害具有潜在价值。Abstract: In order to select efficient and low toxicity insecticides for controlling the Asian long-horn beetle (ALB), Anoplophora glabripennis larvae, Salix matsudana var. matsudana f. umbraculifera (SMM) was selected in this test since it was one of the damaged tree species by ALB. A series of toxicity tests with following three systemic insecticides were taken by SMM trunk infusion at three mass concentrations each: chlorantraniliprole (2, 4, 8 g/L), flubendiamide (0.6, 1.2, 2.4 g/L) and imidacloprid (2.8, 5.6, 11.2 g/L) against A. glabripennis larvae in the field. Our results showed that the overall control efficiencies of chlorantraniliprole, flubendiamide and imidacloprid on the larvae were 37.7%-54.5%, 41.9%-66.0% and 59.1%-86.4%, respectively. After prevention, there was no new oviposition pit on the trunks treated with chlorantraniliprole or flubendiamide, and there were new oviposition pits on one-seventh of the total trunks treated with imidacloprid, there were new oviposition pits on 50%-60% of the total trunks in the control group, and the oviposition pit densities were 2.0-2.2 pits per tree. The results showed that these three systematic insecticides had repellent effects on oviposition behavior of adults in different levels. Therefore, these systemic insecticides are potentially useful in effectively controlling ALB population densities and reducing their damages to forests.
-
松栎柱锈菌(Cronartium orientale)是导致樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)、兴凯湖松(Pinus takahasii)和马尾松(Pinus massoniana)等2针松瘤锈病的森林有害生物，是一种转主寄生菌，其春孢子阶段寄生在松树枝干部[1-2]。当松树被松栎柱锈菌侵染致病后，其病原菌就会长期寄生在松树枝干部，并且病部肿瘤会逐年增大，给林分健康和林木生长造成极大危害[3]。黄酮类化合物具有较高的生物活性，是一种强抗氧化剂，能有效清除自由基从而延缓衰老和阻止细胞衰老、癌变，对人类心脑血管疾病也有很好的治疗和预防效果，具有较高的医疗和保健作用[4-8]。已有较多研究成果表明松科植物树皮与松针中黄酮类化合物含量丰富，具有较好的开发利用潜力[9-10]。国内学者如李石清等对南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)枝叶总黄酮的研究、冯慧英等对巴山冷杉(Abies fargesii)总黄酮的研究、王飞等对青扦(Picea wilsonii)针叶总黄酮的研究等均表明其易提取且具有较强的抗氧化能力[11-13]。
担子菌门(Basidiomycota)的许多菌类代谢产物已经被开发利用，关于担子菌的研究已经成为当代生命科学、食品科学和医药领域的热点[14-15]。锈菌目(Uredinales)隶属于担子菌门，目前却尚未发现任何关于锈菌目真菌开发利用的研究，这也表明我们对于锈菌目真菌的潜在价值知之甚少。本研究选择了锈菌目中寄生在松科植物上的易于采集的松栎柱锈菌春孢子为研究对象，进行了松栎柱锈菌春孢子黄酮类化合物(以下简称CQF)的提取与体外抗氧化活性的研究，旨在为锈菌目菌物开发利用、森林有害生物开发利用和提升与拓宽森林有害生物防治理念提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1 研究材料与预处理
松栎柱锈菌春孢子于2015年5月中旬采自大兴安岭地区，过80目筛后于45℃烘干至恒质量，密封冷藏。所用试剂盒均购自南京建成生物研究所；芦丁标准品，购自上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯；KQ-600B型超声波仪，昆山市超声波仪器有限公司；分析天平(感应量0.0001g)；Gene Quant 1300型分光光度计，美国GE公司。
2.2 测定波长的选择与标准曲线的建立
精密称取芦丁标准品10.0mg，使用体积分数为75%的乙醇溶液配制成50mL 0.2mg/mL的标准溶液。取上述标准溶液稀释为质量浓度为0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20mg/mL的芦丁溶液，分别吸取5mL上述各质量浓度芦丁溶液，置于1，2，3，4，5，6，7，8，9号共9支25mL容量瓶中，分别加入5%亚硝酸钠(NaNO2)溶液1.0mL，摇匀后室温下静置6min，再分别加入10%硝酸铝(Al(NO3)3)溶液1.0mL，摇匀后室温下静置6min，再加入1mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液8mL，用75%乙醇溶液定容至25mL。显色15min后取5号容量瓶进行紫外全波长扫描，以确定吸收峰。用蒸馏水调零后在300~900nm范围内的扫描，截取其在400~650nm范围内的吸光度变化示意图，结果如图 1所示。可知经过本方法处理过的黄酮类化合物在500~520nm处出现了明显的吸收峰，因此判断本方法能够用于CQF的测定。为减小红移和蓝移对检测结果的影响，选择510nm作为测定波长。
不同质量浓度芦丁标准品溶液按照本方法操作后，在510nm处测定各质量浓度对应的吸光度A，以芦丁标准品质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度A值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图 2所示。标准曲线的回归方程为y=2.5617x-0.001，回归方程的相关系数R2=0.9995，说明该检测方法可行，所得回归方程能够用来测定CQF质量浓度。
2.3 单因素试验
设定松栎柱锈菌春孢子黄酮类化合物的初始提取条件为：提取温度A=40℃、料液比B=1:40、提取时间C=1h、乙醇体积分数D=50%(v/v)；每次试验所用春孢子粉200mg；超声频率40kHz，超声功率600W。将所得提取液5000r/min离心8min，吸取上层清液按照2.2的方法进行测定样品吸光值A。根据2.2中所得芦丁标准曲线：y=2.5617x-0.001推算CQF提取液中CQF的质量浓度，并通过式(1)计算CQF的得率。采用控制变量法依次考察该提取条件下上述4个单因子对CQF得率的影响。
T=NnVm×100% (1) 式中：T为CQF得率，%；N为根据标准曲线计算出的CQF的质量浓度，mg/mL；n为稀释倍数；V为提取液的体积，mL；m为供试春孢子质量，mg。
2.4 得率建模试验
在单因子考察试验基础上，根据中心组合实验(central composite design)原理使用软件Design-Expert 8.0.6对提取温度(A)，料液比(B)，提取时间(C)，乙醇体积分数(D)这4个因子较优的水平进行了CQF得率的响应面建模试验。完成建模试验后使用建模试验数据建立CQF得率关于以上4个影响因素的二次多项式回归方程数学模型，对所得模型及各个影响因子进行方差分析。通过软件Design-Expert 8.0.6与所得数学模型得出最优CQF提取条件，并验证优化结果。建模试验各因素水平与实际值对应关系见表 1。
表 1 建模试验因子水平表Table 1. Factors and levels of flavonoid extraction experiment水平
Level影响因子Influencing factor 温度Temperature(A)/℃ 料液比Solid-liquid ratio(B)/(g·mL-1) 时间Time(C)/min 乙醇体积分数
Ethanol contentration(D)/%-2 35 1:100 20 50 -1 45 1:120 30 60 0 55 1:140 40 70 1 65 1:160 50 80 2 75 1:180 60 90 2.5 CQF抗氧化能力测定
除CQF的还原力与DPPH·清除能力之外，清除超氧阴离子(O2-·)活性、清除羟基自由基(·OH)活性和总抗氧化活性均采用从南京建成生物研究所购买的对应的试剂盒测定，并严格按照试剂盒使用说明执行。本文所有CQF体外抗氧化活性测定实验均以抗坏血酸(Vc)做阳性对照，用以评价CQF的体外抗氧化活性。
2.5.1 CQF还原力测定
用体积分数为50%的乙醇溶液将在建模试验中所收集的CQF溶液稀释为原来质量浓度的0.2、0.4、0.6、0.8和1.0倍，分别向装有1.0mL各质量浓度CQF溶液的试管中加入0.2mol/L的pH 6.6的磷酸缓冲溶液2.5mL，快速混匀后加入质量分数1%的铁氰化钾溶液2.5mL并在50℃下水浴20min。迅速冷却反应液并加入质量分数10%的三氯乙酸溶液2.5mL，充分混匀，3000r/min离心10min后取上清液3mL，依次加入3mL蒸馏水和1.0mL的0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀后静置10min，于700nm波长下测定溶液吸光度。吸光度越大还原能力也越大，计算公式如(2)。
A700=A样品−A空白 (2) 2.5.2 DPPH·清除能力测定
用95%乙醇溶液配置DPPH·浓度为0.2mmol/L的乙醇溶液，置于冰箱中避光冷藏备用。测定方法：测定管用2mL DPPH·乙醇溶液中加入2mL各质量浓度的CQF样品溶液，CQF质量浓度设置梯度与2.5.1相同。对照管用95%乙醇代替DPPH·溶液；空白管用蒸馏水代替CQF溶液。混匀器混匀后避光反应30min。波长调至517nm处用0.5mL蒸馏水和2.5mL 95%的乙醇调零，然后测定反应液吸光值A，每个质量浓度设置3个平行实验，结果取平均值。DPPH·自由基的清除率通过公式(3)计算得出。
DPPH⋅清除率=A0−(A1−A2)A0×100% (3) 式中：A0为2mL DPPH·乙醇溶液+2mL超纯水的吸光值；A1为2mL DPPH·乙醇溶液+2mL样品溶液后的吸光值；A2为2mL样品溶液+2mL超纯水的吸光值。
3. 结果与分析
3.1 单因子试验
3.1.1 乙醇体积分数对CQF得率的影响
由图 3可知，在其他影响因子不变的条件下，乙醇体积分数在50%~90%范围内变化导致CQF的得率先逐渐增大，当乙醇体积分数增至70%的时候，得率最大，但是仍然不足0.5%。当乙醇体积分数超过70%以后，随着体积分数的增加导致CQF得率骤降并逐渐趋于稳定。黄酮类化合物难溶于水，易溶于有机溶剂，水和乙醇可以以任意比例互溶。在水中加入不同量的乙醇，溶液的极性也随之不同，因而对某种或某类物质的溶解能力也不相同。根据所得实验结果绘制的折线图可以看出乙醇体积分数为70%是较优水平。
![]()
图 3 乙醇体积分数对黄酮类化合物(CQF)得率的影响Figure 3. Effects of ethanol concentration on extraction rate of flavonoids3.1.2 料液比对CQF得率的影响
根据图 4可以看出在其他条件不变的情况下，随着料液比的减小，CQF得率在不断升高，并逐渐趋于平稳，在料液比达到1:140以后，CQF得率增长幅度变小，得率增幅减小，因此选择1:140为较优水平。这一结果与CQF在50%乙醇溶液中的溶解度相关，当料液比较大时，CQF只有少部分溶于了乙醇溶剂，此时的提取液处于一种近饱和状态；随着提取液的增多，也就是料液比减小，未溶出的CQF部分也逐渐溶出，导致CQF的得率上升。当料液比减小到一定程度时，能溶于50%乙醇溶液的部分溶解殆尽，所以这时的得率逐渐趋于稳定，靠近极值。
![]()
图 4 料液比对CQF得率的影响Figure 4. Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids3.1.3 提取温度对CQF得率的影响图
在其他试验条件不变的条件下，考察了温度在15~75℃之间变化对CQF得率的影响，通过考察发现CQF得率先随着温度升高而增大，随着温度升高至65℃以后又逐渐降低。当提取液温度较低时，分子获得的能量相对较少，分子运动缓慢，有效提取CQF耗费的时间增长，这一点可以通过分子扩散现象很好地解释。但是，温度的变化同样会影响溶剂分子之间的作用力，从而影响溶剂溶解溶质的能力，导致CQF得率也随之发生变化。也就是说温度的变化同时影响着CQF分子运动速率与溶剂，因而CQF得率受此二者的交互作用影响，CQF得率随提取温度的变化如图 5所示。
![]()
图 5 提取温度对CQF提取率的影响Figure 5. Effects of extraction temperature on extraction rate of flavonoids3.1.4 提取时间对CQF得率的影响
在其他试验因子不变的条件下，考察提取时间对CQF得率的影响，结果显示提取时间对CQF得率的影响微弱，时间在20~60min变化时，CQF得率的变化始终处在0.46%~0.468%之间。CQF分子溶解到提取液中需要一定的时间，所以在提取时间40min以内时，CQF得率随着时间增加而增高，随着提取时间的延长，CQF的得率反而逐渐开始降低。这或许是因为部分原生质体内的CQF分子进入了细胞壁，因为细胞壁本身就可以容纳黄酮类化合物，另一方面，松栎柱锈菌春孢子表面具有油球，对黄酮类化合物具有一定的溶解能力。除此之外，随着溶剂分子运动时间的增加，乙醇分子扩散增多引起溶剂中乙醇浓度降低，从而导致CQF提取率也降低。CQF得率随提取时间的变化如图 6所示。
![]()
图 6 提取时间对CQF提取率的影响Figure 6. Effects of extraction time on extraction rate of flavonoids3.2 响应面法分析
3.2.1 建模试验设计及结果
使用软件Design-Expert 8.0.6对提取温度(A)，料液比(B)，提取时间(C)，乙醇体积分数(D)这4个因子的较优水平进行CQF得率的响应面建模试验。试验因子水平设计如表 1所示，中心组合实验设计与结果见表 2。
表 2 中心组合实验设计与结果Table 2. Design and results of central composite design试验号
Run No.温度
Temperature(A)/℃料液比
Solid-liquid ratio(B)/(g·mL-1)时间
Time(C)/min乙醇体积分数
Ethanol concentration(D)/%得率
Yield(T)/%1 0 -2 0 0 1.6329 2 1 -1 -1 1 1.0071 3 -1 1 1 1 0.9619 4 1 1 1 -1 1.4116 5 2 0 0 0 1.2952 6 0 0 0 0 1.1149 7 -1 1 1 -1 1.1555 8 0 0 0 0 1.1586 9 1 -1 1 1 1.1196 10 0 0 0 0 1.0930 11 1 1 -1 -1 1.3928 12 0 0 0 2 0.7542 13 0 0 0 0 1.1477 14 -1 -1 1 1 0.9697 15 1 -1 -1 -1 1.2507 16 -1 -1 -1 -1 1.1524 17 -1 -1 -1 1 0.8713 18 1 1 1 1 1.1805 19 -1 1 -1 1 0.9993 20 0 2 0 0 1.1453 21 -1 -1 1 -1 1.1055 22 0 0 -2 0 1.2133 23 1 -1 1 -1 1.3959 24 0 0 2 0 0.1969 25 1 1 -1 1 1.0555 26 0 0 0 -2 1.1040 27 0 0 0 0 1.1258 28 -2 0 0 0 1.3675 29 0 0 0 0 1.1477 30 -1 1 -1 -1 1.2304 3.2.2 数学模型的建立与分析
以CQF的得率为响应值，通过使用软件Design-Expert 8.0.6对得率T与4个影响因子回归拟合之后，得到CQF关于4个影响因子的数学模型方程：
T=1.13+0.051A−0.019B−0.071C−0.11D+1.171e−3AB+0.029AC−0.015AD−0.017BC−3.513e−3BD+0.016CD+0.059A2+0.073B2−0.098C2−0.042D2 对该数学模型进行方差分析(表 3)可知该模型回归显著(P＜0.05)，失拟项不显著(P=0.149)，说明未知因素对CQF得率影响较小，模型拟合效果良好。在我们设置的4因子水平梯度范围内，乙醇体积分数D对于CQF得率的影响显著(P＜0.05)，这与黄酮类化合物易溶于有机溶剂难溶于水的化学性质密不可分。由F值可得出各个影响因子对CQF得率的影响程度大小顺序为：乙醇体积分数(D)＞提取时间(C)＞提取温度(A)＞料液比(B)。
表 3 数学模型方差分析Table 3. Parameter estimate of regression model and variance analysis方差来源
Variance source平方和Sum
f squares自由度
df均方
Mean squareF值
F valueP值
P value显著性
Significance模型Model 1.150 14 0.082 7.469 0.043 1 显著Significant 温度Temperature(A) 0.062 1 0.062 1.520 0.237 1 料液比Solid-liquid ratio(B) 0.009 1 0.009 0.210 0.650 1 时间Time(C) 0.120 1 0.120 2.900 0.109 1 乙醇体积分数Ethanol concentration(D) 0.290 1 0.290 7.010 0.018 3 AB 0.000 1 0.000 0.001 0.981 9 AC 0.013 1 0.013 0.320 0.577 2 AD 0.004 1 0.004 0.093 0.765 2 BC 0.005 1 0.005 0.120 0.736 6 BD 0.000 1 0.000 0.005 0.945 7 CD 0.004 1 0.004 0.100 0.756 6 A2 0.095 1 0.095 2.300 0.149 8 B2 0.150 1 0.150 3.580 0.078 1 C2 0.260 1 0.260 6.380 0.023 3 D2 0.048 1 0.048 1.160 0.297 5 残差Residual 0.620 15 0.041 失拟项Lack of fit 0.610 10 0.061 0.017 0.149 不显著Not significant 纯误差Pure error 0.003 5 0.001 总误差Total error 1.770 29 3.2.3 交互项对CQF得率的影响
响应面是以响应值与影响响应值的因子构建起了空间三维图形，可以让我们更直观的判断出两两不同影响因子交互作用对响应值的影响趋势以及响应值的变化范围。响应面图中颜色的变化表示响应值(CQF得率)的变化，颜色变化快，响应值变化也快，一般较低的响应值使用蓝色表示，较高的响应值用红色表示，其他颜色均为中间过渡颜色。同时，在一定方向和范围内响应面3D图形中坡度越大表示响应值变化的越快，即对CQF得率的影响更为显著。这一点在等高线图形中也有很好的体现，当某条线段在垂直其中一条轴的方向上移动时，在一定范围内与它所相交的等高线越多，则说明在该范围内某一因子对响应值的影响越显著。等高线表示在此条线上所有试验方案都能够得到相同的响应值，即虽然等高线所对应的试验条件不同，但是能够产生相同的实验结果。4个影响因子的两两之间交互作用对CQF得率的影响示意图见图 7。
![]()
图 7 各因素交互作用对CQF得率影响的响应面与等高线图Figure 7. Response surface and contour plots for the interaction effects of various factors on extraction rate of CQF3.2.4 最佳提取工艺及验证
根据在3.2.2中对模型进行的方差分析，已经得知我们拟合出的回归方程模型显著，失拟项不显著，说明该方程是适合用于CQF得率与提取工艺的数学模型，所以我们可以借助于该方程确定最佳的CQF提取工艺。经软件Design-Expert 8.0.6分析，得知模型预测的最佳提取工艺为：提取温度65℃，料液比1:120，提取时间38min，提取液乙醇体积分数60%。在此条件下有对该优化结果进行了3次验证实验，3次验证实验所得出的CQF得率为1.382%，实际得率与在该条件下模型所预测的得率1.416%相差2.46%，这表明我们优化出来的CQF提取条件真实可靠，能够应用于实践。
3.3 抗氧化活性分析
3.3.1 CQF的还原力测定
还原力是评价物质抗氧化能力的重要指标之一，其原理是具有较强还原力的物质将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+在酸性环境中能与FeCl3产生有颜色的普鲁士蓝。在该检测体系下物质的还原力越强，对应的吸光值也越大。根据图 8可以看出，CQF与Vc的还原力与质量浓度均呈现很好的线性关系，拟合度均超过0.998。在图示浓度范围内，CQF和Vc的质量浓度与还原力均表现出较好的量效关系，相同质量浓度条件下CQF的还原力更强，而且CQF质量浓度与还原力的线性方程斜率更大，量效关系更为明显。在图示范围内，不论是量效关系还是还原力，CQF都强于Vc，说明CQF具备很好的还原力。
3.3.2 CQF对DPPH·的清除能力
在图 9中，根据受试物质量浓度与DPPH·清除率的散点图，我们可以看出Vc对DPPH·的清除能力较CQF强，并迅速逼近清除率最大值。在散点图的基础上，可以得出CQF与Vc清除DPPH·的IC50分别为0.0492mg/mL和0.0335mg/mL，也就是说对CQF对DPPH·清除能力较Vc差。但是随着CQF质量浓度的逐步增大，CQF对DPPH·清除能力也逐步增强，量效关系越来越明显。对于该种人工合成自由基，CQF的反应不够灵敏。
![]()
图 9 受试物清除DPPH·能力的比较Figure 9. Comparison of DPPH· radical scavenging capacity of CQF and Vc3.3.3 CQF总抗氧化能力
生物活性物质总抗氧化能力是指活性物质清除各种自由基的有效总和。虽然已有多种测定抗氧化活性的方法，但这些方法只是从某个角度来衡量天然抗氧化物的活性。事实上，抗氧化作用涉及到多种作用机制，它涉及一系列的问题，目前尚未形成标准方法[16]。本实验测定总抗氧化能力采用的南京建成生物研究所试剂盒原理为FRAP法，在该种检测方法下，由图 10可以看出CQF与Vc的总抗氧化能力相当。根据散点图经计算得知，CQF的半抑制率IC50为0.0303mg/mL，而Vc的半抑制率为0.0240mg/mL，可以看出Vc的总抗氧化能力较CQF强，但是CQF与Vc趋势线在0.0654mg/mL处相交。整体来看，两种物质达到最大清除率都不需要较大浓度，量效关系相近，其总抗氧化能力并不具有很大的差异。所以说，CQF的总抗氧化能力还是非常理想的。
3.3.4 CQF对·OH的清除能力
羟基自由基(·OH)属于一种强氧化剂(E0=2.80V，3.06V)，氧化能力远大于一般氧化剂，是机体中最活跃的一种活性氧分子，具有很强的破坏性。它几乎可以和活细胞中的任何生物分子发生反应而造成损伤，而且反应速度极快[17]。因此，清除机体内过多的·OH具有非常重要的生物学意义。通过与Vc的对比测试，我们可以看出Vc在质量浓度0.016 ~0.080mg/mL范围内呈现线性变化规律，但对·OH较强的清除能力远低于CQF。由图 11可以非常明显的看出Vc与CQF在·OH清除能力上的差距。虽然Vc具有很强的还原性，不仅能够直接清除·OH，还能够阻断Fenton反应，从而减少体系中的·OH，但是CQF对·OH的敏感程度与清除能力依然远胜Vc。经测定，CQF对·OH清除能力的IC50仅为0.0129mg/mL，因为Vc对·OH的清除能力远小于CQF，故未予测定与计算其对·OH的半抑制率。
3.3.5 CQF对O2-·的清除能力
超氧阴离子O2-·经过一系列反应可以生成其他氧自由基，是大多数氧自由基的母体，能够攻击细胞DNA，具有较强的毒性，所以清除生物机体内过多的O2-·具有重要意义。理论上来讲，CQF能够提供电子从而有效清除自由基，但本课题在测定CQF清除O2-·能力时却发现了截然相反的实验结果。由图 12可知，两种受试物对清除O2-·都具有一定的量效关系，但是测定结果不在同一象限内。这也就是说在该中检测体系下受试物CQF非但没有清除O2-·，反而促进了O2-·的产生。所使用试剂盒检测原理为模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，黄嘌呤在黄嘌呤酶的催化下转化为尿酸，在此过程中能够产生O2-·，然后通过衡量O2-·的量来推算加入反应体系的物质时清除还是产生O2-·。黄酮类化合物作为电子提供物质，不会产生O2-·，但是CQF提取液是未经过除杂的，一些会对该反应体系产生影响的物质可能一并被提取了，比如说嘌呤或黄嘌呤氧化酶以及一些自氧化物质，这些物质生成O2-·的能力远超黄酮类物质清除O2-·的能力，所以才产生了如图 12所示的测定结果[18-20]。这一问题没有得到有效解决，所以尚不清楚导致该检测结果的具体原因，需要在后续工作中进一步研究导致该结果的具体原因与解决方法。黄嘌呤酶氧化法目前是测定O2-·最完善最普遍的方法，但是这种方法应该对待测样品设置一定的要求或合适的处理条件以排除干扰因子，需要我们进一步完善这种测定方法。
4. 结论与讨论
从微生物孢子中提取黄酮类化合物的例子尚不多见，在此背景下，本研究采用控制变量法逐个考察了能够影响CQF得率的4个因子。然后使用软件Design-Expert 8.0.6设计了建模试验，完成建模试验之后利用可靠的CQF得率数学模型得到了适用的最优CQF提取条件：提取温度65℃，料液比1:120，提取时间38min，提取液乙醇体积分数60%，在该提取条件下CQF得率为1.382%。虽然松栎柱锈菌春孢子具有厚且坚硬的几丁质细胞壁，能够有效阻止细胞内含物的流失以抵抗不良环境因素，但是我们使用一般植物总黄酮提取的方法并辅以超声振荡也提取到了CQF，说明醇提取法同样能够用于其他孢子总黄酮的提取并且达到了预期的CQF得率。总黄酮得率既取决于提取方法，也取决于实验材料总黄酮含量。一般来说针叶树实验材料总黄酮得率高于菌物但不足5%。闫琳娜通过对落叶松(Larix gmelinii)松针黄酮的研究发现落叶松松针总黄酮含量较高且在不同提取条件下得率都能达到6%以上[21]；孙琼优化了在菌物中黄酮类化合物含量相对较高的杏鲍菇(Pleurotus eryngii)黄酮类化合物的提取条件，但是得率仍然不足3%[22]。同时我们也看到了黄嘌呤酶氧化法在实际应用中暴露出来的问题，没能有效测定出CQF清除O2-·的能力，需要进一步明确并排除干扰因子或者改进O2-·检测方法。
黄晓冬等对阔叶树种白桦(Betula platyphylla)活体寄生真菌桦褐孔菌(Inonotus obliquus)总黄酮的研究表明其具有较强的体内外抗氧化活性[23]，Boonsong等研究了5种食用菌总酚与类黄酮的提取与抗氧化活性，发现乙醇溶液更适合菌物总酚的提取，其提取物均表现出较强的抗氧化活性，然而很多的食用菌不是活体寄生或不含有黄酮类物质[24]。整体来看，对于针叶树总黄酮的研究成果与热情远胜担子菌，而活体寄生的担子菌总黄酮的研究很鲜见。本研究所选研究对象将针叶树与担子菌门菌物总黄酮的研究很好地有机结合，旨在为锈菌目菌物开发利用、森林有害生物开发利用和转变森林有害生物防治理念提供科学依据。迄今为止，人类对锈菌的认知还很不完善，尚未看到国内外任何关于锈菌开发利用的报道。本研究首次完成了CQF的提取与体外抗氧化活性测定工作，发现CQF具有很强的还原力，还原力较Vc强；其次CQF的总抗氧化能力和DPPH·清除能力与Vc相当；CQF对·OH具有非常好的清除作用，这一能力远胜Vc，与Treml等对黄酮类化合物清除·OH能力的研究现状综述相一致[26]。体外试验结果为体内试验提供了一定的科学依据，这表明CQF具有开发利用的潜在价值。
长久以来，人类对于有害生物的认识是不全面的，往往只是单纯的从治理的角度去对待，总是尝试使用各种各样的手段降低或控制有害生物的种群数量。森林有害生物确实为林业生产活动和森林健康产生了很多负面的影响，如果说发现并证实某种有害生物有其独特的利用价值，那么它的某种功能或价值就能在一定程度上抵偿它所造成的损失，从而引导我们转变传统的有害生物防治理念。
-
表 1 样地柳树受危害情况
Table 1 Injury states of willows in three sample plots
样地
Sample plot受害株数
Damaged willow number新排粪孔数
New frass hole number虫口密度/(个·株-1)
Population density/(hole·tree-1)A 72 281 3.90 B 26 60 2.31 C 38 124 3.26 
下载: 导出CSV
表 2 预防治试验后天牛幼虫在4 d内的死亡率
Table 2 Mortalities of larvae in 4 days after pre-testing
杀虫剂
Insecticide质量浓度
Mass concentration/(g·L-1)防治前活虫数
Survival numberbefore prevention防治后活虫数
Survival number after prevention死亡数
Death number死亡率
Mortality/%氯虫苯甲酰胺Chlorantraniliprole 0.5 19 19 0 0 1.0 22 21 1 4.5 2.0 18 15 3 16.7 氟虫双酰胺Flubendiamide 0.3 20 19 1 5 0.6 16 13 3 18.8 1.2 19 14 5 26.3 空白对照CK 0 15 15 0 0 合计Total 129 116 13 10.1%
下载: 导出CSV
表 3 3种杀虫剂对光肩星天牛幼虫的防治效果
Table 3 Control efficiencies of three insecticides on A. glabripennis larvae
组
Group质量浓度
Massconcentration/(g·L-1)株数
Tree number新排粪孔数
New frass hole number新羽化孔数
New emergencehole number死亡数
Death number死亡率
Mortality/%校正死亡率
Corrected mortality/%氯虫苯甲酰胺Chlorantraniliprole 2 5 14 8 6 42.9 37.7 4 4 12 5 7 58.3 54.5 8 5 12 6 6 50 45.5 氟虫双酰胺Flubendiamide 0.6 5 15 8 7 46.7 41.9 1.2 4 15 6 9 60 56.4 2.4 5 16 5 11 68.8 66.0 吡虫啉Imidacloprid 2.8 5 16 6 10 62.5 59.1 5.6 4 13 3 10 76.9 74.8 11.2 5 16 2 14 87.5 86.4 溶剂对照Solvent CK 4 12 11 1 8.3 空白对照Blank CK 5 11 10 1 9.1 合计Total 51 152 70 82 53.9 样地B Sample plot B 26 60 58 2 3.3 样地C Sample plot C 38 124 119 5 4.0
下载: 导出CSV
表 4 3种杀虫剂最佳防效的χ2检验结果
Table 4 Chi-square test results of best control efficiencies of three insecticides
检验组Tested group χ2 df P 氯虫苯甲酰胺Chlorantraniliprile、氟虫双酰胺Flubendiamide 0.324 1 0.430 氯虫苯甲酰胺Chlorantraniliprole、吡虫啉Imidacloprid 3.111 1 0.093 氟虫双酰胺Flubendiamide、吡虫啉Imidacloprid 1.646 1 0.197
下载: 导出CSV
表 5 样地A中各组间天牛的产卵情况
Table 5 Beetles' oviposition states of each group in sample plot A
组
Group杀虫剂
Insecticide总株数
Total tree number新产卵刻痕株数
Tree number with new oviposition pit number无新产卵刻痕株数
Tree number without new oviposition pit number新产卵刻痕数
New oviposition pit number产卵刻痕密度/(个·株-1)
Oviposition pit density/(pit·tree-1)处理组Treatment 氯虫苯甲酰胺Chlorantraniliprole 14 0 14 0 0 氟虫双酰胺Flubendiamide 14 0 14 0 0 吡虫啉Imidacloprid 14 2 12 8 0.57 对照组Control 溶剂Solvent 4 2 2 8 2 空白Blank 5 3 2 11 2.2
下载: 导出CSV
表 6 样地A各组间天牛成虫产卵情况的χ2检验结果
Table 6 Chi-square test results of beetles' oviposition states of each group in sample plot A
检验组Tested group χ2 df P 双酰胺类杀虫剂Diamide insecticides 吡虫啉Imidacloprid 2.154 1 0.241 溶剂对照Solvent CK 7.875 1 0.039 空白对照Blank CK 9.975 1 0.010 吡虫啉Imidacloprid 溶剂对照Solvent CK 2.296 1 0.178 空白对照Blank CK 3.971 1 0.078 溶剂对照Solvent CK 空白对照Blank CK 0.090 1 0.476
下载: 导出CSV
-
[1] 秦凯伦, 胡春祥, 王忠杰.不同药剂对哈尔滨市光肩星天牛的防治试验[J].东北林业大学学报, 2009, 37(9): 97-98, 116. doi: 10.3969/j.issn.1000-5382.2009.09.034 QIN K L, HU C X, WANG Z J. Control effects of five pesticides on Anoplophora glabripennis in Harbin[J]. Journal of Northeast Forestry University, 2009, 37(9): 97-98, 116. doi: 10.3969/j.issn.1000-5382.2009.09.034
[2] 张新才, 李桂亭, 洪家保.注干法施用吡虫啉对光肩星天牛幼虫的防治效果[J].南京林业大学学报(自然科学版), 2005, 29(4): 41-44. doi: 10.3969/j.issn.1000-2006.2005.04.010 ZHANG X C, LI G T, HONG J B. The effects of the larvae of Anoplophora glabripennis (Motschulsky) with stem injection of imidacloprid[J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition), 2005, 29(4): 41-44. doi: 10.3969/j.issn.1000-2006.2005.04.010
[3] 张怡, 李刚, 戴建昌, 等.自流式树干注药防治杨树光肩星天牛幼虫研究[J].西北农业学报, 2001, 10(2): 87-90. doi: 10.3969/j.issn.1004-1389.2001.02.023 ZHANG Y, LI G, DAI J C, et al. The research on controlling larvae of Anoplophora glabripennis Motsch. by autoflowing trunk injection[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2001, 10(2): 87-90. doi: 10.3969/j.issn.1004-1389.2001.02.023
[4] 吕小红, 赵瑞良, 刘随存, 等.干基打孔注药防治光肩星天牛木质部幼虫试验[J].山西林业科技, 1996(1): 4-7. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK199600500871 LV X H, ZHAO R L, LIU S C, et al. Control effects of pesticides on Anoplophora glabripennis in the xylem with base of the trunk injection[J]. Shanxi Forestry Science and Technology, 1996(1): 4-7. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK199600500871
[5] 孟祥志.光肩星天牛化学防治技术研究[J].山西农业科学, 2011, 39(3): 273-275. doi: 10.3969/j.issn.1002-2481.2011.03.24 MENG X Z. Technological study on chemical control of Anoplophora glabripennis[J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2011, 39(3): 273-275. doi: 10.3969/j.issn.1002-2481.2011.03.24
[6] 马瑾, 潘根兴, 万洪富, 等.有机磷农药的残留、毒性及前景展望[J].生态环境, 2003, 12(2): 213-215. doi: 10.3969/j.issn.1674-5906.2003.02.022 MA J, PAN G X, WAN H F, et al. The toxicity, residue and the prospect of organic phosphorus pesticides[J]. Ecology and Environment, 2003, 12(2): 213-215. doi: 10.3969/j.issn.1674-5906.2003.02.022
[7] 唐振华, 陶黎明.新型二酰胺类杀虫剂对鱼尼丁受体作用的分子机理[J].昆虫学报, 2008, 51(6): 646-651. doi: 10.3321/j.issn:0454-6296.2008.06.013 TANG Z H, TAO L M. Molecular mechanism of action of novel diamide insecticides on ryanodine receptor[J]. Acta Entomologica Sinica, 2008, 51(6): 646-651. doi: 10.3321/j.issn:0454-6296.2008.06.013
[8] 林涛, 游泳, 郑丽祯, 等.三种双酰胺类杀虫剂制剂对环境非靶标生物的急性毒性[J].农药学学报, 2015, 17(6): 757-762. doi: 10.3969/j.issn.1008-7303.2015.06.018 LIN T, YOU Y, ZHENG L Z, et al. Acute toxicity of three diamide insecticide preparations to environmental non-target organisms[J]. Chinese Journal of Pesticide Science, 2015, 17(6): 757-762. doi: 10.3969/j.issn.1008-7303.2015.06.018
[9] 宫庆涛, 张坤鹏, 武海斌, 等. 6种杀虫剂对铜绿丽金龟防治效果评价[J].果树学报, 2016, 33(12): 1542-1549. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=gskx201612009 GONG Q T, ZHANG K P, WU H B, et al. Effect evaluation of 6 insecticides on Anomala corpulenta[J]. Journal of Fruit Science, 2016, 33(12): 1542-1549. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=gskx201612009
[10] 唐光辉, 何军, 江志利, 等. 14%吡虫啉·敌敌畏注干液剂防治柳树天牛技术研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版), 2007, 35(1): 116-120. doi: 10.3321/j.issn:1671-9387.2007.01.025 TANG G H, HE J, JIANG Z L, et al. The control effect of Anoplophora glabripennis with the liquid formulation of 14% Imidacloprid+ DDVP for trunk injection[J]. Journal of Northwest A & F University (Natural Sciences Edition), 2007, 35(1): 116-120. doi: 10.3321/j.issn:1671-9387.2007.01.025
[11] 高瑞桐, 冯秀丽, 沈波, 等.吡虫啉杀虫剂注干对4种鞘翅目害虫毒杀效果研究[J].林业科学研究, 2004, 17(2): 263-266. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2004.02.021 GAO R T, FENG X L, SHEN B, et al. Study on controlling 4 species of Coleoptera by injecting of imidacloprid insecticidel[J]. Forest Research, 2004, 17(2): 263-266. doi: 10.3321/j.issn:1001-1498.2004.02.021
[12] 李银生.光肩星天牛综合防治技术研究[J].河北林果研究, 2009, 24(3): 327-329. doi: 10.3969/j.issn.1007-4961.2009.03.026 LI Y S. Integrated control techniques of Anoplophora glabripennis[J]. Hebei Journal of Forestry and Orchard Research, 2009, 24(3): 327-329. doi: 10.3969/j.issn.1007-4961.2009.03.026
[13] 董崭, 袁会珠, 翟明利, 等.树干注射吡虫啉、印楝素和乙酰甲胺磷防治槐尺蠖的效果比较[J].植物保护, 2008, 34(4): 145-148. doi: 10.3969/j.issn.0529-1542.2008.04.036 DONG Z, YUAN H Z, ZHAI M L, et al. Contrast on control effects of Semiothisa cinerearia by injecting imidacloprid, azadirachtin and acephate into trunk[J]. Plant Protection, 2008, 34(4): 145-148. doi: 10.3969/j.issn.0529-1542.2008.04.036
[14] ZHANG J M, CHAI W G, WU Y L. Residues of chlorantraniliprole in rice field ecosystem[J]. Chemosphere, 2012, 87(2): 132-136. doi: 10.1016/j.chemosphere.2011.11.076
[15] 王点点, 宋宁慧, 吴文铸, 等.氟虫双酰胺在水稻和稻田中的残留动态研究[J].环境科学, 2013, 34(2): 740-745. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/hjkx201302047 WANG D D, SONG N H, WU W Z, et al. Residue dynamics of flubendiamide in paddy field[J]. Environmental Science, 2013, 34(2): 740-745. http://d.old.wanfangdata.com.cn/Periodical/hjkx201302047
[16] FENG C, CHAI T, LE Q, et al. Effects of three diamides (chlorantraniliprole, cyantraniliprole and flubendiamide) on life history, embryonic development and oxidative stress biomarkers of Daphnia magna[J]. Chemosphere, 2017, 169: 107-116. doi: 10.1016/j.chemosphere.2016.11.073
[17] 唐光辉.一种新型杀虫注干液剂的研制与应用基础研究[D].杨凌: 西北农林科技大学, 2007. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-2007189323.htm TANG G H. Research and development of a new kind of liquid formulation for trunk injection[D]. Yangling: Northwest A & F University, 2007. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-2007189323.htm
[18] 栾海洋.光肩星天牛生物学特性研究[J].内蒙古林业调查设计, 2016, 39(2): 86-90. doi: 10.3969/j.issn.1006-6993.2016.02.033 LUAN H Y. Research on biological characteristics of Anoplophora glabripennis[J]. Inner Mongolia Forestry Investigation and Design, 2016, 39(2): 86-90. doi: 10.3969/j.issn.1006-6993.2016.02.033
[19] 刘海涛.家蚕对有机磷农药抗性的性别差异研究[D].苏州: 苏州大学, 2010. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10285-2010152273.htm LIU H T. Sex differences in the resistance of silkworm Bombyx mori to organophosphorus[D]. Suzhou: Soochow University, 2010. http://cdmd.cnki.com.cn/article/cdmd-10285-2010152273.htm
[20] 骆有庆, 李建光.光肩星天牛的生物学特性及发生现状[J].植物检疫, 1999, 13(1): 5-7. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK199901148832 LUO Y Q, LI J G. Bionomics and occurrence of Anoplophora glabripennis (Motschulsky)[J]. Plant Quarantine, 1999, 13(1): 5-7. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK199901148832
[21] 黄竞芳, 骆有庆, 周章义.中国光肩星天牛研究的新进展[J].陕西林业科技, 1992(2): 57-62. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK000002926840 HUANG J F, LUO Y Q, ZHOU Z Y. New progress in Anoplophora Glabripennis motsch study in China[J]. Shaanxi Forest Science and Technology, 1992(2): 57-62. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=QK000002926840
[22] 王圣印, 刘永杰, 周仙红, 等.新烟碱类杀虫剂吡虫啉的研究进展[J].江西农业学报, 2012, 24(3): 76-79. doi: 10.3969/j.issn.1001-8581.2012.03.024 WANG S Y, LIU Y J, ZHOU X H, et al. Research progress in new neonicotinoid insecticide imidacloprid[J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2012, 24(3): 76-79. doi: 10.3969/j.issn.1001-8581.2012.03.024
计量
- 文章访问数: 2659
- HTML全文浏览量: 496
- PDF下载量: 31
