Cloning and functional analysis of PebZIP26 and PebZIP33 transcription factors from Populus euphratica
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摘要: bZIP(basic region/leucine zipper motif)是一类在真核生物中分布广泛的超大转录因子家族，参与调节植物的生长发育、衰老、激素调控、能量代谢、病原防御等过程。胡杨是研究抗逆分子机制的模式木本植物，但是关于胡杨的bZIP功能迄今未见研究报道。本研究从胡杨中克隆得到PebZIP26和PebZIP33两个转录因子的cDNA，经分析，分别编码439与371个氨基酸且PebZIP26与PebZIP33基因的表达受干旱、脱水及盐胁迫诱导。构建植物表达载体，利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，获得CaMV35S:PebZIP26和CaMV35S:PebZIP33超表达株系和空载体对照株系。在含有150 mmol/L NaCl及300 mmol/L甘露醇培养基上，PebZIP26和PebZIP33超表达株系根长均长于野生型，叶片嫩绿，无发黄萎蔫现象；另外，对盆土中的幼苗进行21 d的干旱处理和盐处理，超表达PebZIP26及PebZIP33株系耐旱耐盐性较强，表现为胁迫环境中植株营养生长较好，株高显著高于野生型(WT)及空载体对照株系，干旱复水后，植株存活率为61%及48%，显著高于WT的9%及空载体对照的12%。超表达PebZIP26及PebZIP33株系相比于WT和abf1及tga1(拟南芥同源基因ABF1及TGA1突变体)气孔关闭对外源ABA处理更加敏感，且对氧化胁迫的抗性较强。综上所述，胡杨PebZIP26和PebZIP33转录调节因子可能通过调控气孔开度和活性氧水平及根的生长正向调节植物抗旱耐盐性，进一步丰富了木本植物bZIP的基因功能认识，为遗传育种提供基因资源及理论依据。Abstract: bZIP (basic region/leucine zipper motif) transcription factor is a kind of large transcription factor family and widely distributed in eukaryotic organisms. It participates in the regulation of plant growth and development, senescence, hormone regulation, energy metabolism, pathogen defense, etc. Populus euphratica is a model woody plant to study the molecular mechanism of plant resistance, and has excellent resistance ability to stress, but there are fewer reports about its bZIPs function. We cloned PebZIP26 and PebZIP33 cDNA from Populus euphratica, encoding 439 and 371 amino acids, respectively. The expression of PebZIP26 and PebZIP33 genes were induced by drought, dehydration and salt stress, and then constructed expression vectors. The wild type Arabidopsis thaliana was transformed by Agrobacterium tumefaciens infection, and different strains of CaMV35S: PebZIP26 and CaMV35S: PebZIP33 and vacant carrier were obtained. The root length of PebZIP26 and PebZIP33 lines were longer than that of wild type on 150 mmol/L NaCl and 300 mmol/L Mannitol medium, and had a better leaf statement. 21days drought and salt treatment on each strains of pot plants revealed that, the PebZIP26 and PebZIP33 lines showed better salt tolerance and drought resistance with better nutritional growth and the height of main branch was taller than WT and vacant carrier, and the survival rate after re-watering was 61% and 48%, significantly higher than WT(9%) and vacant carrier(12%). In the stomatal closure experiment, the PebZIP26 and PebZIP33 strains were more sensitive to exogenous ABA than WT, abf1 and tga1(arabidopsis homologous gene ABF1 and TGA1 mutant), and also improved the antioxidant activity of plants. Therefore, the study showed that PebZIP26 and PebZIP33 transcription factors could improve the abiotic stress resistance, further enrich the functional study of bZIP genes in woody plants, and provide genetic resources and theoretical basis for genetic breeding.
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Keywords:
- Populus euphratica /
- PebZIP26 /
- PebZIP33 /
- Arabidopsis thaliana /
- drought resistance /
- salt tolerance
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目前我国大宗固废累计堆存量约600亿t，年新增堆存量近30亿t[1]。2021年，我国产生大宗固废约40.38亿t，较2020年增长2.51亿t，同比增长6.6%，其中尾矿增幅居前，达到9.6%，煤矸石、粉煤灰、赤泥和工业副产石膏小幅增长[2]。对于煤矸石固体废弃物大量堆积、水分渗漏严重、水源涵养能力下降等问题，如何在有限的水土资源条件下将煤矸石固体废弃物合理地资源化利用，已经成为我国煤矿区生态修复的紧迫任务。
煤矸石是煤炭开采加工过程中必然产生的固体废物，排放量占煤炭产量的10% ~ 20%[3]。它是矿区的主要固废，产量庞大，但由于资源化利用率较低，长期堆放不仅占用了大量土地，同时也对环境造成污染[4]。当前对煤矸石山恢复治理的主要方法是在其表面直接覆土进行植被重建[5]，但由于覆土成本过高，同时易对取土区造成二次破坏，因此考虑直接将煤矸石应用于矿区裸露立地的基质填充材料。武琳等[6]认为煤矸石基质中含有供植物生长所需的多种元素，其成分与土壤成分非常相似，但是煤矸石大孔隙多，单独使用作为植生基质会使其结构不良，影响渗透与保水保肥能力等[7]，不能满足植物生长的需求。董颖等[8]研究显示，小粒径煤矸石比表面积优于大粒径，且煤矸石颗粒外部的膜状水多，同时，小粒径煤矸石更有利于养分元素释放，供植物生长，且黏粒含量高，减少水分入渗，保水性能优越[9]，因此需要混合其他物质与煤矸石进行合理利用。当前对煤矸石基质改良研究常用的外源物质有玉米秸秆、土壤、粉煤灰、木炭等[10]，但关于煤矸石基质保水性能研究较少，尤其是在煤矸石基质中使用保水剂用量还有待进一步研究，低量改善效果不明显，过量会影响基质的通透性进而影响植物根系呼吸，因此在煤矸石基质中加入适量的保水剂不仅仅可以改善其水分特性，从经济上也会大大降低成本。
杨永刚等[11]研究表明水分是矿区生态系统恢复重建的关键，高吸水树脂（super absorbent polymer，SAP）是一种广泛应用的保水剂[12]，无毒，具有良好的絮凝性，能够使土壤保持良好的通透性，减少土壤侵蚀，抑制土壤水分蒸发。研究表明，高分子聚合物在有效改善作物根际水环境，为植物提供所需水分，提高作物产量的同时[13−14]，还可以改善土壤物理结构，促进土壤团聚体形成，增强土壤通气性[15−16]。刘慧军等[17]在土壤中使用聚丙烯酸钾后，土壤不同粒级团聚体、有机质和各速效养分含量较对照均有提高，同时还可改善土壤本身的孔隙分布状况，促使土壤生成疏松多孔的团粒结构，从而提升土壤的透气性和透水性[18]，在此过程中，极大地改善了土壤的最大持水量、密度、水分蒸发速率以及土壤的温差。目前SAP的研究主要集中在新材料和新产品的研发[19−20]、理化特性的比较和评价[21]以及对土壤和植物生长的影响[22]、SAP与结皮种源混合应用于裸沙表层[23]。以往研究只局限于SAP 改良土壤，防风固沙提高造林成活率[24]的某一个或几个方面，但SAP在煤矸石基质中单独使用尚未见报道。
本文以北京市门头沟矿区煤矸石山为研究对象，仅用SAP与煤矸石基质混合，从容重、孔隙度、毛管水运移规律和保水性等方面，探究高吸水树脂对煤矸石基质水分影响的变化规律，以期得到改善煤矸石基质水分条件的SAP最佳使用量，为无土矿区以及立地条件恶劣的高寒矿区煤矸石基质的资源合理化利用提供支撑，为后期植被重建提供参考。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
本试验材料主要是煤矸石和高吸水树脂SAP。煤矸石取自北京市门头沟区北港沟煤矸石山，将取回后的煤矸石置于阴凉处自然晾干，经粉碎机处理后过2 mm筛，然后选取煤矸石样品300 g进行基本的颗粒分析试验，将样品过1、0.5、0.25、0.1和0.075 mm的标准筛进行多组筛分处理，结果如表1。煤矸石密度测定值为2.50 g/cm3。
表 1 煤矸石的颗粒组成Table 1. Particle composition of coal gangue项目 Item 颗粒分级 Particle classification/mm 1 ~ 2 0.5 ~ 1 0.25 ~ 0.5 0.1 ~ 0.25 0.075 ~ 0.1 ≤ 0.075 煤矸石百分比 Coal gangue percentage/% 4.69 23.17 27.07 22.65 5.71 16.71 将煤矸石粉末过200目筛，磨匀后取适量用玻璃板压实，测试条件为: 光阑系统发散狭缝和散射狭缝均为1°，扫描速度8（°）/min，扫描范围5° ~ 80°，由图1能够看出煤矸石的矿物组成主要为铵云母、石英、叶腊石、黄矾、绿泥石等，这5种主要矿物分别占33.7%、18.6%、14.9%、10.9%、6.1%。同时对煤矸石样品进行X射线荧光光谱分析，结果表明，煤矸石中SiO2含量占49.05%， Al2O3与Fe2O3分别占32.92%和6.39%，同时含有少量的CaO、K2O、TiO2、Na2O、MgO、SO3、P2O5，占比分别为5.01%、1.88%、1.56%、1.40%、0.87%、0.63%和0.29%。
本试验所用高吸水树脂为SOCO保水剂，型号为SDK324，吸水倍率 ≥ 350，其性能优于传统的保水材料，单体为聚丙烯酸钾，外观呈白色细砂晶体状，粒径为0.45 ~ 0.90 mm，凝胶性强，可以增强土壤的透气性，具有三维网状结构，其高分子链上含有大量亲水基团，当水分子与亲水基团接触时，可借助网络结构内外水势梯度不同所形成的水势差而进入到基质内部并储存水分，有极强的吸水性能[25]，可以在吸收水分溶胀的同时又能保持住水分不外流[26]。与传统保水材料相比，SAP是通过物理和化学两种方式吸水，吸水后即使再挤压也不容易释水，进行“有水吸水，缺水释水”反复循环，并能抑制水分蒸发。它无毒无腐蚀性，可生物降解为二氧化碳和水，对植物和土壤有益无害。
1.2 研究方法
设定5个处理，SAP质量分数分别为0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，将SAP与煤矸石基质按比例混合，分别装填于室内土柱模型中，控制初始土柱容重均为1.40 g/cm3，每个处理重复3次。土柱模型壁厚3 mm、直径15 cm、高50 cm。
为便于均匀吸收水分，于土柱下方均匀打直径为5 mm小孔，同时在土柱的外侧分别于10、20、30 cm处钻孔以便插入传感器，土柱外壁贴有刻度条，在吸水过程中便于记录煤矸石基质毛管水上升高度。在装填过程中，每间隔5 cm使用赛钢棒进行捣实，直至装填到设计高度35 cm处。处理好的土柱经24 h室内沉降后，垂直放入水槽中并注水，使水槽中的水面刚好接触土柱底部，同时使用马氏瓶供水，保持水槽中水位的高度不变，如图2a所示。采用先密后疏的计时方法测定煤矸石基质中毛管水上升高度的变化，0 ~ 20 min，每1 min记录1次毛管水上升高度；20 ~ 40 min每2 min记录1次；40 min后每5 min测1次；140 min后每10 min测一次；340 min后每20 min测一次；700 min后每1 h测一次。当土柱中的毛管水上升到35 cm时，将土柱取出称质量观测其质量变化，确定毛管持水量，同时利用土壤墒情监测站来测定不同高度下煤矸石基质的体积含水率。随后增加水槽的水位，直至略低于设计高度35 cm处，使土柱完全吸水饱和，观察柱内体积变化，如图2b所示，并测定煤矸石的饱和含水量。分析SAP对煤矸石基质容重和孔隙度的影响。最后排除水槽中的水，将土柱放置于铁架上于室内通风处，每间隔24 h观测土柱质量变化，分析SAP对煤矸石基质的保水性能，如图2c所示。
2. 结果与分析
2.1 SAP对煤矸石基质容重和孔隙度影响
土柱饱和过程中发现纯煤矸石基质柱内高度没有明显变化，而加入了SAP的煤矸石基质，水分饱和后柱内高度明显增加。SAP质量分数为0.1%、0.2%、0.3%和 0.4%的土柱高度较纯煤矸石依次增加了0.5、1.3、1.8和2.7 cm，可见煤矸石基质的物理性状随SAP质量分数的增加发生了不同程度的变化（表2）。煤矸石基质装填容重为1.40 g/cm3，总孔隙度为44.00%，毛管孔隙度为17.89%，较土壤相比，容重偏大，总孔隙度偏小，导致其水气条件不利于植物根系水分运移。而加入不同质量分数SAP后，随SAP使用量增加，容重依次比纯煤矸石减小1.43%、3.57%、5.00%和7.14%；总孔隙度依次增加1.82%、4.55%、6.36%和9.09%；毛管孔隙度依次增加9.95%、11.46%、13.03%和15.26%。最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行多重比较表明，使用不同质量分数的SAP，煤矸石基质容重、总孔隙度、毛管孔隙度等均比纯煤矸石基质有显著改善（P < 0.05），说明SAP可以在一定程度上改善煤矸石基质物理性状，其水气条件能够更好地满足植物生长需求。
表 2 5种SAP质量分数下煤矸石基质容重和孔隙度变化情况Table 2. Changes of bulk density and porosity of coal gangue matrix under 5 kinds of SAP mass fractionSAP质量分数
SAP mass fraction/%容重
Bulk density/ （g·cm−3）总孔隙度
Total porosity/%毛管孔隙度
Capillary porosity/%毛管持水量
Capillary water capacity/%0 1.40a 44.00e 17.89d 12.78e 0.1 1.38b 44.80d 19.67c 14.25d 0.2 1.35c 46.00c 19.94c 14.77c 0.3 1.33d 46.80b 20.27b 15.24b 0.4 1.30e 48.00a 20.62a 15.86a 注：同列中不同字母表示差异显著（P < 0.05）。Note: different letters in the same column indicate significant differences (P < 0.05). 2.2 SAP对煤矸石基质毛管水运移特征影响
5种不同SAP质量分数下煤矸石基质体积含水率随毛管水上升高度的变化如图3所示。毛管水上升高度于10 cm处，加入SAP的煤矸石基质体积含水率均明显高于纯煤矸石，但SAP质量分数在0.1% ~ 0.4%，煤矸石的体积含水率差别较小，变化范围为74.0% ~ 74.8%，变异系数为0.82%；在30 cm高度时，5种SAP煤矸石基质的体积含水率却出现了差异性的变化，SAP质量分数与煤矸石基质的体积含水率呈正相关，其变化范围是60.8% ~ 73.6%。随毛管水上升高度增加，体积含水率均呈下降趋势，下降趋势与SAP质量分数呈负相关。0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4% 5种质量分数的SAP在不同高度其平均体积含水率分别为64.07%、72.33%、72.83%、73.73%和74.13%，变异系数分别为8.05%、4.36%、2.40%、1.92%、和1.17%。根据试验结果，可以观察到随SAP使用量的增加，不同高度的平均体积含水率随之增加，但变异系数随之减小，结合表2中毛管孔隙度的变化，可以得出SAP能够增加煤矸石基质中毛管水上升运移和持水能力。
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图 3 不同质量分数SAP煤矸石基质体积含水率随毛管水上升高度变化Figure 3. Volumetric water content of coal gangue matrix with different mass fractions of SAP changes with the risingheight of capillary water2.3 SAP对煤矸石基质毛管水上升高度及上升速率的影响
5种SAP质量分数下煤矸石基质毛管水上升高度随时间的变化情况如图4所示。为清楚观察毛管水上升初始阶段SAP的影响，将0 ~ 30 min内的变化情况提取出进一步分析。
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图 4 煤矸石基质毛管水上升高度随SAP质量分数变化Figure 4. Rising height of capillary water in coal gangue matrix varies with the mass fraction of SAP质量分数为 0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4% SAP的煤矸石基质在600 min内毛管水上升高度分别为23.3、19.6、15.4、10.5和11.5 cm，差异极显著（P < 0.01），但在毛管水上升过程中，不同使用量的SAP对煤矸石基质毛管水运移速率抑制程度均不同。因此，将上升过程分成3个阶段，其中0 ~ 30 min为第1阶段，不同质量分数的SAP对毛管水上升高度影响均较小，作用程度较为相似；30 ~ 600 min为第2阶段，可以观察到SAP质量分数为0%、0.1%和0.2%煤矸石基质毛管水的上升高度开始有明显差异，且随着时间的推移差异逐渐扩大，方差分析差异显著。而质量分数为0.3%和0.4%的SAP，其基质毛管水的上升高度差异不显著，并且在多个时间点上升高度保持一致；600 min至到达设计高度为第3阶段，上升速率趋于稳定阶段。纯煤矸石在1480 min达到设计高度，同时在整个上升过程中，纯煤矸石的毛管水上升速度都要远远快于其他质量分数。0.3%与0.4%SAP下基质毛管水上升高度基本一致，上升速度最为缓慢，毛管水上升高度从快到慢为0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%，充分说明SAP在0% ~ 0.4%范围内，使用量越高，抑制毛管水的运移速率越强。但0.3%与0.4%几乎同时达到设计高度处，且0.4%的使用量较0.3%相比，未呈现出显著变化，两者对毛管水上升高度差异不显著。
LSD多重比较拟合分析（表3）可知，煤矸石毛管水上升高度随时间变化呈幂函数增加趋势（P < 0.01）；对毛管水上升速率与时间进行回归拟合分析，得出5种处理煤矸石毛管水的上升速率随时间增加呈对数函数降低趋势。0%~0.4%SAP煤矸石基质的毛管水上升速率范围为 0.002 ~ 0.700 cm/min，通过单因素方差分析，发现不同质量分数之间的上升速率差异显著（P < 0.05）。
表 3 SAP不同质量分数下煤矸石基质毛管水上升高度、上升速率与时间的最佳拟合方程Table 3. Best fitting equation of rising height, rising rate and time of capillary water in coal gangue matrix underdifferent mass fractions of SAP项目
ItemSAP质量分数
SAP mass fraction/%拟合方程
Fitting equationR² P 上升高度
Rising height (y)0 y = 0.343 3t0.677 3 0.919 0 < 0.01 0.1 y = 0.570 1t0.551 8 0.994 5 < 0.01 0.2 y = 0.317 3t0.605 9 0.982 7 < 0.01 0.3 y = 0.291 2t0.570 9 0.980 8 < 0.01 0.4 y = 0.221 7t0.612 9 0.990 7 < 0.01 上升速率
Rising rate (v)0 v = −0.032ln t + 0.219 7 0.1 v = −0.030ln t + 0.199 0 0.2 v = −0.019ln t + 0.134 8 0.3 v = −0.014ln t + 0.106 4 0.4 v = −0.011ln t + 0.088 1 注：t为毛管水上升时间，min。Notes: t is capillary water rising time, min. 2.4 SAP对煤矸石基质保水性的影响
煤矸石自身孔隙大、保水性差，水分散失相比其他基质快。在毛管水上升试验结束后，待土柱充分吸水饱和后自然通风，每间隔24 h，称其土柱质量变化，测定SAP对煤矸石基质的保水性能的影响。
5种处理的煤矸石基质随时间延长，其不同高度含水率均呈现减少趋势，但减少程度不同（图5）。其中纯煤矸石水分散失的最快，保水能力最差，10、20、30 cm处饱和后体积含水率分别为69.3%、65.2%、63.7%，在72 h后分别降为67.0%、63.5%、61.0%。而添加了SAP的煤矸石基质保水性能均好于纯煤矸石，不同高度的体积含水率变化与SAP的质量分数呈正相关，保水效果最好的SAP质量分数为0.4%，其变化范围从饱和状态的76.6% ~ 77.5%，在72 h后下降为75.8% ~ 76.3%，体积含水率变化范围最小。由此可见，随时间的增加，SAP质量分数越高的煤矸石基质水分散失越缓慢。
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图 5 5种SAP质量分数随时间变化各高度煤矸石基质体积含水率变化特征Figure 5. Variation characteristics of volumetric water content of coal gangue matrix at different heights with time of five kinds of SAP mass fraction5种处理煤矸石基质水分饱和后，在自然通风状态下连续测定72 h（图6），可以发现不同SAP质量分数煤矸石基质的质量含水率均持续降低，但是降幅不同。纯煤矸石从15.23%减少到12.80%，SAP质量分数为0.1% 、0.2%、0.3%和0.4%时，质量含水率分别从15.52%减少到13.66%、16.44%减少到15.49%、16.94%减少到16.28%、17.62%减少到17.00%。纯煤矸石基质质量含水率下降趋势最大，水分损失率最大为15.96%。SAP质量分数为0.3%与0.4%质量含水率下降趋势较小，水分损失率分别为3.90%和3.52%，差异不显著，说明在相同的外界条件下，0.4%质量分数的SAP具有较强的保水性能，能够有效抑制水分的散失。从图6可以看出，在72 h内，质量分数为0.4%的煤矸石基质质量含水率最高，这进一步证明了SAP的保水性能。因此，随着SAP质量分数的增加与时间的延长，煤矸石基质的保水性能逐渐增强。如果保住的这部分水分是植物能够利用的有效水分，那么在煤矸石基质中加入SAP将会是解决无土矿区植被缺水的有效方法。
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图 6 5种SAP质量分数下煤矸石质量含水率随时间变化Figure 6. Changes in the mass moisture content of coal gangue over time under five SAP mass fractions3. 讨 论
3.1 改善煤矸石基质容重和孔隙度的SAP适用量
保水剂对土壤水分变化规律的影响不仅取决于保水剂类型，同时使用量也是十分重要的影响因素[27−28]。研究表明在干旱荒漠地区使用适量的SAP能够显著影响沙土的有效水、容重和孔隙度，可以有效促进植物根系水分运移[29]。李杨等[30]研究鄂尔多斯沙质土壤的物理性质对玉米生长影响，得到SAP极大程度提升沙土的保水能力，降低沙土容重，增大沙土孔隙度，当SAP使用量在0.5% ~ 1.0%时效果最佳。赵雪晴等[31]研究加入砂土中的保水剂用量越多，干湿交替对保水剂提高毛管孔隙度、抑制水分蒸发能力以及保水性能的效果削弱程度越明显，其主要原因在于SAP改善了煤矸石的孔隙组成，增加了毛管孔隙，同时SAP 自身的三维网状结构，其高分子链上的大量亲水基团使其吸住的水分不外流，抑制水分蒸发。但当SAP使用过量时，对土壤容重和孔隙度的改善效果并不明显[32]。SAP对煤矸石基质的水分变化规律有一定的改善作用，本研究中发现，SAP质量分数在0% ~ 0.4%范围内，煤矸石基质的容重与SAP呈负相关，总孔隙度、毛管孔隙度与SAP呈正相关，且使用0.3%和0.4%的SAP对于容重和孔隙度改善效果较好，表明SAP用于煤矸石基质的使用量与添加在不同类型的土壤基质中相似，均在一定质量分数下，改善效果最好，但是煤矸石基质中使用SAP质量分数的最大限值，还需要进一步的试验验证。
3.2 SAP与煤矸石基质水分接触时间对毛管水上升高度的影响
本试验中使用的SAP呈白色细砂晶体状，遇水膨胀后变为絮凝状。不同质量分数SAP对煤矸石毛管水上升高度的抑制程度不同，这与张超英等[33]在煤矸石基质中添加丙烯酰胺和丙烯酸钾共聚物和生物炭的研究现象相似。SAP吸水主要依靠氢键，借助网络结构内外水势梯度不同，所形成的水势差作用时间的快慢，有效地将水分子封闭在网络中，从而实现对水分子的活动限制[34]。在SAP与水分接触的过程中，其SAP的使用量不同，导致膨胀的程度不同，进而与煤矸石基质所形成的空间结构必然也会有所差异。吕春娟等[35]研究表明在复垦铁尾矿砂中使用聚丙烯酰胺类保水剂对基质毛管水上升高度由大到小为0%、0.2%、0.05%、0.1%，这一现象与本文SAP对煤矸石毛管水上升高度的抑制作用并非使用量越高效果越好相一致。本文研究表明添加质量分数0.3%和0.4%的SAP对煤矸石毛管水抑制程度较好且差异不显著，多个时间段毛管水上升速率保持一致，其次是0.2%、0.1%、0%。主要原因是SAP高分子链上亲水基团与水分子接触时，自身结构的改变可能都会改变煤矸石基质的孔隙组成，进而影响煤矸石水分运移速率，这需要使用扫描电镜对SAP结构特征进行微观监测。
3.3 SAP改善煤矸石基质保水性的其他影响因素
SAP 在实际应用中，通过吸水和溶胀的保水方式将水分贮存起来，SAP 的使用方法会对其保水效果产生影响。目前对于保水剂的使用方法主要采用溶于灌溉水[36]或者撒施[37]于土壤表面，本试验考虑没有灌溉条件且节约成本的目的，采用混施的方式进行室内土柱模拟试验，便于实施观测水分运移变化。SAP的粒径会直接影响其吸水倍率从而影响煤矸石基质的保水效果，因此选择适宜粒径大小的SAP非常重要，在使用的过程中尽量混合均匀。对于不同地区确定最佳的SAP使用方式和使用量可以有效提高基质的保水性能。极端干旱荒漠区使用保水剂可提高土壤含水量和改善幼苗体内水分状况[38]。李海燕等[39]研究表明一定范围内使用SAP会增加煤矸石基质的保水量，用量过高，煤矸石基质虽然含水率有所增加，而吸水效率会降低，还会出现胶结状，使基质液相部分增加，气相部分被迫减少，影响其通透性，对植物根系水分运移不利。这与荒漠区的沙土研究有所差别，沙漠土壤和煤矸石基质的特性不同，沙漠土壤通常是贫瘠且干燥，而煤矸石基质则含有较高的颗粒物和矿物质，基质质量稍好于沙漠土壤，同时沙漠土壤主要分布于干旱荒漠区，对保水剂的使用量更多，在保持水分的同时还需考虑防风固沙，因此需要考虑SAP 的类型与粒径。不论是在沙漠土壤还是煤矸石基质中应用保水剂，都旨在改善基质的保水能力以促进植物生长，但在选择和使用方式上可能存在一些差异。此外SAP在基质应用中，其吸保水能力还与外界因素有关，诸如植物类型、土壤质地、环境温度、光照、水溶液离子浓度和离子类型等[40]。
为了更好地改善矿区生态环境，后续研究将会引入草本和灌木，拉长时间尺度，综合考虑不同植被间相互作用机制对无土矿区生态恢复效果的影响，高吸水树脂SAP 将会在矿区煤矸石基质生态修复与荒漠化防治领域呈现出良好的应用价值。
4. 结 论
（1）SAP吸水后可以改善煤矸石基质的物理性状，在SAP质量分数0% ~ 0.4%范围内，随质量分数增加，容重持续减小，毛管孔隙度和总孔隙度逐渐增大，SAP最佳使用量为0.4%。
（2）SAP极显著抑制煤矸石毛管水上升高度，且质量分数在0% ~ 0.4%范围内，随SAP使用量的增加抑制效果逐渐增强，但当SAP质量分数为0.4%时，对煤矸石毛管水抑制程度较0.3%差异不显著，但整体均好于0% ~ 0.2%。
（3）SAP质量分数为0.4%时，抑制煤矸石水分散失的能力和保水效果最强，与纯煤矸石基质相比，两者水分损失率相差12.44%，且作用时间越长，SAP的保水性能越强。
从经济上考虑，建议首选质量分数为0.3%的SAP应用于煤矸石基质中，促进矿区生态恢复，为后期植被恢复提供有利条件。
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图 1 拟南芥各株系PCR鉴定结果及GUS染色鉴定
M.标记DNA; WT.野生型; VC.空载体对照；1~8.条带1~8;A.拟南芥PebZIP26的DNA鉴定; B.拟南芥PebZIP33的DNA鉴定; C.拟南芥PebZIP26的GUS鉴定; D.拟南芥PebZIP33的GUS鉴定。
Figure 1. PCR and GUS detection of each strain of Arabidopsis thaliana
M, DNA marker; WT, wide type; VC, vacant carrier; 1-8, line 1-8; A, PCR result of PebZIP26;B, PebZIP33 DNA identification.
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图 2 PebZIP26基因及PebZIP33基因与毛果杨同源基因编码氨基酸序列比对及基因结构图
A.PebZIP26基因与PtrbZIP26基因的氨基酸序列比对；B.PebZIP33基因与PtrbZIP33基因氨基酸序列比对；C.PebZIP26基因与PebZIP33基因结构图。
Figure 2. Comparison of PebZIP26 and PebZIP33 proteins between P. euphratica and P. trichocarpa
A, comparison of amino acid sequence between gene PebZIP26 and PtrbZIP26; B, comparison of amino acid sequence between gene PebZIP33 and PtrbZIP33; C, gene structure of PebZIP26 and PebZIP33.
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图 3 胡杨PebZIP26和PebZIP33蛋白的系统进化树分析
Figure 3. Molecular phylogenetic tree analysis of PebZIP26 and PebZIP33 species
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图 4 不同处理下胡杨PebZIP26和PebZIP33基因在胡杨叶片中的表达
A.脱水处理下PebZIP26的表达量; B.脱水处理下PebZIP33的表达量; C.不同水势下PebZIP26的表达量; D.不同水势下PebZIP33的表达量；E.200 mmol/L NaCl处理下PebZIP26的表达量；F.200 mmol/L NaCl处理下PebZIP33的表达量；RC.对C组(30%水势)进行复水。不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。
Figure 4. Expression of PebZIP26 and PebZIP33 in leaf under treatments in Populus euphratica
A, expression of PebZIP26 under dehydrate treatment; B, expression of PebZIP33 under dehydrate treatment; C, expression of PebZIP26 under different water potentials; D, expression of PebZIP33 under different water potentials; E, expression of PebZIP26 under 200 mmol/L NaCl treatment; F, expression of PebZIP26 under 200 mmol/L NaCl treatment; RC, rewater of C group (30% water potentral); Different letters mean significant difference at P < 0.05 level.
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图 5 3个株系(WT、PebZIP26、PebZIP33)在不同处理下的根长比较
A~F:不同处理条件下的根长表型；G.不同处理条件下的根长统计。不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著。
Figure 5. Comparison in root length of three lines (WT, PebZIP26, PebZIP33)
A-F, root length under different treatment conditions; G, statistics of root length under different treatment conditions. Different letters mean significant difference at P < 0.05 level.
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图 6 干旱和盐胁迫下各株系的(野生型、空载体、超表达)株高的比较及复水后存活率
A.干旱处理21 d，野生型与超表达PebZIP26株系株高对比；B.干旱处理21 d，野生型与超表达PebZIP33株系株高对比；C.盐胁迫处理21 d，野生型与超表达PebZIP26株系株高对比；D.盐胁迫处理21 d，野生型与超表达PebZIP33株系株高对比; E.复水后植株存活率；F.株高统计。
Figure 6. Comparison in stem length of four lines (WT, VC, PebZIP26, PebZIP33) and survival rate being rewatered after drought and salt stress
A, stem length of WT and PebZIP26 after 21days drought treatment; B, stem length of WT and PebZIP33 after 21days drought treatment; C, stem length of WT and PebZIP26 after 21days drought treatment. D, stem length of WT and PebZIP33 after 21days drought treatment. E, survival rate 5 days later being rewatered after drought. F, statistics of stem length.
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图 7 离体叶片失水率以及地上部分干物质含量
Figure 7. Water loss rate of cut leaves and dry matter content in Populus euphratica
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图 8 离体叶片脱水处理2 h以及5 μmol/L外源ABA处理2 h时的组织化学染色检测活性氧
Figure 8. Histochemical staining assay detection of H2O2 and O2 accumulation with diaminobenzidin followed dedehydrate and 5 μmol/L exogenous ABA treatment
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图 9 5及10 μmol/L外源ABA处理后各株系的气孔开度
A.外源ABA处理后各株系气孔开度对比图；B.不同处理下各株系气孔开放宽度与长度比例。
Figure 9. Stomatal aperture ratio in response to ABA treatment in each strain
A, comparison of stomatal aperture of each strain after ABA treatment in WT and PebZIP26, PebZIP33 transgenic and corresponding mutant A. thaliana plants; B, the ratio of width and length of stomatal in different treatments.
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图 10 PebZIP33延缓种子的萌发及植株的营养生长
A.PebZIP33与WT及tga1在150 mmol/L NaCl培养基的发芽趋势；B.PebZIP33与WT及TGA1在300 mmol/L甘露醇培养基的发芽趋势；C.同一时期WT与PebZIP33植株比较。
Figure 10. PebZIP33 delay the germination of seed and nutritional growth
A, germination trend of PebZIP33 and WT and tga1 on 150 mmol/LNaCl medium; B, germination trend of PebZIP33 and WT and tga1 on 300 mmol/L mannitol medium; C, comparison of WT and PebZIP33 on leaf area at the period.
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