实验材料均自哈尔滨东北林业大学校园内。在散粉前后的1周内，观察记录花序特征和花药形态。成熟花粉采集方法为：于晴天当天10:00—16:00将雄花序套袋，次日收集新鲜花粉，放置于4 ℃冰箱保存备用。

白桦野生型雄花序(Wild-type, WT)着生于当年生枝条的顶部，单生或2~3个并生，突变体上有分别着生在枝条顶端和枝条中部的2种不同的花序^[7]。为便于描述，我们将突变体植株位于枝条顶端、与正常雄花序形态相似的雄花序命名为NLM(Normal-like male)；将枝条中部的突变雄花序命名为MM(Mutant male)。由于NLM型花序的大部分花药不开裂，故此类花粉是在显微镜下剥离花药后收集的；MM类型花序的散粉量很少，将收集到的少量花粉作为样品进行后续的花粉活力测定。

碘-碘化钾染色液的配制方法：取0.65 g碘化钾溶于蒸馏水中，加入0.15 g碘结晶，定容至50 mL。使用软毛笔将成熟花粉散于凹面载玻片上，滴加碘-碘化钾溶液1~2滴，盖上盖玻片后，将其放置在20 ℃的恒温培养箱中，20 min后在显微镜下随机选取中央的3个视野，拍照后统计花粉活力。每个样品重复5次，取平均值。

为了选取适于白桦花粉的萌发条件，使用下列3种不同培养基对成熟的野生型花粉进行花粉萌发率的测试。花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发。每种方法重复3次，每次取3个中央视野，每个视野大于20粒花粉，统计萌发率。具体实验方法如下：

方法1：参照胡适宜的方法^[8]，称取硼酸0.1 g，硝酸钙0.3 g，硫酸镁0.2 g，硝酸钾0.1 g，定容至100 mL。应用时吸取上述溶液1 mL，另加15%的蔗糖，定容至10 mL。将上述培养液滴加到载玻片上，将花粉散于培养液中，不盖盖玻片，将载玻片放入含有湿润的滤纸的平皿中，25 ℃暗培养24 h后观察其萌发情况。

方法2：参照姜雪婷等^[9]的方法，将野生型花粉散于0.01%硼酸、10%蔗糖、1%琼脂的固体培养基上。25 ℃暗培养24 h后，统计萌发率和花粉管生长长度。

方法3：将BK萌发液均匀涂于载玻片上，干约2~3 min，去除多余培养液，使花粉充分接触空气，将花粉散于载玻片上，不盖盖玻片，将载玻片放入含有湿润的滤纸的平皿中，25 ℃暗培养24 h后观察其萌发情况。BK萌发液^[10]：称取硼酸0.062 g，硫酸镁3.155 g，氯化钾0.015 g，氯化钙0.11 g，肌醇0.36 g，MES 0.213 g，蒸馏水溶解后定容至200 mL，用KOH调pH值至7.0。

DAPI染液的配制：取10 mg DAPI溶于10 mL水中。0.1 mol/L的PBS缓冲液稀释1 000倍后作为工作浓度使用。使用软毛笔将成熟花粉散于载玻片上，滴加1滴DAPI染液，盖上盖玻片，置于黑暗条件下培养15 min。在紫外灯激发的荧光显微镜下观察，拍照。

选取花药与成熟的新鲜花粉，分别粘附在样品台上，在Eiko IB5型离子溅射仪中喷金4~5 min。然后在日本Hitachi TM-1000型扫描电镜中观察，并且拍摄不同放大倍数的花药及花粉粒照片。

实验所得数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，使用GraphPad Prism进行绘图。

通过对散粉期的WT、NLM、MM 3种花序进行持续观察发现，当野生型雄花序正常散粉时(图 1a、2a)，NLM花序呈干枯褐色，为半松散状态(图 1b)，只有部分花药开裂，大部分花药始终不开裂(图 2b)；MM花序有3种不同形态，均呈干枯褐色(图 1c、1d、1e)。第1种花序松散程度与野生型较相近(图 1c)，其花药可以正常开裂(图 2c)，但散粉量很少。第2种雄花序相对较短，松散程度比第1种较差(图 1d)；其部分花药小、干瘪皱缩(图 2d蓝色箭头指示)；而另一部分表现为花药相对大而饱满，但直至花序从植株上脱落花药仍不开裂(图 2d红色箭头指示)；只有很小一部分的花药能够开裂，但几乎不能散粉(图 2d黑色箭头指示)。第3种雄花序生活力最差，花序几乎不松散，呈枯死状态，其花药极小，呈干瘪皱缩的状态(图 1e、2e)。

图  1  散粉时期的野生型与突变体的花序形态

Figure 1.  Inflorescence morphology of wild type and mutant during pollen dispersal period

图  2  散粉时期的野生型与突变体的花药形态

Figure 2.  Anther morphology of wild type and mutant during pollen dispersal periods

通常情况下，发育成熟的花粉能够积累较多的淀粉，在显微镜下可观察到野生型花粉多数呈球形，发育不良的花粉常呈崎形且无淀粉积累，I-KI溶液通过对淀粉的染色将正常花粉染色，故能通过染色情况反映出花粉的活力。染色后呈蓝色的花粉为发育良好、生活力较强的花粉，染色后呈黄褐色或无色的花粉即为生活力较差的花粉。由图 3d中可看出I-KI染色结果显示野生型与突变体的花粉可育性是存在显著差异的。如图 3a所示，野生型(WT)绝大部分的花粉被染成了蓝色，染色率为99.1%。而突变体上看似正常的花序(NLM)所产生的花粉染色率仅为64.1%(图 3b、3d)，突变花序(MM)染色率为68.9%(图 3c、3d)，说明突变体2种雄花序的花粉活力均显著低于野生型。

图  3  白桦野生型与突变体花粉的I-KI染色

Figure 3.  I-KI staining of wild type and mutant pollen of Betula platyphylla

正常的成熟花粉粒具有较强的活力，在适宜的培养条件下可以萌发和生长，在显微镜下能够直接观察到萌发和生长情况，并能统计其萌发率，确定其活力。我们以白桦野生型成熟花粉为材料，比较3种不同测定方法。结果表明，方法3的BK萌发液对于白桦花粉萌发效果最佳，萌发率可达89.02%(图 4c、4d)；其次是方法1，萌发率为33.24%(图 4a、4d)。而第2种固体培养基的萌发效果最差，仅为22.44%(图 4c、4d)。故选择方法3即BK萌发液对野生型和突变体的花粉活力进行检测。

图  4  3种花粉萌发方法的比较

Figure 4.  Comparison of three pollen germination methods

利用方法3的BK萌发液对WT、NLM、MM 3种不同雄花序的花粉进行萌发率统计分析。野生型花粉(WT)大部分可以正常萌发，萌发率可达88.9%(图 5a、5d)，而突变体上的2种花序所产生的花粉几乎不能萌发，萌发率只有1.63%(图 5b、5d)和1.86%(图 5c、5d)，表明突变体的2种雄花序中的花粉萌发率极显著低于野生型。

图  5  白桦野生型与突变体花粉萌发率分析

Figure 5.  Pollen germination rate of wild type and mutant in Betula platyphylla

DAPI是一种荧光染料，可穿透细胞膜与细胞核中的DNA结合而发挥标记作用。花粉粒经DAPI染色后在荧光显微镜下可观察到细胞核的形态变化。DAPI染色结果显示，白桦野生型花粉饱满且可见2个荧光信号较强的细胞核(图 6a)。突变体上2种花序所产生的花粉粒均出现或皱缩、或膨大、或变形等现象，且细胞核荧光信号弱，看不到细胞核(图 6b、6c)。图中箭头指示处为皱缩或膨大的败育花粉。上述结果表明，突变体花粉粒的细胞核发育出现异常。

图  6  白桦野生型与突变体花粉的DAPI染色

Figure 6.  DAPI staining of wild type and mutant pollen of Betula platyphylla

扫描电镜结果显示，野生型花药外壁上有很多浅绒状的条纹，排列整齐(图 7a)。而突变体中NLM花序的不开裂花药，其花药外壁条纹发生凸起(图 7b)；突变体中MM花序的花药，其花药外壁条纹凸起更为显著(图 7c)。野生型白桦花粉粒呈近球形，表面有凹陷；使用光学显微镜观察新鲜的野生型花粉，其同样呈现具有凹陷的球状(图 8a)。花粉之间的分散程度较好，每个花粉具有3个萌发孔，颗粒状纹饰，有明显的孔环(annulus)和孔盖(operculum)(图 7d、7g)。而突变体中2种花序的花粉粒形态异于野生型，具体表现为花粉粒大小不一，多数呈无凹陷的球形；花粉之间的分散程度较差，花粉粒间似有不明物附着。虽也具有3个萌发孔和颗粒状纹饰，但萌发孔均小于野生型，且孔盖严重内陷(图 7h、7i；图 8b、8c)。

图  7  白桦野生型与突变体花药花粉的扫描电镜观察

Figure 7.  Anther and pollen observation of WT and mutant for Betula platyphylla using scanning electron microscopy

图  8  白桦野生型与突变体花药花粉的光学显微镜观察

Figure 8.  Pollen observation of WT and mutant using light microscope

通过扫描电镜和光学显微镜观察发现大多数突变体白桦花粉粒形态异常，野生型白桦花粉粒呈凹陷的近球形，而突变体呈饱满的球形，而这些形态异常的花粉不能正常地萌发(图 5)，这与前人报道的葡萄(Vitis vinifere)花粉形态异常进而观察到花粉不能萌发相似^[18]。突变体花粉萌发孔数量和纹饰性状与野生型无异，但萌发孔小于野生型且严重内陷。萌发孔是花粉萌发的通道，萌发孔孔盖突出程度与花粉粒败育的早晚成正相关，且突出的不同程度是由发孔区内壁外层(Zwischenkorper层)与内壁的缺乏和结构异常造成的^[19]。有关萌发孔孔盖与花粉活力，萌发力的关系的报道较少。但小麦(Triticum aestivum)T型雄性不育系花粉败育时的花粉粒的萌发孔盖也出现了严重内陷的表型^[19]。同样地，在水稻(Oryza sativa)Osfmds雌雄不育双突变体花粉中也发现了萌发孔孔盖小的现象^[20]。综上，我们推测突变体花粉异与野生型花粉的形态变化，可能是导致其不育的原因之一。

花药和花粉发育出现异常的过程是植物雄性不育研究的重点，现已在多种草本植物中均发现了该类突变体^[11-13]，而关于木本植物雄花突变体的报道鲜有报道。在刘雪梅等^[7]的研究中发现了1个白桦雄花突变体，该突变体的花药及雄配子体在单核小孢子后期发生败育，第2年春天不进行有丝分裂，不能形成成熟的花粉；另外，该突变体上形态看似正常的雄花序虽然能形成单核小孢子越冬，在第2年春天能形成成熟花粉，但只有部分花药开裂并散粉。本文进一步对该突变体散粉时的雄花序、花药进行观察，并对其花粉的活性和萌发力进行检测。研究发现，与野生型的绿色花序相比，突变体的2种花序均呈干枯的褐色且散粉量很少；且突变体花药部分不开裂，花粉活性较低，萌发率差。进一步判断该突变体花药花粉发育异常，这一发现扩宽了白桦不育种质的遗传基础。

花粉活力主要指花粉的寿命，以及在此过程中其具有的生长和萌发的能力。植物花粉生活力的检测方法主要有无机酸法、染色法、离体萌发法^[14]。各种测定花粉生活力的方法可以反映花粉的营养含量和代谢情况，但不能直接体现花粉的萌发率^[15-16]。因此，只有在与花粉离体萌发实验结果相一致时，该测量方法才可应用。本文采用碘-碘化钾染色法、DAPI染色、离体培养3种方法检测白桦花粉活力。通过对测定结果的分析认为，DAPI染色和离体培养法更适用于白桦花粉生活力的测定。NLM和MM花粉的碘-碘化钾染色率分别为64.1%和68.9%，而二者的萌发率只有1.63%和1.86%。表明I-KI染色法并不适于白桦花粉生活力的检测，这与前人研究结果一致^[17]。另外，本文对3种花粉离体萌发方法进行了比较，选择了一种萌发率可达90%左右的白桦花粉离体培养方法，为白桦育种工作提供了理论指导。