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油松FT/TFL1-like基因表达模式与调控分析

刘洋 李帮同 杜桂华 黄东旭 周先清 钮世辉 李伟

引用本文:
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油松FT/TFL1-like基因表达模式与调控分析

    作者简介: 刘洋。主要研究方向:针叶树遗传改良。Email: xiaoyang_jiajia@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院.
    通讯作者: 钮世辉,博士,副教授。主要研究方向:针叶树生殖发育调控。Email:arrennew@bjfu.edu.cn 地址:同上. 
  • 基金项目:

    中央高校基本科研业务费专项资金项目 2015ZCQ-SW-02

    国家自然科学基金项目 31600535

    国家自然科学基金项目 31770713

  • 中图分类号: S722

Expression profiles and regulation of FT/TFL1-like genes in Pinus tabuliformis

图(7)
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-01-30
  • 录用日期:  2018-04-25
  • 刊出日期:  2018-10-01

油松FT/TFL1-like基因表达模式与调控分析

    通讯作者: 钮世辉, arrennew@bjfu.edu.cn
    作者简介: 刘洋。主要研究方向:针叶树遗传改良。Email: xiaoyang_jiajia@163.com 地址:100083 北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院
  • 1. 北京林业大学林木育种国家工程实验室,北京 100083
  • 2. 山西省林业种苗管理总站,山西 太原 030001
  • 3. 内蒙古宁城县农牧业局,内蒙古 宁城 024200
  • 4. 河北省平泉市国有七沟林场,国家油松良种基地,河北 平泉 067509
基金项目:  中央高校基本科研业务费专项资金项目 2015ZCQ-SW-02国家自然科学基金项目 31600535国家自然科学基金项目 31770713

摘要: 目的PEBP基因家族的FT-like与TFL1-like亚基因家族在被子植物生殖发育调控网络中处于核心调控节点,而在针叶树中,仅存在未分化的FT/TFL1-like亚基因家族。研究表明针叶树FT/TFL1-like可能在生殖发育、生长节律及休眠过程中发挥重要功能。然而,目前关于针叶树FT/TFL1-like基因系统的表达模式与不同环境因子对其表达的调控仍然缺乏深入认识。方法本研究从油松中分离得到两个FT/TFL1-like基因,分别命名为PtTFL1与PtTFL2,对它们在不同组织、不同发育阶段雌雄球花、休眠与解除休眠过程中针叶、深冬相对高温、不同光质与光周期处理中的表达水平进行了系统分析。结果PtTFL1仅在花粉中特异表达,在其他组织中只有痕量表达或不表达。而PtTFL2表达范围非常广泛,且在芽组织中的表达丰度显著高于其他组织,二者在快速增殖的愈伤组织中均无明显表达;另外,对PtTFL2在不同环境下表达水平进行分析发现,PtTFL2在芽、针叶休眠时期大量积累,且随着休眠解除表达量水平持续降低;在不足以打破休眠的相对高温处理下,PtTFL2的表达受到极显著的抑制;短日照下远红光处理可以高效诱导PtTFL2的表达。结论由此可知,PtTFL1在油松生殖发育进程中的特异性可能与花粉成熟过程相关,而PtTFL2可能参与更多其他发育调控,但二者均不是维持细胞活性所必须的基因;秋季环境条件非常利于PtTFL2在针叶、芽中大量表达,其表达模式与休眠过程高度相关,但PtTFL2对温度响应过于敏感,其在针叶、雌雄球花中的表达模式很可能是对温度响应的结果,这表明PtTFL2自身的表达可能并不足以维持休眠,也并不作为球花发育调控中的控制因子,而很可能只是作为一个温度、短日照远红光信号的感受与传递因子。本研究为深入理解FT/TFL1-like基因在油松生殖与休眠等重要发育过程中的功能,揭示不同环境因子对其表达的调控作用提供了重要依据。

English Abstract

  • FT基因是被子植物开花诱导中最核心的调控因子之一,是整合外源性和内源性开花信号的关键节点[1]TFL1与FT同属于PEBP基因家族,两者氨基酸序列高度相似,但功能上却表现为相互拮抗[2]。基于全基因组水平分析发现,针叶树中可能并不存在FT的直系同源基因[3-4],最初从挪威云杉(Picea abies)中分离的两个FT类似基因[5],后来在拟南芥异源表达中发现均会严重抑制成花诱导,与超表达FT效应正好相反,而相似于TFL基因效应,因此这两个基因在后期研究中分别被重命名为PaTFL1与PaTFL2[6-7]。另外,通过基因表达分析显示PaTFL1只在雄花大孢子中表达,而PaTFL2在针叶、营养芽与花芽中均有表达[5]。最近研究表明TFL2可能在针叶树的生长节律[5]、封顶(Bud set)与休眠调控中发挥重要作用[8-9]。这些研究为揭示针叶树FT/TFL1-like基因的功能提供了重要依据。然而,目前针叶树FT/TFL1-like基因系统的表达模式与不同环境因子对其表达的调控作用仍然缺乏深入认识,以致以往研究对其关联性调控作用机制的推测可能存在偏差。

    油松(Pinus tabuliformis)是我国重要的乡土针叶树种之一,在北方山区的经济发展和生态建设中具有重要地位。为深入理解FT/TFL1-like基因在油松生殖与休眠等重要发育过程中的功能,揭示不同环境因子对其表达的调控作用。本研究从油松中克隆了两个FT/TFL1-like基因PtTFL1与PtTFL2,对它们在不同组织、不同发育阶段雌雄球花、休眠与解除休眠过程中针叶、深冬中相对高温、不同光质与光周期中的表达水平进行了系统分析。

    • 根据已进行全基因组测序的针叶树物种挪威云杉FT/TFL1-like基因PaTFL1(JN039333)、PaTFL2(EF601975)[7]序列与油松参考转录组中最长对应unigene序列设计特异引物,克隆测序后上传至NCBI,经比对分析获得全长CDS序列。提取油松针叶RNA后反转录为cDNA文库,通过特异性引物扩增得到PtTFL1、PtTFL2,克隆后测序。引物序列为TFL1-F(3′-5′):ATGTCTCGCTTCGTGGAGCCAC;TFL1-R(3′-5′):TCAGCGTCTTCTACCTGCTGT;TFL2-F(3′-5′):TGGCCAGGTTCAGAGAGCCT;TFL2-R(3′-5′):TCAGAAGCGCCTTCGGGGCGC。获得序列已经上传NCBI数据库:PtTFL1(KJ711113)、PtTFL2(KJ711114)。将候选基因DNA序列利用ClustalX[10]进行多重比对,利用MEGA软件[11]构建ML进化树,Bootstrap值通过1000次bootstrap重复获得。

    • 为了深入理解油松PtTFL1、PtTFL2的功能,对其在不同组织中的表达模式及不同培养环境对它们表达的影响进行了系统分析。相关实验材料处理与样品采集方式如下:

      不同组织样品:针叶、茎干形成层、根、新鲜花粉样品取自河北省平泉市国有七沟林场国家油松良种基地(118°44′40″E,40°98′53″N, 海拔为560~580m)成年油松,在春季生长旺季(2016年5月10日)采集于3株油松的不同组织部位;新形成的营养芽、发育初期雌雄球果花芽取自9月底;愈伤组织诱导自针叶。每组样品取3个生物学重复。

      雌雄球花不同发育阶段样品:将雌雄球花从表型可辨别到发育成熟的过程分为6个阶段,每个阶段样品取3个生物学重复,采样时间及球花表型详见前期发表文献[12]

      休眠及休眠解除过程样品:于冬天(2017年1月10日)、春天(2017年3月10日、3月15日、3月20日)采集不同成年油松针叶,每个时间点取12个生物学重复。

      温度响应样品:选取长势一致的20株盆栽油松,随机分为两组,于冬天(室外温度-2~-14℃)将其中一组移至室内(室内温度4~8℃),一周后采集处理苗木针叶。室内与室外各取9个生物学重复,共18株进行分析。

      光质与光周期处理样品:选取长势一致的60株盆栽油松幼苗,随机分为6组,其中3组进行长日照处理(16h光/8h暗),其余进行短日照处理(10h光/14h暗);不同光周期下进行3种光质处理,分别为白光、红光及远红光处理。处理1个月后采集针叶,每个处理取3个生物学重复。

      样品采集后立即放入液氮里带回实验室,在后续试验之前所有样品均保存于-80℃超低温冰箱。

    • 提取样品总RNA,质量检测合格后进行RNA-seq文库构建,基于Illumina Hiseq XTen测序平台进行2×150bp双端测序,所有样本测序通量为6G数据,测序后的质量控制Q30均在90%以上,基因表达丰度利用Kallisto软件估算[13],计算参数采用默认参数。对不同处理条件下油松针叶进行RNA-seq分析,将各文库clean reads与PtTFL1、PtTFL2全长序列进行map,并计算两基因的TPM(Transcripts Per Million Reads)值,并以此比较两基因在不同处理条件下的相对表达丰度。

    • FT/TFL1-like蛋白是一类由~170个氨基酸编码的转录因子,其蛋白序列在进化过程中非常保守,虽然油松PtTFL1与PtTFL2之间的氨基酸序列一致性只有78%,但他们与云杉相应成员的氨基酸序列相似度都在94%以上,表明这两类基因在针叶树物种分化之初就发生了分离。裸子植物FT/TFL1-like蛋白可以明显聚为两类,但两类蛋白均与被子植物开花激活因子FT以及开花抑制因子TFL1遗传距离相当(图 1),如PtTFL1、PtTFL2氨基酸序列与拟南芥AtFT相比序列一致性分别是64%和62%,而与AtTFL1序列一致性分别是62%和58%(图 2),表明被子植物FT/TFL1-like蛋白功能的拮抗性分化可能发生在从原始裸子植物共同祖先分离之后发生的。在部分保守的序列中,油松FT/TFL1-like蛋白有14个氨基酸序列仅与AtFT相同,有16个仅与AtTFL1相同(图 2),表明这些蛋白功能的不同可能来自于少数氨基酸位点的差异[2, 14]

      图  1  种子植物FT/TFL1-like蛋白系统发育分析

      Figure 1.  Phylogenetic analysis of seed plant FT/TFL1-like protein

      图  2  油松FT/TFL1-like蛋白与AtFT及AtTFL1序列比对

      Figure 2.  Amino acid sequence alignment of FT/TFL1-like proteins in P. tabuliformis with AtFT and AtTFL1

    • 为了理解PtTFL1、PtTFL2潜在的功能,我们对它们的组织表达模式进行了分析。结果显示,PtTFL1除了在花粉中表达量较高外,在其他组织中只有痕量表达或不表达(图 3),对挪威云杉不同组织转录组(http://congenie.org)分析发现,PaTFL1(MA_400747g0010)也只在发育晚期的雄球花中表达,暗示TFL1在针叶树中可能特异地与花粉的成熟过程相关。PtTFL2与PtTFL1表达差异非常大,其几乎不在成熟花粉中表达,而在针叶、营养芽、雌雄球花花芽和根中均有表达,在芽组织中的表达丰度要高于其他组织(图 3)。广泛的表达部位暗示除了生殖发育调控,PtTFL2还可能参与其他发育过程,但PtTFL1与PtTFL2均不在快速增殖的愈伤组织细胞中表达,表明FT/TFL1-like蛋白并不是维持细胞活性所必需的蛋白。

      图  3  油松PtTFL1、PtTFL2在不同组织中的表达模式

      Figure 3.  Expression profiles of PtTFL1 and PtTFL2 in different tissue type of P. tabuliformis

    • 由于PtTFL1仅在雄球花发育后期与成熟的花粉中特异表达(图 3),后续表达分析仅针对PtTFL2进行。我们分析了PtTFL2在雌雄球花整个发育进程中6个不同发育阶段[12]的表达水平,发现其表达水平随着发育进程急剧降低(图 4)。由于油松球花发育过程中要经历冬季休眠过程,有研究表明TFL2在云杉中可能与休眠相关[9],而同一时期雄球花中的PtTFL2表达量比雌球花中更低,这一表达模式也与油松中雄球花在春季比雌球花更早萌动相一致,因此PtTFL2在休眠前(VB、M1、F1)与休眠刚被打破时(M2,F2)的高表达可能是休眠调控的结果,而不是与球花发育调控相关。

      图  4  油松PtTFL2在雌雄球花发育中的表达模式

      Figure 4.  Expression patterns of PtTFL2 in developing male and female cones of P. tabuliformis

    • 为了验证油松中PtTFL2的表达水平是否会随着休眠的解除而改变,我们分析了12株自然环境下成年油松针叶中PtTFL2随着休眠解除的表达变化。结果显示,在深冬PtTFL2大量表达,在春季临近冬芽萌动前[15],其表达被抑制,随着休眠的解除,其表达水平持续降低(图 5)。本结果表明,在油松中PtTFL2的表达的确与休眠过程相关。在休眠解除过程中,同时伴随着温度的升高与日照时间的增长,PtTFL2的表达是否以及受何种环境因子的调控需要进一步深入研究。

      图  5  PtTFL2在冬季与春季针叶中的表达模式

      Figure 5.  Expression profiles of PtTFL2 in needles in mid-winter and spring

    • 在被子植物中,现有理论认为休眠的建立依赖低温与光周期信号,而打破休眠仅依赖温度信号[16]。为了进一步理解PtTFL2在针叶树休眠过程中的作用,我们分析了其对于不同环境信号的表达响应。结果表明,PtTFL2的表达对温度十分敏感,即便在深冬深度休眠中,在相对高温(4~8℃)下处理1周,虽然远不足以打破休眠,但仍然极显著地抑制了PtTFL2的表达(图 6)。该结果表明PtTFL2自身的表达可能不足以维持休眠,它很可能只是一个温度信号的感受与传递者。

      图  6  冬季与春季针叶中PtTFL2的表达模式

      Figure 6.  Expression profiles of PtTFL2 in needles in mid-winter and spring

      通过进一步分析PtTFL2对日照长短及不同光质的响应,结果显示短日照可以显著诱导PtTFL2的表达,且短日照下远红光信号对其诱导效率显著高于其他处理。然而,远红光在长日照条件下却并不影响其表达(图 7),表明在光调控通路中,短日照对于PtTFL2的表达调控是必需的,而远红光是短日照条件下主要的光信号。该结果为理解PtTFL2在秋季休眠建立过程中发挥的作用提供了全新的视野。

      图  7  长日照、短日照、红光与远红光对PtTFL2的表达调控

      Figure 7.  Expressional regulation of PtTFL2 by the day length, red light and far-red light

    • 本研究分离得到油松两个FT/TFL1-like基因,系统发育分析表明两者编码蛋白与被子植物FT和TFL遗传距离相当,然而,它们在油松中的表达模式却截然不同,且两者表达部位互不重叠。其中,PtTFL1非常特异地在花粉中表达(图 3),可能仅参与花粉发育与成熟过程的调控,而PtTFL2的表达模式表明其可能发挥着更为广泛的作用(图 3)。在云杉中的研究表明PaTFL1只在雄花大孢子中表达,而PaTFL2在针叶、营养芽与球花花芽中均有表达[5],这种表达模式与油松中的基本一致,表明在针叶树中,两个FT/TFL1-like基因具有显著的功能分化,而且这种机制在针叶树中是十分保守的。因此,本文对于油松相关基因的调控研究,对其他针叶树相关基因及其功能的研究将具有普遍参考价值。

      最近研究表明在模式植物拟南芥中,TFL1除了调控生殖发育,同时还可能调控根的发育[17]PtTFL2在根中具有与TFL1相似的表达水平(图 3),暗示这种调控作用在针叶树中可能是保守的。在被子植物中FT蛋白发挥著名的“成花素”功能,其在叶中感知调控信号,FT蛋白可以通过长距离运输从叶片转移至顶芽发挥功能[18]。虽然PtTFL2同样在针叶中表达,对挪威云杉不同组织转录组(http://congenie.org)分析也同样发现PaTFL2(MA_5386467g0010)在球花原基分化期于针叶中大量表达,目前我们尚不清楚PtTFL2是否同样可以长距离运输,不过其在营养芽与球花花芽中均具有较高的表达量,其移动特性可能并不具备FT蛋白同等重要的生理功能。

    • 虽然针叶树中存在两个FT类似基因,但在拟南芥中这两个基因异源表达均会严重抑制成花诱导,与FT的超表达效应正好相反,而与TFL1基因效应相似,因此这两个基因在后续研究中分别被重命名为TFL1与TFL2[6-7]。现在仍然不确定哪个基因在针叶树中发挥“成花素”功能。在油松中,我们虽然发现PtTFL2在雌雄球花早期花芽中具有很高的表达水平,并随着发育过程表达量逐渐降低(图 4),但后续分析发现PtTFL2对温度十分敏感(图 6),因此,在雌雄球花中相同的表达变化是与采样过程中温度的变化高度相关的,PtTFL2在花芽中的表达更有可能与芽的休眠过程相关,而不是受球花发育进程的影响。研究表明要想全面解析TFL2在针叶树生殖发育中的调控作用还需开展更深入的研究。

      近期研究表明TFL2可能在针叶树的封顶与休眠调控中发挥重要作用[8-9]。本研究发现,PtTFL2在油松春季休眠解除过程中表达水平逐渐降低(图 5),表明PtTFL2很可能是休眠解除的抑制因子。在针叶树中,TFL2的表达调控机制尚未被解析。本研究发现,在油松中PtTFL2同时被低温与短日照所诱导,两种环境因子的作用是相对独立的(图 67)。但是,在未能解除休眠的温度下,可以较迅速地抑制PtTFL2的表达,暗示PtTFL2可能是环境信号感受因子,而不太可能是休眠的直接维持因子。

      在植物生长发育中,红光与远红光是两种至关重要的光调控信号,两种光质被相同的光受体光敏色素(PHY)所感知。PHY存在两种状态:有活性的Pfr与无活性的Pr状态。Pr可以吸收红光,Pfr可以吸收远红光从而逆转PHY的活性状态,两者之间的平衡依赖光中红光与远红光的比例[19]。本研究发现,远红光可以显著激活短日照条件下PtTFL2的表达,这种激活效应依赖日照长短,在长日照条件下不能单独发挥作用。该结果表明秋季日照长度的缩短激活了PtTFL2的表达,该基因的表达是启动休眠程序所必需的条件。由于在黑暗条件下,Pfr会自发地转变为Pr,因此,在长夜条件下(短日照),会有更多的Pfr转变为Pr,远红光信号可以极显著地促进这一进程,表明短日照下远红光对PtTFL2的激活依赖PHY活性的抑制,且该过程很可能需要其他短日照调控因子的参与,这一机制有待进一步深入解析。

参考文献 (19)

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