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蔷薇属(Rosa)植物是世界著名的观赏植物,野生蔷薇属植物作为蔷薇属的重要组成部分,在育种研究中具有十分重要的地位。我国是蔷薇属植物的分布中心,在全属200余种植物中,原产于中国的蔷薇属植物约95种,其中有65个是特有种[1]。西南地区集中分布了约70%的种类,是我国蔷薇属植物的分布中心。
目前,国际上惯用的分类系统是由Rehder[2]和Wissemann[3]提出的,该系统将蔷薇属分为了4个亚属:R. subgen. Hulthemia、R. subgen. Platyrhodon、R. subgen. Hesperhodos、R. subgen. Rosa,其中蔷薇亚属(R. subgen. Rosa)包含了95%以上的物种。俞德浚[4]根据国内蔷薇属的具体情况将中国产和引进的蔷薇属分为2个亚属、9个组、7个系,其中单叶蔷薇亚属(R. subgen. Hulthemia)有1种;其余为蔷薇亚属,包含了芹叶组(Sect. Pimpinellifoliae)、蔷薇组(Sect. Rosa)、桂味组(Sect. Cinnamomeae)、月季组(Sect. Chinenses)、合柱组(Sect. Synstylae)、木香组(Sect. Banksianae)、金缨子组(Sect. Laevigatae)、硕苞组(Sect. Bracteatae)、小叶组(Sect. Microphyllae)9个组。然而蔷薇属植物的生长形态易受生长环境、气候变化等因素的影响,因此基于表型性状的蔷薇属分类研究易产生分歧[5]。在细胞学水平的分类研究中,基于核型分析、染色体数目和形态的分类方法也有着重要的参考价值[3, 7-8]。在分子水平上,基于叶绿体DNA序列、核基因组中内转录间隔区(ITS)序列和单拷贝核基因的分类方法有着较为普遍的应用[9-14]。但是,由于蔷薇属中存在种间杂交以及异源多倍化的现象[9-10],这些研究结果往往不支持现有的分类系统,而且它们之间也存在着许多矛盾。总之,蔷薇属植物系统发生问题尚未得到解决。
SSR标记是当前植物分子生物学研究中广泛应用的分子标记,具有高分辨率、高稳定性、重复性好、共显性遗传和操作简单等特点[15]。在多倍体杂合子中,由于某些等位基因会存在多个拷贝,SSR标记的条带数量有时会小于该物种的倍性,此类个体被Bruvo定义为“部分杂合子”[16]。Esselink等[17]提出MAC-PR方法,即使用各个等位基因的峰面积比值来推断部分杂合子的基因型。此外,SSR标记的最大条带数还可用于估测样本的倍性。对于大量的样本而言,此方法可代替流式细胞仪和核型分析来鉴定多倍体[18]。这一方法在苹果属(Molus)[19]、花楸属(Sorbus)[20]等植物中得到了良好的应用。
单拷贝核基因作为序列信息,具有中等程度的进化速率和适合系统发生分析的基因结构。它是直系同源基因,而且没有内部重复和核苷酸偏向性,更适合构建植物的系统发生关系。Joly等[21]开发了单拷贝基因GAPDH作为核基因标记,重构了北美蔷薇属植物的多倍体起源,并且这一标记在研究蔷薇属植物系统发生过程中起了重要作用[9-10, 14]。
蔷薇属植物特别是野生蔷薇属植物的系统发生研究存在着很多的困难,我国作为野生蔷薇属植物分布中心,资源丰富,但目前尚未有研究可以指明其种间复杂的遗传关系[22]。因此,本文分别使用SSR标记和单拷贝核基因标记对蔷薇属的遗传多样性与遗传关系进行研究,旨在构建中国产野生蔷薇属植物遗传背景,探讨部分品种的起源,为蔷薇属植物及品种的演化、系统分类提供分子学依据;也为种间杂交亲本的选择提供一定指导,为进一步开发我国丰富的野生蔷薇属植物资源奠定理论基础。
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供试材料样本总计50份,包括37种野生蔷薇属植物和5个古老月季品种, 采自昆明杨月季园艺有限责任公司及国家花卉工程技术研究中心种质资源圃,样本信息见表 1。采集的新鲜嫩叶,置于硅胶中干燥保存。
表 1 50个样本名录
Table 1. List of samples
编号No. 种/品种名Specie/variety 组Section 倍性Ploidy level 1 月月红R. chinensis ‘Slater’s Crimson China’ 月季组Sect. Chinenses 2[1] 2 月月粉R. chinensis ‘Old Blush’ 月季组Sect. Chinenses 2[1] 3 单瓣月季花R. chinensis var. spontanea 月季组Sect. Chinenses 2[1] 4 ‘云蒸霞蔚’R. ‘Yunzheng Xiawei’ 月季组Sect. Chinenses 4[23] 5 香水月季R. odorata 月季组Sect. Chinenses 2[24] 6 粉红香水月季R. odorata var. erubescens 月季组Sect. Chinenses 未知Unkonwn 7 粉红香水R. odorata var. erubescens 月季组Sect. Chinenses 未知Unkonwn 8 香水月季R. odorata 月季组Sect. Chinenses 2[24] 9 ‘软香红’R.‘Ruanxianghong’ 月季组Sect. Chinenses 4[24] 10 ‘四面镜’R.‘Simianjing’ 月季组Sect. Chinenses 3[24] 11 桔黄香水月季R. odorata var. pseudindica 月季组Sect. Chinenses 2[24] 12 大花香水月季R. odorata var. gigantea 月季组Sect. Chinenses 2[24] 13 香水月季R. odorata 月季组Sect. Chinenses 2[24] 14 亮叶月季R. lucidissima 月季组Sect. Chinenses 未知Unkonwn 15 弯刺蔷薇R. beggeriana 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 16 弯刺蔷薇R. beggeriana 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 17 刺蔷薇R. acicularis 桂味组Sect. Cinnamomeae 4, 8[1] 18 疏花蔷薇R. laxa 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 19 疏花蔷薇R. laxa 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 20 疏花蔷薇R. laxa 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 21 美蔷薇R. bella 桂味组Sect. Cinnamomeae 4[11] 22 山刺玫R. davurica 桂味组Sect. Cinnamomeae 2, 4, 6[11] 23 华西蔷薇R. moyesii 桂味组Sect. Cinnamomeae 未知Unkonwn 24 大叶蔷薇R. macrophylla 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 25 西藏蔷薇R. tibetica 桂味组Sect. Cinnamomeae 未知Unkonwn 26 密刺蔷薇R. spinosissima 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 4[11] 27 黄刺玫R. xanthina 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[1] 28 异味蔷薇R. foetida 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 4[11] 29 绢毛蔷薇R. sericea 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[1] 30 单瓣黄刺玫R. xanthina f. normalis 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2, 4[1] 31 报春刺玫R. primula 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[24] 32 密刺蔷薇R. spinosissima 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 4[11] 33 峨眉蔷薇R. omeiensis 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[11] 34 毛叶蔷薇R. mairei 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 未知Unkonwn 35 少对峨眉蔷薇R. omeiensis f. paucijuga 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 未知Unkonwn 36 绢毛蔷薇R. sericea 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[1] 37 川西蔷薇R. sikangensis 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 未知Unkonwn 38 白玉堂R. multiflora var. albo-plena 合柱组Sect. Synstylae 2, 3[1] 39 野蔷薇R. multiflora 合柱组Sect. Synstylae 2, 3[1] 40 长尖叶蔷薇R. longicuspis 合柱组Sect. Synstylae 2[11] 41 小叶川滇蔷薇R. soulieana var. microphylla 合柱组Sect. Synstylae 2[11] 42 卵果蔷薇R. helenae 合柱组Sect. Synstylae 2[11] 43 悬钩子蔷薇R. rubus 合柱组Sect. Synstylae 2, 3[11] 44 银粉蔷薇R. anemoniflora 合柱组Sect. Synstylae 4[24] 45 金樱子R. laevigata 金缨子组Sect. Laevigatae 2[11] 46 木香花R. banksiae 木香组Sect. Banksianae 2, 4[1] 47 单瓣木香花R. banksiae var. normalis 木香组Sect. Banksianae 2[1] 48 硕苞蔷薇R. bracteata 硕苞组Sect. Bracteatae 2[24] 49 缫丝花R. roxburghii 小叶组Sect. Microphyllae 2[11] 50 中甸刺玫R. praelucens 小叶组Sect. Microphyllae 10[11] -
取保存于硅胶中的干燥叶片,采用高效植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司,北京)提取样本基因组DNA。随后取5 μL样本基因组DNA用于琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量与浓度,剩余DNA置于-20 ℃冰箱内冷冻保存。
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本文所用SSR引物CL2996、H22E04、H23017、Rw22A3来自Hibrand-Saint Oyant的研究[24],其余引物来自于超的研究[22],引物信息参见表 2,29条引物覆盖了蔷薇属7个连锁群。PCR采用15 μL反应体系,每个体系中加入DNA模板1.0 μL,5U Taq酶0.1 μL,10 mmol/L dNTP 0.3 μL,上下游引物各5 μL,25 mmol/L MgCl2 0.4 μL,10×Buffer I 1.5 μL,ddH2O补齐至15 μL。PCR扩增程序为95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,循环35次;72 ℃再延伸5 min。
表 2 SSR引物信息
Table 2. Information of SSR primers
SSR编号SSR No. 基序Motif 连锁群[23] Linkage group 退火温度Annealing temperature/℃ 目标片段大小Expected size/bp 上游引物Forward primer (5′-3′) 下游引物Reverse primer (5′-3′) CL2996 (CCG)17 2 55.0 183 GCCACCATAGCCAGAGACAT AGAAGAAGTTGACGACAGGGAC H22E04 (AAG)7 6 55.0 241 GACATCACCACCACCACAAG AACCAAGGTTTCCAGTTCCA H23017 (CT)11 1 55.0 218 ACACCAAGCAAACCAAAACC AGCACGAAAACCGAGAGAGA Rw22A3 (TTC)6 6 52.9 150 AGAGAATTGAAAAGGGCAAG GAGCAAGCAAGACACTGTAA 327 (CTT)6 59.8 277, 232, 202 ACTCCTCCAAAGCTTCACCA CCTCATCGACAGAGTCGTCA 336 (TC)9 4 59.9 171, 185, 213 CAAACGAAACCCTCTGCTTC GACGATGCATTTGGTGTGAC 353 (TC)7 5 59.7 212, 107, 223 CGCCCTAGTCTCCTCTCTCTC CTCAAGCTGAAGCTCGGAGT 373 (CT)10 6 58.9 100, 106, 233 ACAAACTTCGCGATTCCTCT AGTTCCAGACGTTGGAGTGC 387 (CT)9 2 58.7 202, 229, 223 GCACTCTTGACGTTGTCCAT GTCAATGTAGTCCGGTTCGG 397 (CT)14 4 59.9 222, 221, 252 GGCCTAGCAAAGCAACAAAC AGTGGAGGGCAGTCTCTGAA 405 (ATG)5 7 59.9 265, 183, 237 CAGCGAAAAGAACAAGGACC CAGAAGCTAATAAATTAACAATCACCA 464 (TCGGA)3 59.5 134, 250, 149 TCTTTCGGTTCAGAAAGTTCG CTCGCTGATCTTGTCCATCA 467 (CGA)5 2 60.0 173, 174, 161 GTACGCTCTCTGGTCTTCGG CCCATGTCTCTGGCTATGGT 490 (TCT)6 60.0 128, 125, 272 ACAACCAACCCAAGAACTCG TCCCAGCTTCAGTCTCACCT 509 (CAC)5 7 60.0 208, 252, 261 CAACTGGGTTGGGTCAGTCT TCAAATGTACCTTGCGCTTG 510 (AAG)5 2 60.1 190, 157, 156 AGAGGTTTAGGGCAGCCATT GCGAATGATGGTGGAGAGTT 521 (GA)8 6 60.5 225, 224, 229 GTTCCAGCAGCACTCCAAGT AGAGGGGATTAGCTGCACTG 541 (AG)7 6 59.7 241, 243, 242 CTACTCCAATGTCCGCTTCC GTTGGAGAAGAAGCCGTGAG 593 (GA)7 60.1 136, 134, 119 TAACCAGGTCCTCACGAAGG AACAAATCCCCCAGGATAGG 596 (AGG)5 5 60.6 211, 212, 222 CGAGGAAAAACCCAAAATCC TGGAAGCAAGAAAAGGCAGT 625 (TC)8 7 59.0 143, 213, 142 CGCGTCTCTCACATCTCAAA AAGATCTTCTCTCCGGCCTT 629 (CTT)7 6 59.7 270, 273, 223 CACGAGCTCTCTCTCCCCTA TTGGTCTGTGAAGTGGTGGA 632 (GCCACC)3 60.1 153, 152, 154 AACTCATGGGTTCGTTGAGC GGTTGCGGAGAGAGAACAAG 637 (TTGATT)3 7 60.1 280, 279, 280 GCCGTAATTCGTGGAAAGAA ATGCCACCAGAACCTTGAAC 648 (CT)8 6 60.5 167, 169, 217 CCTAAAGCTTAAGCCCCCAA GCAATAGACTTGGCAGCCTC 651 (CAG)5 6 60.2 166, 167, 165 TCTGAGCACGACTCAACAGG AGGCATGTAATGCTGTGGGT 682 (TC)10 3 59.7 205, 131, 207 TTCTTGAGCTAAAAGTGCATCG CAGATCCAAACCGAACCCTA 686 (GAA)8 6 59.9 139, 150, 190 CACGAGTGTCACTGTTGCCT AGAATTGGCTTAGCTTGGCA 695 (TA)8 3 59.8 248, 244, 264 AGAAAAGCGAAAGCACAAGC CTTAAATGCGCCACCAATTT GAPDH基因扩增引物参照Joly[21]的研究结果,扩增前、后引物序列分别为5′-GATAGATTTGGA ATTGTTGAGG-3′、5′-GACATTGAATGAGATAAACC-3′,预计产物长度759 bp。扩增使用Golden Star mix(Tsingke公司,北京),PCR采用50 μL反应体系,每个体系中加入44 μL PCR mix,上下游引物各2 μL,PCR模板2 μL。PCR扩增程序为98 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s,48 ℃退火10 s,72 ℃延伸10 s,循环30次;72 ℃再延伸3 min。PCR产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)(TIANGEN公司,北京)纯化回收。
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SSR引物扩增产物送至北京阅微基因技术有限公司检测,检测步骤为:在96孔板中每孔加入ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液(V :V=0.5 :8.5)9 μL,PCR产物1.0 μL;95 ℃变性3 min;用3730XL DNA analyzer(ABI公司,美国)检测;用GeneMapper软件分析电泳结果,计算各片段大小。
GAPDH基因产物采用Zero Background Blunt TOPO Cloning Kit(Clone Smarter,USA)连接、转化,每个样本挑选4~5个克隆产物即菌落进行PCR鉴定。阳性样本送至生工生物工程有限公司测序,测序引物使用通用引物M13F和M13R,采用正反双向测序以保证测序结果的准确性。
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参考Ku[1]、Fougère-Danezan[10]、于超[22]、Mathilde[23]等人的研究确定样本倍性,对于未知倍性的样本,使用R语言Polysat package[18]统计各个样本的SSR最大条带数估算样本倍性。样本中峰的数量小于其倍性的多倍体样本,参照MAC-PR方法,分别计算成对的峰面积之比,依据峰面积比例推断SSR基因型。
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统计各SSR位点等位基因数量,计算多态性信息含量(PIC,polymorphism information content)和有效等位基因数(effective number of alleles)。由于样本中含有不同倍性的多倍体,采用Bruvo[16]提出的方法比较两两个体间的遗传距离。在R中计算两两样本间的Bruvo距离,用邻近归并法(NJ,Neighbor- Joining)建立系统发生树,并选择树的中点赋根[25]。
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GAPDH基因序列使用MAFFT [26]进行多重序列比对,随后使用DAMBE[27]验证碱基序列替换饱和;使用jModeltest[28]软件检验进化模型,选择7模型体系计算似然值,采用BIC(Bayesian Information Criterion)选择最优进化模型;使用BEAST[29]建立系统发生树。
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在R中统计各样本的SSR最大条带数作为样本倍性,估算出其余未知倍性样本的倍性,结果见表 3。7个未知倍性的样本中,粉红香水月季(R. odorata var. erubescens)、华西蔷薇(R. moyesii)、毛叶蔷薇(R. mairei)、少对峨眉蔷薇(R. omeiensis f. poucijuga)、川西蔷薇(R. sikangensis)为四倍体,亮叶月季(R. lucidissima)为二倍体,西藏蔷薇(R. tibetica)为六倍体。该结果用于后续的基因型分析。
表 3 部分样本的倍性预测
Table 3. Ploidy levels of the unknown samples
编号No. 种/品种名Specie/variety 倍性Ploidy level 7 粉红香水月季R. odorata var. erubescens 4 14 亮叶月季R. lucidissima 2 23 华西蔷薇R. moyesii 4 25 西藏蔷薇R. tibetica 6 34 毛叶蔷薇R. mairei 4 35 少对峨眉蔷薇R. omeiensis f. paucijuga 4 37 川西蔷薇R. sikangensis 4 使用GeneMapper软件检测出29条引物的SSR分型,并推断出各个样本的基因型。以四倍体‘云蒸霞蔚’(R.‘Yunzheng Xiawei’)为例,在5个不同的SSR位点(510、596、509、651、490)上,各个位点上的条带数量有所不同(见图 1)。依据每个位点上,各个条带峰面积之比值,可以推断其基因型分别为189/189/189/189、204/204/207/207、291/291/291/300、162/162/168/177、126/129/132/135。
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在29个位点上共计检测出了382个等位基因变异,其结果见表 4。平均每个位点有13.20个变异,变异数量范围为4~23,有效等位基因数[30]介于1.71~15.13之间,平均值7.30。多态性信息含量介于0.413 9至0.934 0之间,平均值0.798 9。不同的位点遗传多态性有较大的差异,336号位点表现出了最高的遗传多态性,其多态信息含量为0.934 0,而510号位点的遗传多态性较低,多态信息含量仅为0.413 9。
表 4 SSR位点变异
Table 4. Variation of the 29 SSR lici in 97 rose samples
位点名称Locus name 等位基因数量Number of alleles 有效等位基因数[30] Effective number of alleles 多态信息含量Polymorphism information content RW22A3 14 6.50 0.846 2 H23017 22 11.40 0.912 4 H22E04 8 4.78 0.790 9 CL2996 9 5.32 0.812 1 695 19 7.85 0.872 7 686 10 6.60 0.848 5 682 17 8.53 0.882 9 651 9 2.71 0.630 9 648 13 7.57 0.868 1 637 6 2.19 0.542 7 632 4 2.38 0.580 0 629 13 5.77 0.826 7 625 21 13.68 0.927 0 596 7 3.78 0.735 8 593 20 14.69 0.932 0 541 16 9.40 0.893 7 521 16 9.71 0.897 2 510 6 1.71 0.413 9 509 8 3.81 0.737 5 490 12 7.07 0.858 7 467 4 2.38 0.579 2 464 5 2.10 0.524 5 405 17 9.81 0.898 2 397 22 14.28 0.930 1 387 16 8.94 0.888 2 373 16 10.02 0.900 3 353 17 6.86 0.854 4 336 23 15.13 0.934 0 327 12 6.62 0.849 1 总计Total 382 平均Mean 13.20 7.30 0.798 9 对不同组蔷薇的多态性信息进行比较,其结果见表 5。9个组中,等位基因数量介于1.28~8.38之间,有效等位基因数介于1.07~6.09之间,平均3.78个,多态性信息含量介于0.241 4~0.753 2之间,平均值0.584 2。芹叶组和合柱组表现出了较高的遗传多态性。
表 5 不同组的SSR位点信息
Table 5. Variation of the SSR loci in 6 sections
组Section 样本容量Sample size 等位基因数量Number of alleles 有效等位基因数Effective number of alleles 多态信息含量Polymorphism information content 月季组Sect. Chinenses 14 5.97 3.96 0.677 2 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 12 8.38 5.82 0.740 3 桂味组Sect. Cinnamomeae 11 7.17 5.79 0.691 6 合柱组Sect. Synstylae 7 6.48 6.09 0.753 2 金缨子组Sect. Laevigatae 1 1.38 1.07 0.344 8 硕苞组Sect. Bracteatae 1 1.28 1.07 0.241 4 小叶组Sect. Microphyllae 2 3.45 3.8 0.685 2 木季组Sect. Banksianae 2 2.41 2.61 0.540 0 平均Mean 6 4.57 3.78 0.584 2 -
通过测序及克隆成功获得了所有样本的GAPDH基因序列片段。其中,比对后的序列长度为841 bp;变异位点数164个,占序列长度的19.5%;信息位点数为73个,占序列长度的比例为8.7%。使用DAMBE验证替换饱和,其中Iss均小于Iss.c且差异显著,适合建树。采用BIC检验进化模型为HKY+G,通过Tracer检验各项参数ESS值大于200,参数收敛。
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基于SSR标记构建了系统发生树(图 2)。图中,50个样本聚成了6个分类群。月季组、桂味组、芹叶组得到了较理想的聚类结果。香水月季、亮叶月季与古老月季品种‘月月红’(R. chinensis ‘Slater's Crimson China’)、‘月月粉’(R. chinensis ‘Old Blush’)等聚在了同一类群中。合柱组中大多数样本聚在一支,但是野蔷薇(R. multiflora)、悬钩子蔷薇(R. rubus)分散在了其他分支中,此外,月季组单瓣月季花(R. chinensis var. spontanea)也聚在了合柱组类群中。芹叶组样本大多数聚在了一支,且按照四数花系(R. Ser. Sericeae)、五数花系(R. Ser. Spinosissmae)分成了两个支系;桂味组样本大多数聚在了一支;但芹叶组的密刺蔷薇(R. spinosissima)、异味蔷薇(R. foetida)、川西蔷薇与桂味组的大叶蔷薇(R. macrophylla)、华西蔷薇以及西藏蔷薇等其他样本聚在了一支,表明它们之间可能存在着共同祖先。同为小叶组的中甸刺玫(R. praelucens)和缫丝花(R. roxburghii)遗传距离很远,表明它们之间有较远的亲缘关系。金缨子组、硕苞组、木香组样本较少,与悬钩子蔷薇聚在了一支。
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基于GAPDH基因的发生树(图 3)显示,月季组与桂味组合并成了一个分支,两个组之间的界限模糊,在分子水平上表现出较高的相似性。芹叶组样本大多数聚在了一支。但是芹叶组的密刺蔷薇、异味蔷薇、川西蔷薇与桂味组样本聚在了一支,这与SSR标记的结果相似,表明这3个物种与桂味组之间存在着分子水平的联系。金缨子组、硕苞组和木香花聚在了一支,小叶组的两个样本也表现出很远的遗传距离,这与SSR分析的结果一致。此外古老月季‘软香红’(R. ‘Ruanxianghong’)、‘四面镜’(R. ‘Simianjing’)与大花香水月季(R. odorata var. gigantea)聚在了一支。
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由于蔷薇属具有十分复杂的遗传背景,种间杂交、异源多倍体化等现象使蔷薇属的系统发生分析进一步复杂化,属内很多物种的起源与分类尚未定论。本研究选取了全国42个种或品种,综合使用SSR标记、单拷贝核基因对蔷薇属的遗传多样性进行了分析,构建了系统发生树,对蔷薇属内的遗传关系进行了较为深入的探讨。
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SSR标记在多倍体杂合子的应用中,一直存在着一些分歧。Esselink等[31]早期采用了依据SSR的表现型构建0-1矩阵的方法处理数据,从而避免了判断多倍体杂合子基因型的问题。并且这一方法在处理多倍体数据中得到了广泛的应用。但是,这种方法无法解释染色体之间的遗传关系。本研究使用MAC-PR理论判断样本基因型,该理论依据峰面积信息定量地判断多倍体基因型,继而推断出“部分杂合子”的基因型,这种数据分析方法的理论模型更符合多倍体的遗传规律,为多倍体的遗传与系统发生分析提供了更多有价值的信息。但是,SSR扩增与电泳谱带的质量会很大地影响数据分析的准确度。因此,需要依据实际的研究背景与研究目的,谨慎地使用该方法,并且确保SSR分型的结果足够精确。必要的情况下,可以使用荧光定量PCR的方法提高分析结果的精确度。
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月季组中,‘月月红’‘月月粉’两个品种历史起源悠久,在现代月季的发展中占有重要的地位。但它们的起源一直没有定论[3]。Meng等[14]基于叶绿体基因及单拷贝核基因的分析认为,单瓣月季花可能是‘月月红’的首个杂交亲本,且野蔷薇、香水月季也参与了杂交事件。Hibrand-Saint Oyant等[32]构建了‘月月粉’的加倍单倍体的株系‘HapOB’,通过对7个二倍体和1个六倍体的蔷薇属物种重测序分析了蔷薇属的遗传多样性,结果表明HapOB[32]的参考序列与单瓣月季花的序列差异性相对较低。这一结果与上述Meng[14]的研究结果一致。本研究中,‘月月红’‘月月粉’都位于月季组的分支之中,但两个系统发生树中内部关系有所不同。在基于GAPDH基因构建的系统树中,两者与粉红香水月季、单瓣月季花亲缘关系较近而在基于SSR构建的系统发生树中结果相反。可见‘月月红’‘月月粉’的品种起源较为复杂,其起源可能与单瓣月季花、香水月季、粉红香水月季有关。单瓣月季花作为‘月月粉’品种起源中重要的亲本,具有进一步研究的价值。
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形态学研究表明,合柱组与月季组有着较为紧密的亲缘关系[1]。在分子系统发生研究中,这两个组常常形成一个分支,且各个种在分支内镶嵌分布[9-12]。本研究中,基于SSR的系统发生树表明,月季组与合柱组分成了两个支系,但个别物种之间存在着交叉(单瓣月季花并入了合柱组支系中,野蔷薇并入了月季组支系中)。基于GAPDH基因的系统发生分析表明,月季组与合柱组不是单系类群,这种关系与前人的研究结果一致。表明在分子水平上,月季组与合柱组存在十分密切的联系。
中国植物志依据托叶形态将合柱组分成了两个系:全缘托叶系(R. ser. Brunonianae)与齿裂托叶系(R. ser. Multiflorae)[4]。但这种分类并未得到分子学证据的支持[9, 12]。本研究中,全缘托叶系与齿裂托叶系也没有形成单系类群,在分子水平上,两个系的遗传关系相互交叉,联系较为紧密。
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芹叶组中,基于SSR标记和GAPDH基因构建的系统发生树结果基本一致。芹叶组中大部分样本聚成了一个单系类群,其中报春刺玫(R. primula)、黄刺玫(R. xanthina)两个五数花系形成了一个分支。在GAPDH基因树中这一分支还有着较高的支持率(0.8)。其他研究中,四数花系、五数花系在进化树中也较好的分离成不同支系。可见这两个系的分类在分子层面上也是可靠的。
密刺蔷薇作为四倍体,其起源相对复杂。Wissemann[12]基于大花密刺蔷薇(R. spinosissima var. altaica)在系统发生树的位置及其表型形态特征,推测密刺蔷薇与桂味组之间存在着自然杂交事件;这一猜测也得到了Matsumoto等[33]研究的支持;Fougère-Danezan等[10]在密刺蔷薇中发现了两种不同的核基因拷贝,其中一个与芹叶组分支一致,另一个与桂味组分支一致,因此推测密刺蔷薇是芹叶组与桂味组间杂交形成的异源多倍体。在本研究中,密刺蔷薇、异味蔷薇、川西蔷薇与合柱组形成了一个支系,同一支系中还包括小叶组的中甸刺玫,而且四倍体异味蔷薇与密刺蔷薇亲缘关系较近,这与Rowley[34]和Roberts[35]基于表型性状的研究结果相符。通过上述研究和本文的结果分析,密刺蔷薇、异味蔷薇的起源可能与芹叶组、桂味组之间的基因交流有关。
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我国产小叶组植物仅有3种,贵州缫丝花(R. kweichowensis)、中甸刺玫和缫丝花[1]。在Wissemann[3]的分类系统中,缫丝花作为一个单型划入了Platyrhodon亚属。中甸刺玫作为十倍体,其倍性起源十分复杂。俞德浚等[4]认为中甸刺玫是桂味组与小叶组的过渡类型。Jian等[36]认为中甸刺玫是异源多倍体。Fougère-Danezan[10]根据叶绿体基因和核基因信息进一步推测它的多倍体起源于桂味组与二倍体缫丝花。本研究发现,中甸刺玫与桂味组亲缘关系较近而与缫丝花亲缘关系很远,小叶组的划分还有待于进一步考证。
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Cronn[37]和Joly[38]的研究表明,系统发生树常常会出现与实际情况不一致的情况,这种误差可能是多方面因素造成的。趋同进化、杂交、基因渐渗、异源多倍化、基因水平转移、不完全谱系分选都有可能导致系统发生树与实际情况不一致[37, 39]。在低阶元的分类中,不完全的谱系分选和基因渐渗是引起系统发生树与实际不一致的突出因素[37-38]。本研究中,基于SSR的系统发生树与基于GAPDH基因的系统发生树有很多不相符的地方。这种误差除了分子标记进化速率不同外,还可能与上述原因有关。在蔷薇属中,种间杂交、异源多倍体的现象普遍存在,这些因素使得蔷薇属的演化进一步复杂化。Zhu[9]认为种间杂交是导致蔷薇属系统发生树与实际不同的主要因素;Fougère-Danezan[10]研究发现异源多倍体也对系统发生树的构建产生了较大的影响。这类现象同时存在于蔷薇属内近缘种与远缘种之间,对系统发生树中各个阶元的结构都可能造成影响。在群体水平上研究蔷薇属的进化能更有效的回溯其进化历史,从而能够进一步了解蔷薇属内的系统发生关系,避免近缘种间杂交、不完整谱系分选所造成的影响[9]。
此外,分子标记是否适用于系统发生分析与标记的进化速率有很大的关系[40],进化速率不同的标记适用的分类阶元有所不同。在蔷薇属内,SSR位点相对保守,适用于亲缘关系较近的群体[41-43]。而GAPDH基因作为单拷贝核基因标记,其进化速率与SSR标记不同,因而会造成分类结果与SSR标记不一致的现象。在此类研究中,依据分类阶元选择合适标记进行分析尤为重要。
Phylogenetic relationships of the genus Rosa based on SSR markers and single copy nuclear gene
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摘要:
目的通过深入分析中国产野生蔷薇属植物的遗传背景,为其品种演化、系统分类提供分子学依据,也为种间杂交亲本的选择提供一定的指导,从而为进一步开发我国丰富的野生蔷薇属植物资源提供理论基础。 方法本研究以50份蔷薇属植物样本、42个种或品种为研究对象,运用SSR标记及单拷贝核基因GAPDH对其遗传多样性进行分析。利用MAC-PR理论预测不同倍性蔷薇属植物的SSR基因型。 结果在29个SSR位点上共计检测出382个等位基因变异,多态性信息含量介于0.413 9至0.934 0之间,平均值为0.798 9。计算Bruvo遗传距离并构建了邻接树,解决了SSR标记在不同倍性样本之间应用困难的问题。同时基于GAPDH基因序列片段构建了50个样本的贝叶斯树。基于SSR标记构建的系统发生树显示,50个样本聚成了6个分类群,月季组、桂味组样本聚类效果较好,而其他种类与现有分类系统差异较大。通过测序及克隆成功获得了所有样本的GAPDH基因序列片段,其中,比对后的序列长度为841 bp,变异位点数164个;基于GAPDH基因的聚类结果与现有的分类系统也有较大的差异。 结论蔷薇属植物基于遗传关系的分类体系与现有的植物学分类系统有较大的差别。月季组、合柱组间遗传关系十分紧密;芹叶组、桂味组没有形成单系类群,这两组间可能存在着基因交流事件;小叶组中两个种没有很近的亲缘关系。 Abstract:ObjectiveThis research provides some information for the controversy over some taxonomy and phylogenetic problems on Rosa species, and provides basis for the selection of parents of interspecific hybrids. This will provide a theoretical basis for further development of abundant wild rose resources in China. MethodIn this study, 50 samples with 42 species and varieties of genus Rosa were used to analyze genetic relationships and construct phylogenetic trees based on SSR markers and single copy nuclear gene (GAPDH). In order to predict the genotype of polyploidies, MAC-PR method was used. ResultA total of 382 alleles were detected at 29 loci. The polymorphism information content ranged from 0.413 9 to 0.934 0 with an average value of 0.798 9. Then we calculated the Bruvo distance and constructed NJ tree (Neighbour-joining tree). The problem to apply SSR markers in polyploidies was solved in the above-mentioned territory. The phylogenetic tree based on GAPDH fragment was also constructed by Bayesian inference. The phylogenetic tree showed that 50 accessions could be clustered into 6 taxa. The traditional classification system of Chinenses and Synstylae is mostly supported by molecular data while others not. GAPDH sequence fragments from all accessions were successfully obtained after cloning and sequencing. The sequence length was 841 bp with 164 variable loci. The phylogenetic relationship based on GAPDH did not correspond to traditional classification system. ConclusionThe result showed that the genus Rosa in its traditional infrageneric circumscription is not supported by molecular data. Sect. Chinenses and Sect. Synstylae are closed in genetic relationship. Sect. Pimpinellifoliae and Sect. Cinnamomeae are not monophyletic and a predicted gene flow exists between these sections. Two species in Sect. Microphyllae are not related based on molecular data. -
Key words:
- Rosa /
- SSR markers /
- single copy nuclear gene /
- genetic diversity
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表 1 50个样本名录
Table 1. List of samples
编号No. 种/品种名Specie/variety 组Section 倍性Ploidy level 1 月月红R. chinensis ‘Slater’s Crimson China’ 月季组Sect. Chinenses 2[1] 2 月月粉R. chinensis ‘Old Blush’ 月季组Sect. Chinenses 2[1] 3 单瓣月季花R. chinensis var. spontanea 月季组Sect. Chinenses 2[1] 4 ‘云蒸霞蔚’R. ‘Yunzheng Xiawei’ 月季组Sect. Chinenses 4[23] 5 香水月季R. odorata 月季组Sect. Chinenses 2[24] 6 粉红香水月季R. odorata var. erubescens 月季组Sect. Chinenses 未知Unkonwn 7 粉红香水R. odorata var. erubescens 月季组Sect. Chinenses 未知Unkonwn 8 香水月季R. odorata 月季组Sect. Chinenses 2[24] 9 ‘软香红’R.‘Ruanxianghong’ 月季组Sect. Chinenses 4[24] 10 ‘四面镜’R.‘Simianjing’ 月季组Sect. Chinenses 3[24] 11 桔黄香水月季R. odorata var. pseudindica 月季组Sect. Chinenses 2[24] 12 大花香水月季R. odorata var. gigantea 月季组Sect. Chinenses 2[24] 13 香水月季R. odorata 月季组Sect. Chinenses 2[24] 14 亮叶月季R. lucidissima 月季组Sect. Chinenses 未知Unkonwn 15 弯刺蔷薇R. beggeriana 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 16 弯刺蔷薇R. beggeriana 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 17 刺蔷薇R. acicularis 桂味组Sect. Cinnamomeae 4, 8[1] 18 疏花蔷薇R. laxa 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 19 疏花蔷薇R. laxa 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 20 疏花蔷薇R. laxa 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 21 美蔷薇R. bella 桂味组Sect. Cinnamomeae 4[11] 22 山刺玫R. davurica 桂味组Sect. Cinnamomeae 2, 4, 6[11] 23 华西蔷薇R. moyesii 桂味组Sect. Cinnamomeae 未知Unkonwn 24 大叶蔷薇R. macrophylla 桂味组Sect. Cinnamomeae 2[1] 25 西藏蔷薇R. tibetica 桂味组Sect. Cinnamomeae 未知Unkonwn 26 密刺蔷薇R. spinosissima 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 4[11] 27 黄刺玫R. xanthina 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[1] 28 异味蔷薇R. foetida 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 4[11] 29 绢毛蔷薇R. sericea 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[1] 30 单瓣黄刺玫R. xanthina f. normalis 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2, 4[1] 31 报春刺玫R. primula 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[24] 32 密刺蔷薇R. spinosissima 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 4[11] 33 峨眉蔷薇R. omeiensis 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[11] 34 毛叶蔷薇R. mairei 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 未知Unkonwn 35 少对峨眉蔷薇R. omeiensis f. paucijuga 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 未知Unkonwn 36 绢毛蔷薇R. sericea 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 2[1] 37 川西蔷薇R. sikangensis 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 未知Unkonwn 38 白玉堂R. multiflora var. albo-plena 合柱组Sect. Synstylae 2, 3[1] 39 野蔷薇R. multiflora 合柱组Sect. Synstylae 2, 3[1] 40 长尖叶蔷薇R. longicuspis 合柱组Sect. Synstylae 2[11] 41 小叶川滇蔷薇R. soulieana var. microphylla 合柱组Sect. Synstylae 2[11] 42 卵果蔷薇R. helenae 合柱组Sect. Synstylae 2[11] 43 悬钩子蔷薇R. rubus 合柱组Sect. Synstylae 2, 3[11] 44 银粉蔷薇R. anemoniflora 合柱组Sect. Synstylae 4[24] 45 金樱子R. laevigata 金缨子组Sect. Laevigatae 2[11] 46 木香花R. banksiae 木香组Sect. Banksianae 2, 4[1] 47 单瓣木香花R. banksiae var. normalis 木香组Sect. Banksianae 2[1] 48 硕苞蔷薇R. bracteata 硕苞组Sect. Bracteatae 2[24] 49 缫丝花R. roxburghii 小叶组Sect. Microphyllae 2[11] 50 中甸刺玫R. praelucens 小叶组Sect. Microphyllae 10[11] 表 2 SSR引物信息
Table 2. Information of SSR primers
SSR编号SSR No. 基序Motif 连锁群[23] Linkage group 退火温度Annealing temperature/℃ 目标片段大小Expected size/bp 上游引物Forward primer (5′-3′) 下游引物Reverse primer (5′-3′) CL2996 (CCG)17 2 55.0 183 GCCACCATAGCCAGAGACAT AGAAGAAGTTGACGACAGGGAC H22E04 (AAG)7 6 55.0 241 GACATCACCACCACCACAAG AACCAAGGTTTCCAGTTCCA H23017 (CT)11 1 55.0 218 ACACCAAGCAAACCAAAACC AGCACGAAAACCGAGAGAGA Rw22A3 (TTC)6 6 52.9 150 AGAGAATTGAAAAGGGCAAG GAGCAAGCAAGACACTGTAA 327 (CTT)6 59.8 277, 232, 202 ACTCCTCCAAAGCTTCACCA CCTCATCGACAGAGTCGTCA 336 (TC)9 4 59.9 171, 185, 213 CAAACGAAACCCTCTGCTTC GACGATGCATTTGGTGTGAC 353 (TC)7 5 59.7 212, 107, 223 CGCCCTAGTCTCCTCTCTCTC CTCAAGCTGAAGCTCGGAGT 373 (CT)10 6 58.9 100, 106, 233 ACAAACTTCGCGATTCCTCT AGTTCCAGACGTTGGAGTGC 387 (CT)9 2 58.7 202, 229, 223 GCACTCTTGACGTTGTCCAT GTCAATGTAGTCCGGTTCGG 397 (CT)14 4 59.9 222, 221, 252 GGCCTAGCAAAGCAACAAAC AGTGGAGGGCAGTCTCTGAA 405 (ATG)5 7 59.9 265, 183, 237 CAGCGAAAAGAACAAGGACC CAGAAGCTAATAAATTAACAATCACCA 464 (TCGGA)3 59.5 134, 250, 149 TCTTTCGGTTCAGAAAGTTCG CTCGCTGATCTTGTCCATCA 467 (CGA)5 2 60.0 173, 174, 161 GTACGCTCTCTGGTCTTCGG CCCATGTCTCTGGCTATGGT 490 (TCT)6 60.0 128, 125, 272 ACAACCAACCCAAGAACTCG TCCCAGCTTCAGTCTCACCT 509 (CAC)5 7 60.0 208, 252, 261 CAACTGGGTTGGGTCAGTCT TCAAATGTACCTTGCGCTTG 510 (AAG)5 2 60.1 190, 157, 156 AGAGGTTTAGGGCAGCCATT GCGAATGATGGTGGAGAGTT 521 (GA)8 6 60.5 225, 224, 229 GTTCCAGCAGCACTCCAAGT AGAGGGGATTAGCTGCACTG 541 (AG)7 6 59.7 241, 243, 242 CTACTCCAATGTCCGCTTCC GTTGGAGAAGAAGCCGTGAG 593 (GA)7 60.1 136, 134, 119 TAACCAGGTCCTCACGAAGG AACAAATCCCCCAGGATAGG 596 (AGG)5 5 60.6 211, 212, 222 CGAGGAAAAACCCAAAATCC TGGAAGCAAGAAAAGGCAGT 625 (TC)8 7 59.0 143, 213, 142 CGCGTCTCTCACATCTCAAA AAGATCTTCTCTCCGGCCTT 629 (CTT)7 6 59.7 270, 273, 223 CACGAGCTCTCTCTCCCCTA TTGGTCTGTGAAGTGGTGGA 632 (GCCACC)3 60.1 153, 152, 154 AACTCATGGGTTCGTTGAGC GGTTGCGGAGAGAGAACAAG 637 (TTGATT)3 7 60.1 280, 279, 280 GCCGTAATTCGTGGAAAGAA ATGCCACCAGAACCTTGAAC 648 (CT)8 6 60.5 167, 169, 217 CCTAAAGCTTAAGCCCCCAA GCAATAGACTTGGCAGCCTC 651 (CAG)5 6 60.2 166, 167, 165 TCTGAGCACGACTCAACAGG AGGCATGTAATGCTGTGGGT 682 (TC)10 3 59.7 205, 131, 207 TTCTTGAGCTAAAAGTGCATCG CAGATCCAAACCGAACCCTA 686 (GAA)8 6 59.9 139, 150, 190 CACGAGTGTCACTGTTGCCT AGAATTGGCTTAGCTTGGCA 695 (TA)8 3 59.8 248, 244, 264 AGAAAAGCGAAAGCACAAGC CTTAAATGCGCCACCAATTT 表 3 部分样本的倍性预测
Table 3. Ploidy levels of the unknown samples
编号No. 种/品种名Specie/variety 倍性Ploidy level 7 粉红香水月季R. odorata var. erubescens 4 14 亮叶月季R. lucidissima 2 23 华西蔷薇R. moyesii 4 25 西藏蔷薇R. tibetica 6 34 毛叶蔷薇R. mairei 4 35 少对峨眉蔷薇R. omeiensis f. paucijuga 4 37 川西蔷薇R. sikangensis 4 表 4 SSR位点变异
Table 4. Variation of the 29 SSR lici in 97 rose samples
位点名称Locus name 等位基因数量Number of alleles 有效等位基因数[30] Effective number of alleles 多态信息含量Polymorphism information content RW22A3 14 6.50 0.846 2 H23017 22 11.40 0.912 4 H22E04 8 4.78 0.790 9 CL2996 9 5.32 0.812 1 695 19 7.85 0.872 7 686 10 6.60 0.848 5 682 17 8.53 0.882 9 651 9 2.71 0.630 9 648 13 7.57 0.868 1 637 6 2.19 0.542 7 632 4 2.38 0.580 0 629 13 5.77 0.826 7 625 21 13.68 0.927 0 596 7 3.78 0.735 8 593 20 14.69 0.932 0 541 16 9.40 0.893 7 521 16 9.71 0.897 2 510 6 1.71 0.413 9 509 8 3.81 0.737 5 490 12 7.07 0.858 7 467 4 2.38 0.579 2 464 5 2.10 0.524 5 405 17 9.81 0.898 2 397 22 14.28 0.930 1 387 16 8.94 0.888 2 373 16 10.02 0.900 3 353 17 6.86 0.854 4 336 23 15.13 0.934 0 327 12 6.62 0.849 1 总计Total 382 平均Mean 13.20 7.30 0.798 9 表 5 不同组的SSR位点信息
Table 5. Variation of the SSR loci in 6 sections
组Section 样本容量Sample size 等位基因数量Number of alleles 有效等位基因数Effective number of alleles 多态信息含量Polymorphism information content 月季组Sect. Chinenses 14 5.97 3.96 0.677 2 芹叶组Sect. Pimpinellifoliae 12 8.38 5.82 0.740 3 桂味组Sect. Cinnamomeae 11 7.17 5.79 0.691 6 合柱组Sect. Synstylae 7 6.48 6.09 0.753 2 金缨子组Sect. Laevigatae 1 1.38 1.07 0.344 8 硕苞组Sect. Bracteatae 1 1.28 1.07 0.241 4 小叶组Sect. Microphyllae 2 3.45 3.8 0.685 2 木季组Sect. Banksianae 2 2.41 2.61 0.540 0 平均Mean 6 4.57 3.78 0.584 2 -
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