供试材料样本总计50份，包括37种野生蔷薇属植物和5个古老月季品种, 采自昆明杨月季园艺有限责任公司及国家花卉工程技术研究中心种质资源圃，样本信息见表 1。采集的新鲜嫩叶，置于硅胶中干燥保存。

取保存于硅胶中的干燥叶片，采用高效植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司，北京)提取样本基因组DNA。随后取5 μL样本基因组DNA用于琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量与浓度，剩余DNA置于-20 ℃冰箱内冷冻保存。

本文所用SSR引物CL2996、H22E04、H23017、Rw22A3来自Hibrand-Saint Oyant的研究^[24]，其余引物来自于超的研究^[22]，引物信息参见表 2，29条引物覆盖了蔷薇属7个连锁群。PCR采用15 μL反应体系，每个体系中加入DNA模板1.0 μL，5U Taq酶0.1 μL，10 mmol/L dNTP 0.3 μL，上下游引物各5 μL，25 mmol/L MgCl₂ 0.4 μL，10×Buffer I 1.5 μL，ddH₂O补齐至15 μL。PCR扩增程序为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃再延伸5 min。

GAPDH基因扩增引物参照Joly^[21]的研究结果，扩增前、后引物序列分别为5′-GATAGATTTGGA ATTGTTGAGG-3′、5′-GACATTGAATGAGATAAACC-3′，预计产物长度759 bp。扩增使用Golden Star mix(Tsingke公司，北京)，PCR采用50 μL反应体系，每个体系中加入44 μL PCR mix，上下游引物各2 μL，PCR模板2 μL。PCR扩增程序为98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，48 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，循环30次；72 ℃再延伸3 min。PCR产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)(TIANGEN公司，北京)纯化回收。

SSR引物扩增产物送至北京阅微基因技术有限公司检测，检测步骤为：在96孔板中每孔加入ROX-500分子量内标和甲酰胺混合液(V :V=0.5 :8.5)9 μL，PCR产物1.0 μL；95 ℃变性3 min；用3730XL DNA analyzer(ABI公司，美国)检测；用GeneMapper软件分析电泳结果，计算各片段大小。

GAPDH基因产物采用Zero Background Blunt TOPO Cloning Kit(Clone Smarter，USA)连接、转化，每个样本挑选4~5个克隆产物即菌落进行PCR鉴定。阳性样本送至生工生物工程有限公司测序，测序引物使用通用引物M13F和M13R，采用正反双向测序以保证测序结果的准确性。

参考Ku^[1]、Fougère-Danezan^[10]、于超^[22]、Mathilde^[23]等人的研究确定样本倍性，对于未知倍性的样本，使用R语言Polysat package^[18]统计各个样本的SSR最大条带数估算样本倍性。样本中峰的数量小于其倍性的多倍体样本，参照MAC-PR方法，分别计算成对的峰面积之比，依据峰面积比例推断SSR基因型。

统计各SSR位点等位基因数量，计算多态性信息含量(PIC，polymorphism information content)和有效等位基因数(effective number of alleles)。由于样本中含有不同倍性的多倍体，采用Bruvo^[16]提出的方法比较两两个体间的遗传距离。在R中计算两两样本间的Bruvo距离，用邻近归并法(NJ，Neighbor- Joining)建立系统发生树，并选择树的中点赋根^[25]。

GAPDH基因序列使用MAFFT ^[26]进行多重序列比对，随后使用DAMBE^[27]验证碱基序列替换饱和；使用jModeltest^[28]软件检验进化模型，选择7模型体系计算似然值，采用BIC(Bayesian Information Criterion)选择最优进化模型；使用BEAST^[29]建立系统发生树。

在R中统计各样本的SSR最大条带数作为样本倍性，估算出其余未知倍性样本的倍性，结果见表 3。7个未知倍性的样本中，粉红香水月季(R. odorata var. erubescens)、华西蔷薇(R. moyesii)、毛叶蔷薇(R. mairei)、少对峨眉蔷薇(R. omeiensis f. poucijuga)、川西蔷薇(R. sikangensis)为四倍体，亮叶月季(R. lucidissima)为二倍体，西藏蔷薇(R. tibetica)为六倍体。该结果用于后续的基因型分析。

使用GeneMapper软件检测出29条引物的SSR分型，并推断出各个样本的基因型。以四倍体‘云蒸霞蔚’(R.‘Yunzheng Xiawei’)为例，在5个不同的SSR位点(510、596、509、651、490)上，各个位点上的条带数量有所不同(见图 1)。依据每个位点上，各个条带峰面积之比值，可以推断其基因型分别为189/189/189/189、204/204/207/207、291/291/291/300、162/162/168/177、126/129/132/135。

图  1  四倍体云蒸霞蔚不同位点的基因型

Figure 1.  Different genotypes on tetraploid sample R. 'Yunzheng Xiawei'

在29个位点上共计检测出了382个等位基因变异，其结果见表 4。平均每个位点有13.20个变异，变异数量范围为4~23，有效等位基因数^[30]介于1.71~15.13之间，平均值7.30。多态性信息含量介于0.413 9至0.934 0之间，平均值0.798 9。不同的位点遗传多态性有较大的差异，336号位点表现出了最高的遗传多态性，其多态信息含量为0.934 0，而510号位点的遗传多态性较低，多态信息含量仅为0.413 9。

对不同组蔷薇的多态性信息进行比较，其结果见表 5。9个组中，等位基因数量介于1.28~8.38之间，有效等位基因数介于1.07~6.09之间，平均3.78个，多态性信息含量介于0.241 4~0.753 2之间，平均值0.584 2。芹叶组和合柱组表现出了较高的遗传多态性。

通过测序及克隆成功获得了所有样本的GAPDH基因序列片段。其中，比对后的序列长度为841 bp；变异位点数164个，占序列长度的19.5%；信息位点数为73个，占序列长度的比例为8.7%。使用DAMBE验证替换饱和，其中I_ss均小于I_ss.c且差异显著，适合建树。采用BIC检验进化模型为HKY+G，通过Tracer检验各项参数ESS值大于200，参数收敛。

基于SSR标记构建了系统发生树(图 2)。图中，50个样本聚成了6个分类群。月季组、桂味组、芹叶组得到了较理想的聚类结果。香水月季、亮叶月季与古老月季品种‘月月红’(R. chinensis ‘Slater's Crimson China’)、‘月月粉’(R. chinensis ‘Old Blush’)等聚在了同一类群中。合柱组中大多数样本聚在一支，但是野蔷薇(R. multiflora)、悬钩子蔷薇(R. rubus)分散在了其他分支中，此外，月季组单瓣月季花(R. chinensis var. spontanea)也聚在了合柱组类群中。芹叶组样本大多数聚在了一支，且按照四数花系(R. Ser. Sericeae)、五数花系(R. Ser. Spinosissmae)分成了两个支系；桂味组样本大多数聚在了一支；但芹叶组的密刺蔷薇(R. spinosissima)、异味蔷薇(R. foetida)、川西蔷薇与桂味组的大叶蔷薇(R. macrophylla)、华西蔷薇以及西藏蔷薇等其他样本聚在了一支，表明它们之间可能存在着共同祖先。同为小叶组的中甸刺玫(R. praelucens)和缫丝花(R. roxburghii)遗传距离很远，表明它们之间有较远的亲缘关系。金缨子组、硕苞组、木香组样本较少，与悬钩子蔷薇聚在了一支。

图  2  基于SSR标记的蔷薇属植物系统发生树

Figure 2.  Phylogenetic tree based on SSRs

基于GAPDH基因的发生树(图 3)显示，月季组与桂味组合并成了一个分支，两个组之间的界限模糊，在分子水平上表现出较高的相似性。芹叶组样本大多数聚在了一支。但是芹叶组的密刺蔷薇、异味蔷薇、川西蔷薇与桂味组样本聚在了一支，这与SSR标记的结果相似，表明这3个物种与桂味组之间存在着分子水平的联系。金缨子组、硕苞组和木香花聚在了一支，小叶组的两个样本也表现出很远的遗传距离，这与SSR分析的结果一致。此外古老月季‘软香红’(R. ‘Ruanxianghong’)、‘四面镜’(R. ‘Simianjing’)与大花香水月季(R. odorata var. gigantea)聚在了一支。

图  3  基于GAPDH基因的蔷薇属植物系统发生树

Figure 3.  Phylogenetic tree based on GAPDH

由于蔷薇属具有十分复杂的遗传背景，种间杂交、异源多倍体化等现象使蔷薇属的系统发生分析进一步复杂化，属内很多物种的起源与分类尚未定论。本研究选取了全国42个种或品种，综合使用SSR标记、单拷贝核基因对蔷薇属的遗传多样性进行了分析，构建了系统发生树，对蔷薇属内的遗传关系进行了较为深入的探讨。

SSR标记在多倍体杂合子的应用中，一直存在着一些分歧。Esselink等^[31]早期采用了依据SSR的表现型构建0-1矩阵的方法处理数据，从而避免了判断多倍体杂合子基因型的问题。并且这一方法在处理多倍体数据中得到了广泛的应用。但是，这种方法无法解释染色体之间的遗传关系。本研究使用MAC-PR理论判断样本基因型，该理论依据峰面积信息定量地判断多倍体基因型，继而推断出“部分杂合子”的基因型，这种数据分析方法的理论模型更符合多倍体的遗传规律，为多倍体的遗传与系统发生分析提供了更多有价值的信息。但是，SSR扩增与电泳谱带的质量会很大地影响数据分析的准确度。因此，需要依据实际的研究背景与研究目的，谨慎地使用该方法，并且确保SSR分型的结果足够精确。必要的情况下，可以使用荧光定量PCR的方法提高分析结果的精确度。

月季组中，‘月月红’‘月月粉’两个品种历史起源悠久，在现代月季的发展中占有重要的地位。但它们的起源一直没有定论^[3]。Meng等^[14]基于叶绿体基因及单拷贝核基因的分析认为，单瓣月季花可能是‘月月红’的首个杂交亲本，且野蔷薇、香水月季也参与了杂交事件。Hibrand-Saint Oyant等^[32]构建了‘月月粉’的加倍单倍体的株系‘HapOB’，通过对7个二倍体和1个六倍体的蔷薇属物种重测序分析了蔷薇属的遗传多样性，结果表明HapOB^[32]的参考序列与单瓣月季花的序列差异性相对较低。这一结果与上述Meng^[14]的研究结果一致。本研究中，‘月月红’‘月月粉’都位于月季组的分支之中，但两个系统发生树中内部关系有所不同。在基于GAPDH基因构建的系统树中，两者与粉红香水月季、单瓣月季花亲缘关系较近而在基于SSR构建的系统发生树中结果相反。可见‘月月红’‘月月粉’的品种起源较为复杂，其起源可能与单瓣月季花、香水月季、粉红香水月季有关。单瓣月季花作为‘月月粉’品种起源中重要的亲本，具有进一步研究的价值。

形态学研究表明，合柱组与月季组有着较为紧密的亲缘关系^[1]。在分子系统发生研究中，这两个组常常形成一个分支，且各个种在分支内镶嵌分布^[9-12]。本研究中，基于SSR的系统发生树表明，月季组与合柱组分成了两个支系，但个别物种之间存在着交叉(单瓣月季花并入了合柱组支系中，野蔷薇并入了月季组支系中)。基于GAPDH基因的系统发生分析表明，月季组与合柱组不是单系类群，这种关系与前人的研究结果一致。表明在分子水平上，月季组与合柱组存在十分密切的联系。

中国植物志依据托叶形态将合柱组分成了两个系：全缘托叶系(R. ser. Brunonianae)与齿裂托叶系(R. ser. Multiflorae)^[4]。但这种分类并未得到分子学证据的支持^{[9, 12]}。本研究中，全缘托叶系与齿裂托叶系也没有形成单系类群，在分子水平上，两个系的遗传关系相互交叉，联系较为紧密。

芹叶组中，基于SSR标记和GAPDH基因构建的系统发生树结果基本一致。芹叶组中大部分样本聚成了一个单系类群，其中报春刺玫(R. primula)、黄刺玫(R. xanthina)两个五数花系形成了一个分支。在GAPDH基因树中这一分支还有着较高的支持率(0.8)。其他研究中，四数花系、五数花系在进化树中也较好的分离成不同支系。可见这两个系的分类在分子层面上也是可靠的。

密刺蔷薇作为四倍体，其起源相对复杂。Wissemann^[12]基于大花密刺蔷薇(R. spinosissima var. altaica)在系统发生树的位置及其表型形态特征，推测密刺蔷薇与桂味组之间存在着自然杂交事件；这一猜测也得到了Matsumoto等^[33]研究的支持；Fougère-Danezan等^[10]在密刺蔷薇中发现了两种不同的核基因拷贝，其中一个与芹叶组分支一致，另一个与桂味组分支一致，因此推测密刺蔷薇是芹叶组与桂味组间杂交形成的异源多倍体。在本研究中，密刺蔷薇、异味蔷薇、川西蔷薇与合柱组形成了一个支系，同一支系中还包括小叶组的中甸刺玫，而且四倍体异味蔷薇与密刺蔷薇亲缘关系较近，这与Rowley^[34]和Roberts^[35]基于表型性状的研究结果相符。通过上述研究和本文的结果分析，密刺蔷薇、异味蔷薇的起源可能与芹叶组、桂味组之间的基因交流有关。

我国产小叶组植物仅有3种，贵州缫丝花(R. kweichowensis)、中甸刺玫和缫丝花^[1]。在Wissemann^[3]的分类系统中，缫丝花作为一个单型划入了Platyrhodon亚属。中甸刺玫作为十倍体，其倍性起源十分复杂。俞德浚等^[4]认为中甸刺玫是桂味组与小叶组的过渡类型。Jian等^[36]认为中甸刺玫是异源多倍体。Fougère-Danezan^[10]根据叶绿体基因和核基因信息进一步推测它的多倍体起源于桂味组与二倍体缫丝花。本研究发现，中甸刺玫与桂味组亲缘关系较近而与缫丝花亲缘关系很远，小叶组的划分还有待于进一步考证。

Cronn^[37]和Joly^[38]的研究表明，系统发生树常常会出现与实际情况不一致的情况，这种误差可能是多方面因素造成的。趋同进化、杂交、基因渐渗、异源多倍化、基因水平转移、不完全谱系分选都有可能导致系统发生树与实际情况不一致^{[37, 39]}。在低阶元的分类中，不完全的谱系分选和基因渐渗是引起系统发生树与实际不一致的突出因素^[37-38]。本研究中，基于SSR的系统发生树与基于GAPDH基因的系统发生树有很多不相符的地方。这种误差除了分子标记进化速率不同外，还可能与上述原因有关。在蔷薇属中，种间杂交、异源多倍体的现象普遍存在，这些因素使得蔷薇属的演化进一步复杂化。Zhu^[9]认为种间杂交是导致蔷薇属系统发生树与实际不同的主要因素；Fougère-Danezan^[10]研究发现异源多倍体也对系统发生树的构建产生了较大的影响。这类现象同时存在于蔷薇属内近缘种与远缘种之间，对系统发生树中各个阶元的结构都可能造成影响。在群体水平上研究蔷薇属的进化能更有效的回溯其进化历史，从而能够进一步了解蔷薇属内的系统发生关系，避免近缘种间杂交、不完整谱系分选所造成的影响^[9]。

此外，分子标记是否适用于系统发生分析与标记的进化速率有很大的关系^[40]，进化速率不同的标记适用的分类阶元有所不同。在蔷薇属内，SSR位点相对保守，适用于亲缘关系较近的群体^[41-43]。而GAPDH基因作为单拷贝核基因标记，其进化速率与SSR标记不同，因而会造成分类结果与SSR标记不一致的现象。在此类研究中，依据分类阶元选择合适标记进行分析尤为重要。