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落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解及抗氧化活性

姜贵全 张卓睿 张诗朦 任宣百 庞久寅

姜贵全, 张卓睿, 张诗朦, 任宣百, 庞久寅. 落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解及抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
引用本文: 姜贵全, 张卓睿, 张诗朦, 任宣百, 庞久寅. 落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解及抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
Jiang Guiquan, Zhang Zhuorui, Zhang Shimeng, Ren Xuanbai, Pang Jiuyin. Degradation of polymeric proanthocyanidin from larch bark catalyzed by resin and antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
Citation: Jiang Guiquan, Zhang Zhuorui, Zhang Shimeng, Ren Xuanbai, Pang Jiuyin. Degradation of polymeric proanthocyanidin from larch bark catalyzed by resin and antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124

落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解及抗氧化活性

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
基金项目: 

吉林市杰出青年基金项目 2013625017

吉林省教育厅项目 吉教科合字[2012]第140号

吉林省植物化工创新团队 20130521022JH

吉林省医药专项资助项目 20140311056YY

详细信息
    作者简介:

    姜贵全,博士,教授。主要研究方向:植物多酚化学。Email:jiangguiquan11@163.com 地址:132013 吉林省吉林市滨江东路3999号北华大学林学院

    通讯作者:

    张卓睿,副教授。主要研究方向:植物功能活性成分的开发利用。Email:teacher_zzr@163.com 地址:同上

  • 中图分类号: TS201

Degradation of polymeric proanthocyanidin from larch bark catalyzed by resin and antioxidant activity

  • 摘要: 目的研究落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解工艺及降解产物的抗氧化活性,为落叶松树皮的开发利用提供科学依据。方法以落叶松树皮中多聚原花青素(LPPC)为原料,使用CR57树脂催化降解制备了落叶松树皮低聚原花青素(LOPC)。通过单因素试验和响应面试验分析,优化降解工艺条件,并对降解产物进行结构表征,考察其抗氧化能力。结果催化降解最佳工艺条件为每100mL多聚原花青素中加入18mL催化树脂,催化温度76℃,催化时间1.8h,此条件下降解产物平均聚合度为3.76。对比LPPC和降解产物LOPC的色谱图,发现降解产物中多聚组分含量明显降低,证实LPPC发生了降解反应;根据紫外光谱图和红外光谱图,确定降解产物具有原花青素的结构特征;由质谱图可知降解产物是从三聚体到十二聚体,并以四聚体为主分布的低聚物。分析降解产物的抗氧化活性,其1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和2, 2′-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐(ABTS)自由基的半数抑制质量浓度(IC50)分别为72.56、12.64和2.52mg/L。与各对照品相比较,降解产物清除DPPH自由基的能力最强,其还原能力、清除·OH自由基能力和清除ABTS自由基能力仅低于葡萄籽提取物(GS),而高于松树皮提取物(PB)、VC、特丁基对苯二酚(TBHQ)。结论催化树脂CR57可适用于催化LPPC的降解反应,降解后的LOPC具有较强的抗氧化性。
  • 图  1  LPPC的主要结构式

    Figure  1.  Main structural formula of LPPC

    图  2  树脂加入量对平均聚合度的影响

    Figure  2.  Effects of resin addition amount on the average degree of polymerization

    图  3  树脂加入量对降解率的影响

    Figure  3.  Effects of resin addition amount on degradation rate

    图  4  各因素交互作用对降解率的影响

    Figure  4.  Effects of parameters' interaction on degradation rate

    图  5  高效液相色谱图

    Figure  5.  HPLC spectra

    图  6  多聚原花青素的催化氢解机理示意图

    Figure  6.  Scheme of catalytic hydrogenolysis mechanism of polymeric proanthocyanidins

    图  7  不同样品的紫外光谱图对比

    a.儿茶素标准品Catechin standard; b. OPC; c. LOPC; d. LPPC

    Figure  7.  Comparison in UV spectra of different samples

    图  8  不同样品的傅里叶红外光谱图对比

    Figure  8.  Comparison in FTIR of different samples

    a. OPC; b. LPPC; c. LOPC

    图  9  LOPC的质谱图

    Figure  9.  Mass spectrum of LOPC

    图  10  不同样品的还原能力比较

    Figure  10.  Reduction power comparison of different samples

    图  11  不同样品对DPPH自由基的半清除率对比

    Figure  11.  Comparison in IC50 of different samples for DPPH

    图  12  不同样品对·OH自由基的半清除率对比

    Figure  12.  Comparison in IC50 of different samples for ·OH

    图  13  不同样品对ABTS自由基的半清除率对比

    Figure  13.  Comparison in IC50 of different samples for ABTS

    表  1  催化反应温度对平均聚合度与降解率的影响

    Table  1.   Effects of catalytic reaction temperature on the average degree of polymerization and degradation rate

    项目Item 催化反应温度Catalytic reaction temperature/℃
    30 50 60 70 80 90
    平均聚合度Average degree of polymerization 7.36 5.16 4.39 3.80 3.85 3.84
    降解率Degradation rate /% 7.88 35.42 45.06 52.44 51.81 51.94
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    表  2  催化反应时间对平均聚合度与降解率的影响

    Table  2.   Effects of catalytic reaction time on the average degree of polymerization and degradation rate

    项目Item 催化反应时间Catalytic reaction time/h
    0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
    平均聚合度Average degree of polymerization 7.99 5.58 3.97 3.83 3.79 3.76 3.78
    降解率Degradation rate /% 0 30.16 50.31 52.06 52.56 52.94 52.69
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    表  3  响应面试验方案与结果

    Table  3.   Experimental design and results for response surface analysis

    序号
    No.
    A B C Y
    1 10 60 1.5 45.19
    2 30 60 1.5 46.72
    3 10 80 1.5 49.06
    4 30 80 1.5 48.18
    5 10 70 1.0 47.25
    6 30 70 1.0 48.12
    7 10 70 2.0 49.47
    8 30 70 2.0 49.45
    9 20 60 1.0 46.63
    10 20 80 1.0 48.46
    11 20 60 2.0 46.83
    12 20 80 2.0 51.23
    13 20 70 1.5 52.07
    14 20 70 1.5 51.81
    15 20 70 1.5 51.83
    16 20 70 1.5 52.16
    17 20 70 1.5 51.97
    注:A代表树脂加入量,mL; B代表催化温度,℃;C代表催化时间, h; Y代表降解率, %。下同。Notes: A is resin addition amount,mL. B is catalytic reaction temperature,℃. C is catalytic reaction time,h. Y is degradation rate, %. The same below.
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    表  4  回归方程方差分析

    Table  4.   Variance analysis for the regression model

    方差来源
    Source of variance
    平方和
    Sum of squares
    自由度
    Df
    均方
    Mean square
    F
    F value
    P
    P value
    显著性
    Significance
    模型Model 83.45 9 9.27 270.90 < 0.0001 **
    A 0.28 1 0.28 8.22 0.0241 *
    B 16.70 1 16.70 488.06 < 0.0001 **
    C 5.31 1 5.31 155.26 < 0.0001 **
    AB 1.45 1 1.45 42.42 0.0003 **
    AC 0.20 1 0.20 5.79 0.0471 *
    BC 1.65 1 1.65 48.25 0.0002 **
    A 2 20.34 1 20.34 594.21 < 0.0001 **
    B 2 25.95 1 25.95 758.32 < 0.0001 **
    C 2 6.04 1 6.04 176.49 < 0.0001 **
    残差Residual 0.24 7 0.034
    失拟项Lack of fit 0.15 3 0.049 2.17 0.2347 不显著Not significant
    纯误差Pure error 0.09 4 0.023
    总误差Total error 83.69 16
    注:*代表差异显著,P<0.05;**代表差异极显著,P<0.01。Notes: * means difference is significant at P<0.05 level, ** means difference is extremely significant at P<0.01 level.
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    [20] 杜晓, 赵博光, 贾黎明, 郭惠红, 莫秋云, 武三安, 张建军, 刁一伟, 刘晓丽, 李成茂, 张厚江, 陈玮, 韩烈保, 胡建忠, 张丽丽, 石娟, 申世杰, 李镇宇, 梁波, 邢长山, 姜笑梅, 张峻萍, 王安志, 徐文铎, 宋菲, 李文彬, 清水晃, 王昌俊, 马履一, 骆有庆, 赵林果, 王小平, 沉昕, 金昌杰, 壁谷直记, 石碧, 崔英颖, 曾凡勇, 李景锐, 殷亚方, 苏德荣, 李海林, 韦艳葵, 韩瑞东, 徐梅, 苗毅, 胡青, 蒋艳灵, 关德新, 陈卫平2, 延廣竜彦, 裴铁璠, 高述民, 严晓素, 赵永利, 徐君, 王瀛坤, 蒋平, 周军, 李凤兰, 蒋平.  落叶松树皮醇溶性红色素的制备及其稳定性 . 北京林业大学学报, 2005, 27(6): 67-70.
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-04-10
  • 修回日期:  2018-07-03
  • 刊出日期:  2018-09-01

落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解及抗氧化活性

doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
    基金项目:

    吉林市杰出青年基金项目 2013625017

    吉林省教育厅项目 吉教科合字[2012]第140号

    吉林省植物化工创新团队 20130521022JH

    吉林省医药专项资助项目 20140311056YY

    作者简介:

    姜贵全,博士,教授。主要研究方向:植物多酚化学。Email:jiangguiquan11@163.com 地址:132013 吉林省吉林市滨江东路3999号北华大学林学院

    通讯作者: 张卓睿,副教授。主要研究方向:植物功能活性成分的开发利用。Email:teacher_zzr@163.com 地址:同上
  • 中图分类号: TS201

摘要: 目的研究落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解工艺及降解产物的抗氧化活性,为落叶松树皮的开发利用提供科学依据。方法以落叶松树皮中多聚原花青素(LPPC)为原料,使用CR57树脂催化降解制备了落叶松树皮低聚原花青素(LOPC)。通过单因素试验和响应面试验分析,优化降解工艺条件,并对降解产物进行结构表征,考察其抗氧化能力。结果催化降解最佳工艺条件为每100mL多聚原花青素中加入18mL催化树脂,催化温度76℃,催化时间1.8h,此条件下降解产物平均聚合度为3.76。对比LPPC和降解产物LOPC的色谱图,发现降解产物中多聚组分含量明显降低,证实LPPC发生了降解反应;根据紫外光谱图和红外光谱图,确定降解产物具有原花青素的结构特征;由质谱图可知降解产物是从三聚体到十二聚体,并以四聚体为主分布的低聚物。分析降解产物的抗氧化活性,其1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和2, 2′-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐(ABTS)自由基的半数抑制质量浓度(IC50)分别为72.56、12.64和2.52mg/L。与各对照品相比较,降解产物清除DPPH自由基的能力最强,其还原能力、清除·OH自由基能力和清除ABTS自由基能力仅低于葡萄籽提取物(GS),而高于松树皮提取物(PB)、VC、特丁基对苯二酚(TBHQ)。结论催化树脂CR57可适用于催化LPPC的降解反应,降解后的LOPC具有较强的抗氧化性。

English Abstract

姜贵全, 张卓睿, 张诗朦, 任宣百, 庞久寅. 落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解及抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
引用本文: 姜贵全, 张卓睿, 张诗朦, 任宣百, 庞久寅. 落叶松树皮多聚原花青素的树脂催化降解及抗氧化活性[J]. 北京林业大学学报, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
Jiang Guiquan, Zhang Zhuorui, Zhang Shimeng, Ren Xuanbai, Pang Jiuyin. Degradation of polymeric proanthocyanidin from larch bark catalyzed by resin and antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
Citation: Jiang Guiquan, Zhang Zhuorui, Zhang Shimeng, Ren Xuanbai, Pang Jiuyin. Degradation of polymeric proanthocyanidin from larch bark catalyzed by resin and antioxidant activity[J]. Journal of Beijing Forestry University, 2018, 40(9): 118-126. doi: 10.13332/j.1000-1522.20180124
  • 落叶松(Larix gmelinii)为松科落叶松属针叶乔木,其树干材质坚韧,抗压并耐腐蚀,有较高的加工价值,常被用作桥梁、建筑、家居、造纸等工业的原料[1]。而落叶松加工的主要剩余物之一就是树皮,占原木材体积的8%~15%,年产量可达9.4万t[2],因此,如何合理利用这些剩余废弃物,已是当前亟待解决的关键性问题。

    原花青素(proanthocyanidins,PC)又名缩合鞣质,广泛分布于植物的叶、皮、果、根中,可分为多聚原花青素(polymeric proanthocyanidins,PPC)和低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPC)[3]。PPC分子量大,不易透过生物膜,生物利用度低,活性较差,只能用于制造胶黏剂等化工产品;而OPC生物活性强,具有清除自由基、抗氧化、抗炎、抑制肿瘤等功效,在功能食品、化妆品、医药保健品等领域有着广阔的应用前景[4],其经济价值比PPC高100倍以上[5-6]。因此,如何将PPC高效降解是当前国内外天然产物研究最热点的前沿性内容。目前,PPC的降解方法包括苄硫醇降解法、碱性降解法、氧化降解法、生物降解法、Pd/C催化氢解法和催化树脂降解法[7],其中苄硫醇降解法、碱性降解法和氧化降解法所用的试剂会对设备造成腐蚀,污染环境,氧化剂还会使酚羟基发生氧化,降低降解产物的生物活性[7],而生物降解法主要针对水解单宁的降解,对缩合单宁的降解比较困难,且降解菌种的筛选和反应的不确定性亦限制了其应用[5]。与上述几种方法相比,Pd/C催化氢解法和催化树脂降解法具有腐蚀性小,操作简便,所得OPC生物活性较强等优点,是两种比较高效的绿色降解方法。国内现已有利用Pd/C催化氢解落叶松树皮多聚原花青素(larch bark polymeric proanthocyanidins,LPPC)方面的研究,2005年杜晓等[8]采用PC/C催化降解了LPPC,并对降解产物进行了结构和性质分析,但关于树脂催化降解LPPC的相关研究还比较少。现在,商品性的原花青素主要是葡萄籽的提取物,产品售价偏高。有研究发现落叶松原花青素的组成、分子结构和组成单元连接等与葡萄籽中原花青素非常相似[5],而利用落叶松树皮制备低聚原花青素属于废弃物再利用,会大大降低产品的单位价格,因此,其具有较好的市场开发前景。

    落叶松树皮中原花青素质量分数高达10%~16%,但近70%为LPPC。LPPC分子是由儿茶素(C)或表儿茶素(EC)通过单元间C4-C8连接键构成的“直链型”结构(图 1)。有研究表明:在热酸性条件下该结构中的单元连接键C4-C8可断裂,使LPPC被氢解为儿茶素、表儿茶素和低聚原花青素[5]。依据此原理,对LPPC进行降解工艺的研究。

    图  1  LPPC的主要结构式

    Figure 1.  Main structural formula of LPPC

    SXC-9树脂和CR57树脂皆属于球状大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂,具有适宜的大孔网状结构和较高的催化活性,反应物可进入球体内部与球体中的氢离子接触,可作为非均相酸性催化剂催化各种氢解反应。所以,本研究利用SXC-9树脂和CR57树脂为介质,以平均聚合度为考核指标,探讨了不同条件对LPPC降解的影响,优化了降解工艺,并评价了催化降解产物的抗氧化活性,为落叶松树皮的开发利用和深入研究提供了理论依据,具有一定的实际应用价值和意义。

    • 将80~100目落叶松树皮粉末按料液比1:12加入60%乙醇,在320W条件下超声提取20min,提取液过滤浓缩,静置12h,抽滤,滤液装入3根串联装有碎磁环的萃取管,用乙酸乙酯逆流萃取,将萃余水相部分按3.61g/L,流速3BV/h通入HP2MGL树脂柱,饱和吸附后依次用10%、30%、50%、70%乙醇梯度洗脱,取70%乙醇洗脱部分冻干,即得落叶松树皮多聚原花青素LPPC。

      儿茶素标准品、OPC对照品、葡萄籽提取物(GS)、松树皮提取物(PB)、VC、特丁基对苯二酚(TBHQ)购于天津尖峰生物制品有限公司;SXC-9催化树脂购于安徽三星树脂科技有限公司;CR57催化树脂购于上海旻永实业有限公司;ABTS、DPPH自由基购于Sigma公司;甲醇(购于中国医药集团上海化学试剂公司)为色谱纯,其余试剂均为分析纯。

    • 称取活化后的催化树脂CR57,加入装有LPPC的三口烧瓶中,在催化温度76℃和搅拌速度150r/min的条件下加热回流,整个反应在氮气保护下进行。反应结束后冷却、抽滤,滤液用FDU-1100型冷冻干燥机干燥,获得降解产物。

    • 以平均聚合度、降解率为评定指标,分别考察每100mL多聚原花青素中催化树脂加入量(0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0mL)、催化温度(30、50、60、70、80、90℃)、催化时间(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)对LPPC催化降解的影响[9],并在单因素基础上,以降解率为评定指标,进行了响应面试验分析优化降解工艺条件[10]

    • 利用盐酸-正丁醇法[5]、香草醛-盐酸法[11]分别测出原花青素的质量浓度和摩尔浓度,则其平均聚合度(Dp):

      $$ D_{p}=\frac{m}{n M_{r}} $$ (1)

      式中:m为原花青素质量浓度,mg/L;n为原花青素摩尔浓度量,mmol/L;Mr为单体儿茶素相对分子质量。

      降解率等于降解反应前、后原花青素平均聚合度的差值,占降解反应前原花青素平均聚合度的百分比。

    • 将样品配成40mg/L甲醇溶液,用Agilent1100液相色谱仪进行检测。进样量为20μL,色谱柱为pHenomenex C18柱(4.6mm×250mm, 5μm),柱温为30℃,流速为0.7mL/min;二极管阵列检测器;检测波长为280nm;流动相为0.5%磷酸水溶液(B)-乙腈(A);采用梯度洗脱,0~45min A由10%增加至20%,45~65min A由20%增加至60%,A在60%保持30min[12]

    • 采用KBr压片法制样,利用Magana-IR560E.S.P傅里叶红外分光光度计在4000~400cm-1进行扫描[13],分辨率2cm-1。将样品配成40mg/L甲醇溶液,利用北京普析通用仪器有限公司的TU1810型紫外-可见分光光度计在200~700nm进行扫描。

    • Bruker autoflex Ⅲ smartbeam MALDI-TOF/TOF质谱仪,smartbeam激光,波长355nm,扫描模式为线性,电离模式为正离子,加压电压20kV,延迟引出时间200ns。溶剂为水,基质为2, 5-二羟基苯甲酸,外标均为Angiotensin Ⅱ(1046.5Da),Bombesin (1619.8Da),ACTHclip18~39(2465.2Da)和Somatostatin 28 (3147.47Da),离子化试剂为CsI。基质和样品以体积比1:3混合后取1.5μL在靶上点样[14]

    • 分别检测了样品的还原能力(普鲁士蓝法[15])、DPPH自由基清除能力(比色法[16])、·OH自由基清除能力(邻二氮菲-Fe2+[17])和ABTS自由基清除能力(比色法[18])。

    • 催化树脂用量对LPPC降解的影响如图 23所示。全文中催化树脂用量为每100mL多聚原花青素中的树脂加入体积。从图 23可知:CR57催化树脂降解效果好于SXC-9催化树脂,加入10mL的CR57催化树脂时,平均聚合度从7.99下降到4.3,随着催化树脂加入量的增加,平均聚合度逐渐下降,加入量到达20mL以后,基本趋于稳定。综合考虑,选择CR57作为催化树脂,其最佳加入量为20mL,此时平均聚合度可降解为3.86,催化降解率为51.69%。

      图  2  树脂加入量对平均聚合度的影响

      Figure 2.  Effects of resin addition amount on the average degree of polymerization

      图  3  树脂加入量对降解率的影响

      Figure 3.  Effects of resin addition amount on degradation rate

    • 催化反应温度对LPPC降解的影响如表 1所示。随着反应温度的升高,平均聚合度下降;在70℃时,平均聚合度降到最低值为3.80,降解率为52.44%;之后继续升高温度,平均聚合度略有上升趋势,这是因为过高的温度会破坏原花青素结构,使本已裂解的单体或低聚体发生氧化聚合等反应。因此,确定适宜的催化反应温度为70℃。

      表 1  催化反应温度对平均聚合度与降解率的影响

      Table 1.  Effects of catalytic reaction temperature on the average degree of polymerization and degradation rate

      项目Item 催化反应温度Catalytic reaction temperature/℃
      30 50 60 70 80 90
      平均聚合度Average degree of polymerization 7.36 5.16 4.39 3.80 3.85 3.84
      降解率Degradation rate /% 7.88 35.42 45.06 52.44 51.81 51.94
    • 催化反应时间对LPPC降解的影响如表 2所示。随着反应时间增加,平均聚合度逐渐降低,当反应时间为1.5h时,平均聚合度为3.83,降解率为52.06%;之后延长反应时间,LPPC的平均聚合度下降幅度非常缓慢,降解率趋于水平。因引,从节能角度考虑,选择适宜的反应时间为1.5h。

      表 2  催化反应时间对平均聚合度与降解率的影响

      Table 2.  Effects of catalytic reaction time on the average degree of polymerization and degradation rate

      项目Item 催化反应时间Catalytic reaction time/h
      0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
      平均聚合度Average degree of polymerization 7.99 5.58 3.97 3.83 3.79 3.76 3.78
      降解率Degradation rate /% 0 30.16 50.31 52.06 52.56 52.94 52.69
    • 在单因素试验基础上,利用Design-Expert8.0.6软件进行响应面试验设计,试验结果见表 3。利用Design-Expert8.0.6软件对表 3中数据进行回归拟合,得到降解率(Y)对应树脂加入量(A)、催化温度(B)和催化时间(C)的回归模型为:

      $$ \begin{array}{l}{Y=51.97+0.19 A+1.45 B+0.81 C-0.6 A B-} \\ {0.22 A C+0.64 B C-2.22 A^{2}-2.48 B^{2}-1.2 C^{2}}\end{array} $$

      表 3  响应面试验方案与结果

      Table 3.  Experimental design and results for response surface analysis

      序号
      No.
      A B C Y
      1 10 60 1.5 45.19
      2 30 60 1.5 46.72
      3 10 80 1.5 49.06
      4 30 80 1.5 48.18
      5 10 70 1.0 47.25
      6 30 70 1.0 48.12
      7 10 70 2.0 49.47
      8 30 70 2.0 49.45
      9 20 60 1.0 46.63
      10 20 80 1.0 48.46
      11 20 60 2.0 46.83
      12 20 80 2.0 51.23
      13 20 70 1.5 52.07
      14 20 70 1.5 51.81
      15 20 70 1.5 51.83
      16 20 70 1.5 52.16
      17 20 70 1.5 51.97
      注:A代表树脂加入量,mL; B代表催化温度,℃;C代表催化时间, h; Y代表降解率, %。下同。Notes: A is resin addition amount,mL. B is catalytic reaction temperature,℃. C is catalytic reaction time,h. Y is degradation rate, %. The same below.

      试验结果的方差分析见表 4。回归模型检验P<0.0001,差异极显著,说明模型有统计学意义;失拟项是模型中数据的变异[19]P=0.2347>0.05,差异不显著,说明无失拟因素存在,模型能充分反映实际情况;同时,模型决定系数R2=0.9971,考察值与模拟预测值拟合度高,自变量与响应值间的线性关系显著。另外,水平变异系数CV=0.38%值较低,表明试验精密度高,模型是可重复的[19]。综上所述,所建模型可以对树脂催化降解LPPC的效果进行预测和分析。根据回归方程一次项系数绝对值的大小可知:影响LPPC降解的主次因素为催化温度(B)>催化时间(C)>树脂加入量(A),其中催化温度(P<0.0001)和催化时间(P<0.0001)是极显著因素,对LPPC降解率影响较大,树脂加入量(P=0.024<0.05)为显著因素,其对降解反应的影响程度不如前两者。

      表 4  回归方程方差分析

      Table 4.  Variance analysis for the regression model

      方差来源
      Source of variance
      平方和
      Sum of squares
      自由度
      Df
      均方
      Mean square
      F
      F value
      P
      P value
      显著性
      Significance
      模型Model 83.45 9 9.27 270.90 < 0.0001 **
      A 0.28 1 0.28 8.22 0.0241 *
      B 16.70 1 16.70 488.06 < 0.0001 **
      C 5.31 1 5.31 155.26 < 0.0001 **
      AB 1.45 1 1.45 42.42 0.0003 **
      AC 0.20 1 0.20 5.79 0.0471 *
      BC 1.65 1 1.65 48.25 0.0002 **
      A 2 20.34 1 20.34 594.21 < 0.0001 **
      B 2 25.95 1 25.95 758.32 < 0.0001 **
      C 2 6.04 1 6.04 176.49 < 0.0001 **
      残差Residual 0.24 7 0.034
      失拟项Lack of fit 0.15 3 0.049 2.17 0.2347 不显著Not significant
      纯误差Pure error 0.09 4 0.023
      总误差Total error 83.69 16
      注:*代表差异显著,P<0.05;**代表差异极显著,P<0.01。Notes: * means difference is significant at P<0.05 level, ** means difference is extremely significant at P<0.01 level.

      图 4可以看出LPPC降解率在考察范围内皆出现了最大值,说明各因素水平选择合理,能反映出彼此交互作用对降解工艺的影响。其中树脂加入量与催化温度(P=0.0003<0.01)、催化温度与催化时间(P=0.0002<0.01)的交互作用对降解反应影响极显著,三维曲面陡峻,相应等高线呈椭圆形;树脂加入量与催化时间(P=0.0471<0.05)交互作用差异显著,对降解工艺的影响要低于前两者。

      图  4  各因素交互作用对降解率的影响

      Figure 4.  Effects of parameters' interaction on degradation rate

      通过响应面试验优化,得出LPPC树脂催化降解的最佳工艺条件为催化树脂用量18.07mL,为方便操作修正为18mL,催化温度75.93℃,为方便操作修正为76℃,催化时间1.8h。按此条件进行3次平行验证试验,测定LPPC平均降解率为52.87%,与预测值52.21%基本吻合,所得落叶松树皮低聚原花青素(larch bark oligomeric proanthocyanidins,LOPC)平均聚合度为3.76。

    • 图 5为LPPC和降解产物LOPC的液相色谱图。由图 5可以看出:LPPC在50min之前无峰检出,表明不含儿茶素、表儿茶素和原花青素B1,在50~70min之间出现的较大包峰为比较难分离的多聚组分;而降解后LOPC中有儿茶素、表儿茶素和原花青素B1检出,且50~70min之间峰高明显降低,说明降解效果比较好。

      图  5  高效液相色谱图

      Figure 5.  HPLC spectra

      LPPC分子是由儿茶素(C)或表儿茶素(EC)通过单元间C4-C8连接键构成的“直链型”结构,由于A环的C8位为亲核中心,酸性条件下会被H+进攻而变成正碳离子,而C环的C4位在适当条件下又易形成亲电中心。在加热条件下,LPPC分子进入CR57树脂球体内部与球体中的氢离子接触,氢离子会进攻连接键中C8生成正碳离子,使C4-C8键断裂,从而使LPPC降解为LOPC,反应过程如图 6所示。

      图  6  多聚原花青素的催化氢解机理示意图

      Figure 6.  Scheme of catalytic hydrogenolysis mechanism of polymeric proanthocyanidins

      图 78分别为不同样品的紫外谱图和红外谱图对比。由图 7可以看到:LOPC分别在230、278nm处有最大吸收峰,而LPPC分别在227、279nm处有最大吸收峰。可见LOPC的紫外吸收光谱与低聚原花青素和儿茶素标准品非常接近,仍反映了原花青素单元的特征吸收,证实降解反应主要断裂的是原花青素单元中的C4-C8键,未破坏原花青素的单元结构。由图 8可知: OPC、LPPC和LOPC在波数3390cm-1处为酚羟基上—OH宽而强的伸缩吸收峰;波数2930cm-1处为亚甲基上C—H的伸缩振动吸收峰;波数1611、1515和1450cm-1处为苯环的特征吸收峰;波数1290cm-1处为醚键C—O—C的伸缩振动吸收峰;波数1112cm-1处为仲醇的特征吸收峰。上述结果表明:用树脂对LPPC催化降解,其产物LOPC基本结构单元没有发生改变,具有原花青素的结构特征。

      图  7  不同样品的紫外光谱图对比

      Figure 7.  Comparison in UV spectra of different samples

      图  8  不同样品的傅里叶红外光谱图对比

      Figure 8.  Comparison in FTIR of different samples

      图 9中可以找到一个相邻离子峰之间差值固定为288u的离子峰系列:999.6、1288.3、1576.8、1865.1、2153.3、2441.5、2729.5、3017.6、3305.8和3593.8。考虑到288u恰好等于原花青素中EC/C结构单元的分子量,可以推测这一系列的离子峰属于原花青定型结构。设立方程式m/z=290+288Dp+133计算原花青素在质谱图中的质荷比(m/z),以比较观测值与计算值的差别,其中290代表末端单元EC/C的相对分子质量,288代表延伸单元EC/C的相对分子质量,133代表Cs+的相对原子质量,Dp代表了原花青素的聚合度。将本试验测得数据与由公式推导的理论数据比较发现,两者基本吻合。因此,可以推断LOPC是从三聚体(质荷比为999.6)到十二聚体(质荷比为3593.8)分布的多聚物,离子峰最强的为四聚体(质荷比为1288.3),说明LOPC主要以四聚体为主的低聚体存在。

      图  9  LOPC的质谱图

      Figure 9.  Mass spectrum of LOPC

    • 抗氧化剂在一定条件下可将Fe3+还原为Fe2+,根据还原能力的大小可以间接评价出待测物质的抗氧化性,是评价抗氧化能力的一个重要指标,通常还原能力越强,表明抗氧化性越强。从图 10可知:落叶松树皮多聚原花青素、催化树脂降解产物和各对照品的还原能力与其质量浓度呈明显的量效关系,随着质量浓度的升高,还原能力也相应提高。其还原能力大小顺序为LPPC<PB<VC<LOPC<GS。随着几种化合物分子质量的降低,空间位阻变小,其分子结构中的羟基容易失去氢原子,因此还原能力增强。

      图  10  不同样品的还原能力比较

      Figure 10.  Reduction power comparison of different samples

    • DPPH在有机溶剂中可形成呈紫红色的、稳定的自由基,其在517nm处具有典型的特征吸收峰。当加入抗氧化剂后,抗氧化剂会提供氢原子和电子给DPPH自由基,使溶液由紫色变为黄色或无色,导致溶液特征吸收波长处的吸光值变小。在此反应中,体系颜色变得越浅表明所检测物质的抗氧化能力越强。从图 11可知:各样品对DPPH自由基的半数抑制质量浓度(IC50)差异并不显著,基本符合平均聚合度降低,相对分子质量分布变窄,其清除DPPH自由基能力增强的趋势。其中,LOPC对DPPH自由基的IC50值最小,为72.56mg/L,清除能力最强;VC的清除能力最弱,IC50值为98.32mg/L。清除DPPH自由基能力大小顺序为LOPC>GS>PB>LPPC>TBHQ>VC。

      图  11  不同样品对DPPH自由基的半清除率对比

      Figure 11.  Comparison in IC50 of different samples for DPPH

    • ·OH自由基是氧三电子还原产物,是已知的最强、最活泼、危害最大的一种自由基。试样结构中的酚羟基可释放H+,竞争性地与·OH自由基结合,阻断了自由基链式反应,从而抑制了·OH自由基的氧化作用,并且低聚合度原花青素空间位阻小,易失去羟基H+,因此随着平均聚合度的降低和相对分子质量分布变窄,其·OH自由基清除能力增强。从图 12可知:GS对·OH自由基的IC50值最小,为7.27mg/L;LOPC次之,为12.64mg/L;LPPC最大,为69.6mg/L。清除·OH自由基能力顺序为GS>LOPC>PB>TBHQ>VC>LPPC。

      图  12  不同样品对·OH自由基的半清除率对比

      Figure 12.  Comparison in IC50 of different samples for ·OH

    • ABTS自由基清除法常被用来测定活性成分的总抗氧化能力。在反应体系中,ABTS经过硫酸钾氧化后生成相对稳定的蓝绿色ABTS+·自由基。抗氧化剂与ABTS+·自由基反应后,蓝绿色溶液褪色,特征吸收波长处的吸光度值随之减弱,而吸光度值减弱得越明显则表明抗氧化剂的总抗氧化能力越强。从图 13可知:GS清除ABTS自由基能力最强,IC50值为2.05mg/L;其次是LOPC,IC50值为2.52mg/L;各样品清除ABTS自由基能力都显著高于VC。清除ABTS自由基能力大小顺序为GS>LOPC>LPPC>PB>TBHQ>VC。

      图  13  不同样品对ABTS自由基的半清除率对比

      Figure 13.  Comparison in IC50 of different samples for ABTS

    • 利用CR57树脂催化降解了LPPC,确定最佳的降解工艺条件为:每100mL多聚原花青素催化树脂用量18mL,催化温度76℃,催化时间1.8h。按此工艺条件降解,其降解率为52.87%,降解产物LOPC平均聚合度为3.76。利用仪器分析方法对降解产物进行结构分析,确定其具有原花青素结构特征,是从三聚体到十二聚体,并以四聚体为主分布的低聚物,说明利用CR57树脂对LPPC催化降解的方法是可行的。通过抗氧化分析,确定降解产物的DPPH自由基清除能力较强,而还原能力和清除·OH自由基、ABTS自由基能力仅略低于葡萄籽提取物,具有较好的抗氧化性。本研究结果为落叶松树皮的精细化利用提供了新途径,具有一定的研究价值和意义。

参考文献 (19)

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