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转录组分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对毛白杨悬浮细胞表达谱的影响

张永卓 刘雅琳 陆海 李慧

引用本文:
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转录组分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对毛白杨悬浮细胞表达谱的影响

    作者简介: 张永卓,博士生。主要研究方向:树木分子生物学。Email:156498755@qq.com 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院.
    通讯作者: 李慧,讲师。主要研究方向:树木分子生物学。Email: 830lihui@163.com 地址:同上
  • 基金项目:

    中央高校基本科研业务费专项 BLX2015-37

    国家自然科学基金项目 31500161

  • 中图分类号: S718.43;S792.117;Q786

Transcriptome analysis of gene expression profiling in the suspension cells of Populus tomentosa treated by histone deacetylase inhibitor TSA

图(5)表(3)
计量
  • 文章访问数:  1504
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  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2018-05-16
  • 录用日期:  2018-07-21
  • 刊出日期:  2018-09-01

转录组分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对毛白杨悬浮细胞表达谱的影响

    通讯作者: 李慧, 830lihui@163.com
    作者简介: 张永卓,博士生。主要研究方向:树木分子生物学。Email:156498755@qq.com 地址:100083北京市海淀区清华东路35号北京林业大学生物科学与技术学院
  • 北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083
基金项目:  中央高校基本科研业务费专项 BLX2015-37国家自然科学基金项目 31500161

摘要: 组蛋白去乙酰化酶HDAC具有调节细胞增殖、诱导细胞分化、凋亡的作用, 是近年生物学研究热点之一, 而在木本植物方面的作用却鲜有报道。目的本实验用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)对杨树悬浮细胞进行处理, 通过改变细胞的组蛋白乙酰化水平, 来探讨其对基因表达谱变化的影响。方法用0.5 μmol/L的TSA处理悬浮细胞, 10 d后收集材料用于RNA-Seq分析, 比较经过TSA处理与对照组的悬浮细胞之间转录组表达差异情况。结果通过显微镜观察发现, 对照组细胞呈均匀椭圆形, 而经过TSA处理后的细胞出现圆形及长条形细胞。通过转录组分析得到4 465个差异表达基因(DEGs), 其中2 363个基因上调, 2 102个基因下调。差异表达基因主要富集在细胞周期、苯丙素生物合成、细胞壁结构成分和乙酰化相关等途径。结论通过分析TSA处理和对照组的悬浮细胞基因表达差异, 发现TSA通过影响组蛋白乙酰化水平直接或间接影响细胞生长、细胞壁组分和细胞周期的相关基因, 为认识组蛋白乙酰化对植物生长发育的影响提供依据。

English Abstract

  • 在表观遗传学的研究中,组蛋白的修饰(histone modification)作用是其中最常见的一种调控机制,它对植物的生长、发育以及胁迫反应都有一定程度的影响。组蛋白修饰过程包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化及泛素化等等。目前的研究表明组蛋白乙酰化是一种普遍存在的、重要的、可逆并且高效调控的翻译后修饰方式,它通过改变组蛋白与DNA的结合紧密程度来控制靶基因的转录水平[1],是由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)共同调控的一个动态可逆过程[2]。组蛋白乙酰化和去乙酰化的过程参与了很多生物学过程,例如应激反应、新陈代谢、转录以及蛋白质的合成与降解等。其中,组蛋白去乙酰化酶在真核细胞转录活动调节中起着十分关键的作用[3]。HDACs由一个基因家族编码,包括RPD3/HDA1、HD2和SIR2三个亚家族,不仅能够催化组蛋白的去乙酰化,同时也与非组蛋白的去乙酰化过程密切相关,且广泛存在于酵母、哺乳动物和植物中。研究表明在植物生长过程中,HDACs发挥着关键作用,其中包括花发育[4]、种子发育[5]、根发育[6]以及器官生长过程中细胞的增殖[7]和死亡[8-9]等,同时也参与响应生物和非生物胁迫,如干旱[10]、盐胁迫[11]、低温[12]、ABA[11]等胁迫。除上述功能外,在植物研究方面HDACs还与细胞周期进程、基因沉默有关。

    目前对植物中HDACs的功能研究还集中在草本模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,而木本植物的研究相对较少。为了研究HDACs在植物发育中的功能,一方面可采用过量表达或抑制组蛋白去乙酰化酶基因的表达,检测转基因植物的表型;另一方面可采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂进行处理来检测植物。已知的HDACIs(HDAC inhibitors, HDACIs)按其结构可分为4类:(1)氧肟酸盐,如曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA);(2)脂肪酸,如丙戊酸和丁酸盐;(3)环肽,如环氧肟酸;(4)苯酰胺类,如MS-275和MGCD0103等。其中MS-275对I类HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8)的抑制作用强于III类HDACs(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的组蛋白去乙酰化酶),而对HDAC6几乎没影响;白皮杉醇(Piceatannol)仅仅对HDAC2和HDAC6有很强抑制作用;槲皮素(Quercetin)和漆黄素(Fisetin)高效抑制HDAC6;而SAHA和TSA能广谱抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC7、HDAC10和HDAC6[13]。目前HDACIs作为抑癌药物,抑制癌细胞的增殖方面作用明显。HDACIs能通过抑制HDAC的活性、重塑染色质、干扰HDAC募集功能进而抑制基因表达, 从而治疗癌症[14]。有研究指出,哺乳动物细胞中,染色体紧密程度与组蛋白乙酰化程度有关,染色体的浓缩导致细胞有丝分裂期H4K5和H3K9的乙酰化水平下降[15]。此外HDAC抑制剂也被用于植物学研究,其中曲古抑菌素A(TSA)是最早发现的一类天然组蛋白去乙酰化酶抑制剂。有研究发现,体外培养过程中添加TSA可以调节油菜(Brassica napus)花粉命运的转变,TSA抑制HDAC的活性提高了组蛋白H3和H4乙酰化程度,导致胚性转化的花粉比例大幅度增加[16]。花生(Arachis hypogaea)经过TSA处理,引起组蛋白H3高度乙酰化,影响了干旱响应过程[17]。在拟南芥中,TSA处理可诱导拟南芥幼苗产生大量根毛[18]。此外还发现在有丝分裂过程中,染色体会发生浓缩或者解聚,而染色体的状态受组蛋白乙酰化和去乙酰化调控,组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理会影响着植物细胞的有丝分裂。经过TSA、丁酸钠处理,豌豆(Pisum sativum)根分生组织细胞有丝分裂进程被抑制[19]。不同染色体区域的乙酰化状态与细胞周期相关,常染色体和异染色体H4乙酰化的程度与DNA的复制时期密切相关,某些染色体区域在有丝分裂中期仍保持高度乙酰化[20]。但在对大麦(Hordeum vulgare)和蚕豆(Vicia faba)有丝分裂的研究中发现,它们的组蛋白H4乙酰化水平发生不同程度的降低[21-23]。在烟草(Nicotiana tabacum)原生质体培养中发现,组蛋白H4和H3的乙酰化水平与有丝分裂所处的时期有关,而经过TSA处理显著降低了有丝分裂的频率,影响了有丝分裂的进程[24]。说明组蛋白去乙酰化广泛的参与植物细胞周期的调控和细胞的生长。

    本研究通过在木本植物毛白杨(Populus tomentosa)悬浮细胞体系中添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂,改变组蛋白的乙酰化程度, 来检测其对毛白杨细胞生长和细胞增殖的影响。悬浮培养的植物细胞具备良好的分散性,而且生长迅速、重复性好、容易获得同步化的细胞,被广泛应用于细胞学、生物化学、生理学、遗传学及其分子生物学等研究[25]。同时基于新一代测序技术——高通量转录组测序(RNA-Seq)的广泛应用,利用悬浮细胞体系可以迅速发掘细胞生长途径中的功能基因,从而为研究基因的表达及功能提供了信息支持。利用TSA处理悬浮细胞改变其蛋白的乙酰化状态,同时结合转录组分析挖掘组蛋白去乙酰化酶被抑制后差异表达的基因,从而研究组蛋白乙酰化状态的改变对木本植物细胞周期和生长的影响,为进一步研究其关键基因的功能提供重要资料。

    • 741毛白杨, 二甲基亚砜(DMSO),曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA),1/2MS固体培养基,1.0 mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine 6-BA),0.1 mg/L萘乙酸(1-Naphthylacetic acid NAA),MS液体培养基,2 mg/L, 溴化丙啶(Propidium Iodide, PI)。

    • (1) 组织培养:取野生型741毛白杨在含激素2 mg/L 2, 4-D和0.1 mg/L NAA的1/2MS固体培养基中进行组织培养,待组培苗生长2~3个月,取其叶片,将叶片剪至0.5 cm×0.5 cm进行愈伤组织培养。(2)悬浮细胞系的建立:经过培养剪取的叶片在诱导愈伤组织固体培养基上形成的愈伤组织,选取松散的、颜色嫩黄、快速增殖的愈伤组织接种到液体MS培养基中, 并添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA稳定继代增殖。1 500~2 000 lx光照下进行悬浮培养,150 r/min,24℃。(3)悬浮细胞样品处理:从同一瓶悬浮细胞系中,吸取等量悬浮细胞进行不同处理。用DMSO溶解的终浓度0.5 μmol/L TSA处理悬浮细胞,对照组用等量的DMSO处理。相同条件下培养10 d后,将扩增的悬浮细胞过筛除去培养液,在液氮中速冻10 min用于转录组分析。

    • (1) 杨树悬浮细胞的富集:吸取10 mL加入DMSO对照的杨树野生型悬浮细胞和10 mL经TSA处理10 d后的杨树悬浮细胞转入离心管中,5 000 r/min离心5 min后,留少许培养液制成细胞悬液直接观察。(2)制片:碘化丙啶(PI)溶于含0.1% TritionX-100的PBS中,终浓度为50 μg/mL,含RNase 100 μg/mL,分别取1 mL的细胞悬液,加10 μL的PI染液混合,避光作用10 min;加入5 mL PBS,1 500 r/min离心5 min,弃上清,重复洗涤2次,重悬细胞,并用盖玻片封片。(3)观察细胞形态:将荧光显微镜的汞灯提前打开预热,先在明场下观察细胞形态并拍照记录。绿色滤色片(535 nm)过滤杂光,并观察细胞染色情况并拍照记录。

    • 选取用TSA处理10 d的毛白杨悬浮细胞样品和用相同浓度DMSO处理的对照组进行后续的RNA-Seq分析。每组选取3个独立样品进行混合,进行总RNA的提取。交由北京诺禾致源公司进行后续文库构建、转录组测序,并返还转录组测序数据,我们对测序结果进行分析。(1)Total RNA样品提取:通过Nanodrop检测RNA的纯度(OD260/280),同时利用Qubit对RNA浓度进行精确定量,Agilent 2100精确检测RNA的完整性。(2)文库构建和库检:Total RNA检测合格后,通过Oligo(dT)等一系列方法进行PCR富集得到最终的cDNA文库。文库构建完成后,先使用Qubit 2.0进行初步定量,使用Agilent 2100对文库进行检测,以保证文库质量。(3)测序分析:把构建的文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求进行Illumina HiSeq 4 000测序。原始测序结果经质量评估、与相关物种参考序列进行比对分析、基因表达分析及基因差异表达分析后,采用GO、KEGG、COG和Swiss-Prot等数据库进行生物信息学分析。从而进行基因和转录本定量分析、基于基因表达水平的各项分析,并对筛选出的样品间差异表达基因,进行GO功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析。

    • 将经过0.5 μmol/L TSA处理10 d和对照组悬浮细胞10 mL转入离心管中,5 000 r/min离心5 min后,除去上清5 mL,留下培养液制成细胞悬液,移至平板中观察拍照。图 1为细胞形态实验结果,显示了加入TSA处理10 d后和未加TSA的对照组杨树悬浮细胞的细胞形态对比。对照组悬浮细胞大多数生长状态正常且呈均匀椭圆形(图 1C图 1E),经过TSA处理后的悬浮细胞部分呈圆形或者长条形(图 1D图 1F)。说明经过一定浓度TSA处理,影响了细胞生长状态。

      图  1  TSA处理和对照组毛白杨悬浮细胞形态观察

      Figure 1.  Cell morphological observation of TSA-treated and control group suspension cells in Populus tomentosa

    • 转录组样本原始测序数据具体见表 1,整体评估优良,结果合格可用。所有有效序列百分数均大于97%,平均GC含量为44.24%,总数据大小为19.76 Gb。采用表达差异倍数(Fold change, x)以及精确检验统计学方法,对经过0.5 μmol/L TSA处理10 d和对照组的毛白杨悬浮细胞表达基因进行差异表达基因筛选(log2x>2, P < 0.05)。如图 2所示,共有4 465个基因的转录水平存在显著性差异(DEGs),上调基因数量为2 363个,下调基因数量为2 102个。

      表 1  转录组测序数据基本情况

      Table 1.  Details of transcriptome raw data

      样本名称Sample name WT TSA
      Raw reads 78 359 688 56 834 686
      Clean reads 76 174 698 55 525 586
      Clean reads percentage/% 97.2 97.7
      Clean bases 11.43G 8.33G
      Error rate/% 0.01 0.01
      Q20/% 98.27 98.69
      Q30/% 95.61 96.49
      GC content/% 44.09 44.39
      FPKM Interval(0~1) 17 990(43.20%) 17 828(42.81%)
      FPKM Interval(1~3) 3 675(8.83%) 3 773(9.06%)
      FPKM Interval(3~15) 10 137(24.34%) 10 086(24.22%)
      FPKM Interval(15~60) 7 526(18.07%) 7 651(18.37%)
      FPKM Interval(>60) 2 314(5.56%) 2 304(5.53%)
      注 Notes:Raw reads, 原始序列数据; Clean reads, 过滤后数据; Clean reads percentage,过滤后数据百分比;Clean bases, 转化数据; Error rate, 误码率; Q20(Q30), Phred数值大于20、30的碱基百分比; GC content, G和C数量占总碱基百分比; FPKM Interval, expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced,是每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目,按照不同表达水平区间统计。

      图  2  差异表达基因的火山图

      Figure 2.  Volcano map of differentially expressed genes

      表 2  显著性差异表达基因的统计分析

      Table 2.  Statistical analysis of significantly differentialby expressed genes

      log2x 上调基因数目
      Up-regulated gene number/%
      下调基因数目
      Down-regulated gene number/%
      >2 2 363 2 102
      2~5 1 680(71.1%) 1 735(82.5%)
      5~10 623(26.4%) 346(16.4%)
      10 60(2.5%) 21(1.0%)

      表 3  差异表达的部分基因的功能分析

      Table 3.  Functional analysis of differentially expressed genes

      类别 Category 基因ID Gene ID log2x P值 P value 描述 Description
      下调转录因子
      Down-regulate transcription factors
      AP2-EREBP POPTR_0002s16900 -5.096 41 1.89×10-16 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0003s13910 -2.269 73 6.91×10-7 ethylene-responsive transcription factor
      POPTR_0003s17830 -2.639 41 2.53×10-8 ethylene-responsive transcription factor ERF003
      POPTR_0006s10510 -4.754 64 3.82×10-16 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0006s27710 -2.946 40 1.28×10-10 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0010s22320 -4.569 17 3.88×10-10 ethylene-responsive transcription factor
      POPTR_0014s01260 -2.150 90 7.90×10-6 AP2-like ethylene-responsive transcription factor
      POPTR_0014s09020 -2.835 97 1.14×10-5 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0001s18800 -3.404 59 2.42×10-5 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0004s05110 -4.306 81 5.75×10-5 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0017s04540 -2.237 32 2.56×10-7 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      AUX/IAA POPTR_0002s10880 -2.836 41 1.22×10-10 putative indoleacetic acid-induced protein 8 (IAA8)
      POPTR_0006s06550 -10.671 2 1.78×10-19 aux/IAA protein
      POPTR_0008s16100 -5.260 87 2.35×10-24 aux/IAA protein
      POPTR_0010s08890 -3.235 68 1.65×10-12 aux/IAA protein
      POPTR_0018s14300 -4.437 79 1.83×10-19 auxin response factor
      POPTR_0008s17220 -3.372 51 3.01×10-12 aux/IAA protein
      POPTR_0018s12790 -3.539 40 5.30×10-12 aux/IAA protein
      POPTR_0001s17780 -8.999 63 2.45×10-10 aux/IAA protein
      POPTR_0013s03860 -4.137 51 5.19×10-18 putative auxin-induced protein IAA4
      bHLH POPTR_0001s09450 -2.155 17 5.94×10-7 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0002s05510 -3.028 3 1.42×10-9 transcription factor TT8
      POPTR_0005s06220 -4.140 25 2.93×10-16 transcription factor HEC3
      POPTR_0006s03560 -2.099 8 3.58×10-6 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0006s07440 -2.278 97 4.65×10-7 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0004s05490 -3.654 06 2.25×10-11 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0001s31250 -8.825 50 1.84×10-9 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0001s19250 -3.213 79 2.87×10-9 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0017s07520 -2.338 43 7.97×10-8 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0008s19510 -4.875 90 6.40×10-7 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0018s13840 -3.509 27 1.12×10-5 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0006s05640 -2.208 79 5.49×10-5 Helix--loop-helix DNA-binding
      POPTR_0018s13850 -4.660 67 9.43×10-18 Helix-loop-helix DNA-binding
      MYB POPTR_0018s10390 -9.739 11 5.66×10-14 SANT domain, DNA binding; transcription regulator HTH, MYB-type
      POPTR_0003s14420 -4.532 38 5.50×10-10 SANT domain, DNA binding; transcription regulator HTH, MYB-type
      POPTR_0002s18170 -3.791 69 1.08×10-15 MYB-related transcription factor LHY
      POPTR_0003s11360 -3.745 86 3.77×10-12 putative MYB family transcription factor (MYB85)
      POPTR_0019s07760 -3.707 5 1.80×10-14 putative transcription factor MYB101
      POPTR_0015s13180 -2.902 47 2.73×10-6 MYB-like DNA-binding protein
      POPTR_0012s14540 -2.768 56 1.14×10-7 transcription regulator HTH, Myb-type, DNA-binding
      POPTR_0006s25840 -2.751 47 4.98×10-9 putative C-MYB-like transcription factor (MYB3R2)
      POPTR_0002s13030 -2.661 68 1.21×10-6 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0006s09860 -2.535 63 9.87×10-7 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0006s18620 -2.363 55 2.33×10-6 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0007s15110 -2.262 71 5.78×10-7 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0012s03530 -3.690 53 3.23×10-13 MYB-like DNA-binding domain
      MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0011s04010 -7.828 67 1.09×10-5 MYB-like DNA-binding domain
      MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0004s08480 -4.162 95 4.56×10-12 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0010s13290 -4.807 59 3.48×10-9 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0009s01270 -2.384 50 6.88×10-6 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0002s11440 -2.047 54 3.90×10-6 MYB-like DNA-binding domain
      WRKY POPTR_0012s10290 -2.007 31 7.54×10-6 WRKY transcription factor 75
      POPTR_0014s15320 -2.914 72 2.59×10-10 DNA-binding WRKY
      POPTR_0005s08720 -2.860 66 2.57×10-9 DNA-binding WRKY
      POPTR_0005s05700 -2.077 97 4.79×10-6 DNA-binding WRKY
      下调基因
      Down-regulate genes
      乙酰化相关 POPTR_0009s07820 -11.523 24 4.84×10-25 GNAT5-related n-acetyltransferase (GNAT) family protein; similar to GNAT family
      Acetylation related POPTR_0019s01520 -5.006 67 9.72×10-18 shikimate O-hydroxycinnamoyl transferase
      POPTR_0004s05280 -2.038 49 1.85×10-6 transferase family protein; similar to elicitor inducible gene product EIG-i24
      木质素合成 POPTR_0014s14310 -5.919 72 1.52×10-27 xyloglucan endo-transglycosylase, C-terminal
      Lignin synthesis POPTR_0008s03810 -2.516 21 7.35×10-9 phenylalanine ammonia-lyase
      POPTR_0019s14590 -5.195 90 1.12×10-25 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      POPTR_0004s02030 -2.352 01 2.70×10-6 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      POPTR_0013s14860 -2.062 34 1.41×10-6 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      POPTR_0010s23100 -2.013 57 6.39×10-6 phenylalanine/histidine ammonia-lyases, active site; phenylalanine ammonia-lyase
      纤维素合成 POPTR_0003s14230 -2.656 26 2.28×10-9 cellulose synthase
      Cellulose synthesis POPTR_0002s20130 -3.850 09 1.20×10-8 cellulose synthase
      POPTR_0014s12000 -2.448 48 3.08×10-7 cellulose synthase
      上调转录因子
      Up-regulate transcription factors
      AP2-EREBP POPTR_0003s15060 3.926 373 1.82×10-13 ethylene-responsive transcription factor ERF106
      POPTR_0003s07910 6.005 648 9.03×10-30 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0001s15390 2.893 319 1.39×10-10 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0006s23480 4.311 008 5.06×10-10 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0009s10470 4.597 455 1.10×10-9 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0015s13830 4.803 138 3.96×10-8 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0002s08610 2.231 947 4.25×10-7 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0003s13610 3.464 754 2.20×10-6 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0001s15550 3.183 902 5.26×10-6 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0014s09540 9.120 961 1.63×10-11 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0006s14100 4.137 601 1.77×10-8 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0002s06620 2.297 645 1.35×10-7 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0017s08250 2.551 527 2.38×10-6 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0012s13880 2.173 311 4.10×10-5 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      POPTR_0005s08940 2.850 637 1.40×10-9 pathogenesis-related transcriptional factor/ERF
      bHLH POPTR_0005s22870 5.416 638 8.03×10-14 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0004s02870 4.947 659 2.29×10-13 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0001s27680 3.088 316 6.92×10-12 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0003s05010 3.544 713 1.26×10-6 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0018s09060 2.513 479 1.75×10-6 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0001s29400 2.408 46 1.85×10-6 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0019s11870 2.055 089 2.34×10-6 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0010s14010 2.599 038 3.95×10-6 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0010s08760 7.719 238 5.45×10-6 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0001s18660 2.835 36 6.24×10-6 helix-loop-helix DNA-binding
      POPTR_0005s04160 5.664 689 2.00×10-20 transcription factor bHLH99
      MYB POPTR_0003s06320 2.583 688 1.47×10-8 MYB-like DNA-binding protein
      POPTR_0007s14630 3.054 572 3.85×10-10 MYB domain protein 87
      POPTR_0017s04890 3.299 653 3.43×10-9 putative MYB transcription factor
      POPTR_0001s07830 2.490 851 3.49×10-8 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0014s11230 2.845 941 1.04×10-7 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0007s11470 3.070 633 8.56×10-12 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0017s04720 4.004 355 2.89×10-17 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0010s18130 4.068 391 1.50×10-12 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0001s02010 6.986 829 0.000517 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0018s06410 9.007 962 5.84×10-11 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0006s15480 2.275 316 2.63×10-5 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0005s21420 4.377 921 1.70×10-17 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0016s12430 2.263 672 1.01×10-6 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0006s10190 2.025 607 8.49×10-6 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0001s22660 5.347 404 1.52×10-10 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0004s02570 5.778 901 1.25×10-9 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0006s12400 4.105 249 2.30×10-8 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0005s24550 2.524 575 3.04×10-8 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0011s12750 3.745 664 1.47×10-5 MYB-CC type transcription factor
      POPTR_0002s07440 3.708 866 5.67×10-13 MYB-like DNA-binding protein
      POPTR_0001s20370 4.142 885 9.88×10-14 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0009s03240 4.551 641 1.71×10-16 putative MYB family transcription factor MYB59
      POPTR_0008s16660 6.760 851 7.71×10-20 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0011s04120 7.339 587 4.98×10-26 MYB transcription factor-related
      POPTR_0017s04720 4.004 355 2.89×10-17 MYB-like DNA-binding domain
      POPTR_0009s03990 2.642 05 3.19×10-9 MYB-like DNA-binding domain
      WRKY POPTR_0001s10490 3.049 334 8.40×10-10 putative WRKY transcription factor 41
      POPTR_0001s13600 2.678 04 1.89×10-9 putative WRKY transcription factor 45
      POPTR_0001s13610 3.055 109 5.18×10-11 putative WRKY transcription factor
      POPTR_0002s16590 2.778 68 7.05×10-10 WRKY transcription factor 22
      POPTR_0003s13840 3.925 765 1.27×10-14 putative WRKY transcription factor 53
      POPTR_0003s18060 4.696 985 2.94×10-21 putative WRKY transcription factor 40
      POPTR_0008s09140 4.204 637 2.08×10-16 putative WRKY transcription factor 3
      POPTR_0015s07530 2.614 523 3.20×10-9 DNA-binding WRKY
      POPTR_0015s11130 2.538 428 6.01×10-9 WRKY transcription factor 75
      POPTR_0017s11570 3.024 346 1.44×10-10 putative WRKY transcription factor 72
      POPTR_0002s21330 5.191 626 1.31×10-12 DNA-binding WRKY
      POPTR_0003s16750 3.001 877 2.79×10-11 DNA-binding WRKY
      POPTR_0001s34520 2.472 224 1.91×10-8 DNA-binding WRKY
      POPTR_0016s13600 2.270 756 2.06×10-7 DNA-binding WRKY
      POPTR_0002s19630 2.314 696 2.31×10-7 DNA-binding WRKY
      POPTR_0001s09900 2.442 682 1.90×10-6 DNA-binding WRKY
      POPTR_0019s14460 2.760 178 5.27×10-10 WRKY transcription factor 25
      上调基因
      Up-regulate genes
      乙酰化相关 POPTR_0005s18970 6.099 277 7.99×10-16 GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) domain
      Acetylation related POPTR_0007s13930 2.380 817 3.83×10-8 Histone H1/H5
      POPTR_0006s01190 2.205 723 5.79×10-7 chloramphenicol acetyltransferase-like domain
      POPTR_0016s11990 2.709 516 4.48×10-6 chloramphenicol acetyltransferase-like domain
      POPTR_0008s15450 3.704 659 9.50×10-14 GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) domain
      POPTR_0003s18090 3.476 053 3.90×10-7 GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) domain
      POPTR_0010s06380 3.686 076 8.04×10-14 chloramphenicol acetyltransferase-like domain
      POPTR_0010s19360 2.671 295 1.16×10-7 chloramphenicol acetyltransferase-like domain
      POPTR_0019s14700 2.592 051 1.44×10-6 chloramphenicol acetyltransferase-like domain
      POPTR_0018s11840 7.567 995 1.27×10-5 chloramphenicol acetyltransferase-like domain
      POPTR_0010s06390 7.306 48 7.55×10-5 chloramphenicol acetyltransferase-like domain
      POPTR_0005s11860 2.582 812 3.05×10-9 Histone H5
      细胞周期 POPTR_0008s08890 4.544 545 3.32×10-16 cell cycle and apoptosis regulator protein
      Cell cyclin POPTR_0008s08880 5.080 659 7.40×10-7 cell cycle and apoptosis regulator protein
      POPTR_0002s12450 2.348 594 8.65×10-8 cyclin-like
      POPTR_0002s11980 4.406 009 7.55×10-5 cyclin-like
      POPTR_0001s45630 4.777 505 3.77×10-13 F-box domain, cyclin-like
      POPTR_0011s01490 3.731 533 3.69×10-12 F-box domain, cyclin-like
      POPTR_0009s05230 2.808 402 1.65×10-9 F-box domain, cyclin-like
      POPTR_0006s22490 2.553 471 3.17×10-8 F-box domain, cyclin-like
      POPTR_0003s19730 2.329 87 6.76×10-8 F-box domain, cyclin-like
      木质素合成 POPTR_0006s07060 2.624 056 1.87×10-9 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      Lignin synthesis POPTR_0007s14570 4.197 216 9.25×10-18 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      POPTR_0002s06120 3.670 01 4.53×10-13 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      POPTR_0003s09590 3.004 086 1.75×10-11 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      POPTR_0005s22300 2.032 963 1.03×10-5 xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
      POPTR_0001s07100 8.394 74 2.93×10-8 xyloglucan fucosyltransferase
      POPTR_0001s07130 2.411 038 3.25×10-7 xyloglucan fucosyltransferase
      POPTR_0018s10300 4.105 44 9.51×10-14 xyloglucan endo-transglycosylase, C-terminal
      纤维素合成 POPTR_0011s07040 2. 549 334 2.01×10-5 cellulose synthase
      Cellulose synthesis POPTR_0009s17100 4.878 897 1.65×10-8 cellulose synthase

      按照log2x数值进行深入分析。大量差异基因集中在2~5倍,上调基因和下调基因分别占整体差异基因的71.1%和82.5%。而大于10倍的极显著基因中,上调基因有60个,下调基因有21个,分别占总差异表达基因的2.5%和1.0%(表 2)。

    • 根据Gene Ontology的功能分类体系,对差异表达基因相关的主要特征功能进行分类。总GO功能富集条目为3 477个。其中GO功能分类体系的生物学过程(biological process)占总数的67%,细胞组分(cellular component)占总数的23%,分子功能(molecular function)为11%(图 3A)。

      图  3  差异基因GO功能富集

      Figure 3.  GO function enrichment of differential genes

      为进一步分析经过TSA处理后基因转录的差异,逐步分析上调GO功能富集以及下调的GO功能富集的基因。其中GO显著富集上调总数160条(P < 0.05)。按照生物学功能(biological process)分类,显著性富集的条目主要集中在“氧化还原过程”“光合作用”和“肽酶活性的负调控”等,其中富集数量最多的是单体代谢过程;按照细胞组分分类(cellular component),主要集中在“类囊体”“光合膜”和“光系统”上;按照分子功能分类(molecular function),主要集中在“氧化还原酶活性”“肽链内切酶抑制剂活性”和“肽酶抑制剂活性”(图 3B)。“氧化还原过程”中有273个基因上调,“氧化还原酶活性”有253个基因上调,“类囊体”有68个基因上调。转录组数据显示,经过组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理后有2个编码组蛋白H1-3基因(POPTR_0007s13930、POPTR_0005s11860)和1个编码组蛋白H3K9Me脱甲基酶基因(POPTR_0004s00770)上调。细胞周期和凋亡调节蛋白(POPTR_0008s08890、POPTR_0008s08880)以及细胞周期蛋白D也上调,同时有报道指出在对结肠癌细胞的研究中,TSA可以延缓细胞周期G1-S进程,并且影响细胞周期素Cyclin E、Cyclin A聚集[26]

      下调GO功能中显著富集总数一共168条(P < 0.05)。按照生物学功能分类,显著性富集的条目主要集中在“微管运动”“细胞组分的运动”和“DNA复制起始”等;按照细胞组分分类,主要集中在“驱动蛋白复合体”“微管相关复合物”和“微管细胞骨架”上;按照分子功能分类(molecular function),主要集中在“微管运动活性”“运动活性”和“细胞骨架结合蛋白”(图 3C)。在下调的差异表达基因中,微管相关蛋白(POPTR_0015s14350、POPTR_0005s18580)发生改变,同时有报道指出,经过秋水仙素、低温等方法处理神经元细胞,发现微管解聚,细胞变圆,与我们观察到的实验结果相似[27]。而植物减数分裂与细胞骨架的有序分布和变化密切相关[28]。还发现POPTR_0009s07820编码的Gcn5-N-乙酰基转移酶(GNAT)家族蛋白发生下调,有报道指出组蛋白乙酰转移酶GCN5与组蛋白去乙酰化酶HD1在调节光诱导基因表达方面起着相反的作用,gcn5突变后胚轴增长,并且光诱导相关基因的表达下降,而hd1突变后的表型相反,两者双突变后植株光形态建成正常[29]。同时参与细胞壁组成具备纤维素合成酶活性的基因表达也发生下调。结果说明经过TSA处理,抑制了组蛋白去乙酰化酶的活性,导致大量有关组蛋白调控、细胞分裂的GO功能基因下调,也证明组蛋白去乙酰化的乙酰作用广泛参与影响了微管运动、微管活性以及细胞周期相关功能,导致细胞增殖、分化、形态等有关功能发生改变。

    • 根据KEGG数据库,对差异表达基因进行功能分类和Pathway注释,其中有113条显著富集的KEGG通路发生改变(图 4)。KEGG途径主要富集在苯丙素的生物合成、亚油酸代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、次生代谢产物生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢。分析发现与乙酰化密切相关通路包括“赖氨酸生物合成”“苯丙素的生物合成”。其中各类氨基酸相关代谢证明经过TSA处理后改变了组蛋白乙酰化水平导致氨基酸合成途径受阻。淀粉与蔗糖代谢可以有效保证植物体内的能量平衡以及提高植物细胞在处理后正常生长的能力。代谢途径中如泛醌等萜醌类生物合成、核苷酸切除修复及维生素B6代谢途径均下调,说明悬浮细胞在去乙酰化酶抑制剂下容易发生基因突变、细胞周期紊乱[30]

      图  4  差异基因KEGG富集分析

      Figure 4.  KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

      其中苯丙氨酸代谢途径变化非常显著,177个背景基因中有45个基因发生改变(图 5), 其中21个基因上调,24个基因下调。其中一条从L-苯丙氨酸到阿魏酰辅酶A合成通路,多个基因呈下调趋势(图 5),主要包括苯丙氨酸解氨酶(POPTR_0008s03810、POPTR_0010s23100)、肉桂酸4-加氧酶(POPTR_0019s15110、POPTR_0013s15380)、反式阿魏酰辅酶A合成酶(POPTR_0006s18500、POPTR_0006s18490、POPTR_0006s18510、POPTR_0017s 13880、POPTR_0004s10170)以及咖啡酰辅酶A甲基转移酶(POPTR_0009s10270)。2个编码苯丙氨酸解氨酶的基因下调(POPTR_0010s23100、POPTR_0008s03810),苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类代谢途径的关键酶之一,参与了L-苯丙氨酸反式肉桂酸的合成。莽草酸-O-羟基肉桂酰基转移酶HCT(POPTR_0019s01520)是木质素合成的关键酶,在催化香豆酰辅酶A合成咖啡酰辅酶A过程中起着重要作用,有研究表明在拟南芥中沉默该基因导致木质素合成受阻,植物矮化[31]。在苯丙酮酸和L-苯丙氨酸相互转化的过程由多个转氨酶调控,一部分转氨酶下调(POPTR_0005s08100、POPTR_0017s04600、POPTR_0017s04590),而另一部分转氨酶上调(POPTR_0006s10770、POPTR_0018s02250、POPTR_0018s 08910、POPTR_0007s01130),这些转氨酶互相调节,共同改变苯丙酮酸和L-苯丙氨酸的表达。另一些与木质素合成相关基因及纤维素合成相关基因,例如木葡聚糖内酯葡糖苷酶(POPTR_0014s14310)和纤维素合酶下调。因此经过TSA处理改变与细胞壁组分相关的基因,包括木质素和纤维素合成途径中关键酶,进而影响细胞壁组分。

      图  5  苯丙素的生物代谢途径

      Figure 5.  Phenylalanine metabolism pathway

      组蛋白乙酰化酶可通过与转录因子相互作用来共同调控靶基因的转录。有研究报道,拟南芥组蛋白去乙酰化酶HDA6与AS1协同调控叶形态,HDA6与AS1直接互作, 在hda6/as1双突变体中, 表现出了比as1更明显的叶形态发育异常表型[11]。分析结果表明:差异表达显著且数量较多的转录因子家族有AP2/EREBP、NAC、WRKY、MYB、Zinc finger、bHLH和Gata等(表 3)。ERF、MYB、NAV、WRKY、bHLH等转录因子在植物发育生长、激素信号转导通路调控上起着关键作用,TSA的添加导致信号传导途径相关的基因出现异常。如植物生长素IAA家族有5个转录因子的下调,包括IAA8等MYB转录因子家族有15个下调,其中包括对木质素合成基因的表达进行正调控MYB85、MYB101等。上调转录因子中,MYB家族有11个,包括MYB87、MYB59和调控黄酮生物合成的MYB29;WRKY家族有11个转录因子上调,包括参与盐胁迫WRKY41等。说明经过TSA处理,抑制HDAC的活性,导致染色质结构发生改变,影响了转录因子的表达。

    • 组蛋白的乙酰化修饰是一种十分重要的表观遗传修饰,其参与的基因表达调控是一个复杂的过程,一方面组蛋白去乙酰化酶与组蛋白乙酰转移酶共同影响组蛋白乙酰化的状态,改变HDAC或者HAT的活性都会造成组蛋白乙酰化水平的失衡,引起染色质重构进而调控部分基因的表达[32-36];另一方面通过与转录因子或其他基因互作间接调节靶基因的表达[37-38]

      本研究发现TSA处理后毛白杨悬浮细胞的形态发生了变化;转录组分析比较TSA处理和未处理的毛白杨悬浮细胞,发现细胞周期调节途径相关的基因表达受到影响。TSA处理可能通过影响“细胞周期调节”相关基因的表达,从而改变细胞周期的进程。对烟草原生质体细胞分裂研究发现,经过TSA的处理,有丝分裂后期S10磷酸化程度降低,组蛋白发生高度乙酰化,会导致细胞有丝分裂进程受阻,有丝分裂的频率急剧下降[39]。在对豌豆进行TSA处理,发现染色质乙酰化程度改变会导致根细胞分裂受到抑制[40]。随后Noh等[41]研究发现,TSA导致了细胞周期相关蛋白Cyclin B1启动子结合区域的组蛋白H4乙酰化降低,从而使得Cyclin B1的转录和表达降低,说明了细胞周期相关蛋白基因的表达受其启动子结合区域组蛋白乙酰化水平的调节。

      同时,转录组分析发现比较TSA处理后细胞壁组分、次生代谢物等多个途径的相关基因表达也受到影响。有研究报道,乙酰化水平的改变可以调节植物激素信号转导途径或抗性相关基因等途径的基因表达。抑制蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性,改变组蛋白乙酰化程度,导致GA2ox2基因表达上升,根细胞数量降低[42]。经过TSA处理,PIN蛋白被26S蛋白酶降解,抑制了拟南芥主根的生长[43]。在花生水分胁迫中,TSA处理可以改变AhHDA1基因的表达程度[17]。在TSA处理后的毛白杨悬浮细胞中,调控纤维素和木质素生物合成途径关键基因的表达发生变化,其中纤维素合酶相关基因、木质素生物合成途径基因PAL、HCT等都参与了细胞壁的组成,而细胞壁在植物生长中起支持、物质运输和维持细胞形态的重要作用[44-45],这些基因表达的改变影响了细胞的生长形态。另外,基因的表达也受组蛋白特定位点的乙酰化水平调控,如在酵母中H3K18、H3K27和H3K9三个位点的乙酰化与靶基因转录水平呈显著正相关,而H4K16呈显著负相关[46]。因此我们推断在染色质水平上组蛋白乙酰化程度的变化可以直接影响基因的表达。而判断这些关键基因能否与组蛋白乙酰基团直接结合,受其乙酰化水平的调控表达,需要通过染色质免疫共沉淀实验进一步证明。

      综上所述,TSA可能是通过改变组蛋白乙酰化水平,调节植物细胞周期、次生代谢产物以及细胞壁组分等相关基因的表达,从而影响细胞的生长。

参考文献 (46)

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